專利名稱：：嵌合Kunitz結(jié)構(gòu)域及其用途的制作方法嵌合Kunitz結(jié)構(gòu)域及其用途本發(fā)明涉及天然和非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域與人組織因子抑制物結(jié)構(gòu)域1的嵌合體，及其制備方法和用途。Kunitz結(jié)構(gòu)域是能夠以不同的強(qiáng)度抑制大量絲氨酸蛋白酶的多肽。它們包含穩(wěn)定蛋白并確定其三維結(jié)構(gòu)的三對二硫鍵。與各絲氨酸蛋白酶之間的相互作用原則上是通過Kunitz結(jié)構(gòu)域N末端區(qū)域的、約9個氨基酸長的環(huán)發(fā)生的。所述的環(huán)與蛋白酶的催化中心結(jié)合，由此阻礙合適的蛋白酶底物的切割(LaskowskiandKato[1980];BodeandHuber[1992])。牛胰蛋白酶抑制劑(Aprotinin)(BPTI;圖1;SeqNo.6)被視為Kunitz結(jié)構(gòu)域的原型(FritzandWunderer[1983])。這是一種具有58個氨基酸長度的堿性蛋白，其可由多種牛的器官(尤其是，胰腺、肺、肝臟和心臟)中分離獲得。牛胰蛋白酶抑制劑通過三對二硫鍵得以穩(wěn)定(Cys5-Cys55;Cys14-Cys38;Cys30-Cys51),是一種對于特別是胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶、血漿激肽釋放酶的有效抑制劑。目前已經(jīng)可以利用牛胰蛋白酶抑制劑和牛胰蛋白酶之間的復(fù)合體的X-射線結(jié)構(gòu)分析顯示出牛胰蛋白酶抑制劑與蛋白酶的催化中心的接觸區(qū)域主要是通過氨基酸11到氨基酸19組成的環(huán)形成的(參見BodeandHuber[1992]以及其中所列的參考文獻(xiàn))。氨基酸Lysl5對于牛胰蛋白酶抑制劑的抑制作用起核心重要作用，并且其與蛋白酶的催化活性絲氨酸的接觸尤為緊密。由此，將氨基酸Lysl5定義為PI殘基(SchechterandBerger[1967])。P2，P3等殘基位于Lys-15的N末端，位于自Lys-15C末端的氨基酸被稱為Pl，，P2，等。由于Lys-15正好位于牛胰蛋白酶抑制劑的第二個半胱氨酸殘基的C末端，在其它Kunitz結(jié)構(gòu)域這一位置的相應(yīng)氨基酸也被類似地稱作PI殘基。早已證明可以通過靶定交換殘基11到殘基19這一區(qū)域中的氨基酸對牛胰蛋白酶抑制劑的抑制效果進(jìn)行修飾(Otlewskietal.[2001],Apeleretal.[2004],Krowarschetal.[2005])。氨基酸36-39對于牛胰蛋白酶抑制劑的活性具有附加重要作用(FritzandWunder[1983]，Krowarschetal.[2005])。臨床研究表明利用牛胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行治療顯著地降低心臟外科手術(shù)中對輸血的需求，同時減少繼發(fā)性出血，因而，目前牛胰蛋白酶抑制劑Trasylol(商品名)主要應(yīng)用于心臟外科手術(shù)中(Royston[1992])。臨床效果歸因于對內(nèi)源性凝血的抑制(接觸激活作用)、纖維蛋白溶解作用的抑制和凝血酶形成的降低(Blauhutetal.[1991],Dietrichetal.[1995])。纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋》文酶的抑制對于牛胰蛋白酶抑制劑的止血作用是重要的。牛胰蛋白酶抑制劑作為牛的蛋白在人體中引起抗體的形成。反復(fù)施用Trasylol可能引起嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)(過敏性休克)。其風(fēng)險性為2.8%，因此，牛胰蛋白酶抑制劑的多次應(yīng)用在很大程度上受到限制(Dietrichetal.[2001],Beierieinetal.[2005])。由此，醫(yī)學(xué)上急需具有類似或優(yōu)于牛胰蛋白酶抑制劑的臨床效果、同時顯著降低變態(tài)反應(yīng)的活性成份。通過外源途徑(例如，組織損傷)的凝血活化作用是通過由內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織因子所引發(fā)的(Lindahl[1997],LwaleedandBass[2005])。組織因子進(jìn)入血液后與Vila因子結(jié)合。由此形成的復(fù)合體活化X因子(外源凝血)和IX因子(內(nèi)源凝血)。在生理?xiàng)l件下，組織因子受到組織因子抑制劑(TFPI)的抑制。人組織因子抑制物(hTFPI)是一種具有276個氨基酸的長度、分子量約42kDa的蛋白，其首先抑制Xa因子，而后與Vila因子/組織因子復(fù)合體結(jié)合。TFPI由三個Kunitz結(jié)構(gòu)域組成，在血漿中主要與脂蛋白結(jié)合。由此被稱作"脂蛋白相關(guān)的促凝劑抑制物"(LACI)。TFPI最先由人HepG2細(xì)胞上清純化(Brozeetal.[1987])，其后不久又從人血漿中純化出來(Novotnyetal.[1989])。1988年克隆出了hTFPI的cDNA(Wunetal.[1988])。Sprecher等克隆并描述了組織因子抑制物另外的同種型(hTFPI2;Sprecheretal.[1994])。通過靶定交換hTFPI相應(yīng)Kunitz結(jié)構(gòu)域Pl位的氨基酸表明Kunitz結(jié)構(gòu)域2(D2)負(fù)責(zé)Xa因子的抑制，Kunitz結(jié)構(gòu)域1(Dl)和2對于與Vila因子/組織因子復(fù)合體的結(jié)合而言是必需的(Girardetal.[1989])。對單獨(dú)表達(dá)的hTFPI的Kunitz結(jié)構(gòu)域的研究表明僅Kunitz結(jié)構(gòu)域2可抑制Xa因子，Kunitz結(jié)構(gòu)域1也抑制纖維蛋白溶酶(Petersenetal.[1996])。Markland等公開了通過噬菌體展示的方法由hTFPIDl的變異制備蛋白文庫。通過在氨基酸10-20和31-39的區(qū)域中引入突變可對hTFPIDl的性質(zhì)進(jìn)行修飾，由此使所得的Kunitz結(jié)構(gòu)域成為高效能的、選擇性纖維蛋白溶酶抑制物(Marklandetal.[1996a])，或高效能的、選擇性血漿激肽釋放酶抑制物(Marklandetal.[1996b])。Baja等討論了氨基酸8-20和31-39對hTFPIDl抑制活性的重要性(Bajajetal.