專利名稱：低后酸化乳酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有低的或降低的后酸化特性的乳酸菌，以及制備這樣的 細(xì)菌的方法。此外，本發(fā)明涉及這樣的細(xì)菌在制備發(fā)酵的乳制品上的應(yīng)用， 以及含有所述細(xì)菌的乳制品。
背景技術(shù)：
德、氏乳才干菌寸呆力口利亞亞種(丄acto6ac/〃ws (ie/6raecA:" subsp. 6w/gan'cz^) 菌種的菌抹是用于生產(chǎn)發(fā)酵乳和特別地酸乳的細(xì)菌培養(yǎng)物的基本成分。這 樣的菌林通常在乳制品保質(zhì)期期間產(chǎn)生乳酸，所述乳制品用細(xì)菌培養(yǎng)物 ——該菌林是此細(xì)菌培養(yǎng)物的一種成分——進(jìn)行發(fā)酵。這種現(xiàn)象常常被稱 為"后酸化"。這樣的細(xì)菌通常不會(huì)有助于乳制品提高的質(zhì)地，所述乳制品 用細(xì)菌培養(yǎng)物——該菌林是此細(xì)菌培養(yǎng)物的一種成分——發(fā)醉獲得的。
根據(jù)大部分歐盟(EU)國(guó)家的法規(guī)，要用于生產(chǎn)酸乳的引子培養(yǎng)物必 須由保加利亞乳桿菌(toc/〃ws Zm/gw/cw )型菌抹和嗜熱鏈球菌 (5^eptococa^ Awmop/n/^ )型菌抹組成。此外，當(dāng)引子培養(yǎng)物是由這兩 個(gè)型的菌抹組成而不是僅僅由單一一個(gè)型的菌抹組成時(shí)，乳的酸化發(fā)生得 更快。
發(fā)酵乳市場(chǎng)上的趨勢(shì)是這樣的產(chǎn)品其在保質(zhì)期期間具有輕度至不存 在酸化發(fā)展(低后酸化)，并且具有高的質(zhì)地(或粘度)。當(dāng)選擇德氏乳桿 菌保加利亞亞種型的菌林單獨(dú)或作為培養(yǎng)物的成分用于發(fā)酵乳和酸乳的 生產(chǎn)時(shí)，產(chǎn)品開發(fā)者必須在具有下列特性組合的已知菌4朱之間選擇
>低后酸化和低質(zhì)地形成能力；或
>高后酸化和低質(zhì)地形成能力；或
>高后酸化和高質(zhì)地形成能力，因?yàn)?，沒有這樣的德氏乳桿菌保加利亞亞種的菌林可以得到所述菌
林以令人滿意的方式將低后酸化特征和高質(zhì)地形成特征相結(jié)合。
采用任何上述已知菌林，發(fā)酵乳制品由于使用細(xì)菌培養(yǎng)物將導(dǎo)致高程
度的后酸化或者低質(zhì)地。乳品業(yè)經(jīng)常選擇用這樣的培養(yǎng)物加工在該培養(yǎng) 物中德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林結(jié)合了低后酸化和低質(zhì)地。為了增加發(fā) 酵乳制品的質(zhì)地，它們?cè)诎l(fā)酵發(fā)生之前向乳基質(zhì)中添加增稠劑(一種或多 種)。
發(fā)明概述
技術(shù)人員所面臨的問題是提供可選的將低后酸化特征和高質(zhì)地形成 特征相結(jié)合的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林，從而使增稠劑的加入變得多 余。幾個(gè)科學(xué)家已經(jīng)試圖獲得這樣的菌抹，但沒有任何的成功。Mdller爭(zhēng) 人.(2001)，為了獲得具有較少后酸化的突變體，對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞 種菌抹(Visby菌林231)進(jìn)行化學(xué)誘變(用誘變劑MNNG (N-甲基-N-亞硝基 -N-硝基胍))。誘變的菌林被手工鋪板并且菌落被手工轉(zhuǎn)移至含有乳的微量 滴定板上。溫育后，通過使用微電極對(duì)大約2000個(gè)分離物每個(gè)孔每個(gè)孔 地測(cè)量pH。分離出了四個(gè)最終pH高于母菌抹的突變體。所述誘變和篩選 沒有得到任何具有高質(zhì)地和低后酸化的突變體。
本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地表明提供這樣的菌抹的確是可能的，并且他 們已經(jīng)研發(fā)出提供這樣的菌林的方法，所述方法不同于M6ller等(2001)的 方法，原因在于本發(fā)明人使用高質(zhì)地菌抹作為母菌林并且使用的是弱誘變 劑。通過實(shí)施本發(fā)明的方法，本發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地鑒別出相對(duì)于其母 菌抹具有提高的質(zhì)地特性的菌抹。因此，本發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計(jì)了開發(fā)這樣的 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹的方法，所述菌抹基本上有助于提高通過用 本發(fā)明的菌林或者本發(fā)明的菌抹作為其成分的細(xì)菌培養(yǎng)物發(fā)酵所獲得的
乳制品的質(zhì):l也。
所得乳制品的特征在于具有比先前已知的產(chǎn)品具有好聞的溫和的、更 少的酸味。
具體實(shí)施例方式
在第一方面，本發(fā)明涉及這樣的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹，其特
