專利名稱：用于肺癌的診斷、預(yù)后和治療的基于微小rna的方法和組合物的制作方法
發(fā)明人Carlo M.Croce，Nozomu Yanaihara和Curtis C.Harris
政府資助
本發(fā)明全部或部分由來自CCR/NCI/NIH的基金CA76259和校內(nèi)基金資助，也依照合同號(hào)NO1-CO-12400由來自NCI/NIH的聯(lián)邦基金資助。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
在世界范圍內(nèi)，肺癌造成比任何其它形式的癌癥更多的死亡(Goodman，G.E.，Thorax 57994-999(2002))。在美國(guó)，肺癌是男性和女性癌癥死亡的主要原因。在2002年，肺癌死亡率估計(jì)是134,900例。肺癌也是所有歐洲國(guó)家癌癥死亡的主要原因，肺癌-相關(guān)死亡的數(shù)目在發(fā)展中國(guó)家也快速增加。
無論在診斷時(shí)的疾病階段，所有肺癌患者的五年生存率僅是約13％。這與在該疾病仍然在局部時(shí)檢測(cè)出的病例的46％的五年生存率形成對(duì)比。但是，在該疾病已經(jīng)擴(kuò)散之前，僅16％的肺癌被發(fā)現(xiàn)。早期檢測(cè)是困難的，因?yàn)樵谠摷膊∫呀?jīng)達(dá)到晚期之前經(jīng)常觀察不到臨床癥狀。目前，使用胸部X線、痰中含有的細(xì)胞類型的分析和支氣管氣道的纖維光學(xué)檢查來輔助診斷。治療方案由癌癥的類型和階段決定，包括手術(shù)、放療和/或化療。盡管對(duì)該癌癥和其它癌癥的治療進(jìn)行了大量研究，肺癌仍然難以有效地診斷和治療。因此，非常需要改進(jìn)的檢測(cè)和治療這些癌癥的方法。
Carbone，J.Clin.Oncol.233219-3226(2005)；Granville和Dennis，Cell Mol.Biol.32169-176(2005))。例如，p53和RB/p16途徑中的缺陷是肺癌中常見的。幾個(gè)其它的基因，例如K-ras，PTEN，F(xiàn)HIT和MY018B，在肺癌中發(fā)生遺傳改變，盡管頻率更低(Minna等人，CancerCell 149-52(2002)；Sekido等人，Annu.Rev.Med.5473-87(2003)；Yokota和Kohno，Cancer Sci.95197-204(2004))。盡管對(duì)已知的基因和蛋白的關(guān)注已經(jīng)產(chǎn)生了有用的信息，以前未知的肺癌標(biāo)記也可以導(dǎo)致對(duì)肺癌生物學(xué)的洞察。
微小RNA(miRNA)是通過與信使RNA(mRNA)靶雜交并引發(fā)對(duì)它的翻譯抑制或較不常見地引起其降解來控制基因表達(dá)的一類小的非編碼RNA。miRNA的發(fā)現(xiàn)和研究已揭示在生物發(fā)育和各種細(xì)胞過程例如細(xì)胞分化、細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用的miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控機(jī)制(Cheng，A.M.，等人，Nucleic Acids Res.331290-1297(2005))。近年來的研究表明，特定miRNA的異常表達(dá)可參與人的疾病，例如神經(jīng)障礙(Ishizuka，A.，等人，Genes Dev.162497-2508(2002))和癌癥。具體地，已在人慢性淋巴細(xì)胞性白血病中發(fā)現(xiàn)miR-16-1和/或miR-15a的不當(dāng)表達(dá)(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9915524-15529(2002))。
含有所有已知的人微小RNA的微陣列的開發(fā)和應(yīng)用，已經(jīng)允許同時(shí)分析樣品中每種miRNA的表達(dá)(Liu，C.G.等人，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.1019740-9744(2004))。這些微小RNA微陣列不僅已經(jīng)用于證實(shí)miR-16-1在人CLL細(xì)胞中失調(diào)，而且用于產(chǎn)生與明確定義的人CLL的臨床病理學(xué)特征有關(guān)的miRNA表達(dá)特征(Calin，G.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1011175-11760(2004))。
對(duì)在肺癌細(xì)胞中差異表達(dá)的微小RNA的鑒定，會(huì)輔助診斷、預(yù)測(cè)和治療肺癌。此外，對(duì)這些miRNA的推定靶的鑒定，會(huì)輔助解釋它們的致病作用。本發(fā)明提供了用于肺癌的診斷、預(yù)后和治療的新的方法和組合物。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地基于與肺癌細(xì)胞中改變的表達(dá)水平有關(guān)的特定miRNA的鑒定。
因此，本發(fā)明包括診斷受試者是否患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，將受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比較。與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變(例如增加，降低)，指示著受試者患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a和let-7f-1。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-155，miR-210，miR-126*和miR-224。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-205和miR-216。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-155，miR-210，miR-126*，miR-126，miR-24-2，miR-219-1，miR-95，miR-192-prec，miR-220，miR-216-prec，miR-204-prec，miR-188，miR-198，miR-145和miR-224。
使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的眾多技術(shù)(例如，定量或半定量RT-PCR，RNA印跡分析，溶液雜交檢測(cè))，可以測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，如下測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，使所述靶寡脫氧核苷酸與一種或多種miRNA-特異性探針寡核苷酸(例如，包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列)雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜，并對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜。測(cè)試樣品中至少一種miRNA的信號(hào)相對(duì)于對(duì)照樣品的變化指示著受試者患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)所有已知人miRNA的實(shí)質(zhì)部分的miRNA-特異性探針寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)選自下述的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a和let-7f-1。
本發(fā)明也提供了確定患有肺癌的受試者的預(yù)后的方法，其包括測(cè)量在來自受試者的測(cè)試樣品中與肺癌不良預(yù)后有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。根據(jù)這些方法，與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中與不良預(yù)后有關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著不良預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-155，miR-17-3p，miR-106a，miR-93，let-7a-2，miR-145，let-7b，miR-20和miR-21。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-155和let-7a-2。
可以如本文所述(例如定量或半-定量RT-PCR，RNA印跡分析，溶液雜交檢測(cè)，微陣列分析)，測(cè)量所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與對(duì)照樣品相比，測(cè)試樣品中至少一種miRNA的信號(hào)的改變，指示著受試者患有不良預(yù)后的肺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，miR-125a、miR-125b-1、miR-224和/或miR-21的信號(hào)的改變，指示著受試者患有不良預(yù)后的肺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，來自患有肺腺癌的受試者的樣品中miR-155和/或let-7a-2信號(hào)的改變，指示著不良預(yù)后。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)選自下述的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a和let-7f-1。
本發(fā)明也包括治療受試者的肺癌的方法，其中受試者的癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)，增量調(diào)節(jié))。當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在肺癌細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括，施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。
在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，治療受試者的肺癌的方法另外包括下述步驟首先測(cè)定受試者肺癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量，并將所述miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照細(xì)胞中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相對(duì)比。如果肺癌細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物的表達(dá)失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)，增量調(diào)節(jié))，該方法另外包括，改變?cè)诜伟┘?xì)胞中表達(dá)的所述至少一種miR基因產(chǎn)物的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量小于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的所述miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段施用給受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量大于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，并將有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因的表達(dá)的化合物施用給受試者。
本發(fā)明另外提供了用于治療肺癌的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞在肺癌細(xì)胞中具有降低的表達(dá)水平的miR基因產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，所述分離的miR基因產(chǎn)物選自miR-126*，miR-143，miR-192，miR-224，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-9，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216，miR-219-1，miR-125a，miR-26a-1，miR-199b，let-7a-2，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c，miR-101-1，miR-124a-3，let-7f-1和其組合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種抑制miR表達(dá)的化合物。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述至少一種抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)大于對(duì)照細(xì)胞的miR基因產(chǎn)物是特異性的。在某些實(shí)施方案中，所述抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)一種或多種選自下述的miR基因產(chǎn)物是特異性的miR-21，miR-191，miR-210，miR-155，miR-205，miR-24-2，miR-212，miR-214，miR-17-3p，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-146，miR-203，miR-150和其組合。
本發(fā)明也包括鑒定抗肺癌劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，和測(cè)量細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，和測(cè)量與肺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對(duì)照細(xì)胞相比，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的增加，指示著測(cè)試試劑是抗肺癌劑。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，與肺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-126*，miR-143，miR-192，miR-224，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-9，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216，miR-219-1，miR-125a，miR-26a-1，miR-199b，let-7a-2，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c，miR-101-1，miR-124a-3，let-7f-1和其組合。
在其它實(shí)施方案中，該方法包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，和測(cè)量與肺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對(duì)照細(xì)胞相比，與肺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平的降低，指示著測(cè)試試劑是抗肺癌劑。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，與肺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-210，miR-155，miR-205，miR-24-2，miR-212，miR-214，miR-17-3p，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-146，miR-203，miR-150和其組合。
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圖1顯示的圖描繪了通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析測(cè)得的肺癌(Ca)和非癌(N)組織中人miR-21前體(hsa-mir-21；上圖)、人miR-126*前體(hsa-mir-126*；中圖)和人miR-205前體(hsa-mir-205；下圖)的相對(duì)表達(dá)水平。癌樣品是腺癌或鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，以確定肺癌組織和非癌肺組織中的表達(dá)水平之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
圖2描述了通過溶液雜交測(cè)得的肺癌樣品(即，腺癌(Adeno)和鱗狀細(xì)胞癌(SCC))中miR-21(hsa-mir-21)、miR-126*(hsa-mir-126*)和miR-205(hsa-mir-205)的成熟miRNA的表達(dá)。Ca代表癌性的肺組織，N代表非癌肺組織。5S rRNA用作加樣對(duì)照。
圖3A的樹狀圖描繪了基于代表小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的13個(gè)肺癌細(xì)胞系的微小RNA表達(dá)譜的分級(jí)聚類。
圖3B描述了與圖3A所列出的那些相對(duì)應(yīng)的13個(gè)肺癌細(xì)胞系(頂部)的miRNA表達(dá)簇視圖。根據(jù)顏色指示在圖右側(cè)列出的不同miRNA的表達(dá)水平。藍(lán)色指示低于中值的表達(dá)水平，黑色指示大約與中值相等的表達(dá)水平，橙色指示大于中值的表達(dá)水平?；疑甘救鄙俚臄?shù)據(jù)點(diǎn)。
圖4是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲線。根據(jù)hsa-mir-155表達(dá)，將其中雜交強(qiáng)度不同于背景的腺癌病例(參見實(shí)施例4)分類，并使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比存活數(shù)據(jù)。將平均表達(dá)比定義為，平均表達(dá)比＝腫瘤表達(dá)的平均值/非癌組織表達(dá)的平均值。將hsa-mir-155高表達(dá)組(即，表達(dá)比≥平均表達(dá)比(1.42)的組；n＝27)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。將hsa-mir-155低表達(dá)組(即，表達(dá)比<平均表達(dá)比(1.42)的組；n＝28)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。所述比例代表相對(duì)于非癌對(duì)照的肺癌樣品中的雜交信號(hào)強(qiáng)度。