[2001])。US6,010,880;EP0737207;US6,071,723和US6，953，674中描述了高效、高特異性抑制纖維蛋白溶酶的Kunitz結(jié)構(gòu)域的變體。US5,795,865;EP0739355和US2004/0038893中描述了高效、高特異性抑制血漿激肽釋放酶的Kunitz結(jié)構(gòu)域的變體。US6，783，960中描述了由hTFPIl和/或hTFPI2的多種Kunitz結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白。US5,786,328;US5,780,265和EP0832232中公開了Kunitz型的血漿激肽釋放酶抑制物。發(fā)明簡述本發(fā)明的目的在于制備具有相當(dāng)于或優(yōu)于牛胰蛋白酶抑制劑的活性、同時顯著降低免疫原性的、人組織因子抑制物1結(jié)構(gòu)域1(hTFPIDl)變體。所需的特性是通過用來自其它天然或非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域活性部位的相應(yīng)氨基酸交換hTFPIDl活性部位的氨基酸來實(shí)現(xiàn)的。由此生成的嵌合體高效抑制纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶。發(fā)明詳述本發(fā)明中的Kunitz結(jié)構(gòu)域是牛胰蛋白酶抑制劑的同源物，具有55到62個氨基酸，其中包含6個半胱氨酸殘基和三對二硫^:。所述的氨基酸如表1所示按照牛胰蛋白酶抑制劑的58個氨基酸進(jìn)行編號。由此，Cysl為氨基酸5，Cys6為氨基酸55。表l中，"x"代表任意氨基酸，"X"代表詳細(xì)描述的每一種情況下的氨基酸之一。在各具體情況中，于Cys5-Cys55;Cys14-Cys38和Cys30-Cys51之間形成二錄"建。到目前為止，已在特別是多種脊推動物(例如人，牛)和一些無脊推動物(鼻弟蟲，?？?中發(fā)現(xiàn)了Kunitz抑制物(LaskowskiandKato[1980]以及其中所引用的參考文獻(xiàn))。這種天然存在的Kunitz結(jié)構(gòu)域在本申請中稱作"天然Kunitz結(jié)構(gòu)域"。作為天然Kunitz結(jié)構(gòu)域的例子，如牛胰蛋白酶抑制劑，人胎盤尿抑胰酶素結(jié)構(gòu)域1，人胎盤尿抑胰酶素結(jié)構(gòu)域2，人淀粉狀蛋白PA4蛋白前體Kunitz結(jié)構(gòu)域和人Eppin前體Kunitz結(jié)構(gòu)域。一些天然Kunitz結(jié)構(gòu)域的序列如表2詳示。通過遺傳工程的方法可以制備重組的Kunitz結(jié)構(gòu)域的變體，其與天然的Kimitz結(jié)構(gòu)域有一個或以上氨基酸的差異。這種通過交換氨基酸所得的Kunitz結(jié)構(gòu)域在本申請中稱作"非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域"?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中公開了多種非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域(Demiisetal.[1995〗,Marklandetal.[1996a],Marklandetal.[1996b],Apeleretal.[2004],EP0307592)。一些非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域的序列如表3所示。本發(fā)明的目的在于制備具有相當(dāng)于或優(yōu)于牛胰蛋白酶抑制劑的臨床作用、同時，與牛胰蛋白酶抑制劑相比顯著降低在人體中所引起的變態(tài)反應(yīng)的Kunitz結(jié)構(gòu)域。hTFPIDl是人Kunitz結(jié)構(gòu)域，其具有下述序列MHSFCAFKADDGPCKAMKRFFEN1FTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD(SeqNo.2).因?yàn)閔TFPIDl是人源的，所以可以預(yù)期在人體中應(yīng)用hTFPIDl不會引起相當(dāng)于應(yīng)用牛胰蛋白酶抑制劑的情況時的變態(tài)反應(yīng)。牛胰蛋白酶抑制劑是一種有效的纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶抑制物(表4),其臨床效果歸因于對內(nèi)源性凝血(接觸激活作用)、纖維蛋白溶解作用的抑制和凝血酶形成的降低(Blauhutetal.[1991]，Dietrichetal.[1995])。相反地，hTFPIDl被認(rèn)為是纖維蛋白溶酶的弱抑制物，而且對血漿激肽釋放酶沒有抑制作用(表4)。本發(fā)明的目的在于制備具有最低潛在免疫原性同時還可以高效抑制纖維蛋白溶酶以及血漿激肽釋放酶的hTFPIDl的變體。優(yōu)選地，本發(fā)明的變體以<100nM的IC50抑制纖維蛋白溶酶，更優(yōu)選以<10nM的IC50抑制纖維蛋白溶酶。優(yōu)選的本發(fā)明的變體以<100nM的IC50抑制血漿激肽釋》文酶，更優(yōu)選以<10nM的IC50抑制血漿'激肽釋it酶。本發(fā)明的hTFPIDl的變體是通過形成hTFPIDl與其它天然或非天然的Kunitz結(jié)構(gòu)域的嵌合體制備的。所述嵌合體的形成通過將hTFPIDl活性部位的一個或以上的氨基酸與來自其它天然或非天然的Kunitz結(jié)構(gòu)域的活性部位的相應(yīng)氨基酸相交換而進(jìn)行的。所述的活性部位包括相應(yīng)Kunitz結(jié)構(gòu)域的氨基酸10到20和31到39。令人驚訝的是，由此產(chǎn)生的hTFPIDl變體所表現(xiàn)出的性質(zhì)不僅可相當(dāng)于、在一些情況下甚至顯著優(yōu)于牛胰蛋白酶抑制劑。舉例而言，與牛胰蛋白酶抑制劑相比，本發(fā)明的TFPI變體對血漿激肽釋放酶具有更強(qiáng)的抑制效果(表4)。此外，本發(fā)明的TFPI變體與牛胰蛋白酶抑制劑相比具有類似的甚或顯著提高的抗凝血效果(圖3,圖8)。本發(fā)明的TFPI變體以相當(dāng)于牛胰蛋白酶抑制劑的效力抑制人血漿中的纖維蛋白溶解(圖2,圖7)。本發(fā)明的TFPI變體的止血作用已在多種動物模型中進(jìn)行檢測。在大鼠出血模型中本發(fā)明的TFPI變體表現(xiàn)出相當(dāng)于牛胰蛋白酶抑制劑的作用(圖4,圖9)。牛胰蛋白酶抑制劑與本發(fā)明的TFPI變體對減少大鼠腸系膜出血時間作用相當(dāng)(圖11,圖12)。