征在于
a) 當(dāng)存在于發(fā)酵乳制品(例如在儲(chǔ)存期)時(shí)比其它同種高質(zhì)地的菌抹 產(chǎn)生更少的酸；和/或
b) 用該茼株發(fā)酵的釓制品的質(zhì)地比同種低后酸化的菌抹增加至更高 的水平。
這樣的菌抹令人感興趣的實(shí)施方式是這樣的菌抹，其
a)在儲(chǔ)存14天后和/或21天后和/或28天后在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后酸 化特性的試驗(yàn))中測(cè)量的pH在4.25-4.55的范圍內(nèi)(例如在4.30-4.55的范 圍內(nèi)；或者在4.35-4.55的范圍內(nèi))；并且
b )采用測(cè)定粘度的試驗(yàn)以Pa計(jì)測(cè)量的質(zhì)地形成特性不小于25 (例如 不小于30;不小于35;不小于39;不小于42;不小于44;不小于45; 不小于46;不小于47;不小于48;或者不小于50);
或者這樣的菌^f朱，其
a) 在儲(chǔ)存14天后使在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后酸化特性的試驗(yàn))中測(cè)量的 pH降低小于0.30 pH單位(例如小于0.20 pH單位);并且
b )采用測(cè)定粘度的試驗(yàn)以Pa計(jì)測(cè)量的質(zhì)地形成特性不小于25 (例如 不小于30;不小于35;不小于39;不小于42;不小于44;不小于45; 不小于46;不小于47;不小于48;或者不小于50);
或者這樣的菌抹，其
a )在8攝氏度下在儲(chǔ)存7天后使在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后酸化特性的試驗(yàn)) 中測(cè)量的pH降低小于0.20pH單位(例如小于0.15;小于0.11;小于0.08; 小于0.07;小于0.06;小于0.05;小于0.04;小于0.03;或者甚至小于0.02pH 單位；)；并且
b) 采用測(cè)定粘度的試驗(yàn)以Pa計(jì)測(cè)量的質(zhì)地形成特性不小于25 (例如 不小于30;不小于35;不小于39;不小于42;不小于44;不小于45; 不小于46;不小于47;不小于48;或者不小于50)。術(shù)語"使pH降低"應(yīng)當(dāng)理解為相對(duì)于起始點(diǎn)即pH4.55， pH的降低。例 如降低0.30 pH單位意味著最終pH為4.25。
在兩種令人感興趣的實(shí)施方式中，降低的酸產(chǎn)生不是由于(3-半乳糖苷 酶活性顯著或完全的失活；和/或不是由于乳酸脫氫酶活性顯著或完全的失 活。術(shù)語"不是由于顯著失活"被理解為小于30%的活性降低(例如小于20% 或者甚至小于10%)。
目前優(yōu)選的是這樣的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林，其選自 CHCC10019; CHCC8535;和CHCC7159;以及這些菌抹中任一種的突變 體(例如功能相當(dāng)?shù)耐蛔凅w，如具有基本上相同的后酸化和質(zhì)地形成特性 的突變體)，并且最優(yōu)選的是菌抹CHCC7159或其突變體，例如功能相當(dāng) 的突變體，如具有基本上相同的后酸化和質(zhì)地形成特性的突變體。
在本上下文中，術(shù)語"其突變體"應(yīng)當(dāng)被理解為通過例如基因工程、輻 射和/或化學(xué)處理從本發(fā)明的菌林中衍生的菌林。優(yōu)選的是該突變體是功能 相當(dāng)?shù)耐蛔凅w，如與母菌抹具有基本上相同的后酸化和質(zhì)地形成特性的突 變體。這樣的突變體是本發(fā)明的一部分。特別地，術(shù)語"其突變體"是指通 過使本發(fā)明的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林(例如CHCC10019; CHCC8535; CHCC7159; CHCC3984; CHCC3606或CHCC5713 )經(jīng)歷任 何常規(guī)使用的誘變處理獲得的菌抹或自發(fā)的突變體，所述常規(guī)使用的誘變 處理包括用化學(xué)誘變劑例如甲磺酸乙酯(EMS )或者N-甲基-N'-亞硝基-N-硝基胍(NTG)、 UV光。突變體菌抹應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地滿足上述a)和b)組合 中至少一種。盡管目前優(yōu)選的是通過隨機(jī)突變或者通過對(duì)自發(fā)的突變體進(jìn) 行選擇而提供該菌林，即沒有使用重組DNA技術(shù)，但是應(yīng)當(dāng)料想到德氏 乳桿菌保加利亞亞種的突變體可以通過這樣的技術(shù)提供，所述技術(shù)包括位 點(diǎn)定向誘變和PCR技術(shù)以及其它DNA序列的體外或體內(nèi)修飾。