圖5是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲線。根據(jù)hsa-let-7a-2表達(dá)，將其中雜交強(qiáng)度不同于背景的腺癌病例(參見實(shí)施例4)分類，并使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比存活數(shù)據(jù)。將平均表達(dá)比定義為，平均表達(dá)比＝腫瘤表達(dá)的平均值/非癌組織表達(dá)的平均值。將hsa-let-7a-2高表達(dá)組(即，表達(dá)比≥平均表達(dá)比(0.95)的組；n＝34)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。將hsa-let-7a-2低表達(dá)組(即，表達(dá)比<平均表達(dá)比(0.95)的組；n＝18)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。
圖6是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲線。根據(jù)前體hsa-miR-155表達(dá)，將來自一個(gè)原始組群的32個(gè)腺癌病例分類，并使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比存活數(shù)據(jù)。將平均表達(dá)比定義為，平均表達(dá)比＝腫瘤表達(dá)的平均值/非癌組織表達(dá)的平均值。將前體hsa-miR-155高表達(dá)組(即，表達(dá)比≥平均表達(dá)比(1.19)的組；n＝13)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。將前體hsa-miR-155低表達(dá)組(即，表達(dá)比<平均表達(dá)比(1.19)的組；n＝19)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。
圖7是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲線。根據(jù)前體hsa-let-7a-2表達(dá)，將來自一個(gè)原始組群的32個(gè)腺癌病例分類，并使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比存活數(shù)據(jù)。將平均表達(dá)比定義為，平均表達(dá)比＝腫瘤表達(dá)的平均值/非癌組織表達(dá)的平均值。將前體hsa-let-7a-2高表達(dá)組(即，表達(dá)比≥平均表達(dá)比(0.92)的組；n＝18)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。將前體hsa-let-7a-2低表達(dá)組(即，表達(dá)比<平均表達(dá)比(0.92)的組；n＝14)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。
圖8是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲線。根據(jù)前體hsa-let-7a-2表達(dá)，將來自一個(gè)獨(dú)立的額外組群的32個(gè)腺癌病例分類，并使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比存活數(shù)據(jù)。前體hsa-mir-155高表達(dá)組(n＝14)；前體hsa-mir-155低表達(dá)組(n＝18)。
圖9是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲線。根據(jù)前體hsa-let-7a-2表達(dá)，將來自一個(gè)獨(dú)立的額外組群的32個(gè)腺癌病例分類，并使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比存活數(shù)據(jù)。前體hsa-let-7a-2高表達(dá)組(n＝15)；前體hsa-let-7a-2低表達(dá)組(n＝17)。
圖10是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲線。根據(jù)如通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析所估計(jì)的前體hsa-mir-155表達(dá)，將來自2個(gè)獨(dú)立組群組合的64個(gè)腺癌病例分類。使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比存活數(shù)據(jù)。將平均表達(dá)比定義為，平均表達(dá)比＝腫瘤表達(dá)的平均值/非癌組織表達(dá)的平均值。將前體hsa-miR-155高表達(dá)組(即，表達(dá)比≥平均表達(dá)比(1.19)的組；n＝27)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。將前體hsa-miR-155低表達(dá)組(即，表達(dá)比<平均表達(dá)比(1.19)的組；n＝37)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。
圖11是腺癌患者的Kaplan-Meier存活曲線。根據(jù)如通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析所估計(jì)的前體hsa-let-7a-2表達(dá)，將來自2個(gè)獨(dú)立組群組合的64個(gè)腺癌病例分類。使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比存活數(shù)據(jù)。將平均表達(dá)比定義為，平均表達(dá)比＝腫瘤表達(dá)的平均值/非癌組織表達(dá)的平均值。將前體hsa-let-7a-2高表達(dá)組(即，表達(dá)比≥平均表達(dá)比(0.92)的組；n＝33)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。將前體hsa-let-7a-2低表達(dá)組(即，表達(dá)比<平均表達(dá)比(0.92)的組；n＝31)與相應(yīng)的非癌肺組織相對(duì)比。
圖12描述了在2個(gè)肺癌細(xì)胞系(H157，A549)中用5-氮雜-dC和/或TSA處理后MY018BmRNA的表達(dá)，如通過RT-PCR分析所測(cè)得的。泳道1，無處理；泳道2，用1.0μM5-氮雜-dC處理72小時(shí)；泳道3，用1.0μMTSA處理24小時(shí)；泳道4，用1.0μM5-氮雜-dC處理72小時(shí)，隨后用1.0μM TSA處理24小時(shí)。GAPDH表達(dá)用作加樣對(duì)照。
發(fā)明詳述 本發(fā)明部分地基于，與正常的對(duì)照細(xì)胞相比，在肺癌細(xì)胞中具有改變的表達(dá)的特定miRNA的鑒定，也基于這些微小RNA與特定診斷、預(yù)后和治療特征的關(guān)聯(lián)。
如本文中互換使用的，＂miR基因產(chǎn)物，＂微小RNA，＂＂miR，＂或＂miRNA＂是指來自miR基因的未加工的或加工過的RNA轉(zhuǎn)錄物。由于miR基因產(chǎn)物不翻譯成蛋白，術(shù)語＂miR基因產(chǎn)物＂不包括蛋白。未加工的miR基因轉(zhuǎn)錄物也稱作＂miR前體＂，通常包含長(zhǎng)度為約70-100個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物。miR前體可以用RNA酶(例如，Dicer，Argonaut，或RNA酶III(例如，大腸桿菌RNA酶III))消化加工成有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子。該有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也稱作＂加工過的＂miR基因轉(zhuǎn)錄物或＂成熟的＂miRNA。
所述有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子可以通過天然加工途徑(例如，使用完整細(xì)胞或細(xì)胞裂解物)或通過合成加工途徑(例如，使用分離的加工酶，例如分離的Dicer，Argonaut，或RNA酶III)從miR前體得到。應(yīng)當(dāng)理解，所述有活性的19-25個(gè)核苷酸的RNA分子也可以通過生物或化學(xué)合成直接生成，不必從miR前體加工。當(dāng)在本文中用名稱提及微小RNA時(shí)，該名稱對(duì)應(yīng)著前體和成熟形式兩者，除非另有說明。
本發(fā)明包括診斷受試者是否患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括測(cè)量來自受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，并將測(cè)試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相對(duì)比。如本文所用的，“受試者”可以是患有或被懷疑患有肺癌的任意哺乳動(dòng)物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者是患有或被懷疑患有肺癌的人。
所述肺癌可以是任意形式的肺癌，例如，不同組織學(xué)的肺癌(例如腺癌，鱗狀細(xì)胞癌)。此外，所述肺癌可以伴隨特定預(yù)后(例如低生存率，快速進(jìn)展)。
表1a和1b描述了特定的前體和成熟人微小RNA的核苷酸序列。
表1a-人微小RNA前體序列。
*前體序列中加下劃線的序列對(duì)應(yīng)于成熟的加工過的miR轉(zhuǎn)錄物(參見表1b)。有些前體序列具有2個(gè)加下劃線的序列，它們表示源自相同前體的2種不同的成熟miR。所有序列都是人的。
表1b-人成熟微小RNA序列。
可以測(cè)量從受試者得到的生物樣品的細(xì)胞中的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，通過常規(guī)活檢技術(shù)，可以從被懷疑患有肺癌的受試者取出組織樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以從受試者取出血液樣品，并通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，分離白細(xì)胞用于DNA提取。優(yōu)選地，在放療、化療或其它治療性處理之前，從受試者得到血液或組織樣品。相應(yīng)的對(duì)照組織或血液樣品或?qū)φ諈⒄諛悠?，可以從受試者的未受影響的組織、從正常人個(gè)體或正常個(gè)體的群體、或從與受試者樣品中大多數(shù)細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞得到。然后與來自受試者的樣品一起，加工處理對(duì)照組織或血液樣品，從而可以將來自受試者樣品的細(xì)胞中從給定miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來自對(duì)照樣品的細(xì)胞的相應(yīng)miR基因產(chǎn)物水平相對(duì)比。或者，可以與測(cè)試樣品單獨(dú)分開地得到和加工處理參照樣品(例如在不同時(shí)間)，并將來自測(cè)試樣品的細(xì)胞中從給定miR基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的水平與來自參照樣品的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物水平相對(duì)比。
在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被“增量調(diào)節(jié)”)。如本文使用的，當(dāng)來自受試者的細(xì)胞或組織樣品中miR基因產(chǎn)物的量大于對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)物的量時(shí)，該miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被＂增量調(diào)節(jié)＂。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中的相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平(即，miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被＂減量調(diào)節(jié)＂)。如本文使用的，當(dāng)從來自受試者的細(xì)胞或組織樣品的基因產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物的量小于從對(duì)照細(xì)胞或組織樣品中相同基因產(chǎn)生的量時(shí)，該miR基因產(chǎn)物的表達(dá)被＂減量調(diào)節(jié)＂?？梢韵鄬?duì)于一種或多種RNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定對(duì)照和正常樣品中的相對(duì)miR基因表達(dá)。所述標(biāo)準(zhǔn)可包括，例如，零miR基因表達(dá)水平，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系中的miR基因表達(dá)水平，受試者的未受影響的組織中的miR基因表達(dá)水平，或以前對(duì)正常人對(duì)照群體得到的miR基因表達(dá)的平均水平。
與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，從受試者得到的樣品中miR基因產(chǎn)物水平的改變(即，增加或降低)，指示著受試者中存在肺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a和let-7f-1。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-205和miR-216。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-155，miR-210，miR-126*和miR-224. 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是下述的一種或多種let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
使用適用于檢測(cè)生物樣品中的RNA表達(dá)水平的任意技術(shù)，可以測(cè)量樣品中miR基因產(chǎn)物的水平。用于測(cè)定生物樣品(例如，細(xì)胞，組織)中RNA表達(dá)水平的合適技術(shù)(例如，RNA印跡分析，RT-PCR，原位雜交)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用RNA印跡分析，檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。例如，可以如下從細(xì)胞純化總細(xì)胞RNA在有核酸提取緩沖液存在下勻漿，隨后離心。沉淀核酸，通過用DNA酶處理和沉淀，去除DNA。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過瓊脂糖凝膠上的凝膠電泳分離RNA分子，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜。然后通過加熱，將RNA固定化在濾膜上。使用與目標(biāo)RNA互補(bǔ)的適當(dāng)標(biāo)記的DNA或RNA探針，進(jìn)行對(duì)特定RNA的檢測(cè)和定量。參見，例如，Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook等人編，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapter7，其所有公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
從表1a和表1b中提供的核酸序列，可以生成適用于給定miR基因產(chǎn)物的RNA印跡雜交的探針(例如DNA探針，RNA探針)，包括、但不限于，與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互補(bǔ)性的探針，以及與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有完全互補(bǔ)性的探針。標(biāo)記的DNA和RNA探針的制備方法，和其與靶核苷酸序列的雜交的條件，描述在Molecular CloningA Laboratory Manual，J.Sambrook等人，編.，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapters 10和11，其所有公開內(nèi)容都通過參考引用并入本文。
例如，核酸探針用下述物質(zhì)標(biāo)記，例如，放射性核素，例如3H，32P，33P，14C，或35S；重金屬；能起到標(biāo)記配體的特異性結(jié)合對(duì)成員功能的配體(例如，生物素，抗生物素蛋白或抗體)；熒光分子；化學(xué)發(fā)光分子；酶等。
通過Rigby等人(1977)，J.Mol.Biol.113237-251的切口平移方法，或通過Fienberg等人(1983)，Anal.Biochem.1326-13的隨機(jī)引物法，可以將探針標(biāo)記成高比放射性，所述文獻(xiàn)的所有公開內(nèi)容都通過參考引用并入本文。后者是從單鏈DNA或從RNA模板合成高比放射性的32P-標(biāo)記的探針的選擇方法。例如，通過根據(jù)切口平移方法用高放射性的核苷酸替換現(xiàn)有的核苷酸，可以制備比放射性大大超過108cpm/微克的32P-標(biāo)記的核酸探針。然后通過使雜交的濾膜曝光于照相膠片，可以進(jìn)行雜交的放射自顯影檢測(cè)。對(duì)雜交的濾膜曝光的照相膠片的光密度掃描，會(huì)提供miR基因轉(zhuǎn)錄物水平的精確測(cè)量。使用另一個(gè)方案，通過計(jì)算機(jī)化成像系統(tǒng)，例如可從AmershamBiosciences，Piscataway，NJ得到的Molecular Dynamics 400-B 2D磷光計(jì)，可以定量miR基因轉(zhuǎn)錄物水平。
當(dāng)DNA或RNA探針的放射性核素標(biāo)記不可行時(shí)，隨機(jī)-引物方法可以用于將類似物例如dTTP類似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己?；?-3-氨基烯丙基)脫氧尿苷三磷酸摻入探針分子中。通過與生物素-結(jié)合蛋白(例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素和抗體(例如，抗-生物素抗體)，其偶聯(lián)到熒光染料或產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶上)的反應(yīng)，可以檢測(cè)生物素化的探針寡核苷酸。