在大鼠動靜脈短路模型中研究了本發(fā)明的TFPI變體的抗血栓形成效果。在該研究中本發(fā)明的TFPI變體表現(xiàn)出與牛胰蛋白酶抑制劑相當(dāng)?shù)目寡ㄐ纬勺饔?圖10)。在經(jīng)麻醉的大鼠中檢測了本發(fā)明的TFPI變體對心血管系統(tǒng)的非期望效果。在靜脈內(nèi)施用劑量最高達(dá)50mg/kg的情況下本發(fā)明的TFPI變體也沒有顯示出對血壓和ECG的作用(表8)。外傷、再灌注和體外循環(huán)可通過體液或細(xì)胞級聯(lián)系統(tǒng)引起復(fù)合炎癥反應(yīng)。其導(dǎo)致特別是白細(xì)胞和血小板的活化，其可引起臨床可見的副反應(yīng)，例如形成浮胂或器官損傷(HessPJJr.[2005])。多種研究結(jié)果表明牛胰蛋白酶抑制劑可能對分流術(shù)病人的炎癥狀況有影響(AsimakopoulosG.etal.[2000])。本發(fā)明的TFPI變體對炎癥反應(yīng)的可能影響已通過多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)進(jìn)行了檢測。本發(fā)明的TFPI變體以與相當(dāng)于或稍好于牛胰蛋白酶抑制劑的效果抑制IL-8-和C5a-誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化性(圖13，表6)。類似地，本發(fā)明的TFPI變體以與相當(dāng)于或稍好于牛胰蛋白酶抑制劑的效果抑制CAP-37-誘導(dǎo)的通透性增加(圖14,表7)。本發(fā)明的hTFPIDl變體具有下述通式MHSFCAFKAX'oXnGPCXuX'oXnXwXwX^iXnFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD或EAMHSFCAFKAX'oXnGPCXuXj^XwXwXMXnXnFNIFTRQCEEnYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD.其中，"X"是表1所示編號的、Kunitz結(jié)構(gòu)域的氨基酸。這種氨基酸可能來自于hTFPIDl,也可能來自于表2和3所示的另一種天然或非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的變體是通過用來自相應(yīng)天然或非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域的另一種氨基酸交換hTFPIDl的至少一個氨基酸來制備的。優(yōu)選用于交換hTFPIDl的相應(yīng)氨基酸的、來自天然和非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域的氨基酸的例子如表5所示。下述的hTFPIDl的變體是特別優(yōu)選的MHSFCAFKAETGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD(SeqNo.4)MHSFCA.FKAETGPCRAAHPRWWFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD(SeqNo.5).EAMHSFCAPKAETGPCRAAHPRWFFNIFTRQCEEFIYGOOBGNQNRFESLEECKKMCTRD(SeqNo.W)EAMHSFCAFKAETGPCRAAHPRWWFNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD(SeqNo.20).一些本發(fā)明的hTFPIDl變體抑制胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶的IC50值如表4所示。本發(fā)明的hTFPIDl的其它變體如圖l所示。本發(fā)明還涉及包含一種或以上本發(fā)明的hTFPIDl變體的藥物。所述的新Kunitz結(jié)構(gòu)域適合用于治療下述的病理狀態(tài)具有增加出血風(fēng)險的手術(shù)相關(guān)的失血；對血栓栓塞類疾病的治療(例如術(shù)后，意外傷害)，休克，多發(fā)性損傷，膿毒病，彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC),多器官衰竭，不穩(wěn)定型心絞痛，心肌梗塞，中風(fēng)，栓塞，深度靜脈血栓，炎癥性病變(例如風(fēng)濕，哮喘)，侵入性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，對疼痛和浮腫的治療(腦水腫,脊髓浮腫),在透滲析治療中預(yù)防止血法的活化作用，皮膚老化的癥狀的治療(彈性組織變性，萎縮,皺紋，脈管改變，色素改變,光化性角化病,黑頭粉刺，嚢腫),皮膚癌,皮膚癌癥狀的治療(光化性角化病，皮膚基底細(xì)胞癌,鱗狀細(xì)胞癌,惡性黑色素瘤),多發(fā)性硬化,纖維化,腦出血,腦和脊髓的炎癥，腦感染。實(shí)施例實(shí)施例1人組織因子抑制物結(jié)構(gòu)域1(hTFPI,組織因子途徑抑制物)的克隆以及TFPI變體的生成對可商購的大腸桿菌/釀酒酵母(S.cweWWae)穿梭載體pYES2(Invitrogen)進(jìn)行修飾(參見Apeler[2005])并將其作為構(gòu)建酵母分泌型載體pIU10.10W和pIU3.12.M的起始材料。pIU10.10.WMFal啟動子-MFal-Metl-Arg2...前序歹'J...Ala17-Leu18-Ala19|信號肽酶pIU3.12.MMFal啟動子-MFal-Metl-Arg2...前序歹'J原...Asp83-Lys84-Arg85|KexII蛋白酶天然存在的人TFPI結(jié)構(gòu)域1(hTFPIDl,acc.P10646,氨基酸Met49-Aspl07,here:Metl-Asp58)作為合成基因(為用作釀酒酵母密碼子而進(jìn)行優(yōu)化)與酵母分泌型載體pIU10.10.W中的Alal9(通過限制酶切位點(diǎn)BsaBI和Xhol)或酵母分泌型載體pIU3.12.M中的Arg85(通過PCR和限制酶切位點(diǎn)HindIII和BamHI)融合。將hTFPIDl克隆到酵母分泌型載體pIU10.10.W中合成制備的hTFPIDl(SeqNo.2)基因通過限制酶BsaBI(5，)和Xhol(3，)亞克隆到酵母分泌型載體pIU10.10.W(圖5)中，并經(jīng)DNA序列分析檢測核苷酸序列。通過轉(zhuǎn)化pIUl0.10.W在酵母中制備hTFPIDl變體^f吏具備N末端氨基酸序列MHSF的hTFPIDl變體表達(dá)。