術(shù)語"基 本上相同的后酸化特性，，應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地被理解為所述pH值相對(duì)于母菌抹可以 變化高達(dá)+/-0.1 pH單位(例如0.05、 0.01或0.00單位)，并且術(shù)語"基本上 相同的質(zhì)地形成特性"應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地被理解為所述Pa值相對(duì)于母菌株可以變 化高達(dá)20% (例如高達(dá)10%或者高達(dá)5°/。)和/或+10/-2單位(例如+5、 +3、 +/醫(yī)2、 +/-1.0、 +/-0.5或0.0單位)。在第二方面，本發(fā)明涉及提供這樣的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹的 方法，所述菌抹與母菌抹相比當(dāng)存在于發(fā)酵乳制品(例如在終產(chǎn)品的儲(chǔ)存 過程中)時(shí)產(chǎn)生更少的酸，所述方法包括用誘變劑(優(yōu)選地溫和或弱誘變 劑)或者輻射處理德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林(母菌抹)，所述誘變劑
例如選自下列的誘變劑曱磺酸乙酯(例如1%);亞硝酸(例如0.05 M); 曱磺酸甲酯(例如20 mM);亞硝基胍(例如25M);和ICR-170吖啶 芥(acrine mustard)(例如5g/ml )，所述輻射例如X射線(例如2000 r/min); 或UV射線(例如每分鐘600 erg/mm2 )。目前優(yōu)選的是誘變劑EMS (甲磺 酸乙酯)。
目前優(yōu)選的是，該母菌抹是這樣的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹，其 在乳中生長(zhǎng)后具有高的質(zhì)地形成，而且具有高的后酸化，這樣的菌抹選自 具有下列特性的菌^f朱
a) 高的質(zhì)地形成特性，例如用測(cè)定粘度的試驗(yàn)測(cè)量的Pa不小于25(例 如不小于30;不小于35;不小于39;不小于42;不小于44;不小于45; 不小于46;不小于47;不小于48;或者不小于50)的菌抹；和
b) 高后酸化特性，例如在儲(chǔ)存7天后使在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后酸化特 性的試4全)中測(cè)量的pH降低大于0.20 (例如大于0.30或0.40,或者甚至 大于0.50) pH單位。
這樣的菌抹的實(shí)例是CHCC3984、 CHCC3606和CHCC5713以及這些 中任意一種的突變體(例如功能相當(dāng)?shù)耐蛔凅w，如具有基本上相同的后酸 化和質(zhì)地形成特性的突變體)。這些菌抹以及通過本發(fā)明的方法可獲得的 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林都是本發(fā)明的 一部分。
在令人感興趣的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括
誦在培養(yǎng)基中(例如在pH指示劑板上；在含有例如補(bǔ)充有pH指示劑 的培養(yǎng)基的微量滴定板中；或者在含有例如補(bǔ)充有pH指示劑的培養(yǎng)基的 試管中)溫育單個(gè)突變體；并且
-選擇溫育后培養(yǎng)基的最終pH比母菌林顯著高的突變體。
便利地，pH通過pH電極或者通過使用pH指示劑例如溴苯酚紫或溴 苯酚綠進(jìn)行測(cè)量，并且培養(yǎng)基是乳，例如標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明所述的德氏乳桿菌保加利亞 亞種菌林在制備發(fā)酵乳制品例如酸乳上的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及制備乳制品的方法，其包括將根據(jù)本發(fā)明的菌抹與乳混 合，以及通過所述方法可獲得的乳制品。所得乳制品的特征在于具有比先 前已知的產(chǎn)品具有好聞的溫和的、更少的酸味。
在仍是進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林的繁 殖方法，其包括將本發(fā)明的菌林或者包含所述菌抹的組合物與生長(zhǎng)培養(yǎng)基 例如乳(如標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)混合。
在最后一方面，本發(fā)明涉及可用于使乳發(fā)酵的組合物，其包括根據(jù)本 發(fā)明的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹。這樣的組合物的一個(gè)實(shí)例是引子培 養(yǎng)物，其除了本發(fā)明的菌林外進(jìn)一步包含用于保藏的菌林或添加劑。該組 合物可以是千燥、凍干、冷凍或液體形式。
定義
在本上下文中，術(shù)語"乳(milk)"包括無脂乳、低脂乳、全脂乳、無 乳糖乳(通過用乳糖酶使乳糖水解成葡萄糖和半乳糖或者其它方法而生產(chǎn) 的)、濃縮乳或者奶粉。無脂乳是無脂的(non-fat)或者脫脂(skim)乳制 品。低脂乳典型地被定義為含有大約1%至大約2%脂肪的乳。全脂乳經(jīng)常 含有2%或更多的脂肪。如本文所用，術(shù)語"乳"也意圖包括來自動(dòng)物和植物 來源的乳。動(dòng)物來源的乳包括但不限于人、牛、綿羊、山羊、水牛、駱駝、 美洲駝、母馬和鹿。植物來源的乳包括但不限于從大豆和燕麥中提取的乳。 此外，術(shù)語"乳"不但是指全乳，而且指脫脂乳或從中得到的任何液體成分。