除了RNA印跡和其它RNA雜交技術(shù)以外，使用原位雜交技術(shù)，可以測(cè)定RNA轉(zhuǎn)錄物的水平。該技術(shù)需要比RNA印跡技術(shù)更少的細(xì)胞，包括將整個(gè)細(xì)胞放置在顯微鏡蓋玻片上，用含有放射性的或其它標(biāo)記的核酸(例如，cDNA或RNA)探針的溶液探測(cè)細(xì)胞的核酸內(nèi)容物。該技術(shù)特別適用于分析來自受試者的組織活檢樣品。原位雜交技術(shù)的實(shí)踐更詳細(xì)地描述在美國(guó)專利號(hào)5,427,916，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。從表1a和表1b中提供的核酸序列，可以生成適用于給定miR基因產(chǎn)物的原位雜交的探針，包括、但不限于，與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互補(bǔ)性的探針，以及與目標(biāo)miR基因產(chǎn)物具有完全互補(bǔ)性的探針，如上所述。
通過逆轉(zhuǎn)錄miR基因轉(zhuǎn)錄物，隨后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物，也可以測(cè)定細(xì)胞中miR基因轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)數(shù)目?？赏ㄟ^與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)例如來自存在于相同樣品中的“管家”基因的mRNA的水平比較，來定量miR基因轉(zhuǎn)錄物的水平。用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的合適的“管家”基因包括例如肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)。用于定量和半-定量RT-PCR的方法和其變化形式，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
在一些情況下，可能希望同時(shí)測(cè)定樣品中許多不同miR基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。在其它情況下，可能希望測(cè)定所有已知的與癌癥相關(guān)的miR基因的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。評(píng)估數(shù)百個(gè)miR基因或基因產(chǎn)物的癌癥特異性表達(dá)水平是非常耗時(shí)的，并且需要大量總RNA(對(duì)于每個(gè)RNA印跡至少20μg)和需要放射性同位素的放射自顯影技術(shù)。
為克服這些限制，可構(gòu)建微芯片形式(即，微陣列)的寡物文庫(kù)，其包含對(duì)于一組miR基因特異性的一組寡核苷酸(例如，寡脫氧核苷酸)探針。通過使用該微陣列，可通過逆轉(zhuǎn)錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸，然后使其與微陣列上的探針寡脫氧核苷酸雜交，從而產(chǎn)生雜交或表達(dá)譜，來測(cè)定生物樣品中多種微小RNA的表達(dá)水平。然后科將測(cè)試樣品的雜交譜與對(duì)照樣品進(jìn)行比較，以確定在實(shí)體癌細(xì)胞中具有改變的表達(dá)水平的微小RNA。如本文所用的，“探針寡核苷酸”或“探針寡脫氧核苷酸”是指能夠與靶寡核苷酸雜交的寡核苷酸?！鞍泄押塑账帷被颉鞍泄衙撗鹾塑账帷笔侵复龣z測(cè)(例如通過雜交)的分子?！癿iR-特異性的探針寡核苷酸”或“對(duì)miR特異性的探針寡核苷酸”是指具有經(jīng)選擇與特定miR基因產(chǎn)物雜交或與該特定miR基因產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄物雜交的序列的探針寡核苷酸。
特定樣品的“表達(dá)譜”(expression profile)或“雜交譜”(hybridization profile)基本上是樣品的狀態(tài)的指紋圖譜；盡管兩種狀態(tài)可具有相似表達(dá)的任何特定基因，但同時(shí)評(píng)估許多基因可允許產(chǎn)生對(duì)于細(xì)胞狀態(tài)獨(dú)特的基因表達(dá)譜。即，正常組織可與肺癌組織區(qū)分，并且在肺癌組織內(nèi)，可確定不同的預(yù)后狀態(tài)(例如，好的或差的長(zhǎng)期存活希望)。通過比較不同狀態(tài)中的肺癌組織的表達(dá)譜，可獲得關(guān)于那些基因在這些狀態(tài)每一種中是重要的(包括基因的增量調(diào)節(jié)和減量調(diào)節(jié))信息。在肺癌組織或正常肺組織中差異表達(dá)的序列的鑒定以及導(dǎo)致不同的預(yù)后結(jié)果的差異表達(dá)的鑒定，允許以許多方式使用該信息。例如，可評(píng)價(jià)特定的治療方案(例如，以確定化療藥物是否起著改善特定患者的長(zhǎng)期預(yù)后的作用)。類似地，可通過將患者的樣品與已知的表達(dá)譜比較來進(jìn)行或確認(rèn)診斷。此外，這些基因表達(dá)譜(或個(gè)別基因)允許篩選抑制肺癌表達(dá)譜或?qū)⒉铑A(yù)后譜轉(zhuǎn)變成較好的預(yù)后譜的藥物候選品。
因此，本發(fā)明提供了診斷受試者是否患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，使所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜，并對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜，其中至少一種miRNA的信號(hào)的改變指示著受試者患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)所有已知人miRNA的實(shí)質(zhì)部分的miRNA-特異性探針寡核苷酸。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述微陣列包含針對(duì)選自下述的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a，let-7f-1和其組合。
可以從由已知的miRNA序列產(chǎn)生的基因特異性寡核苷酸探針制備微陣列。微陣列可包含對(duì)于每種miRNA的兩種不同的寡核苷酸探針，一種包含活性的成熟序列，另一種對(duì)于該miRNA的前體是特異性的。微陣列還可以包含對(duì)照，例如一個(gè)或多個(gè)與人直系同源物相異僅少數(shù)堿基的小鼠序列，該序列可用作雜交嚴(yán)格性條件的對(duì)照。還可將來自兩個(gè)物種的tRNA和其它RNA(例如，rRNA，mRNA)印在微芯片上，為特異性雜交提供內(nèi)部的、相對(duì)穩(wěn)定的陽性對(duì)照。還可在微芯片上包含非特異性雜交的一個(gè)或多個(gè)合適的對(duì)照。為此，基于與任何已知的miRNA不存在任何同源性來選擇序列。
可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)制造微陣列。例如，在位置C6上對(duì)合適長(zhǎng)度例如40個(gè)核苷酸的探針寡核苷酸進(jìn)行5’-胺修飾，然后使用可商購(gòu)獲得的微陣列系統(tǒng)例如GeneMachine OmniGridTM 100Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化載玻片進(jìn)行印制。通過用標(biāo)記的引物逆轉(zhuǎn)錄靶RNA來制備相應(yīng)于靶RNA的標(biāo)記的cDNA寡物。在第一鏈合成后，使RNA/DNA雜交體變性以降解RNA模板。然后將所制備的標(biāo)記的靶cDNA在雜交條件下與微陣列芯片雜交，所述條件是例如在25℃下在6X SSPE/30％甲酰胺中進(jìn)行18小時(shí)，然后在37℃下在0.75XTNT中洗滌40分鐘。雜交在陣列上在固定的探針DNA識(shí)別樣品中的互補(bǔ)靶cDNA的位置上發(fā)生。標(biāo)記的靶cDNA標(biāo)記了陣列上發(fā)生結(jié)合的確切位置，從而允許自動(dòng)檢測(cè)和定量。輸出由一列雜交事件組成，其顯示了特定cDNA序列的相對(duì)豐度，從而顯示患者樣品中相應(yīng)的互補(bǔ)miR的相對(duì)豐度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，標(biāo)記的cDNA寡物是從生物素標(biāo)記的引物制備的生物素標(biāo)記的cDNA。然后通過使用例如鏈霉抗生物素-Alexa647綴合物直接檢測(cè)含生物素的轉(zhuǎn)錄物來處理微陣列和使用常規(guī)的掃描方法掃描微陣列。陣列上各點(diǎn)的圖像強(qiáng)度與患者樣品中相應(yīng)的miR的豐度成比例。
陣列的使用對(duì)于miRNA表達(dá)檢測(cè)具有幾個(gè)有利方面。第一，可在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)在相同的樣品中鑒定數(shù)百個(gè)基因的整體表達(dá)。第二，通過對(duì)寡核苷酸探針的仔細(xì)設(shè)計(jì)，可鑒定成熟和前體分子的表達(dá)。第三，與RNA印跡分析相比，芯片需要少量的RNA，并且使用2.5μg的總RNA可提供可重復(fù)的結(jié)果。相對(duì)有限數(shù)量的miRNA(每個(gè)物種數(shù)百個(gè))允許構(gòu)建幾個(gè)物種的共同微陣列，對(duì)于各物種具有不同的寡核苷酸探針。該工具允許對(duì)多種不同條件下各已知miR的跨物種表達(dá)進(jìn)行分析。
除了用于特定miR的定量表達(dá)水平測(cè)定外，包含相應(yīng)于相當(dāng)大部分的miRNome(優(yōu)選整個(gè)miRNome)的miRNA特異性探針寡核苷酸的微芯片可用于確定miR基因表達(dá)譜，從而進(jìn)行miR表達(dá)模式的分析。不同的miR特征譜可與已建立的疾病標(biāo)記或直接與疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。
根據(jù)本文描述的表達(dá)譜確定分析法，定量逆轉(zhuǎn)錄來自獲自懷疑患有癌癥(例如，肺癌)的受試者的樣品的總RNA，以提供一組與樣品中的RNA互補(bǔ)的標(biāo)記的靶寡脫氧核苷酸。然后使所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，從而提供樣品的雜交譜。結(jié)果是展示樣品中miRNA的表達(dá)模式的樣品的雜交譜。雜交譜包含來自樣品的靶寡脫氧核苷酸與微陣列中的miRNA特異性探針寡核苷酸結(jié)合產(chǎn)生的信號(hào)。該譜可記錄為結(jié)合的存在或不存在(信號(hào)相對(duì)于零信號(hào))。更優(yōu)選，記錄的譜包括來自各雜交的信號(hào)的強(qiáng)度。將所述譜與從正常例如非癌性的對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜進(jìn)行比較。信號(hào)的改變指示著受試者中存在癌癥或發(fā)生癌癥的傾向。
用于測(cè)量miR基因表達(dá)的其它技術(shù)也在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)，并且包括用于測(cè)量RNA轉(zhuǎn)錄和降解的速率的各種技術(shù)。
本發(fā)明也提供了確定患有肺癌的受試者的預(yù)后的方法，其包括測(cè)量來自受試者的測(cè)試樣品中與肺癌的特定預(yù)后(例如，好的或積極的預(yù)后，差的或不良的預(yù)后)有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。根據(jù)這些方法，與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中與特定預(yù)后有關(guān)的miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著受試者患有具有特定預(yù)后的肺癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物與不良(即，差)預(yù)后有關(guān)。不良預(yù)后的實(shí)例包括、但不限于，低生存率和快速疾病進(jìn)展。在某些實(shí)施方案中，與特定預(yù)后有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-155，miR-17-3p，miR-106a，miR-93，let-7a-2，miR-145，let-7b，miR-20和miR-21。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且與特定預(yù)后有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-155和let-7a-2。在某些實(shí)施方案中，如下測(cè)量至少一種miR基因產(chǎn)物的水平從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸，使所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜，并對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜。
不希望受任何一種理論的束縛，認(rèn)為細(xì)胞中一種或多種miR基因產(chǎn)物的水平的變化可導(dǎo)致這些miR的一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)靶失調(diào)，這可導(dǎo)致肺癌的形成。因此，改變miR基因產(chǎn)物的水平(例如，通過降低在肺癌細(xì)胞中被增量調(diào)節(jié)的miR的水平，通過增加在肺癌細(xì)胞中被減量調(diào)節(jié)的miR的水平)可成功地治療肺癌。
因此，本發(fā)明包括治療受試者的肺癌的方法，其中受試者細(xì)胞(例如肺癌細(xì)胞)中的至少一種miR基因產(chǎn)物失調(diào)(例如，減量調(diào)節(jié)，增量調(diào)節(jié))。在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品(例如肺癌樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)試樣品(例如肺癌樣品)中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。當(dāng)肺癌細(xì)胞中至少一種分離的miR基因產(chǎn)物被減量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括，施用有效量的所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。例如，當(dāng)受試者癌細(xì)胞中miR基因產(chǎn)物被減量調(diào)節(jié)時(shí)，給受試者施用有效量的分離的miR基因產(chǎn)物可以抑制癌細(xì)胞的增殖。施用給受試者的分離的miR基因產(chǎn)物可以與在癌癥細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)的內(nèi)源野生型miR基因產(chǎn)物(例如在表1a或表1b中所示的miR基因產(chǎn)物)相同，或可以是其變體或生物活性片段。如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的＂變體＂是指與相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物具有小于100％同一性、且具有相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性的miRNA。這樣的生物活性的實(shí)例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)(例如，抑制靶RNA分子的翻譯，調(diào)控靶RNA分子的穩(wěn)定性，抑制靶RNA分子的加工)和抑制與肺癌有關(guān)的細(xì)胞過程(例如，細(xì)胞分化，細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞死亡)。這些變體包括物種變體和作為miR基因中的一個(gè)或多個(gè)突變(例如，置換，缺失，插入)的結(jié)果的變體。在某些實(shí)施方案中，所述變體與相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
如本文所定義的，miR基因產(chǎn)物的＂生物活性片段＂是指具有相應(yīng)的野生型miR基因產(chǎn)物的一種或多種生物活性的的miR基因產(chǎn)物的RNA片段。如上所述，這樣的生物活性的實(shí)例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表達(dá)和抑制與肺癌有關(guān)的細(xì)胞過程。在某些實(shí)施方案中，所述生物活性片段的長(zhǎng)度是至少約5，7，10，12，15，或17個(gè)核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可以與一種或多種其它的抗癌治療相組合，將分離的miR基因產(chǎn)物施用給受試者。合適的抗癌治療包括、但不限于，化療，放療和其組合(例如，放化療)。
當(dāng)至少一種分離的miR基因產(chǎn)物在癌細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)時(shí)，該方法包括，給受試者施用有效量的抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。這樣的化合物在本文中稱作抑制miR基因表達(dá)的化合物。合適的抑制miR基因表達(dá)的化合物的實(shí)例包括、但不限于，本文所述的那些(例如雙鏈RNA，反義核酸和酶RNA分子)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，抑制miR基因表達(dá)的化合物可以與一種或多種其它抗癌治療組合施用給受試者。合適的抗癌治療包括、但不限于，化療，放療和其組合(例如，放化療)。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，在肺癌中失調(diào)的分離的miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a和let-7f-1。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-205和miR-216。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-155，miR-210，miR-126*和miR-224。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是下述的一種或多種let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
