專利名稱：一種體外生產(chǎn)活性蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種 以復(fù)制缺陷型腺病毒為載體，利用動(dòng)物乳腺細(xì)胞生產(chǎn)各種活性蛋白藥物的體外 生產(chǎn)活性蛋白的方法。
技術(shù)背景基因工程蛋白藥物的生產(chǎn)是目前國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。目前，生產(chǎn)外源基因 蛋白的方法大體上包括利用細(xì)菌，真菌，轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，體外培養(yǎng) 動(dòng)物細(xì)胞等幾種宿主來進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，最終獲得外源基因所表達(dá)的蛋白。以大腸桿菌為例的細(xì)菌作為原核生物的代表，被廣泛用于構(gòu)建生產(chǎn)各種蛋 白的基因工程菌株，但由于其細(xì)胞體內(nèi)缺乏基因翻譯后修飾功能，而只適用于 表達(dá)那些翻譯后不需加工修飾的或改造的蛋白。以酵母為代表的真菌則只能進(jìn) 行翻譯后簡(jiǎn)單的修飾，因此也不適用于生產(chǎn)翻譯后需復(fù)雜修飾和加工的蛋白。 而轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物雖能夠進(jìn)行翻譯后的蛋白修飾，但由于構(gòu)建復(fù)雜，生產(chǎn)技術(shù)要 求高，成本昂貴，而且外源基因的導(dǎo)入也容易造成宿主基因的突變，因此目前 也不是用于生產(chǎn)那些需要翻譯后進(jìn)行修飾的蛋白。目前，需要翻譯后修飾的蛋 白的生產(chǎn)大多利用培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行,但是往往某些特定的蛋白要在特 定的培養(yǎng)細(xì)胞中才能表達(dá)，這除了與宿主細(xì)胞本身的特性有關(guān)外，還與將外源 基因?qū)胨拗骷?xì)胞的載體有關(guān)。此外，利用體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行重組 蛋白的生產(chǎn)，還存在著如下缺陷(1)由于復(fù)雜的培養(yǎng)條件而造成生產(chǎn)成本過 高；(2)目前的培養(yǎng)體系不健全；(3)所生產(chǎn)蛋白的分離純化比較困難。因此，選用體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行那些需要復(fù)雜翻譯后修飾蛋白的生產(chǎn)仍然不是 生產(chǎn)這些重組蛋白的最佳選擇。近幾年有人(如專利文獻(xiàn)WO2004/034780等)根據(jù)乳腺生物反應(yīng)器原理， 利用腺病毒載體通過乳腺導(dǎo)管將外源基因?qū)雱?dòng)物乳腺，含有外源基因的腺病 毒轉(zhuǎn)染上皮細(xì)胞后，目標(biāo)蛋白基因在乳腺上皮細(xì)胞中獲得了表達(dá)；由于乳腺上 皮細(xì)胞的分泌特性，所表達(dá)的目標(biāo)蛋白可以分泌到乳汁中，從而在動(dòng)物乳汁中 獲得了高效表達(dá)的重組蛋白。雖然利用此法可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量目標(biāo)產(chǎn)物的 表達(dá)，但是利用以往的腺病毒載體通過動(dòng)物乳腺所生產(chǎn)的重組蛋白如紅細(xì)胞生 成素等主要存在以下兩個(gè)問題(1)利用目前采用的腺病毒如復(fù)制缺陷型腺病 毒或非復(fù)制缺陷型腺病毒作為載體所生產(chǎn)的一些蛋白活性不高；(2)利用以往 的腺病毒載體所表達(dá)的蛋白與天然蛋白存在著翻譯后修飾上的結(jié)構(gòu)差異，從而 導(dǎo)致一些蛋白基本無活性。因此，研制高效表達(dá)具有生物活性外源蛋白的載體 日益成為研究人員所重視的一個(gè)問題。 發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述技術(shù)體系所存在的缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種體外生產(chǎn) 活性蛋白的方法。