術(shù)語"高質(zhì)地形成菌林"應(yīng)當(dāng)理解為這樣的菌抹，其當(dāng)被用于在43°C的 溫育溫度下以lxlO5- lxlO、fu/g的比值給標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基接種直至pH4.55時(shí)， 導(dǎo)致發(fā)酵乳的剪切應(yīng)力高于25Pa，其是在發(fā)酵/凝固結(jié)束后20小時(shí)用儀器 測(cè)定的，如"測(cè)定粘度試驗(yàn)"中所述。相反，術(shù)語"低質(zhì)地形成菌林"應(yīng)當(dāng)理 解為這樣的菌林，其當(dāng)被用于在43。C的溫育溫度下以lxlO5- lxlO、fU/g的 比值給標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基接種直至pH 4.55時(shí)，導(dǎo)致發(fā)酵乳的剪切應(yīng)力低于25 Pa， 其是在發(fā)酵/凝固結(jié)束后20小時(shí)用儀器測(cè)定的，如"測(cè)定粘度試驗(yàn)"中所述。術(shù)語"高后酸化菌抹，，應(yīng)當(dāng)理解為這樣的菌抹，其當(dāng)按照"測(cè)定后酸化特
性的試驗(yàn)"生長(zhǎng)時(shí)在儲(chǔ)存7天后使所述pH降低多于0.2 pH單位(所述pH 從4.55降至4.35或更低)。相反，術(shù)語"低后酸化菌林"應(yīng)當(dāng)理解為這樣的 菌抹，其當(dāng)按照"測(cè)定后酸化特性的試驗(yàn)"生長(zhǎng)時(shí)在儲(chǔ)存7天后使所述pH 降低不多于0.20 pH單位(所述pH從4.55降至4.35或4.55-4.35范圍內(nèi)的 某一pH值，兩個(gè)端點(diǎn)都包括在內(nèi))。
術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基"應(yīng)當(dāng)被理解為從脫脂乳粉中再造的乳，其具有9.5% 的干物質(zhì)含量，并且在成批處理中已經(jīng)被加熱處理至99攝氏度保持15分 鐘。
"a ( — )，，和"an ( — )，，和"the(所述)"以及類似的指示物的使用應(yīng)當(dāng)被解釋 為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非本文另外指明或者上下文明顯矛盾。術(shù)語"包括 (comprising)，，、"具有(having)，，、"包才舌(including)"和"containing (含 有)"應(yīng)當(dāng)被解釋為開放式術(shù)語(即，意指"包括但不限于")，除非另外指 示。本文數(shù)值范圍的引用僅僅意圖作為單獨(dú)引用落入本范圍內(nèi)的各個(gè)單獨(dú) 的值的一種筒寫方法，除非本文另外指明，并且每個(gè)單獨(dú)的值被引入到說 明書中，似乎它在本文中^^皮單獨(dú)引用一樣。本文所述的所有方法可以以任 何合適的順序?qū)嵤?，除非本文另外指明或者上下文明顯矛盾。本文所提供 的任何及全部實(shí)例或者示例性語言的使用僅僅意圖更好地闡明本發(fā)明并 且沒有對(duì)本發(fā)明的范圍施加限制，除非另外要求保護(hù)。本說明書中的語言 不應(yīng)當(dāng)解釋為指示了對(duì)本發(fā)明的實(shí)施來說必要的任何非要求保護(hù)的元素。


圖1描述了在43。C下突變體菌抹CHCC8535和母菌抹CHCC5713的 pH-時(shí)間圖。參考實(shí)施例1。
圖2描述了在43。C下突變體菌林CHCC7159和母菌抹CHCC3606的 pH-時(shí)間圖。參考實(shí)施例1。
圖3描述了對(duì)用德氏乳桿菌保加利亞亞種品種的不同菌林生產(chǎn)的三個(gè) 獨(dú)立的樣品測(cè)量所得的剪切應(yīng)力的平均值。誤差線跨過平均值附近的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。參考實(shí)施例1。
圖4描述了在43°C下突變體菌林CHCC10019和母菌林CHCC3984的 pH-時(shí)間圖。參考實(shí)施例2。
圖5描述了對(duì)用突變體菌抹CHCC10019和母菌林CHCC3984生產(chǎn)的 三個(gè)獨(dú)立的樣品測(cè)量所得的剪切應(yīng)力的平均值。誤差線跨過平均值附近的 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。參考實(shí)施例2。
實(shí)施例
常規(guī)方法
根據(jù)本發(fā)明的方法，具有高質(zhì)地形成特性和高后酸化特性的德氏乳桿 菌保加利亞亞種的母菌林用化學(xué)誘變劑進(jìn)行處理。從所得菌林中篩選出具 有低后酸化特性的突變體，并且隨后篩選出具有高質(zhì)地形成特性的期望突 變體。所述方法在下面更詳細(xì)地描述
測(cè)定粘度(質(zhì)地形成特性)的試驗(yàn)