如本文所用的，術(shù)語“治療”、“醫(yī)治”和“醫(yī)療”是指改善與疾病或病癥例如實(shí)體癌相關(guān)的癥狀，包括阻止或延遲疾病癥狀的發(fā)作和/或減少疾病或病癥的癥狀的嚴(yán)重度或頻率。術(shù)語“受試者”、“患者”和“個(gè)體”在本文定義為包括動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物，包括但不限于，靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族動(dòng)物、羊科動(dòng)物、馬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物或鼠類物種。在優(yōu)選實(shí)施方案中，動(dòng)物是人。
如本文所用的，分離的miR基因產(chǎn)物的“有效量”是足以抑制遭受肺癌的受試者中癌細(xì)胞增殖的量。通過考慮諸如受試者的身材大小和體重、疾病侵入的程度、受試者的年齡、健康和性別、給藥途徑以及給藥是局部的還是全身性的等因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定對(duì)給定受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量。
例如，分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可基于被治療的腫瘤塊的近似重量?？赏ㄟ^計(jì)算團(tuán)塊的近似體積確定腫瘤塊的近似重量，其中1立方厘米的體積大致相當(dāng)于1克?；谀[瘤塊的重量的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可以在約10-500微克/克的腫瘤塊的范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，腫癌塊可以是至少約10微克/克的腫瘤塊，至少約60微克/克的腫瘤塊或至少約100微克/克的腫瘤塊。
分離的miR基因產(chǎn)物的有效量還可基于被治療的受試者的近似或估計(jì)的體重。優(yōu)選，如本文所描述的，通過胃腸外或腸內(nèi)給藥施用該有效量。例如，對(duì)受試者施用的分離的miR基因產(chǎn)物的有效量可在約5至3000微克/kg的體重，約700至1000微克/kg的體重的范圍內(nèi)變動(dòng)，或大于約1000微克/kg的體重。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可容易地確定對(duì)給定的受試者施用分離的miR基因產(chǎn)物的合適的給藥方案。例如，可對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物一次(例如，作為單次注射或沉積(deposition))?；蛘?，可每天對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物1次或2次，進(jìn)行約3至約28天，更特別地約7至約10天的時(shí)期。在特定的給藥方案中，每天1次施用miR基因產(chǎn)物，進(jìn)行7天。當(dāng)給藥方案包括多次施用時(shí)，要理解對(duì)受試者施用的miR基因產(chǎn)物的有效量可包括在整個(gè)給藥方案中施用的基因產(chǎn)物的總量。
如本文所用的，“分離的”miR基因產(chǎn)物是合成的或通過人干預(yù)從天然狀態(tài)改變的或取出的產(chǎn)物。例如，合成的miR基因產(chǎn)物或部分地或完全地從與其天然狀態(tài)的共存材料分離的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”。分離的miR基因產(chǎn)物可以基本上純化的形式存在，或可存在于已遞送了該miR基因產(chǎn)物的細(xì)胞中。因此，有意遞送至細(xì)胞或有意在細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物被認(rèn)為是“分離的”miR基因產(chǎn)物。在細(xì)胞內(nèi)從miR前體分子產(chǎn)生的miR基因產(chǎn)物也被認(rèn)為是“分離的”分子。根據(jù)本發(fā)明，本文所述的分離的miR基因產(chǎn)物可以用于生產(chǎn)治療受試者(例如，人)的肺癌的藥物。
可使用許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得分離的miR基因產(chǎn)物。例如，可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法化學(xué)合成或重組產(chǎn)生miR基因產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用適當(dāng)保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)的DNA/RNA合成儀，化學(xué)合成miR基因產(chǎn)物。合成的RNA分子或合成試劑的商業(yè)提供商包括例如Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，U.S.A.)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，U.S.A.)、Glen Research(Sterling，VA，U.S.A.)、ChemGenes(Ashland，MA，U.S.A.)和Cruachem(Glasgow，UK)。
或者，可使用任何合適的啟動(dòng)子從重組環(huán)狀或線性DNA質(zhì)粒表達(dá)miR基因產(chǎn)物。用于從質(zhì)粒表達(dá)RNA的合適的啟動(dòng)子包括例如U6或H1RNA pol III啟動(dòng)子序列或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。本發(fā)明的重組質(zhì)粒還可包含用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子。
可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物。也可將從重組質(zhì)粒表達(dá)的miR基因產(chǎn)物遞送至和直接在癌細(xì)胞中表達(dá)。下面更詳細(xì)地討論重組質(zhì)粒用于將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。
可從分開的重組質(zhì)粒表達(dá)miR基因產(chǎn)物，或可從相同的重組質(zhì)粒表達(dá)它們。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR基因產(chǎn)物從單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)為RNA前體分子，然后前體分子通過合適的加工系統(tǒng)(包括但不限于存在于癌細(xì)胞內(nèi)的加工系統(tǒng))加工成功能性miR基因產(chǎn)物。其它合適的加工系統(tǒng)包括，例如，體外果蠅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)(lysate system)(例如，如屬于Tuschl等人的美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?002/0086356中描述的，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文)和大腸桿菌RNA酶III系統(tǒng)(例如，如屬于Yang等人的美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?004/0014113中描述的，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文)。
適合用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒的選擇，用于將核酸序列插入質(zhì)粒以表達(dá)基因產(chǎn)物的方法和將重組質(zhì)粒遞送入目的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。參見，例如，Zeng等人(2002)，Molecular Cell 91327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20446-448；Brummelkamp等人(2002)，Science 296550-553；Miyagishi等人(2002)，Nat.Biotechnol.20497-500；Paddison等人(2002)，Genes Dev.16948-958；Lee等人(2002)，Nat.Biotechnol.20500-505；和Paul等人(2002)，Nat.Biotechnol.20505-508，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)miR基因產(chǎn)物的質(zhì)粒包含在CMV即早期啟動(dòng)子控制之下的編碼miR前體RNA的序列。如本文所用的，“在啟動(dòng)子控制之下”意指編碼miR基因產(chǎn)物的核酸序列位于啟動(dòng)子的3’，這樣啟動(dòng)子可起始編碼miR基因產(chǎn)物的序列的轉(zhuǎn)錄。
也可從重組病毒載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物?？蓮膬蓚€(gè)分開的重組病毒載體或從相同的病毒載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分離從重組病毒載體表達(dá)的RNA，或可在癌細(xì)胞中直接表達(dá)它。下面更詳細(xì)地描述重組病毒載體將miR基因產(chǎn)物遞送至癌細(xì)胞的用途。
本發(fā)明的重組病毒載體包含編碼miR基因產(chǎn)物的序列和用于表達(dá)RNA序列的任何合適的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子包括、但不限于例如U6或H1 RNA pol III啟動(dòng)子序列或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。其它合適的啟動(dòng)子的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。本發(fā)明的重組病毒載體還可包含用于在癌細(xì)胞中表達(dá)miR基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型或調(diào)控型啟動(dòng)子。
可使用能夠接受miR基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；例如來源于腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，慢病毒(LV)、桿狀病毒、鼠白血病病毒)、皰疹病毒等的載體。適當(dāng)時(shí)，可通過用包膜蛋白和來自其它病毒的其它表面蛋白假型化載體或通過置換不同的病毒衣殼蛋白來改變病毒載體的向性。
例如，可用來自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病毒病毒、埃博拉病毒、莫科拉病等的表面蛋白假型化本發(fā)明的慢病毒載體。通過對(duì)載體進(jìn)行基因工程改造以表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型來產(chǎn)生本發(fā)明的AAV載體，從而使其靶向不同的細(xì)胞。例如，在血清2型基因組上表達(dá)血清2型衣殼的AAV載體稱為AAV 2/2?？捎醚?型衣殼蛋白基因取代AAV2/2載體中的該血清2型衣殼蛋白基因以產(chǎn)生AAV 2/5載體。用于構(gòu)建表達(dá)不同的衣殼蛋白血清型的AAV載體的技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)；參見，例如，Rabinowitz，J.E.，等人(2002)，J.Virol.76791-801，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
適合用于本發(fā)明的重組病毒載體的選擇、用于將表達(dá)RNA的核酸序列插入載體的方法、將病毒載體遞送至目的細(xì)胞的方法以及表達(dá)的RNA產(chǎn)物的回收在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)。參見，例如，Dornburg(1995)，Gene Therap.2301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therap.15-14；和Anderson(1998)，Nature 39225-30，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
特別合適的病毒載體是來源于AV和AAV的載體。用于表達(dá)本發(fā)明的miR基因產(chǎn)物的合適的AV載體、用于構(gòu)建重組AV載體的方法以及將載體遞送入靶細(xì)胞的方法描述于Xia等人(2002)，Nat.Biotech.201006-1010中，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。用于表達(dá)miR基因產(chǎn)物的合適的AAV載體、用于構(gòu)建重組AAV載體的方法以及將載體遞送入靶細(xì)胞的方法描述于Samulski等人(1987)，J.Virol.613096-3101；Fisher等人(1996)，J.Virol.，70520-532；Samulski等人(1989)，J.Virol.633822-3826；美國(guó)專利號(hào)5,252,479；美國(guó)專利號(hào)5,139,941；國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 94/13788；和國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 93/24641，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，從包含cMV立即早期啟動(dòng)子的單個(gè)重組AAV載體表達(dá)miR基因產(chǎn)物。
在某一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組AAV病毒載體包含在人U6 RNA的控制下、與polyT終止序列有效連接的編碼miR前體RNA的核酸序列。如本文所用的，“與polyT終止序列有效連接”是指編碼有義或反義鏈的核酸序列以5’方向與polyT終止信號(hào)直接相鄰。在從載體轉(zhuǎn)錄miR序列的過程中，polyT終止信號(hào)起著終止轉(zhuǎn)錄的作用。
在本發(fā)明的治療方法的其它實(shí)施方案中，可對(duì)受試者施用有效量的至少一種抑制miR表達(dá)的化合物。如本文所用的，“抑制miR表達(dá)”是指在治療后miR基因產(chǎn)物的前體和/或活性成熟形式的產(chǎn)量比治療前產(chǎn)生的量低。通過使用例如本文討論的確定miR轉(zhuǎn)錄物水平的技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定miR的表達(dá)在癌細(xì)胞中是否已被抑制。抑制可在基因表達(dá)的水平上發(fā)生(即，通過抑制編碼miR基因產(chǎn)物的miR基因的轉(zhuǎn)錄)或在加工水平上發(fā)生(例如，通過抑制miR前體加工成成熟的活性miR)。
如本文所用的，抑制miR表達(dá)的化合物的“有效量”是足以在罹患癌癥(例如，肺癌)的受試者中抑制癌細(xì)胞的增殖的量。通過考慮諸如受試者的身材大小和體重、疾病侵入的程度、受試者的年齡、健康和性別、給藥途徑和給藥是局部的還是全身性的等因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定抑制miR表達(dá)的化合物的有效量。
例如，表達(dá)抑制化合物的有效量可基于待治療的腫瘤塊的近似重量，如本文所述。抑制miR表達(dá)的化合物的有效量也可基于待治療的受試者的近似或估計(jì)重量，如本文所述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也可容易地確定對(duì)給定的受試者施用抑制miR表達(dá)的化合物的合適的給藥方案，如本文所述。用于抑制miR基因表達(dá)的合適的化合物包括雙鏈RNA(例如短的或小的干擾RNA或“siRNA”)、反義核酸和酶RNA分子例如核酶。此類化合物中的各化合物可靶向給定的miR基因產(chǎn)物和干擾靶miR基因產(chǎn)物的表達(dá)(例如，通過抑制翻譯，通過誘導(dǎo)切割和/或降解)。
例如，通過用與miR基因產(chǎn)物的至少一部分具有至少90％、例如至少95％、至少98％、至少99％、或100％序列同源性的分離的雙鏈RNA(＂dsRNA＂)分子誘導(dǎo)miR基因的RNA干擾，可以抑制給定miR基因的表達(dá)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，dsRNA分子是＂短的或小的干擾RNA＂或＂siRNA＂。
用于本方法的siRNA包含長(zhǎng)度為約17個(gè)核苷酸至約29個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度為約19至約25個(gè)核苷酸的短的雙鏈RNA。siRNA包含根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基配對(duì)相互作用(以下稱“堿基配對(duì)”)退火在一起的有義RNA鏈和互補(bǔ)反義RNA鏈。有義鏈包含基本上與靶miR基因產(chǎn)物內(nèi)包含的核酸序列相同的核酸序列。
如本文所用的，siRNA中與靶mRNA中包含的靶序列“基本上相同”的核酸序列是與靶序列相同或與靶序列相異1個(gè)或2個(gè)核苷酸的核酸序列。siRNA的有義和反義鏈可包含兩個(gè)互補(bǔ)的單鏈RNA分子，或可包含其中兩個(gè)互補(bǔ)部分是堿基配對(duì)的并且通過單鏈“發(fā)夾”區(qū)域共價(jià)連接的單鏈分子。
siRNA可以是與天然存在的RNA不同在于一個(gè)或多個(gè)核苷酸的添加、缺失、置換和/或改變的改變的RNA。此類改變可包括非核苷酸材料的添加，例如添加至siRNA的末端或添加至siRNA的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸，或使siRNA對(duì)核酸酶降解具有抗性的修飾或用脫氧核糖核苷酸對(duì)siRNA中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。
siRNA的一條或兩條鏈還可包含3′突出端。如本文所用的，“3′突出端”是指從雙鏈RNA鏈的3′末端延伸的至少一個(gè)未配對(duì)的核苷酸。因此，在某些實(shí)施方案中，siRNA包含長(zhǎng)度為1個(gè)至約6個(gè)核苷酸(其包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)、長(zhǎng)度為1至約5個(gè)核苷酸、長(zhǎng)度為1至約4個(gè)核苷酸或長(zhǎng)度為約2至約4個(gè)核苷酸的至少一個(gè)3′突出端。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，3′突出端存在于siRNA的兩條鏈上，且長(zhǎng)度為2個(gè)核苷酸。例如，siRNA的各鏈包含二胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dithymidylic acid)(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3′突出端。