XholPCR引物4:5'-TCCCTCGAGTTATTAATCTCTAGTACACAT-3'導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸交換的核苷酸交換以粗體以及灰色背景示于PCR引物3中。將用PCR引物3和4擴(kuò)增的DNA片段通過限制酶位點(diǎn)Nsil(5')和Xhol(3，)克隆到酵母分泌型載體pIU10.10.W中。用部分2中所述的PCR引物(PCR引物1和PCR引物2)將TFPImutl亞克隆到酵母分泌型載體PIU3.12.M中。每種情況下的核苷酸序列均經(jīng)過DNA序列分析進(jìn)行檢測。變體2:TFPImut3(SeqNo.4)與hTFPIDl和TFPImutl相比，TFPImut3具有進(jìn)一步的氨基酸交換D10E，DlIT,K15R，I17A，M18H,K19P，F(xiàn)21W(SeqNo.4)TFPImut3是由TFPImutl通過誘變引物1和2經(jīng)體外誘變(利用Quick-changeIIXL定點(diǎn)誘變試劑盒，Stratagene制)制備的。待誘變的、TFPImutl(部分序列)中的起始序列為5'…，tttgtgcttttaaagct2aisaiggtccatgtagagctgctc-….3'cafkaddgpcraai秀哭引沖勿1:5'-TTTGTGC'nTTAAAGCTGAAkfcTGGTCCATGTAGAGCTGCTC-3'誘變引物1包含經(jīng)修飾的三聯(lián)體OA眉和fe,而非GAT/D10和GAT/D11,由此導(dǎo)致氨基酸交換D10E和DllT。誘變引物2:(S'-GAGCAGCTCTACATGGACCAtetfTCAGCTTTAAAAGCACAAA-3，)與誘變引物1互補(bǔ)。XholPCRprimer4:5'-TCCSCCQAeTTATTAATCTCTAGTACACAT-3'導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸交換的核苷酸交換以粗體以及灰色背景示于PCR引物3中。將PCR引物3和4擴(kuò)增的DNA片段通過限制酶位點(diǎn)Nsil(5，)和Xhol(3，)克隆到酵母分泌型載體pIU10.10.W中。用部分2中所述的PCR引物(PCR引物1和PCR引物2)將TFPImutl亞克隆到酵母分泌型載體PIU3.12.M中。每種情況下的核苷酸序列均經(jīng)過DNA序列分析進(jìn)行檢測。變體2:TFPImut3(SeqNo.4)與hTFPIDl和TFPImutl相比，TFPImut3具有進(jìn)一步的氨基酸交換D10E,DlIT,K15R,I17A,M18H,K19P，F(xiàn)21W(SeqNo.4)TFPImut3是由TFPImutl通過誘變引物1和2經(jīng)體外誘變(利用Quick-changeIIXL定點(diǎn)誘變試劑盒，Stratagene制)制備的。待誘變的、TFPImutl(部分序列)中的起始序列為5'….-tttgtgcttttaaagctsaiqm:ggtccatgtagagctgctc-….3'cafkaddgpcraa謙變引物1:5'-tttgtgcttttaaagctga^ctcgtccatgtagagctgctc-3'誘變引物1包含經(jīng)修飾的三聯(lián)體GA|andJCT1,而非GAT/D10和GAT/D11,由此導(dǎo)致氨基酸交換D10E和D11T。i秀變引4勿2:(5'-GAGCAGCTCTACATGGACC^gftieAGCTTTAAAAGCACAAA-3')與誘變引物1互補(bǔ)。誘變根據(jù)產(chǎn)品說明進(jìn)行，其后利用DNA序列分析檢測核苷酸序列。實(shí)施例2酉良酒酵母(5^cc/iarow2yces1cerevz、z'ae)的壽爭4b在10mlYEPD(2%葡萄糖；2%蛋白胨；P/oDifco酵母提取物)中培養(yǎng)，其后在OD6Q()nm0.6到0.8時收獲酵母細(xì)胞，例如菌才朱JC34.4D(MAT口，ura3-52,suc2)。用5ml溶液A(1M山梨糖醇；10mMN-二(羥乙基)甘氨酸pH8.35;3%乙二醇)洗細(xì)胞，重懸于0.2ml的溶液A中，于-70匸保存。將包含編碼TFPImut3EA基因的質(zhì)粒DNA(5pg)和作為載體DNA的緋精DNA(50pg)添加到冷凍的細(xì)胞中。將所述的細(xì)胞在37°C下振蕩5min解凍。添加1.5ml的溶液B(40%PEG1000;200mMN-二(羥乙基)甘氨酸pH8.35)后，所述細(xì)胞在30。C下培養(yǎng)60min，沉淀后用1.5ml的溶液C(0.15MNaCl;lOmMN-二(羥乙基)甘氨酸pH8.35)洗細(xì)胞，并將其重懸于100pl的溶液C中。涂板于含2%瓊脂的選擇培養(yǎng)基上。30。C下培養(yǎng)3天后獲得轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例3通過發(fā)酵酵母細(xì)胞制備TFPImut3EA營養(yǎng)液下述的營養(yǎng)液用于發(fā)酵酵母細(xì)胞以表達(dá)TFPImut3EA:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>痕量元素溶液4(SL4溶液):Titripkxffl(Merck8418)5gFeS047H20(Merck3965)2gZ11SO47H20(Merck8883)0.1gMnCl2-4H2O(Merck5927)30mgH3B03(Merck165)0.3gC0CI2.6H20(Merck2533)0.2gCuCl22H20(Merck2733)10mgNiC26H20(Merck6717)20mgNa2Mo04'2H20(Merck6521)30mg將SL4溶液的成份溶解于脫礦質(zhì)水中，用NaOH將pH調(diào)節(jié)為pH3-4。用脫礦質(zhì)水將上述的營養(yǎng)液制成1000ml,以等分試樣儲存于-20。C下。將營養(yǎng)液SD2和SC5的成份溶于脫礦質(zhì)水中，將pH調(diào)節(jié)為pH5.5。121°C滅菌20min。將葡萄糖溶解于1/5所需體積的脫礦質(zhì)水中，單獨(dú)滅菌，冷卻后添加到剩余的營養(yǎng)液中。菌抹原液所有酵母轉(zhuǎn)化子的菌抹原液都是通過將lml的小份預(yù)培養(yǎng)物與lml80%甘油溶液混合，保存于-140匸下。預(yù)培養(yǎng)物預(yù)培養(yǎng)物的發(fā)酵用裝有10或100mlSD2營養(yǎng)液的50ml(用于小容量主培養(yǎng)物)或l升的搖瓶(用于中等容量的主培養(yǎng)物)進(jìn)行?？梢杂镁衷夯騍D2瓊脂平板上單個菌落接種。