該菌林的冷凍濃縮物被用于給200 mL從脫脂乳粉(標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)中 再造的乳接種。該乳具有9.5%的干物質(zhì)含量并且在大氣壓力下在成批處理 中已經(jīng)—皮熱處理至99。C保持15分鐘。保加利亞乳桿菌的冷凍濃縮物典型 地呈現(xiàn)細(xì)胞數(shù)在1,109與1.10^cfu/g之間。接種率為每IOL乳1 g濃縮物， 因此在l-105與1.106 cfu/mL乳之間。在43。C下進(jìn)行溫育直至pH達(dá)到4.55， 此時(shí)該乳已經(jīng)發(fā)生凝固。發(fā)酵的乳然后在定期攪拌下冷卻至5°C (通過力文 在冰浴中20分鐘，然后放在冰箱中)。
達(dá)到pH 4.55后20小時(shí)，發(fā)酵的乳升溫至13。C并且通過配有帶孔圓 盤(直徑二3cm)的棒輕輕攪拌直至樣品均勻。攪拌由棒在樣品進(jìn)行20個(gè) 上下運(yùn)動(dòng)組成。樣品的流變特性是在13。C下在安裝有轉(zhuǎn)子^皮子(CC25) 同軸測(cè)量系統(tǒng)的流變4義(StressTech, Reologica Instruments, Sweden)上進(jìn)
行確定。
粘度測(cè)定是用21步從0.27變至300 1/s的剪切速率進(jìn)行的。剪切速率 先增加后降低，并且記錄了剪切應(yīng)力的向上和向下曲線以及表觀粘度。延
ii遲、積分和平衡時(shí)間分別為5 s、 10s和5min。選擇300 s-l下的剪切應(yīng)力 進(jìn)行進(jìn)一步分析。
剪切應(yīng)力以Pa為單位進(jìn)行測(cè)量。通過定義，粘度等于剪切應(yīng)力除以 剪切速率。因此粘度和剪切應(yīng)力成正比，并且^R定剪切應(yīng)力是在固定剪切 速率300 1/s下測(cè)定的，它們則表示相同的特性。
測(cè)定后酸化特性的試驗(yàn)
該菌抹的冷凍濃縮物被用于給200 mL從脫脂乳粉(標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)中 再造的乳接種。該乳具有9.5%的干物質(zhì)含量并且在成批處理中已經(jīng)被熱處 理至99。C保持15分鐘。
保加利亞乳桿菌的冷凍濃縮物典型地呈現(xiàn)細(xì)胞數(shù)在1.109與3.1010 cfu/g之間。接種率為每10 L乳1 g濃縮物，因此在1.105與3.106 cfu/mL 乳之間。在43。C下進(jìn)行溫育直至pH達(dá)到4.55，此時(shí)該乳已經(jīng)發(fā)生凝固。 發(fā)酵的乳然后在定期攪拌下冷卻至5°C (通過放在冰浴中20分鐘，然后放 在冰箱中)。在大約儲(chǔ)存l; 7; 14; 21天后，用pH電極測(cè)量冷卻的發(fā)酵 乳的pH。
制備標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的方法
將脫脂乳粉(Aria Ingredients, Denmark - Milex 240中溫奶粉)溶解在 水中不多于30min。制備乳的目標(biāo)是9.5% (w/w)的干物質(zhì)。
該乳應(yīng)當(dāng)通過下列溫度分布進(jìn)行滅菌
溫度(。C) 時(shí)間(min)
力口^fe -〉99±1 <20
滅菌 99±1 15±1
冷卻 99±1->40±5 <40
隨后，該乳應(yīng)當(dāng)被儲(chǔ)存在〈7。C下。該乳在第二天前不應(yīng)當(dāng)被使用。 細(xì)菌的繁殖
增加發(fā)酵乳中的質(zhì)地并且后酸化的德氏乳桿菌保加利亞亞種品種的 菌林是眾所周知的。這樣的菌抹優(yōu)選地被用作母菌株。乳酸菌菌抹通常作 為液體溶液、作為凍干粉末或者作為冷凍顆粒加入到乳中以使其發(fā)酵。釆用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)，該液體、粉末和顆粒的細(xì)菌數(shù)可以在每克化6至1E12 個(gè)菌落形成單位(1.106至1.1012cfu/g)之間變化。該液體、粉末和顆粒以 大約0.0005至1%的水平加入到乳中。
誘變
細(xì)菌例如德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹——其在乳中生長(zhǎng)后產(chǎn)生高 的質(zhì)地而且具有高后酸化——優(yōu)選地用溫和誘變劑例如用EMS(甲磺酸乙 酯)進(jìn)行化學(xué)誘變。EMS導(dǎo)致誘變細(xì)菌的基因材料(染色體和質(zhì)粒)上隨 機(jī)的堿基對(duì)取代。誘變后誘變的培養(yǎng)物在培養(yǎng)基上鋪板。
優(yōu)選的方案將冷凍儲(chǔ)存物中的母菌4朱接種在在MRS培養(yǎng)液中在厭 氧下于37。C培養(yǎng)24小時(shí)。為了誘變，將過夜的培養(yǎng)物在最大速度下渦旋 1分鐘以分開可能的細(xì)胞鏈，并且用EMS (10 ml/ml)在37。C下處理2小 時(shí)。EMs導(dǎo)致殺死多于99%的細(xì)胞。EMS處理的培養(yǎng)物在-80。C下在20% 甘油中進(jìn)行冷凍并且該儲(chǔ)存物用于篩選。
篩選