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，，將目標(biāo) 蛋白基因及其修飾蛋白基因共同構(gòu)建入穿梭載體中同一啟動(dòng)子的下游，產(chǎn)生融 合基因，再利用分子重組的方式將含有此基因的表達(dá)框重組入腺病毒基因組骨 架中，構(gòu)建成重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體，經(jīng)體外輔助細(xì)胞包裝后，將含有該 融合基因的新型重組腺病毒導(dǎo)入動(dòng)物乳腺中，從動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞分泌的乳汁 中獲得具有生物活性的目標(biāo)基因蛋白。其具體操作步驟如下1) 將目標(biāo)蛋白基因cDNA序列和修飾蛋白基因cDNA序列按順序用IRES序列連接，然后插入穿梭載體的多克隆位點(diǎn)處，經(jīng)體外表達(dá)檢測(cè)獲得正確的表 達(dá)框，再將此穿梭載體與腺病毒骨架質(zhì)粒載體進(jìn)行分子重組，構(gòu)建成重組腺病毒載體；2) 用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)重組腺病毒載體，檢測(cè)新型重組腺病毒載體 的瞬時(shí)表達(dá)效率；3) 利用輔助包裝細(xì)胞進(jìn)行重組腺病毒的擴(kuò)增，并采用病毒純化試劑盒純 化重組腺病毒載體；4) 將重組腺病毒載體導(dǎo)入動(dòng)物乳腺，在乳汁中獲得高活性的目標(biāo)蛋白。 本發(fā)明所述的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體是將目標(biāo)蛋白基因及其修飾蛋白基因按順序用IRES序列連接并構(gòu)建入同一啟動(dòng)子的下游，產(chǎn)生重組的復(fù)制 缺陷型病毒載體。本發(fā)明中的目標(biāo)蛋白基因選自絲氨酸裂解性蛋白，如人蛋白C，神經(jīng)生 長(zhǎng)因子，胰島素，胰島素樣生長(zhǎng)因子，胰島素前受體，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子pi，甲狀 旁腺激素相關(guān)蛋白，凝血因子，胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，彈性蛋白酶，胞漿 素，Clr禾n Cls等。本發(fā)明中所述的修飾蛋白基因選自絲氨酸裂解酶，如人fbrin，酵母Kex2 內(nèi)肽酶，枯草桿菌蛋白酶等。其中步驟一中，所克隆的目標(biāo)蛋白基因的大小應(yīng)小于復(fù)制缺陷型病毒所能 容納的范圍減去3kb，如復(fù)制缺陷型病毒所能包裝的序列大小為14kb，則所克 隆的目標(biāo)基因應(yīng)小于llkb。本發(fā)明所述的穿梭載體是指既能夠在原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中表達(dá)，而且能夠與腺病毒骨架進(jìn)行重組的載體，如p幼i/"/e(STRAGEN)或 / 572w"/e-cmv(STRAGENE),/ iX:^7 (MICROBOX)或pZX7375(MICROBOX)等。本發(fā)明所用的腺病毒骨架載體為pA/e"^(STRAGENE)、 /^//G/ox^to) 或五"Oe(MICROBOX)。本發(fā)明正確表達(dá)框的獲得既包括利用western blotting等手段檢測(cè)蛋白的表 達(dá)，也包括核酸的序列測(cè)定。本發(fā)明的新型重組腺病毒載體的構(gòu)建通過酶切加以驗(yàn)證。本發(fā)明所述的真核細(xì)胞既包括能夠進(jìn)行輔助包裝腺病毒的細(xì)胞如 HEK293， AD293， 911細(xì)胞，也包括上皮細(xì)胞如乳腺上皮細(xì)胞等。本發(fā)明的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，也可采用電 融合等其他方法獲得轉(zhuǎn)入腺病毒載體的細(xì)胞。本發(fā)明所述的輔助細(xì)胞是指能輔助復(fù)制缺陷型病毒載體進(jìn)行包裝的細(xì)胞， 如HEK293細(xì)胞、911細(xì)胞等。本發(fā)明步所述的通過病毒試劑盒(Clonetech)的純化，腺病毒載體的滴度 達(dá)10、10"PFU/ml，可直接用于導(dǎo)入動(dòng)物乳腺。本發(fā)明所述的分泌的乳汁，經(jīng)離心分離乳清，常規(guī)緩沖液稀釋后獲得目標(biāo) 蛋白藥物。