于28-30°C連續(xù)振蕩培養(yǎng)(240rpm)2-3天。主培養(yǎng)物發(fā)酵小規(guī)模的主培養(yǎng)物發(fā)酵利用裝有100mlSC5營養(yǎng)液的1升容量搖瓶進(jìn)行。通常用3ml上述預(yù)培養(yǎng)物接種。于28-30°C將所述培養(yǎng)物連續(xù)振蕩培養(yǎng)(240rpm)4天。在對主培養(yǎng)物進(jìn)行中等規(guī)模的發(fā)酵時，利用WaveBiotech(Tagelswangen,CH)的生物反應(yīng)器進(jìn)行。具體而言，將30ml預(yù)培養(yǎng)物接種于1000ml的SC5培養(yǎng)基中，在Wavebag中以32/min的搖動速率培養(yǎng)4天(角度10。；送氣0.251/min)。在第1-3天監(jiān)控培養(yǎng)物的pH，必要時用5MNaOH將pH調(diào)節(jié)到pH5-6。在第1-3天，向每一100ml培養(yǎng)物添加1ml50%濃度(strength)的酵母提取物溶液和4ml4M葡萄糖溶液。對于1000ml的培養(yǎng)物，1天中連續(xù)添加大約10或40ml的營養(yǎng)液。測定不同時間培養(yǎng)物的OD600nm以監(jiān)控其生長。4天后，離心(6000rpml5minJA14轉(zhuǎn)子)收集無細(xì)胞的上清液。實(shí)施例4由經(jīng)發(fā)酵的酵母細(xì)胞上清中純化TFPImut3EA將1MNaOH添加到在主培養(yǎng)物發(fā)酵中制備的含有TFPImut3EA的無細(xì)胞上清中至pH為7.8。4。C下2000rpm(15min;Beckman-Allegra6KR)離心4吏上清液中的懸浮顆粒沉降下來。將上清液以lml/min裝在于10ml胰蛋白酶-瓊脂糖柱(Sigma-T1763)。用70ml50mMTrispH7.8,250mMNaCl和50ml50mMTrispH7.8,600mMNaCl洗柱。用180ml50mMKC1/10mMHC1pH2.0將TFPImut3EA洗脫下來。用每管包含用于中和的500|til200mMTrispH7.6，2MNaCl的管分別收集2ml組分。通過下述的胰蛋白酶抑制實(shí)驗(yàn)鑒定含TFPImut3EA的組分。將胰蛋白酶抑制組分收集在一起在截斷值(cutoff)1000道爾頓(Spectra/POR6)的透析管中透析兩次，每次均相對于2升50mMTrispH7.5進(jìn)行。將透析物在Amicon8200攪拌杯中通過截斷值1000道爾頓的超濾膜進(jìn)行濃縮。所得的蛋白濃度用考馬斯plus實(shí)驗(yàn)(Pierce，23236)依照制造商所述確定。所測定的蛋白濃度一般在0.1到6mg/ml之間?？蛇x擇地，在經(jīng)胰蛋白酶-瓊脂糖純化后，將胰蛋白酶抑制組分收集在一起，將其與相同容積的0.1%TFA混合裝載于Source15RPC柱。用6ml0.1%TFA(HPLC-A緩沖液)洗柱，接下來用25ml梯度至50%HPLC-B緩沖液(0.1%TFA,60%乙腈)并進(jìn)一步用5ml梯度至100。/oHPLC-B緩沖液洗脫TFPImut3EA。將含有TFPImut3EA的洗脫物凍干，將每組分凍干物收集于250pi50mMTrispH7.5中。實(shí)施例5確定TFPImut3EA對胰蛋白酶，纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶的抑制能力通過熒光底物輔助的生化試驗(yàn)，在白色的384-孔微滴定板中確定TFPImut3對胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋》文酶的酶促活性抑制能力。試驗(yàn)緩沖液由50mMTris/Cl，pH7.4，100mMNaCl,5mMCaCl2,0.08%(w/v)BSA組成。具體試驗(yàn)條件如下所述<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>將10|ul連續(xù)稀釋的TFPImut3EA加入各孔中，與20|til的酶在RT條件下預(yù)培養(yǎng)5min。通過在各孔中添加20pi底物來開始反應(yīng)。60-90min后用Tecan讀板儀以360nm的激發(fā)波長和465nm的發(fā)射波長進(jìn)行測定。劑量-活性圖和半最大抑制常數(shù)(IC50值)利用GraphPadPrism軟件(4.02版本)確定。實(shí)施例6通過hTFPIDl變體抑制纖維蛋白溶解在體外纖維蛋白溶解模型中檢測了hTFPIDl變體的作用，且與Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)的作用進(jìn)行比較。將人檸檬酸鹽血漿與0.13pM組織因子(TF)和164U/ml組織纖維蛋白溶酶原激活物(tPA)混合，并將其再與不同濃度的hTFPIDl變體或牛胰蛋白酶抑制劑(0.06^M到15pM)混合，于37。C下培養(yǎng)40min。以生理鹽水為對照。用TecanSafire通過測定光密度(OD405nm)確定因TF所形成的血塊和接下來因tPA造成的血塊溶解。計(jì)算所得的曲線下面積(areaunderthecurve(AUC))并將其相對于底物濃度作圖。AUC的降低表明纖維蛋白溶解抑制。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將纖維蛋白溶解定義為血塊形成后OD的相對降低。利用OD的相對降低可對抗纖維蛋白溶解活性進(jìn)行量度。TFPImut3EA和TFPImut4EA的抗纖維蛋白溶解活性與Trasylol相當(dāng)。實(shí)施例7通過hTFPIDl變體抑制凝固(coagulation)在體外凝固模型中檢測了hTFPIDl變體的作用，且與Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)的作用進(jìn)行比較。將人檸檬酸鹽血漿與12mMCaCl2混合誘導(dǎo)凝固，并將其與不同濃度的hTFPIDl變體或牛胰蛋白酶抑制劑(0.1pM到25pM)混合。以生理鹽水為對照。在37。C下90min的培養(yǎng)過程中，確定405nm下的OD值，將其作為凝固的量度。計(jì)算半最大凝固時間。半最大凝固時間的延長意味著凝固抑制。與Trasylol相比，TFPImut3EA的抗凝固活性提高，TFPImut4EA的抗凝固活性稍有提高。實(shí)施例8TFPID1變體在大鼠出血模型中的止血作用用聚乙烯導(dǎo)管對經(jīng)麻醉的大鼠的兩頸靜脈進(jìn)行插管。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，為延長正常的出血時間，向大鼠注入tPA(組織纖維蛋白溶酶激活物)(8mg/kg/h)。