幾千個(gè)菌落被菌落挑選機(jī)器人挑選到含有200微升添加有例如pH指 示劑(溴苯酚紫/溴苯酚綠)的乳的微量滴定板中。微量滴定板中每個(gè)孔然 后相應(yīng)著進(jìn)行模型乳發(fā)酵。含有突變體的孔中乳的pH與含有野生型菌抹 (德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹，其在乳中生長(zhǎng)后產(chǎn)生高的質(zhì)地而且具有 高后酸化，例如德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹CHCC3984、 CHCC3606和 CHCC5713 )的相應(yīng)孔進(jìn)行比較。例如通過比色分析評(píng)定(使用pH指示劑) 或者使用pH電極鑒別出在43。C酸化后乳具有比野生型菌林顯著更高的最 終pH的突變體。為了證實(shí)突變體導(dǎo)致更低的后酸化，通過在帶有標(biāo)準(zhǔn)pH 電極的記錄器系統(tǒng)中記錄pH進(jìn)行較大規(guī)才莫(200ral)的酸化。
為了控制所獲得的突變體具有與母菌抹相同的質(zhì)地形成潛力，乳樣品 用突變體和母菌才朱發(fā)酵至相同的最終pH值并且通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)定和比較 所獲得的發(fā)酵乳的流變學(xué)特性。
實(shí)施例1: LB菌抹CHCC7159和CH8535的制備和特性
CHCC7159和CHCC8535是保加利亞乳桿菌(LB)型的乳酸菌。這 些菌林能在工業(yè)上相應(yīng)的條件下使乳酸化并且特征在于低后酸化。菌林CHCC7159是從CHCC3606中獲得并與之比較的突變體。CHCC8535是 CHCC5713的并與之比較的突變體。如上所述進(jìn)行誘變(優(yōu)選的方案)和 篩選。
CHCC7159、 CHCC8535、 CHCC3606和CHCC5713的冷凍濃縮物祐二 用于給200 mL從脫脂乳粉中再造的乳接種。該乳具有9.5%的干物質(zhì)含量 并且已在成批處理中被熱處理至99。C保持15分鐘。保加利亞乳桿菌的冷 凍濃縮物典型地呈現(xiàn)細(xì)胞數(shù)在1.109與3.101Q cfu/g之間。接種率為每10 L 乳1 g濃縮物，因此在1.105與3.106 cfu/mL乳之間。在43。C下進(jìn)行溫育直 至pH達(dá)到4.55，此時(shí)該乳已經(jīng)發(fā)生凝固。發(fā)酵的乳然后被冷卻至5。C。
pH-時(shí)間圖表明CHCC8535在小于20小時(shí)中達(dá)到pH 4.60，這證明該 菌抹能在工業(yè)上相應(yīng)的接種和溫育條件下使乳酸化(圖1)。
pH-時(shí)間圖表明CHCC7159在大約21小時(shí)中達(dá)到pH 4.60，這證明該 菌林能在工業(yè)上相應(yīng)的接種和溫育條件下使乳酸化(圖2)。
CHCC7159和CHCC8535在整個(gè)發(fā)酵期間比其各自母菌抹酸化得低。 CHCC8535顯示20小時(shí)后pH為4.17，其比母菌林高0.32 pH單位。 CHCC7159顯示20小時(shí)后pH為4.64,其比母菌抹高0.50 pH單位。
CHCC7159和CHCC8535能在發(fā)酵乳中產(chǎn)生提高的質(zhì)地
溫育后的那天，發(fā)酵的乳升溫至13。C并且通過帶有孔的圓盤的棒輕輕 攪拌直至樣品均勻。樣品的流變特性是在在安裝有C25同軸測(cè)量系統(tǒng)的流 變4義(StressTech, Reologica Instruments, Sweden)上進(jìn)4亍確定。粘度測(cè)定 是用剪切速率在21步幅0.27變至300 1/s進(jìn)行的。剪切速率先增加后降低， 并且記錄了剪切應(yīng)力的向上和向下曲線以及表》見粘度。延遲和積分時(shí)間分 別為5 s和10 s。選擇300 s-l下的剪切應(yīng)力進(jìn)行進(jìn)一步分析。用CHCC7159 和CHCC8535的濃縮物溫育的發(fā)酵乳比用其各自母菌^^生產(chǎn)的發(fā)酵乳具有 更好的質(zhì)地(圖3)。對(duì)于這兩種突變體菌抹記錄的剪切應(yīng)力值平均為45 和55 Pa，而它們的母菌林的剪切應(yīng)力值大約在40 Pa或以下。
結(jié)論
菌抹CHCC7159和CHCC8535結(jié)合了下列特性*能在發(fā)酵乳中產(chǎn)生高的質(zhì)地——在測(cè)試實(shí)驗(yàn)條件下比40 Pa高
能在小于24小時(shí)中使乳酸化至pH4.60。
*在測(cè)試實(shí)驗(yàn)條件下20小時(shí)后達(dá)到比4.15高的pH。
實(shí)施例2: LB菌株CHCC10019的制備和特性
CHCC10019是保加利亞乳桿菌型的乳酸菌。CHCC10019能在工業(yè)上 相應(yīng)的條件下使乳酸化并且特征在于低后酸化。菌林CHCC10019是從 CHCC3984中獲得的并與其比較的突變體。如上所述("優(yōu)選的方案")進(jìn) 行誘變和篩選。所用的誘變劑是EMS。
CHCC10019和CHCC3984的過夜培養(yǎng)物是通過給10 mL從脫脂乳粉 再造的乳接種制備的。該乳具有9.5%的干物質(zhì)含量并且在成批處理中已經(jīng) 被熱處理至99。C保持15分鐘。生物材料是從各自菌林的冷凍安瓿中取出 的。在37。C下溫育24小時(shí)。