siRNA可通過化學(xué)或生物學(xué)的方法產(chǎn)生，或如上面關(guān)于分離的miR基因產(chǎn)物所描述的，可從重組質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)。用于產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于屬于Gewirtz的美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?002/0173478和屬于Reich等人的美國(guó)公開專利申請(qǐng)?zhí)?004/0018176，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
還可通過反義核酸來抑制給定的miR基因的表達(dá)。如本文所用的，“反義核酸”是指通過RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用結(jié)合至靶RNA的核酸分子，其可改變靶RNA的活性。適合用于本發(fā)明的方法的反義核酸是通常包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的單鏈核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合體、肽核酸(PNA))。反義核酸可包含與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列50-100％互補(bǔ)、75-100％互補(bǔ)或95-100％互補(bǔ)的核酸序列。表1a和表1b中提供了特定人miR基因產(chǎn)物的核酸序列。不希望受限于任何理論，認(rèn)為反義核酸激活RNA酶H或降解miR基因產(chǎn)物/反義核酸雙鏈體的另一種細(xì)胞核酸酶。
反義核酸還可包含對(duì)核酸主鏈的修飾或?qū)μ呛蛪A基部分(或其等同物)的修飾，以增強(qiáng)靶特異性、對(duì)核酸酶的抗性、與分子的功效相關(guān)的遞送或其它性質(zhì)。此類修飾包括膽固醇部分、雙鏈體插入劑(例如吖啶)或一種或多種抗核酸酶基團(tuán)。
反義核酸可通過化學(xué)或生物學(xué)方法產(chǎn)生，或如上面關(guān)于分離的miR基因產(chǎn)物所描述的，可從重組質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)。用于產(chǎn)生和檢測(cè)的示例性方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)；參見，例如，Stein和Cheng(1993)，Science 2611004和Woolf等人的美國(guó)專利號(hào)5,849,902，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
還可用酶核酸抑制給定的miR基因的表達(dá)。如本文所用的，“酶核酸”是指包含具有與miR基因產(chǎn)物的連續(xù)核酸序列的互補(bǔ)性的底物結(jié)合區(qū)的核酸，其能夠特異性切割miR基因產(chǎn)物。酶核酸底物結(jié)合區(qū)可以與miR基因產(chǎn)物中的連續(xù)核酸序列具有例如50-100％的互補(bǔ)性、75-100％的互補(bǔ)性或95-100％的互補(bǔ)性。酶核酸還可包含在堿基、糖和/或磷酸基團(tuán)上的修飾。用于本發(fā)明的方法的示例性酶核酸是核酶。
酶核酸可通過化學(xué)或生物學(xué)方法產(chǎn)生，或如上面關(guān)于分離的miR基因產(chǎn)物所描述的，可從重組質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)。用于產(chǎn)生和檢測(cè)dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995)，Nucleic Acids Res.232092-96；Hammann等人(1999)，Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev.925-31；和屬于Cech等人的美國(guó)專利號(hào)4,987，071，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
至少一種miR基因產(chǎn)物或至少一種抑制miR表達(dá)的化合物的施用，將抑制患有癌癥(例如肺癌)的受試者中的癌細(xì)胞的增殖。如本文所用的，“抑制癌細(xì)胞的增殖”是指殺死細(xì)胞或永久性地或臨時(shí)性地阻止或減緩細(xì)胞的生長(zhǎng)。如果在施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物后，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目保持恒定或減少，那么可推斷此類細(xì)胞的增殖被抑制。如果癌細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目增加但腫瘤生長(zhǎng)速率減小也可推斷癌細(xì)胞的增殖被抑制。
可通過直接測(cè)量或通過從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移腫瘤塊的大小估計(jì)來確定受試者體內(nèi)的癌細(xì)胞的數(shù)目。例如，可通過免疫組織學(xué)方法、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)或設(shè)計(jì)用于檢測(cè)癌細(xì)胞的特征性表面標(biāo)記的其它技術(shù)測(cè)量受試者中的癌細(xì)胞數(shù)目。
可通過直接目視觀察或通過診斷性影像學(xué)方法例如X射線、磁共振顯像、超聲和閃爍照相術(shù)確定腫瘤塊的大小。如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可在存在或不存在造影劑的情況下使用用于確定腫瘤塊的大小的診斷性影像法。還可使用物理方法例如組織塊的觸診或使用測(cè)量?jī)x器例如測(cè)徑器測(cè)量組織塊來確定腫瘤塊的大小。
可通過適合將這些化合物遞送至受試者的癌細(xì)胞的任何方法對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物。例如，可通過適合于用這些化合物或用包含編碼這些化合物的序列的核酸轉(zhuǎn)染受試者的細(xì)胞的方法來施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR表達(dá)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用包含編碼至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的質(zhì)粒或病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
用于真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知，包括例如核酸至細(xì)胞的細(xì)胞核或前核的直接注射、電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移或通過親脂材料介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、受體介導(dǎo)的核酸遞送、bioballistic或粒子加速；磷酸鈣沉淀和通過病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
例如，可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移化合物DOTAP(甲基硫酸N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基-銨，Boehringer-Mannheim)或等同物例如LIPOFECTIN轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用的核酸的量對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐不是至關(guān)重要的；可用0.1-100微克的核酸/105個(gè)細(xì)胞獲得可接受的結(jié)果。例如，可使用每105個(gè)細(xì)胞約0.5微克質(zhì)粒于3微克DOTAP中的比率。
還可通過任何合適的腸內(nèi)或胃腸外給藥途徑對(duì)受試者施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物。用于本方法的合適的腸內(nèi)給藥途徑包括例如口服、直腸或鼻內(nèi)遞送。合適的胃腸外給藥途徑包括例如血管內(nèi)給藥(例如，至脈管系統(tǒng)的靜脈內(nèi)快速注射、靜脈輸注、動(dòng)脈內(nèi)快速濃注、動(dòng)脈內(nèi)輸注和導(dǎo)管滴注)；組織外周和組織內(nèi)注射(例如，瘤周和瘤內(nèi)注射、視網(wǎng)膜內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下注射)；皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如通過滲透泵)；對(duì)目的組織的直接施用，例如通過導(dǎo)管或其它安置裝置(例如，視網(wǎng)膜彈丸劑或栓劑或包含多孔、無孔或凝膠狀材料的植入體)；以及吸入。特別適合的給藥途徑是注射、輸注和直接注射至腫瘤中。
在本方法中，可將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物作為裸RNA與遞送試劑一起或作為核酸(例如，重組質(zhì)?；虿《据d體)給受試者施用，所述核酸包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物的序列。合適的遞送試劑包括例如Mirus TransitTKO親脂試劑、LIPOFECTIN、lipofectamine、cellfectin、聚陽離子(例如，多聚賴氨酸)和脂質(zhì)體。
本文討論了包含表達(dá)miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物的序列的重組質(zhì)粒和病毒載體以及用于遞送此類質(zhì)粒和載體至癌細(xì)胞的技術(shù)，且/或是本領(lǐng)域眾所周知的。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，脂質(zhì)體用于將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至受試者。脂質(zhì)體也可以增加基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期?？蓮臉?biāo)準(zhǔn)的形成小囊泡的脂質(zhì)(其通常包含中性或帶負(fù)電荷的磷脂和固醇例如膽固醇)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體。通常通過考慮諸如想要的脂質(zhì)體大小和血流中脂質(zhì)體的半衰期等因素，指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。用于制備脂質(zhì)體的許多方法是已知的，例如，如在Szoka等人(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467；和美國(guó)專利號(hào)4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文)中描述的方法。
用于本方法的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體靶向癌細(xì)胞的配體分子。結(jié)合癌細(xì)胞中普遍存在的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。
還可對(duì)用于本方法的脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，以避免被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(“MMS”)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(“RES”)清除。此類經(jīng)修飾的脂質(zhì)體具有存在于表面上或整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中的調(diào)理作用抑制部分。在特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)體可同時(shí)包含調(diào)理作用抑制部分和配體兩者。
用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分通常是結(jié)合至脂質(zhì)體的膜的大的親水聚合物。如本文所用的，當(dāng)其例如通過脂溶性錨嵌入膜本身中或通過對(duì)膜脂質(zhì)的活性基團(tuán)直接結(jié)合而被化學(xué)地或物理地附著至膜時(shí)，調(diào)理作用抑制部分“結(jié)合”至脂質(zhì)體膜。這些調(diào)理作用抑制性親水聚合物形成了顯著減少脂質(zhì)體被MMS和RES吸收的保護(hù)表面層；例如，如美國(guó)專利號(hào)4,920,016中所描述的，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
適合用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選是具有約500至約40,000道爾頓和優(yōu)選約2,000至約20,000道爾頓的數(shù)量平均分子量的水溶性聚合物。此類聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)或其衍生物；例如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯酮；線性的、分支的或樹狀聚酰胺-胺(polyamidoamines)；聚丙烯酸；多元醇，例如羧基或氨基化學(xué)連接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神經(jīng)節(jié)苷脂例如神經(jīng)節(jié)苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合適的。此外，調(diào)理作用抑制性聚合物可以是PEG與多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。調(diào)理作用抑制性聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng)氨酸、海藻酸、角叉菜膠的天然多糖；氨化多糖或寡糖(線性或分支的)；或羧化多糖或低聚糖，例如與碳酸的衍生物反應(yīng)，獲得羧基的連接。優(yōu)選，調(diào)理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“PEG化脂質(zhì)體”。
可通過許多熟知的技術(shù)中的任一種將調(diào)理作用抑制部分與脂質(zhì)體膜結(jié)合。例如，可將PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯結(jié)合至磷脂酰乙醇胺脂溶性錨，然后再將其結(jié)合至膜。類似地，可使用Na(CN)BH3和溶劑混合物(例如以30:12比例的四氫呋喃和水)在60℃下通過還原氨化作用用硬脂酰胺脂溶性錨衍生葡聚糖聚合物。
用調(diào)理作用抑制部分修飾的脂質(zhì)體在循環(huán)中比未修飾的脂質(zhì)體保持長(zhǎng)得多的時(shí)間。因此，這樣的脂質(zhì)體有時(shí)稱為“秘密(stealth)”脂質(zhì)體。已知秘密脂質(zhì)體在由多孔的或“滲漏的”微血管滋養(yǎng)的組織中積累。因此，特征在于該微血管缺陷的組織例如實(shí)體瘤(例如肺癌)將有效率地積累這些脂質(zhì)體；參見Gabizon，等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，186949-53。此外，減少的由RES進(jìn)行的吸收通過防止脂質(zhì)體在肝和脾中大量積累而降低了秘密脂質(zhì)體的毒性。因此，用調(diào)理作用抑制部分修飾的脂質(zhì)體特別適合將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至腫瘤細(xì)胞。