開始輸注tPA后10min，通過輸注hTFPIDl變體或Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)，或者通過結(jié)合推注(bolus)施用以及接下來的保持輸注(maintenanceinfusion)對大鼠進(jìn)行處理。在第一次實(shí)驗(yàn)中，以6mg/kg/h的劑量連續(xù)輸注TFPImut3EA或Trasylol。在第二次實(shí)驗(yàn)中，以1.5mg/kg(推注)和3mg/kg/h(輸注)的劑量用TFPImut4EA或Trasylol處理實(shí)驗(yàn)動物，上述劑量最高為5mg/kg和10mg/kg/h。兩次實(shí)驗(yàn)中均以生理鹽水作為對照。在開始輸注后15min,將尾(2mm)橫切，將尾尖浸沒在37°C下的生理鹽水中測定出血時間。出血時間定義為4黃切到可見出血終止之間的時間間隔。出血時間的縮短可對止血作用進(jìn)行量度。TFPImut3EA和TFPImut4EA的止血作用與Trasylol相當(dāng)。實(shí)施例9TFPImut4EA在大鼠動靜脈(AV)短路才莫型中的抗血栓作用利用大鼠動靜脈短路模型研究了TFPImut4EA的抗血栓作用。用聚乙烯導(dǎo)管對經(jīng)麻醉的大鼠的頸動脈和頸靜脈進(jìn)行插管，所述的導(dǎo)管之間通過小段的管(支路)連接在一起。粗糙的尼龍環(huán)引入上述管中作為凝血酶原的表面。血液通過上述支路在體外循環(huán)15min之后形成血栓。所得的血栓從管線中去除，確定血栓的重量。通過推注施用以及接下來的保持輸注TFPImut4EA或Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)處理大鼠。應(yīng)用劑量為0.15mg/kg(推注)和0.3mg/kg/h(輸注)，上述劑量最高為5mg/kg和10mg/kg/h。以生理鹽水作為對照。用血栓重量的減少對抗血栓效果進(jìn)行量度。TFPImut4EA的抗血栓作用與Trasylol相當(dāng)。實(shí)施例10Trasylol和TFPImut4EA對大鼠中相對的腸系膜出血時間的影響Wistar大鼠(250-300g)腹膜內(nèi)麻醉(硫噴妥鈉，100mg/kg)并進(jìn)行靜脈插管。打開腹部后，將一段小腸移到外面。一邊用溫鹽水溶液沖洗，一邊在立體顯微鏡下借助于顯微手術(shù)剪割取一小段腸系膜動脈。測定了施用底物前的三個對照切口(cut)和施用實(shí)-驗(yàn)底物后的一個切口的出血時間。逐一地將各動物用底物處理后的出血時間和施用底物前的對照出血時間相關(guān)聯(lián)。Trasylol以劑量依賴的方式減少腸系膜出血時間(圖11)。以推注1.5mg/kg以及隨后輸注(3mg/kg/h)施用Trasylol對出血時間沒有明顯的影響。更高的5mg/kg劑量推注以及10或30mg/kg/h$餘注可以相應(yīng)地減少出血時間28.5±7.4%和42.7±4.2%。TFPImut4EA(圖12)以與Trasylol類似的方式減少腸系膜出血時間。推注5mg/kgTFPImut4EA以及輸注10mg/kg/h可以使出血時間減少23.6%。最好的效果是在推注5mg/kgTFPImut4EA以及輸注30mg/kg/h的施用后觀察到的。這種劑量之下TFPImut4EA可將出血時間減少31.7%。實(shí)施例11在經(jīng)麻醉的大鼠中研究hTFPIDl變體對心血管系統(tǒng)的作用用戊巴比妥Na麻醉大鼠。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自主呼吸，并通過加熱墊保持體溫恒定。利用壓力傳感器和壓力測量橋經(jīng)由頸動脈內(nèi)的導(dǎo)管測量動脈血壓。通過3個標(biāo)準(zhǔn)末端導(dǎo)聯(lián)(standardextremityleads)由ECG放大器記錄ECG。通過軟件獲得評價并且儲存獲得的測定信號。由血壓信號計(jì)算收縮、舒張和平均血壓以及心率。實(shí)驗(yàn)后對ECG進(jìn)行了另外的人工評估和核定。有另外的血壓和ECG信號的類似記錄。在安裝了導(dǎo)管并和流動階段(coursephrase)(恒定血壓和心率)之后，靜脈內(nèi)推注或連續(xù)輸注施用TFPImut3EA或TFPImut4EA。既定的觀察階段過后，通過過量施用麻醉劑殺死動物結(jié)束實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例12hTFPIDl變體對IL-8-和C5a-誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化性的抑制通過常規(guī)的方法從血液中分離嗜中性粒細(xì)胞。在兩室系統(tǒng)(two-chambersystem)進(jìn)行嗜中性粒細(xì)胞的趨化性實(shí)驗(yàn)。在所用的膜(3卞m孔大小，聚碳酸酯，F(xiàn)alcon制)上對HUVEC單細(xì)胞層培養(yǎng)24小時。RPMI1640培養(yǎng)基中的1x105嗜中性粒細(xì)胞置于上層小室(upperchamber)中，所述的培養(yǎng)基中事先加入了熒光染料。下層小室(lowerchamber)中包含不同濃度的刺激物，或恒定濃度的刺激物(IL-8:5nM或C5a:10nM)和不同濃度的實(shí)驗(yàn)底物Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)、TFPImut3EA或TFPImut4EA。有待研究的物質(zhì)存在于兩個小室中。將實(shí)驗(yàn)混合物在37。C、5。/oC02的條件下培養(yǎng)45min。實(shí)驗(yàn)后，確定遷移到下層小室的細(xì)胞(熒光測定，記數(shù))。實(shí)施例13hTFPIDl變體對CAP-37-誘導(dǎo)的通透性增加的抑制將匯合成片的HUVEC單細(xì)胞層在兩室系統(tǒng)(Falcon)中的插入物(insert)的膜上進(jìn)行培養(yǎng)。為此，每片插入物上接種2x105細(xì)胞、培養(yǎng)(37。C/50/。CO2)18-20小時。開始實(shí)驗(yàn)前，通過結(jié)合臺盼藍(lán)的白蛋白溶液檢測了所述單細(xì)胞層的連續(xù)性。然后將CAP37(5^M)置于上層小室。3個小時中，在不同濃度(IOpM-O.OlpM)的實(shí)驗(yàn)物質(zhì)Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)，TFPImut3EA或TFPImut4EA存在下確定通透性的改變。