CHCC10019和CHCC3984的過夜培養(yǎng)物被用于給200 mL從脫脂乳粉 再造的乳(標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基)接種。所用的乳與上述相同。轉(zhuǎn)接的量為1%。 對(duì)于每個(gè)菌林兩瓶乳被溫育。 一瓶用于獲得酸化曲線；第二瓶用于獲得用 于測(cè)定流變學(xué)特性的產(chǎn)品。
保加利亞乳桿菌的過夜培養(yǎng)物典型地呈現(xiàn)細(xì)胞數(shù)在1.106與1.108 cfU/g 之間。接種率為每100 g乳1 g過夜培養(yǎng)物，因此在1.104與1.106 cfu/mL 乳之間。
在43。C下溫育20小時(shí)。在相同條件下制備的第二瓶在43。C下溫育直 至pH達(dá)到4.55，此時(shí)該乳已經(jīng)發(fā)生凝固。該瓶-敗冷卻至5。C直至第二天進(jìn) 行流變學(xué)特性分析。
pH-時(shí)間圖表明CHCC10019在大約7小時(shí)30分鐘中達(dá)到pH4.50,這 證明該菌林能在工業(yè)上相應(yīng)的接種和溫育條件下能使乳酸化，參見圖4。
CHCC10019在整個(gè)發(fā)酵期間比其母菌抹酸化得低。CHCC10019顯示 20小時(shí)后pH為4.22，其比母菌抹高0.64pH單位。
CHCC10019能在發(fā)酵乳中產(chǎn)生提高的質(zhì)地
溫育后的那天，發(fā)酵的乳升溫至13。C并且通過帶孔的圓盤的棒輕輕攪
15拌直至樣品均勻。該樣品的流變學(xué)特性如實(shí)施例1中所述進(jìn)行評(píng)定。對(duì)于
結(jié)果參見圖5。用CHCC10019溫育的發(fā)酵乳比用CHCC3984生產(chǎn)的發(fā)酵 乳具有更好的質(zhì)地。對(duì)于該突變體菌林記錄的剪切應(yīng)力值平均地為45Pa， 而它們對(duì)于母菌林為大約35Pa。
CHCC7159在2006年2月8日被保藏在Deutsche Samml皿g von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM)并給予了保藏編號(hào)DSM 17959。 CHCC3606、 CHCC5713和CHCC8535在2006年3月30日被保藏 在DSM，并且分別給予了保藏編號(hào)DSM 18142、DSM 18143和DSM 18144。 CHCC10019和CHCC3984在2007年4月03日被保藏，并且分別給予了 保藏編號(hào)DSM 19252和DSM 19251。所有的保藏都是根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于 專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約進(jìn)行的。
本文描述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，包括發(fā)明人已知的實(shí)施本發(fā)明最 好的方式。閱讀前面的說明書后，那些優(yōu)選實(shí)施方式的變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說可能變得顯而易見。本發(fā)明人預(yù)期到技術(shù)人員會(huì)應(yīng)用這樣的合適 的變化，并且本發(fā)明人意圖本發(fā)明以本文所特別描述的之外的方式進(jìn)行實(shí) 施。因此，如可適用法律所允許，本發(fā)明包括在附在此處的權(quán)利要求書中 所引用的主題的所有變化和等價(jià)物。而且，在其所有可能的變化中上述元 素的任意組合都^fe本發(fā)明所包括，除非本文另外指明或者上下文另外清楚 地相矛盾。
參考文獻(xiàn)
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http:〃www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc51 .htm 在本專利中引用的所有參考文獻(xiàn)在此引入其全部作為參考。
權(quán)利要求
1. 提供德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)菌株的方法，當(dāng)存在于發(fā)酵乳制品時(shí)所述菌株比母菌株產(chǎn)生更少的酸，所述方法包括用誘變劑(例如EMS)處理德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株(母菌株)，其中所述母菌株選自具有下列特性的菌株a)高的質(zhì)地形成特性；和b)高的后酸化特性
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述誘變劑是溫和(或弱)誘變劑。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述母菌抹選自具有下列特性的 菌林a) 高的質(zhì)地形成特性，即所述菌林采用測(cè)定粘度的試驗(yàn)測(cè)量，具有不 小于25的Pa;和b) 高的后酸化特性，即所述菌^MM諸存7天后在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后 酸化特性的試驗(yàn))中測(cè)量的pH降低多于0.20 pH單位。