按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)在給受試者施用之前，可將miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物配制為藥物組合物，有時(shí)稱為“藥物”。因此，本發(fā)明包括用于治療肺癌的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，至少一種miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于這樣的miR基因產(chǎn)物，即相對(duì)于合適的對(duì)照細(xì)胞，該miR基因產(chǎn)物在肺癌細(xì)胞中具有減少的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，所述分離的miR基因產(chǎn)物選自miR-126*，miR-192，miR-224，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-9，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216，miR-219-1，miR-125a，miR-26a-1，miR-199b，let-7a-2，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125b-1，let-7f-1和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-210或miR-212。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-21，miR-143，miR-205或miR-9。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-214，miR-218-2，miR-145，miR-106a，miR-192，miR-203，miR-150，miR-220，miR-212或miR-9。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種抑制miR表達(dá)的化合物。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述至少一種抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)大于對(duì)照細(xì)胞的miR基因是特異性的。在某些實(shí)施方案中，所述抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)一種或多種選自下述的miR基因產(chǎn)物是特異性的miR-21，miR-191，miR-210，miR-155，miR-205，miR-24-2，miR-212，miR-214，miR-17-3p，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-146，miR-203，miR-150和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的miR基因產(chǎn)物不是對(duì)miR-15a或miR-16-1特異性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是對(duì)miR-210或miR-212特異性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是對(duì)miR-21、miR-143、miR-205或miR-9特異性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是對(duì)miR-21、miR-191、miR-126*、miR-210、miR-155、miR-143、miR-205、miR-126、miR-30a-5p、miR-140、miR-214、miR-218-2、miR-145、miR-106a、miR-192、miR-203、miR-150、miR-220、miR-212或miR-9特異性的。本發(fā)明的藥物組合物的特征在于是至少無菌的和無熱原的。如本文所用的，“藥物組合物”包括用于人和獸醫(yī)用途的制劑。用于制備本發(fā)明的藥物組合物的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍之內(nèi)，例如，如Remington′sPharmaceutical Science，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA.(1985)中所描述的，其全部公開內(nèi)容通過參考引用并入本文。
本發(fā)明的藥物組合物包含與藥學(xué)上可接受的載體相混合的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)(例如，0.1-90％重量)或其生理上可接受的鹽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物另外包含一種或多種抗癌劑(例如，化療劑)。本發(fā)明的藥物制劑也可以包含由脂質(zhì)體包封的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)，和藥學(xué)上可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含不是miR-15、miR-16、miR-143和/或miR-145的miR基因或基因產(chǎn)物。
特別合適的藥學(xué)上可接受的載體是水、緩沖水溶液、生理鹽水、0.4％的鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含對(duì)核酸酶的降解具有抗性的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地合成對(duì)核酸酶具有抗性的核酸，例如通過將一個(gè)或多個(gè)在2’位置被修飾的核糖核苷酸摻入miR基因產(chǎn)物。合適的2’-修飾的核糖核苷酸包括在2’位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和0-烯丙基修飾的核糖核苷酸。
本發(fā)明的藥物組合物還可包含常規(guī)藥物賦形劑和/或添加劑。合適的藥物賦形劑包括穩(wěn)定劑、抗氧化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、緩沖劑和pH調(diào)節(jié)劑。合適的添加劑包括例如生理生物相容性緩沖劑(例如，鹽酸氨丁三醇)、螯合劑(例如，DTPA或DTPA-雙酰胺)或鈣螯合物(例如，DTPA鈣、CaNaDTPA-雙酰胺)的加入，或任意地，鈣或鈉鹽(例如，氯化鈣、抗壞血酸鈣、葡萄糖酸鈣或乳酸鈣)的加入?？砂b本發(fā)明的藥物組合物以使以液體形式使用或可將其凍干。
對(duì)于本發(fā)明的固體藥物組合物，可使用常規(guī)的無毒性固體藥學(xué)上可接受的載體例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。
例如，用于口服給藥的固體藥物組合物可包含上列的任何載體和賦形劑和10-95％，優(yōu)選25％-75％的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)。用于氣霧劑(吸入)給藥的藥物組合物可包含封裝在上述脂質(zhì)體中的按重量計(jì)算0.01-20％、優(yōu)選按重量計(jì)算1％-10％的至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)和噴射劑。當(dāng)需要時(shí)也可包含載體；例如用于鼻內(nèi)遞送的卵磷脂。
本發(fā)明的藥物組合物可以另外包含一種或多種抗癌劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，組合物包含至少一種miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物(或至少一種包含編碼miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物的序列的核酸)和至少一種化療劑。適用于本發(fā)明的方法的化療劑，包括、但不限于，DNA-烷化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素拮抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-CoA抑制劑，CDK抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三鏈螺旋DNA，核酸適體，和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。適用于本發(fā)明的組合物的試劑的實(shí)例包括、但不限于，阿糖胞苷，甲氨蝶呤，長(zhǎng)春新堿，依托泊苷(VP-16)，多柔比星(阿霉素)，順鉑(CDDP)，地塞米松，arglabin，環(huán)磷酰胺，沙可來新，甲基亞硝基脲，氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶(5FU)，長(zhǎng)春堿，喜樹堿，放線菌素-D，絲裂霉素C，過氧化氫，奧沙利鉑，伊立替康，托泊替康，亞葉酸，卡莫司汀，鏈佐星，CPT-11，泰素，他莫昔芬，達(dá)卡巴嗪，利妥昔單抗，柔紅霉素，1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶，伊馬替尼，氟達(dá)拉濱，多西他賽和FOLFOX4。
本發(fā)明也包括鑒定抗肺癌劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，和測(cè)量細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，和測(cè)量與肺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對(duì)照(例如對(duì)照細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平)相比，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的增加，指示著測(cè)試試劑是抗肺癌劑。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，與肺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-126*，miR-192，miR-224，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-9，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216，miR-219-1，miR-125a，miR-26a-1，miR-199b，let-7a-2，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125b-1，let-7f-1和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是下述的一種或多種let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
在其它實(shí)施方案中，該方法包括，給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，和測(cè)量與肺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平。與合適的對(duì)照(例如對(duì)照細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平)相比，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的降低，指示著測(cè)試試劑是抗肺癌劑。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，與肺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-210，miR-155，miR-205，miR-24-2，miR-212，miR-214，miR-17-3p，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-146，miR-203，miR-150和其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR基因產(chǎn)物不是下述的一種或多種let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
合適的試劑包括但不限于藥物(例如，小分子、肽)，和生物大分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸)。可通過重組、合成方法產(chǎn)生該試劑，或其可從天然來源分離(即，純化)。用于對(duì)細(xì)胞提此類試劑的各種方法(例如，轉(zhuǎn)染)在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，上文中描述了幾種這樣的方法。用于檢測(cè)至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法(例如，RNA印跡法、原位雜交法、RT-PCR、表達(dá)譜確定分析)在本領(lǐng)域內(nèi)也是熟知的。本文中也描述了這些方法中的幾種方法。
現(xiàn)在通過下列非限制性實(shí)施例解釋本發(fā)明。
實(shí)施例 實(shí)施例1原發(fā)性肺癌中改變的miRNA表達(dá) 材料和方法 樣品 在該研究中使用了104對(duì)原發(fā)性肺癌和相應(yīng)的非癌肺組織。可隨訪長(zhǎng)達(dá)5年的另外32例用于獨(dú)立的驗(yàn)證數(shù)據(jù)組。在征得知情同意后且符合Institutional Review Board，這些組織在1990至1999年作為手術(shù)標(biāo)本從Baltimore大都市市區(qū)患者獲得。肺癌組織來自65位肺腺癌患者和39位肺鱗狀細(xì)胞癌患者。中值年齡為65(38-84)歲的65位男性和39位女性患者構(gòu)成該集合。65個(gè)腫瘤分類成I期，17個(gè)分類成II期，和22個(gè)分類成III或IV期腫瘤。對(duì)于大多數(shù)樣品，可得到臨床和生物學(xué)信息。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，通過

Reagent(Invitrogen)，從組織分離總RNA。
微陣列分析 如前所述進(jìn)行微陣列分析(Liu，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1019740-9744(2004))。簡(jiǎn)而言之，使5μg總RNA與含有一式三份的352個(gè)的探針的miRNA微陣列芯片雜交。具體而言，這些芯片含有基因特異性的40-聚體寡核苷酸探針，它們通過接觸技術(shù)來印制，并共價(jià)結(jié)合到聚合基質(zhì)上，它們從161人miRNA、84個(gè)小鼠miRNA、來自3個(gè)其它物種的miRNA和tRNA產(chǎn)生。微陣列在25℃在6X SSPE(0.9MNaCl/60mM NaH2PO4·H2O/8mM EDTA，pH 7.4)/30％甲酰胺中雜交18小時(shí)，在37℃在0.75X TNT(Tris·HCl/NaCl/吐溫20)中洗滌40min，通過鏈霉抗生物素-Alexa647綴合物(Molecular Probes，Carlsbad，CA)，使用對(duì)含有生物素的轉(zhuǎn)錄物的直接檢測(cè)方法進(jìn)行處理。使用PerkinElmer ScanArray XL5K掃描儀掃描處理過的載玻片，激光設(shè)定在635nm，在功率80和PMT 70設(shè)置，掃描分辨率是10μm。標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)miRNA的3個(gè)點(diǎn)重復(fù)的平均值，并在BRB-ArrayTools 3.2.3版本中分析。排除雜交強(qiáng)度低于背景的負(fù)值后，使用每個(gè)芯片按照中位值標(biāo)準(zhǔn)化方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并相對(duì)于作為參照的中位值陣列標(biāo)準(zhǔn)化。最后，選擇147個(gè)miRNA，它們?cè)诔^50％的樣品中存在一致的log值。使用t-或F-檢驗(yàn)，鑒定出在組之間差異表達(dá)的基因，如果它們的p值小于0.001，則認(rèn)為該基因是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。通過置換與組相對(duì)應(yīng)的陣列的標(biāo)記，也進(jìn)行組之間的表達(dá)譜是否存在差異的總體檢驗(yàn)。對(duì)于每個(gè)置換，重新計(jì)算p值，并記錄在0.001水平顯著的基因的數(shù)目。產(chǎn)生至少象實(shí)際數(shù)據(jù)一樣多的顯著基因的置換的比例，是總體檢驗(yàn)的顯著性水平。
溶液雜交檢測(cè)分析和實(shí)時(shí)RT-PCR分析 使用mirVanaTM miRNA檢測(cè)試劑盒(Ambion Inc.，TX)，通過溶液雜交檢測(cè)，測(cè)量成熟miRNA的表達(dá)水平。簡(jiǎn)而言之，將1μg總RNA與對(duì)應(yīng)于這些miRNA的放射性標(biāo)記的探針溫育。消化以去除靶miRNA沒有結(jié)合的任意探針后，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離放射性標(biāo)記的產(chǎn)物。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，使用mirVanaTM探針&標(biāo)記試劑盒(Ambion Inc.，TX)，通過用T4多核苷酸激酶進(jìn)行5’末端標(biāo)記，制備探針。如(Schmittgen等人，Nucl.Acids Res.32e43(2004))所述，在Applied Biosystem的序列檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR，所有反應(yīng)一式三份地進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，用基因特異性的引物和Thermoscript，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并測(cè)定對(duì)于起始物蛋氨酸每種miRNA相對(duì)于tRNA的相對(duì)量，其中使用方程2-dCT，其中dCT＝(CTmiRNA-CTU6)。
存活分析 鑒定出其表達(dá)與患者的存活顯著相關(guān)的基因?；贐RB-ArrayTools3.2.3版本中的單變量cox比例危險(xiǎn)回歸模型，計(jì)算每個(gè)基因的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平。然后將這些p值用于多變量置換檢驗(yàn)，其中將存活時(shí)間和檢查指示物在陣列間隨機(jī)置換。如果它們的p值小于0.05，則認(rèn)為基因是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
通過Kaplan-Meier方法(SAS Institute，Cary，NC)估計(jì)存活曲線，使用時(shí)序檢驗(yàn)對(duì)比得到的曲線。使用Cox比例危險(xiǎn)回歸模型，檢查共變量的聯(lián)合作用。使用StatMate(ATMS Co.Ltd.，Tokyo，Japan)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果 分析104對(duì)原發(fā)性肺癌和相應(yīng)的非癌肺組織中的miRNA表達(dá)，以研究miRNA在肺癌中的參與。在表2中對(duì)比了幾個(gè)特定組對(duì)的miRNA表達(dá)。鑒定出在5個(gè)表型和組織學(xué)分類中差異表達(dá)的miRNA(表2)。
在對(duì)比肺癌組織和相應(yīng)的非癌肺組織中的miRNA表達(dá)后，鑒定出表現(xiàn)出組間的表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異的43種miRNA(表3)。在使用我們的微陣列分析工具的類別對(duì)比分析中，進(jìn)行多變量置換檢驗(yàn)，以控制多重對(duì)比。該檢驗(yàn)提供了一個(gè)特定的置信水平，用于確保假發(fā)現(xiàn)的數(shù)目不超過靶水平，或用于確保代表假發(fā)現(xiàn)的基因列表的比例不超過靶水平。因而，通過多變量置換檢驗(yàn)估計(jì)出，如果類別之間沒有實(shí)際差異，則在<0.001水平偶然獲得至少43個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異表達(dá)的miRNA的概率是0。此外，使用基于化合物共變量預(yù)測(cè)因子的剩下一個(gè)(leave-one-out)交叉驗(yàn)證的類別預(yù)測(cè)方法，104個(gè)肺癌中的91％得以正確地分類。基于2000個(gè)隨機(jī)置換，p值<0.0005，所述p值定義為產(chǎn)生不大于真實(shí)數(shù)據(jù)的交叉驗(yàn)證誤差率的交叉驗(yàn)證誤差率的隨機(jī)置換的比例。