在上述情況下，結(jié)合了臺盼藍(lán)的白蛋白溶液的流出作為通透性改變的指示。在590nm下測定OD值。參考文獻(xiàn)Apeleretal.[2004]Apeler[2005〗Bajajetal.[2001]Beierleinetal.[2005〗Blauhutetal.[腦]BodeundHuber[1992]Brozeetal,[1987]Dennisetal.[1995]Dietrichetal.[2001]Dietrichetal.[1995]FritzundWunderer[1983]Girardetal.[l卿〗Hess[2005]Krowarschetal.[2005]LaskowskiundKato[1980]Lindahl[1997]LwaleedundBass[2005]Marklandetal.[1996a〗Marldandetal.[1996b]Novotnyetal.[1989]Otlewskietal.[2001]Petersenetal.[1996]Royston[1992]Schecl加rundBerger[1967]Sprecheretal.〖1994]Wunetal.[1988]Apeler,H.etal.(2004).Arzneimittelforschung54,483-497.■Apeler,H.in:J.Knablein(Ed.),ModernBiopharma-ceuticals,WILEY-VHC，Weinheim,2005,pp.1021-1032Bajaj，M.S.(2001).ThrombHaemost86,959-972.Beierlein,W.etal,(2005).AnnThoracSurg79,741-748.Bauhut'B.etal.(1991).JThoracCardiovascSurg101，958-967.Bode,W.,undHuber,R.(1992).EurJBiochem204,433-451.Broze，G.J.etal.(1987).ThrombRes48,253-259.Dennis,M.S.etal.(1995).JBiolChem270,25411-25417.Dietrich,W.etal.(2001).Anesthesiology95,64-71.Dietrich,W.etal.(1995).Anesthesiology83,679>689.Fritz,H.，undWunderer,G.(19$3),Arzneimittelforschung33,479494.Girard,TJ.etal.(1989).Nature388,518-520,Hess,P.J.Jr(2005).A邁JHealthSystPharm62(18Suppl4),6-9.Krowarsch,D.etal.(2005).ProteinPeptLett12,403^407.Laskowski,M.,undKato,I.(1980).AnnRevBiochem49,593-626.Lindahl,A.K.(1997).CardiovascRes33,286-291.Lwaleed,B.A.,undBass'P.S.(2005).JPathol,DOI:10.1002/path.l871Markland,W.etal.(1996).Biochemistry35,8045-8057.Markland,W.etal.(1996).Biochemistry35,8058-8067.Novotny,W.F.etal.(1989).JBiolChem264,18832-18837.Otlewski,J.etal.(2001).ActaBiochimPol48,419428.Petersen,L.C.etal.(1996).EurJBiochem235,310-316.Royston,D.(1992).JCardiothoracVaseAnesth6,76-100.Schechter,I.,undBerger,A.(1967).Biochem.Biophys.Res.Commun.27,157-162.Sprecher,C.A.(1994).ProcNatlAcadSciUSA91,3353-3357.Wun,T,C.etal.(1988).JBiolChem263,6001-6004.縮寫說明AUC曲線下面積BPTI牛胰蛋白酶抑制物DIC彌漫性血管內(nèi)凝血DNA脫氧核糖核酸ECG心電圖HepG2人肝癌細(xì)胞系HPLC高效液相色i普hTFPI人組織因子途徑抑制物1hTFPIDl人組織因子途徑抑制物1Kunitz結(jié)構(gòu)域1HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IC50抑制50%酶活性的抑制物濃度IL-8白細(xì)胞介素-8i.v.靜脈內(nèi)kDa千道爾頓LACI脂蛋白相關(guān)的促凝劑抑制物M摩爾(mo1/1)Min分鐘MOF多器官衰竭(multiorganfailure)OD吸收(Absorption)PEG聚乙二醇PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Rpm每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)TF組織因子TFA三氟乙酸TPA組織纖維蛋白溶酶原激活物U單位(酶活單位)圖1表示本發(fā)明的一些優(yōu)選的hTFPIDl變體的氨基酸序列，以及牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)和hTFPIDl的序列。圖2表示Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)和本發(fā)明的變體TFPImut3EA(SeqNo.19)在人血漿(體外)對纖維蛋白溶解的作用。圖3表示Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)和本發(fā)明的變體TFPImut3EA(SeqNo.19)在人血漿中(體外)對凝固的作用。圖4表示大鼠中Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)和本發(fā)明的變體TFPImut3EA(SeqNo.19)在TPA(體內(nèi))存在下對出血時間的作用。圖5表示克隆到載體pIU10.10.W中的合成的hTFPIDl結(jié)構(gòu)域(hTFPIDl,粗體)的核香酸序列，以及推定的氨基酸序列。用于亞克隆的限制酶(BsaBI，Xhol)的識別序列用下劃線標(biāo)識。圖6表示表示克隆到載體pIU3.12.M中的合成的hTFPIDl結(jié)構(gòu)域(hTFPIDl,粗體)的核苷酸序列，以及推定的氨基酸序列。