4. 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林，其可通過任何前述權(quán)利要求的方法獲得。
5. 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹，其a) 當(dāng)存在于發(fā)酵乳制品(例如在儲(chǔ)存期間)時(shí)產(chǎn)生比其它同種高質(zhì)地 的菌抹更少的酸；和/或b) 將用所述菌林發(fā)酵的乳制品的質(zhì)地增加至比同種低后酸化的菌抹 更高的水平。
6. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林，其a) 在儲(chǔ)存14天后在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后酸化特性的試驗(yàn))中測(cè)量的pH 在4.25-4.55的范圍內(nèi);并且b) 具有不小于25的釆用測(cè)定粘度試驗(yàn)以Pa測(cè)量的質(zhì)地形成特性。
7. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林，其 a)在儲(chǔ)存14天后使在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后酸化特性的試驗(yàn))中測(cè)量的pH降低小于0.30 pH單位；并且b)具有不小于25的采用測(cè)定粘度試驗(yàn)以Pa測(cè)量的質(zhì)地形成特性。
8. 根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林，其a)在8攝氏度下儲(chǔ)存7天后使在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后酸化特性的試驗(yàn)) 中測(cè)量的pH降低小于0.20 pH單位；并且b )具有不小于25的采用測(cè)定粘度試驗(yàn)以Pa測(cè)量的質(zhì)地形成特性。
9. 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹，其選自由以下組成的組 CHCC10019 (DSM19252 ); CHCC8535 (DSM18144);和CHCC7159(DSM17959);以及這些菌林中任一種的突變體，例如功能相當(dāng)?shù)耐蛔凅w， 如具有基本上/本質(zhì)上相同的后酸化和質(zhì)地形成特性的突變體。
10. 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹，其選自由以下組成的組 CHCC10019 (DSM9252 ); CHCC8535 (DSM18144);和CHCC7159(DSM17959 );以及這些菌抹中任一種的突變體，其a) 在8攝氏度下儲(chǔ)存7天后在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(測(cè)定后酸化特性的試驗(yàn))中 測(cè)量的pH降低小于0.20 pH單位；并且b) 具有不小于25的采用測(cè)定粘度試驗(yàn)以Pa測(cè)量的質(zhì)地形成特性。
11. 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌林CHCC7159或它的具有基本上/本質(zhì) 上相同的后酸化和質(zhì)地形成特性的突變體。
12. 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹，其選自由以下組成的組 CHCC3984 (DSM19251); CHCC3606 (DSM 18142)和CHCC5713 (DSM 18143);以及這些菌林中任一種的突變體，例如功能相當(dāng)?shù)耐蛔凅w，如具 有基本上/本質(zhì)上相同的后酸化和質(zhì)地形成特性的突變體。
13. 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌抹，其選自由以下組成的組 CHCC3984 (DSM19251); CHCC3606 (DSM 18142)和CHCC5713 (DSM 18143);以及這些菌林中任一種的突變體，所述突變體具有不小于25的采 用測(cè)定粘度試驗(yàn)以Pa測(cè)量的質(zhì)地形成特性。
14. 通過包括將根據(jù)任何前述權(quán)利要求所述的菌林與乳混合的方法獲 得的乳制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有低的或降低的后酸化特性的乳酸菌，以及制備這樣的細(xì)菌的方法。此外，本發(fā)明涉及這樣的細(xì)菌在制備發(fā)酵的乳制品上的應(yīng)用，以及含有所述細(xì)菌的乳制品。
文檔編號(hào)A23C9/123GK101472481SQ200780022740
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月23日
發(fā)明者安妮特·希勒·約翰森, 尼爾斯·班·斯姆森·詹森 申請(qǐng)人:科.漢森有限公司