這些miRNA中的幾個(gè)與FRA有關(guān)(表3)。更具體地，3種miRNA位于脆性位點(diǎn)內(nèi)(hsa-mir-21在FRA17B，hsa-mir-27b在FRA9D，和hsa-mir-32在FRA9E)。此外，這些鑒定出的miRNA中的許多位于在幾種惡性腫瘤中頻繁缺失或擴(kuò)增的區(qū)域(表3)。例如，hsa-mir-21和hsa-mir-205位于在肺癌中擴(kuò)增的區(qū)域，而hsa-mir-126*和hsa-mir-126是在9q34.3，該區(qū)域在肺癌中缺失。還在腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了前體let-7a-2和let-7f-1的降低的表達(dá)，p值截止值為0.05。以相同的方式，肺腺癌相對(duì)于非癌組織之間、以及鱗狀細(xì)胞癌相對(duì)于非癌組織之間的對(duì)比分析，分別揭示了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異表達(dá)的17和16種miRNA(表4)。6種miRNA(hsa-mir-21，hsa-mir-191，hsa-mir-155，hsa-mir-210，hsa-mir-126*，和hsa-mir-224)在這兩種組織學(xué)類型的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中共有。
表2.臨床病理學(xué)分類的的對(duì)比分析
a基因數(shù)，在0.001顯著的基因的數(shù)目。
bFDR，假發(fā)現(xiàn)率，它是顯著基因的偶然概率。
c正確分類％(p-值)?；诨衔锕沧兞款A(yù)測(cè)因子的剩下一個(gè)交叉驗(yàn)證的類別預(yù)測(cè)方法。p-值是產(chǎn)生不大于真實(shí)數(shù)據(jù)的交叉驗(yàn)證誤差率的交叉驗(yàn)證誤差率的隨機(jī)置換的比例。
d腺，腺癌。
eSCC，鱗狀細(xì)胞癌。
表3.相對(duì)于非癌肺組織，在肺癌組織中差異表達(dá)的43種miRNA。

a信息來自以前的報(bào)道(Calin，G.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1012999-3004(2004))。
b信息來自以前的報(bào)道(Rodriguez，A.等人，Genome Res.141902-1910(2004))。
cAmp，擴(kuò)增；dDel，缺失；eNSCLC，非小細(xì)胞肺癌；fHCC，肝細(xì)胞癌；gmlncRNA，mRNA樣非編碼RNA；hND，未確定；iMFHs，惡性纖維組織細(xì)胞瘤。
進(jìn)行對(duì)選擇前體miRNA的實(shí)時(shí)RT-PCR分析，以驗(yàn)證微陣列分析的結(jié)果。首先，使用hsa-mir-21、hsa-mir-126*、hsa-mir-205和U6(作為對(duì)照)的基因特異性引物，制備來自16對(duì)肺腺癌和16對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌的cDNA。隨后，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR分析，以測(cè)定這些miRNA在不同樣品中的表達(dá)水平。當(dāng)與這些miRNA在相應(yīng)的非癌組織中的表達(dá)水平相比時(shí)，分別在32個(gè)病例的66％和56％中發(fā)現(xiàn)了hsa-mir-21和hsa-mir-205前體miRNA表達(dá)的至少2倍增量調(diào)節(jié)(圖1)。通過配對(duì)的t-檢驗(yàn)，差異在p<0.001是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的。相比之下，檢查的32個(gè)肺癌病例中31％表現(xiàn)出前體hsa-mir-126*表達(dá)的大于50％減少，盡管這些結(jié)果不是統(tǒng)計(jì)上顯著的(圖1)。這些發(fā)現(xiàn)表明，特定前體miRNA在肺癌中頻繁增量調(diào)節(jié)或減少，這與它們的成熟miRNA的表達(dá)模式相一致，如使用微陣列分析所測(cè)定的。
表4。相對(duì)于非癌肺組織，在腺癌組織/鱗狀細(xì)胞肺癌組織中差異表達(dá)的miRNA。

另外，通過溶液雜交檢測(cè)方法，對(duì)成熟miRNA證實(shí)了3種前體miRNA-hsa-mir-21、hsa-mir-126*和hsa-mir-205的微陣列數(shù)據(jù)。具體地，分析了7對(duì)原發(fā)性肺癌組織和相應(yīng)的非癌肺組織，可以得到足夠量的RNA。與相應(yīng)的非癌肺組織相比，成熟形式的hsa-mir-21和hsa-mir-205在肺癌組織中明顯地增量調(diào)節(jié)(圖2)，而hsa-mir-126*在大多數(shù)檢查的肺癌組織中減量調(diào)節(jié)。因此，象RT-PCR結(jié)果一樣，這些分析證實(shí)了這3種miRNA的微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。
實(shí)施例2人肺癌細(xì)胞系中不同的miRNA表達(dá)特征 材料和方法 樣品 在該研究中使用了13種肺癌細(xì)胞系，它們由5種小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞系和8種非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系組成。5種SCLC細(xì)胞系是DMS92，NCI-H82，NCI-H146，NCI-H446和NCI-H417(美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心)。8種NSCLC細(xì)胞系是NCI-H157，Calu-1，Calu-6，NCI-H292，NCI-H596，A-427，A549和A2182(美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心，Manassas，VA)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，用

Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)從組織和培養(yǎng)的細(xì)胞分離總RNA。
微陣列分析 如前所述進(jìn)行微陣列分析(Liu，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1019740-9744(2004)，也參見，實(shí)施例1)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 如上文所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如實(shí)施例1)。
結(jié)果 通過微陣列分析，產(chǎn)生了5種小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞系和8種非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系的miRNA表達(dá)譜。對(duì)比NSCLC和SCLC的miRNA表達(dá)譜，揭示了3種miRNA(hsa-mir-24-1，hsa-mir-29a，和hsa-mir-29c)的表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(t-檢驗(yàn)，p<0.001)。此外，當(dāng)將分級(jí)聚類分析應(yīng)用于每種樣品類型的18種最為差異表達(dá)的miRNA時(shí)，揭示了不同簇，所有NSCLC細(xì)胞系落入不同于SCLC細(xì)胞系的簇中(圖3A，圖3B)。這些結(jié)果指示，miRNA表達(dá)譜可以在不同的起源和/或類型的細(xì)胞中有差異，如在以前的研究中所發(fā)現(xiàn)的(參見，例如Liu，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1019740-9744(2004)；Bhattacharjee，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9813790-13795(2001)；Garber，M.E.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9813784-13789(2001))。
實(shí)施例3與肺癌的臨床病理學(xué)特征有關(guān)的miRNA的鑒定 材料和方法 微陣列分析 如前所述進(jìn)行微陣列分析(Liu，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1019740-9744(2004)，也參見，實(shí)施例1)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 如上文所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如實(shí)施例1)。
結(jié)果 分析了微陣列數(shù)據(jù)是否揭示臨床行為有差異的肺癌子集的特異性分子特征。對(duì)于該分析，檢查了5類臨床和病理學(xué)信息的關(guān)系(表2)。在組織學(xué)分類中，鑒定出在兩種最常見組織學(xué)類型的NSCLC-腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中差異表達(dá)的6種miRNA(hsa-mir-205，hsa-mir-99b，hsa-mir-203，hsa-mir-202，hsa-mir-102，和hsa-mir-204-prec)。腺癌中hsa-mir-99b和hsa-mir-102的表達(dá)水平更高。對(duì)于通過年齡、性別或種族區(qū)分的組，沒有鑒定出差異表達(dá)的miRNA。
實(shí)施例4hsa-mir-155和hsa-let-7a-2表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。
材料和方法 微陣列分析 如前所述進(jìn)行微陣列分析(Liu，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1019740-9744(2004)，也參見，實(shí)施例1)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 如上文所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如實(shí)施例1)。
基因本體論分析 通過Lewis等人(Lewis，B.P.等人，Cell 12015-20(2005))和PicTar(Krek，A.等人，Nat.Genet.37495-500(2005))的方法，確定hsa-mir-155和hsa-let-7a的預(yù)測(cè)靶，并就特定基因本體論(GO)生物群內(nèi)的過度表示進(jìn)行分析。對(duì)GO項(xiàng)目列進(jìn)行使用Whole Pathway Scope(WPS)應(yīng)用的分析，并列出Fisher Exacts cores小于0.005的那些項(xiàng)。
結(jié)果 評(píng)估了miRNA表達(dá)與患者存活的關(guān)聯(lián)。BRB-ArrayTools中帶總體置換檢驗(yàn)的單變量Cox比例危險(xiǎn)回歸模型指示，8種miRNA(hsa-mir-155，hsa-mir-17-3p，hsa-mir-106a，hsa-mir-93，hsa-let-7a-2，hsa-mir-145，hsa-let-7b和hsa-mir-21)與腺癌患者存活相關(guān)。發(fā)現(xiàn)hsa-mir-155、hsa-mir-17-3p、hsa-mir-106a、hsa-mir-93或hsa-mir-21的高表達(dá)和hsa-let-7a-2、hsa-let-7b或hsa-mir-145的低表達(dá)具有顯著更差的預(yù)后。另外，41位I期腺癌患者中的存活分析揭示，3種miRNA(hsa-mir-155，hsa-mir-17-3p，和hsa-mir-20)與患者結(jié)果有關(guān)。這些結(jié)果證實(shí)了miRNA表達(dá)譜與患者存活之間的重要關(guān)系，與疾病階段無關(guān)。
因?yàn)檫@些miRNA中的5種(hsa-mir-155，hsa-mir-17-3p，hsa-let-7a-2，hsa-mir-145，和hsa-mir-21)相對(duì)于相應(yīng)的非癌肺組織在肺癌組織中差異表達(dá)，將這些miRNA用于進(jìn)一步的存活分析。為這5種miRNA中的每一種計(jì)算肺癌表達(dá)與相應(yīng)的非癌肺組織表達(dá)的比例，并根據(jù)所述表達(dá)比將病例分類。使用對(duì)每種miRNA的這些分組，進(jìn)行Kaplan-Meier存活分析。Kaplan-Meier存活估計(jì)表明，具有高h(yuǎn)sa-mir-155表達(dá)或降低的hsa-let-7a-2表達(dá)的肺腺癌患者的存活前景比具有低hsa-mir-155或高h(yuǎn)sa-let-7a-2表達(dá)的患者更差(圖4和圖5)。這2組的預(yù)后的差異，對(duì)于hsa-mir-155是非常顯著的(p＝0.006；時(shí)序檢驗(yàn))，但是對(duì)于hsa-let-7a-2不太顯著(p＝0.033；時(shí)序檢驗(yàn))。對(duì)臨床病理學(xué)因素的存活分析表明，階段與存活顯著相關(guān)(p＝0.01；時(shí)序檢驗(yàn))，而年齡、種族、性別和吸煙史不能解釋差的預(yù)后(表5A和5B)。為了調(diào)整進(jìn)行多重對(duì)比，我們使用了Storey等人的方法(Storey，J.D.和Tibshirani，R.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1009440-9445(2003))，將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率限定到0.05。使用該比率，hsa-mir-155和疾病階段仍然是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。隨后，使用所有這些臨床病理學(xué)和分子因素，進(jìn)行多變量Cox比例危險(xiǎn)回歸分析。確定高h(yuǎn)sa-mir-155表達(dá)是不利的預(yù)后因素，獨(dú)立于其它臨床病理學(xué)因素(p＝0.027；危險(xiǎn)比率3.03；95％ CI，1.13-8.14)以及疾病階段(p＝0.013；危險(xiǎn)比率3.27；95％ CI，1.31-8.37；表5A)。
表5A.與分子和臨床病理學(xué)特征和miRNA表達(dá)(通過微陣列分析進(jìn)行分析)相關(guān)的肺腺癌患者的手術(shù)后存活。

a95％ CI，95％置信區(qū)間。
b多變量分析，Cox比例危險(xiǎn)回歸模型。
chsa-let-7a-2低/高不是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(p＝0.089)。
表5B.與臨床病理學(xué)特征和前體miRNA表達(dá)(通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析而分析的)相關(guān)的肺腺癌患者的手術(shù)后存活。

a95％ CI，95％置信區(qū)間。
b多變量分析，Cox比例危險(xiǎn)回歸模型。
為了研究改變的hsa-mir-155和hsa-let-7a-2表達(dá)的生物學(xué)結(jié)果，進(jìn)行生物信息分析，來根據(jù)基因本體論(GO)項(xiàng)分組這些miRNA的預(yù)測(cè)靶(表6)。除了與更一般的功能GO項(xiàng)的聯(lián)系以外，對(duì)hsa-mir-155觀察到與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的靶的顯著富集。hsa-let-7a顯示出與蛋白激酶和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)相關(guān)聯(lián)的基因靶的過度表示，該發(fā)現(xiàn)與報(bào)道的let-7與RAS之間的功能相互作用一致(Johnson，S.M.等人，Cell 120635-647(2005))。
表6.hsa-mir-155和hsa-let-7a的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄物靶的基因本體論分析(生物學(xué)過程)。

對(duì)hsa-mir-155和hsa-let-7a-2進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR分析，以確定前體miRNA表達(dá)是否也對(duì)腺癌患者具有預(yù)后影響。首先，對(duì)32對(duì)來自原始集合的腺癌(其中可以得到RNA)進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR分析。計(jì)算肺癌表達(dá)與相應(yīng)的非癌肺組織表達(dá)的比例，并根據(jù)表達(dá)比將病例分類。Kaplan-Meier存活分析(圖6，圖7)證實(shí)了具有高前體hsa-mir-155表達(dá)(p＝0.047；時(shí)序檢驗(yàn))或降低的前體hsa-let-7a-2表達(dá)(p＝0.037；時(shí)序檢驗(yàn))的患者的顯著更差的存活(表5B)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本文所述的預(yù)后分類標(biāo)準(zhǔn)，使用實(shí)時(shí)RT-PCR分析，分析了另一個(gè)獨(dú)立的32個(gè)腺癌的集合。Kaplan-Meier存活曲線(圖8，圖9)也顯示出該組群中前體hsa-mir-155表達(dá)的明顯關(guān)系(p＝0.033；時(shí)序檢驗(yàn))和hsa-let-7a-2表達(dá)的接近顯著性(p＝0.084；時(shí)序檢驗(yàn))(表5B)。另外，通過多變量Cox比例危險(xiǎn)回歸分析，發(fā)現(xiàn)高前體hsa-mir-155表達(dá)是差預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(表5B)。為了進(jìn)一步證實(shí)原始集合(32個(gè)病例)和附加集合(32個(gè)病例)中是否存在任何分組偏倚，對(duì)所有64個(gè)病例進(jìn)行單變量和多變量存活分析。與以前的結(jié)果相一致，這些分析顯示出前體hsa-mir-155表達(dá)的顯著性(表5B；圖10)。注意到，降低的前體hsa-let-7a-2表達(dá)也對(duì)腺癌患者具有類似的預(yù)后影響(表5B；圖11)，這與以前的報(bào)道(Takamizawa，J.等人，Cancer Res.64，3753-3756(2004))相一致。
實(shí)施例5NSCLC細(xì)胞系中miRNA表達(dá)的外遺傳調(diào)節(jié)的缺乏。