用于亞克隆的限制酶(HindIII,BamHI)的識別序列用下劃線標(biāo)識，PCRS1物用灰色背景標(biāo)識出。圖7表示Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)和本發(fā)明的TFPImut4EA變體(SeqNo.20)在人血漿中(體夕卜)對纖維蛋白溶解的作用。.圖8表示Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)和本發(fā)明的TFPImut4EA變體(SeqNo.20)在人血漿中(體外)對凝固的作用。圖9表示大鼠中Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)和本發(fā)明的TFPImut4EA變體(SeqNo.20)在TPA存在下(體內(nèi))對出血時間的作用。圖10表示在大鼠動靜脈(AV)短路模型中，Trasylol(牛胰蛋白酶抑制劑)和本發(fā)明的TFPImut4EA變體對抗血栓的作用。圖11表示在大鼠中Trasylol對相對的腸系膜出血時間的作用。施用實(shí)驗(yàn)物質(zhì)后的出血時間與施用實(shí)驗(yàn)物質(zhì)前的平均對照出血時間相關(guān)聯(lián)。所述的數(shù)值以平均值±SEM，n-8表示。*顯著區(qū)別于載體，P〈0.05;***顯著區(qū)別于載體，P〈0.001。圖12表示本發(fā)明的TFPImut4EA變體對大鼠中腸系膜相對出血時間的作用。施用實(shí)驗(yàn)物質(zhì)后的出血時間與施用實(shí)驗(yàn)物質(zhì)前的平均對照出血時間相關(guān)聯(lián)。所述的凄丈值以平均值±SEM,n二8表示。**顯著區(qū)別于載體，P〈0.01;***顯著區(qū)別于載體，P〈0.001。圖13表示本發(fā)明的TFPImut4EA變體對IL-8-誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞趨化性的抑制。圖14表示本發(fā)明的TFPImut4EA變體對CAP-37-誘導(dǎo)的通透性增加的抑制。表lKunitz結(jié)構(gòu)域的定義X21=Phe,Tyr，TrpX22-Tyr,Phe,Ttp,HisX23-Tyr或PheX35-Tyr，Phe,SerX36=Gly,Ser,Arg,ThrX40=Gly,Ala,ArgX43=Asn或GlyX45=Phe或Tyr氨基酸1,2,3,4可以沒有氨基酸56,57,58可以;殳有表2:一些天然Kunitz結(jié)構(gòu)域的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表3:—些非天然Kimitz結(jié)構(gòu)域的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表4:一些用于抑制人胰蛋白酶，纖維蛋白溶酶和血漿激肽釋放酶的Kunitz結(jié)構(gòu)域的IC50值<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>可由來自hTFPIDl的相應(yīng)氨基酸替換的、天然或非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域的抑制活性區(qū)域的氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權(quán)利要求1.如下述通式所示的hTFPID1變體MHSFCAFKAX10X11GPCX15X16X17X18X19X20X21X22FNIFTRQCEEFIYGGCEGNQNRFESLEECKKMCTRD所述的hTFPID1變體與天然序列相比在X10，X11，X15，X16，X17，X18，X19，X20，X21和X22位具有至少一個突變，其中X10是氨基酸D，E，Y，V或S，X11是氨基酸D或T，X15是氨基酸K，或R，X16是氨基酸A，X17是氨基酸I，R，S或A，X18是氨基酸M，I，F(xiàn)或H，X19是氨基酸K，I或P，X20是氨基酸R，X21是氨基酸F或W，和X22是氨基酸F或W序列SEQIDNo.1所示的肽TFPImut1除外。2.如權(quán)利要求l所述的肽，其N末端還包含氨基酸E和A。3.如權(quán)利要求l所述的肽，其選自SeqIDNo.3所示的TFPImutl3,SeqIDNo.4所示的TFPImut3,SeqIDNo.5所示的TFPImut4，SeqIDNo.7所示的TFPImut2,SeqIDNo.8所示的TFPImut5,SeqIDNo.9所示的TFPImut6，SeqIDNo.10所示的TFPIrandom,SeqIDNo.11所示的TFPImut7,SeqIDNo.12所示的TFPImut8，SeqIDNo.13所示的TFPImut9,SeqIDNo.14所示的TFPImutlO,SeqIDNo.15所示的TFPImutll,和SeqIDNo.16所示的TFPImut12。4.權(quán)利要求2所述的肽，其選自SeqNo.17所示的TFPImutl5，SeqNo.18所示的TFPImutl3EA,SeqNo.19所示的TFPImut3EA，SeqNo.20所示的TFPImut4EA,SeqNo.21所示的TFPImut2EA，SeqNo.22所示的TFPImut5EA，SeqNo.23所示的TFPImut6EA，SeqNo.24所示的TFPIrandomEA，SeqNo.25所示的TFPImut7EA,SeqNo.26所示的TFPImut8EA,SeqNo.27所示的TFPImut9EA,SeqNo.28所示的TFPImutlOEA,SeqNo.29所示的TFPImutllEA,SeqNo.30所示的TFPImutl2EA，和SeqNo.31所示的TFPImutl5EA.5.編碼權(quán)利要求1-4所述的肽的DNA。6.包含權(quán)利要求5所述DNA的載體。7.包含權(quán)利要求5所述DNA的孩i生物。8.通過表達(dá)權(quán)利要求5所述的微生物制備權(quán)利要求l-4所述的肽的方法。9.包含一種或以上的權(quán)利要求l-4所述肽的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及具有天然和非天然Kunitz結(jié)構(gòu)域的、人組織因子抑制物結(jié)構(gòu)域1的嵌合體，其制備方法以及其用途。文檔編號C12N1/19GK101395274SQ200780007877公開日2009年3月25日申請日期2007年3月1日優(yōu)先權(quán)日2006年3月8日發(fā)明者A·哈倫加,F·奧梅,F·迪特默,H·阿佩勒,J·倫茨,J·弗蘭茨,M·斯帕澤爾,S·格雷芬申請人:拜耳醫(yī)藥保健股份公司