材料和方法 微陣列分析 如前所述進(jìn)行微陣列分析(Liu，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1019740-9744(2004)，也參見，實(shí)施例1)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 如上文所述進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(參見，例如實(shí)施例1)。
5-氮雜-dC和/或TSA處理 用含有1.0μM5-氮雜-dC(Sigma，St.Louis，MO)的培養(yǎng)基溫育A549和NCI-H157肺癌細(xì)胞(來自美國(guó)組織培養(yǎng)物保藏中心)48小時(shí)，然后在有1.0μM TSA(Sigma，St.Louis，MO)存在下，再溫育24小時(shí)。用

Reagent(Invitrogen)分離總RNA，如上所述進(jìn)行微陣列分析。每種處理進(jìn)行一式三份。
結(jié)果 miRNA微陣列用于分析在2種肺癌細(xì)胞系(A549和NCI-H157)中用5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-氮雜-dC)(一種DNA甲基化抑制劑)和/或曲古抑菌素A(TSA)(一種有效的組蛋白去乙酰化酶抑制劑)處理后多種不同miRNA的表達(dá)。盡管在用5-氮雜-dC或TSA處理后證實(shí)了已知轉(zhuǎn)錄沉默的基因(MY018B)的增強(qiáng)表達(dá)(圖12)，來自微陣列的miRNA在任一種化合物處理后都沒有表現(xiàn)出表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的變化，提示超甲基化和組蛋白去乙酰化在至少這2種細(xì)胞系中不導(dǎo)致降低水平miRNA表達(dá)。
未明確通過參考引用并入的本文引述的所有出版物的相關(guān)教導(dǎo)通過參考引用整體并入本文。盡管參考其優(yōu)選實(shí)施方案已具體地顯示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解其中可進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)上的多種不同變化，而不偏離所附權(quán)利要求包括的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.診斷受試者是否患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括，測(cè)量來自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，測(cè)試樣品中所述miR基因產(chǎn)物的水平的改變，指示著受試者患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a和let-7f-1。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-205和miR-216。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-155，miR-210，miR-126*和miR-224。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-155，miR-210，miR-126*，miR-126，miR-24-2，miR-219-1，miR-95，miR-192-prec，miR-220，miR-216-prec，miR-204-prec，miR-188，miR-198，miR-145和miR-224。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述肺癌是肺鱗狀細(xì)胞癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-205，miR-224，miR-191，miR-126*，miR-140，miR-210，miR-17-3p，miR-29b，miR-143，miR-203，miR-155，miR-21，miR-214，miR-212，miR-30a-5p和miR-197。
7.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平小于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
8.權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平大于對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平。
9.確定患有肺癌的受試者的預(yù)后的方法，其包括測(cè)量來自所述受試者的測(cè)試樣品中至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中
所述miR基因產(chǎn)物與肺癌不良預(yù)后有關(guān)；且
與對(duì)照樣品中相應(yīng)的miR基因產(chǎn)物的水平相比，肺測(cè)試樣品中所述至少一種miR基因產(chǎn)物的水平的改變指示著不良預(yù)后。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-155，miR-17-3p，miR-106a，miR-93，let-7a-2，miR-145，let-7b，miR-20和miR-21。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述肺癌是肺腺癌，且所述至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-155和let-7a-2。
12.診斷受試者是否患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括
(1)從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸；
(2)使所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供測(cè)試樣品的雜交譜；和
(3)對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜，
其中至少一種miRNA的信號(hào)的改變指示著受試者患有肺癌或處于發(fā)生肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
13.權(quán)利要求13的方法，其中與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)相比，至少一種miRNA的信號(hào)被減量調(diào)節(jié)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的信號(hào)相比，至少一種miRNA的信號(hào)被增量調(diào)節(jié)。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述微陣列包含針對(duì)選自下述的一種或多種miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a，let-7f-1和其組合。
16.診斷受試者是否患有不良預(yù)后的肺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，其包括
(1)從獲自受試者的測(cè)試樣品逆轉(zhuǎn)錄RNA，以提供一組靶寡脫氧核苷酸；
(2)使所述靶寡脫氧核苷酸與包含miRNA-特異性探針寡核苷酸的微陣列雜交，以提供所述測(cè)試樣品的雜交譜；和
(3)對(duì)比測(cè)試樣品雜交譜與從對(duì)照樣品產(chǎn)生的雜交譜，
其中信號(hào)的改變指示著受試者患有不良預(yù)后的肺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
17.權(quán)利要求16的方法，其中選自miR-155，miR-17-3p，miR-106a，miR-93，let-7a-2，miR-145，let-7b，miR-20和miR-21的至少一種miR基因產(chǎn)物的信號(hào)的改變，指示著受試者患有不良預(yù)后的肺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述肺癌是肺腺癌，且選自miR-155和let-7a-2的至少一種miR基因產(chǎn)物的信號(hào)的改變，指示著受試者患有不良預(yù)后的肺癌或處于發(fā)生不良預(yù)后的肺癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述微陣列包含至少一種針對(duì)選自下述的miRNA的miRNA-特異性探針寡核苷酸miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-192-prec，miR-224，miR-126，miR-24-2，miR-30a-5p，miR-212，miR-140，miR-9，miR-214，miR-17-3p，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216-prec，miR-219-1，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-125a-prec，miR-26a-1-prec，miR-146，miR-203，miR-199b-prec，let-7a-2-prec，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c-prec，miR-150，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125a，let-7f-1和其組合。
20.治療患有肺癌的受試者的肺癌的方法，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，受試者癌細(xì)胞中的至少一種miR基因產(chǎn)物被減量調(diào)節(jié)或增量調(diào)節(jié)，該方法包括
(1)當(dāng)癌細(xì)胞中的至少一種miR基因產(chǎn)物被減量調(diào)節(jié)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，條件是，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-1，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖；或
(2)當(dāng)癌細(xì)胞中的至少一種miR基因產(chǎn)物被增量調(diào)節(jié)時(shí)，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物，從而抑制受試者中癌細(xì)胞的增殖。
21.權(quán)利要求20的方法，其中步驟(1)中的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物選自miR-126*，miR-143，miR-192，miR-224，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-9，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216，miR-219-1，miR-125a，miR-26a-1，miR-199b，let-7a-2，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c，miR-101-1，miR-124a-3，let-7f-1和其組合。
22.權(quán)利要求20的方法，其中步驟(2)中的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-210，miR-155，miR-205，miR-24-2，miR-212，miR-214，miR-17-3p，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-146，miR-203，miR-150和其組合。
23.治療受試者的肺癌的方法，其包括
(1)測(cè)定與對(duì)照細(xì)胞相比，肺癌細(xì)胞中至少一種miR基因產(chǎn)物的量；和
(2)通過下述方式，改變?cè)诜伟┘?xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量
(i)如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量小于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，給受試者施用有效量的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，條件是，所述miR基因產(chǎn)物不是miR-15a或miR-16-1；或
(ii)如果在癌細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量大于在對(duì)照細(xì)胞中表達(dá)的miR基因產(chǎn)物的量，給受試者施用有效量的至少一種用于抑制所述至少一種miR基因產(chǎn)物的表達(dá)的化合物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中步驟(i)中的至少一種分離的miR基因產(chǎn)物選自miR-126*，miR-143，miR-192，miR-224，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-9，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216，miR-219-1，miR-125a，miR-26a-1，miR-199b，let-7a-2，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c，miR-101-1，miR-124a-3，let-7f-1和其組合。
25.權(quán)利要求23的方法，其中步驟(ii)中的至少一種miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-210，miR-155，miR-205，miR-24-2，miR-212，miR-214，miR-17-3p，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-146，miR-203，miR-150和其組合。
26.用于治療肺癌的藥物組合物，其包含至少一種分離的miR基因產(chǎn)物、或其分離的變體或生物活性片段，和藥學(xué)上可接受的載體。
27.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述至少一種分離的miR基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞在肺癌細(xì)胞中減量調(diào)節(jié)的miR基因產(chǎn)物。
28.權(quán)利要求26的藥物組合物，其中所述分離的miR基因產(chǎn)物選自miR-126*，miR-192，miR-224，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-9，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216，miR-219-1，miR-125a，miR-26a-1，miR-199b，1et-7a-2，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c，miR-101-1，miR-124a-3，miR-125b-1，let-7f-1和其組合。
29.用于治療肺癌的藥物組合物，其包含至少一種抑制miR表達(dá)的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。
30.權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述至少一種抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞在肺癌細(xì)胞中增量調(diào)節(jié)的miR基因產(chǎn)物是特異性的。
31.權(quán)利要求29的藥物組合物，其中所述至少一種抑制miR表達(dá)的化合物對(duì)選自下述的miR基因產(chǎn)物是特異性的miR-21，miR-191，miR-210，miR-155，miR-205，miR-24-2，miR-212，miR-214，miR-17-3p，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-146，miR-203，miR-150和其組合。
32.鑒定抗肺癌劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，和測(cè)量與肺癌細(xì)胞中降低的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的增加，指示著測(cè)試試劑是抗肺癌劑。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述miR基因產(chǎn)物選自miR-126*，miR-143，miR-192，miR-224，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-9，miR-124a-1，miR-218-2，miR-95，miR-145，miR-198，miR-216，miR-219-1，miR-125a，miR-26a-1，miR-199b，let-7a-2，miR-27b，miR-32，miR-29b-2，miR-220，miR-33，miR-181c，miR-101-1，miR-124a-3，let-7f-1和其組合。
34.鑒定抗肺癌劑的方法，其包括給細(xì)胞提供測(cè)試試劑，和測(cè)量與肺癌細(xì)胞中增加的表達(dá)水平有關(guān)的至少一種miR基因產(chǎn)物的水平，其中與對(duì)照細(xì)胞相比，所述細(xì)胞中所述miR基因產(chǎn)物的水平的降低，指示著測(cè)試試劑是抗肺癌劑。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述miR基因產(chǎn)物選自miR-21，miR-191，miR-210，miR-155，miR-205，miR-24-2，miR-212，miR-214，miR-17-3p，miR-106a，miR-197，miR-192，miR-146，miR-203，miR-150和其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于肺癌的診斷、預(yù)后和治療的新的方法和組合物。本發(fā)明還提供了鑒定抗肺癌劑的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/58GK101400361SQ200780006750
公開日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2007年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月5日
發(fā)明者C·M·克羅斯, 矢內(nèi)原望, C·C·哈里斯 申請(qǐng)人:俄亥俄州立大學(xué)研究基金會(huì)