本發(fā)明是利用Western blotting檢測(cè)動(dòng)物乳汁中目標(biāo)蛋白的表達(dá)，ELASA 法檢測(cè)動(dòng)物乳汁中目標(biāo)蛋白的含量；同時(shí)，對(duì)所獲得的目標(biāo)蛋白進(jìn)行活性鑒定 以確定其表達(dá)活性。本發(fā)明中所獲得的活性蛋白的表達(dá)量達(dá)0.2-7g/L，蛋白表達(dá)持續(xù)時(shí)間達(dá)10天以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果1) 選用動(dòng)物乳腺生產(chǎn)蛋白藥物具有優(yōu)勢(shì)動(dòng)物乳腺是一個(gè)封閉的系統(tǒng)， 乳腺所表達(dá)的蛋白大多不會(huì)回流到血液循環(huán)，避免高效表達(dá)的外源蛋白對(duì)動(dòng)物 本身造成傷害。2) 所選用新型復(fù)制缺陷型腺病毒載體是真核表達(dá)載體系統(tǒng)，可正確運(yùn)載 并高效表達(dá)目標(biāo)蛋白藥物基因，由于腺病毒載體不整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，而 是以附加體形式游離在宿主細(xì)胞基因組外，這樣就避免了病毒載體插入宿主細(xì) 胞基因組中而可能引起宿主基因突變等后果，因而使用時(shí)更安全。3) 利用修飾蛋白基因與目標(biāo)蛋白基因共同構(gòu)建入腺病毒骨架載體中，修 飾蛋白基因的表達(dá)促進(jìn)了目標(biāo)蛋白的翻譯后修飾，可獲得具有完全生物活性的 蛋白。所產(chǎn)生的活性蛋白經(jīng)分離、純化、濃縮后，可直接作為藥物用于治療， 大大降低了藥物研發(fā)成本，特別是人類昂貴藥物蛋白的研發(fā)，可產(chǎn)生巨額的經(jīng) 濟(jì)效益。


圖1人蛋白C和furin的PCR擴(kuò)增結(jié)果 圖2重組腺病毒的基因組DNA電泳結(jié)果M為標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker, LawMa DNA/五co及I+所m/ III酶切片段依次為 21226bp、 5148bp、 4973bp、 4268bp、 3530bp、 2027bp、 1904bp、 1584bp、 1375bp、 947bp; A為重組腺病毒基因組DNA，大小約為36000bp。圖3含fiirin和目標(biāo)蛋白基因的重組腺病毒制備示意圖具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的具體實(shí)施方式
來進(jìn)一步說明本發(fā)明的方法 及其有益效果，但本發(fā)明的內(nèi)容完全不局限于此。本發(fā)明是以腺病毒骨架載體作為基本元素，將目標(biāo)蛋白基因和其翻譯后蛋 白修飾基因按順序共同構(gòu)建入同一啟動(dòng)子控制下的腺病毒骨架載體中，生成了 新的腺病毒載體；通過將此新的腺病毒載體導(dǎo)入動(dòng)物的乳腺，在動(dòng)物乳汁中獲得了該活性目標(biāo)蛋白的高效表達(dá)。 [實(shí)施例1下面就以人蛋白C的生產(chǎn)為例，人蛋白C (humanproteinC， hPC)是肝中合成 的絲氨酸蛋白酶前體，新生多肽由461個(gè)氨基酸殘基組成，包括42個(gè)氨基酸殘基 的前導(dǎo)肽、155個(gè)氨基酸殘基的輕鏈、連接輕重鏈的(Lys-Arg)KR二肽和262個(gè)氨 基酸殘基的重鏈組成。蛋白C(ProteinC，PC)在維生素K的存在下，進(jìn)行復(fù)雜的 翻譯后修飾，經(jīng)酶解、羧基化、羥基化和糖基化而成為成熟的PC。 PC是體內(nèi)重 要的抗凝物質(zhì)，對(duì)靜脈血栓擴(kuò)大、動(dòng)脈血栓形成、膿毒血癥、內(nèi)毒素血癥和彌 散性血管內(nèi)凝血等均具有預(yù)防和治療作用，此外，研究發(fā)現(xiàn)蛋白C還具有抗炎 作用。蛋白C的氨基酸序列如下SEQIDNo.l具體操作步驟如下(一)人蛋白C及修飾蛋白forin cDNA的合成、克隆和序列測(cè)定 1.人胎肝組織總RNA的提取(1) 將組織塊直接放入研缽內(nèi)，加入少許液氮，迅速研磨，待組織變軟 后，再加入少許液氮，繼續(xù)研磨，待組織充分磨碎后按50 100mg/mLTrizo1加 入Trizol試劑混成勻漿并將其轉(zhuǎn)入離心管中；(2) 室溫放置10min，待組織充分裂解；(3) 按200pL氯仿/mLTrizol加入氯仿，振蕩混勻2min，室溫放置lOmin;(4) 4°C lOOOOg離心15min;(5) 吸取上清水相轉(zhuǎn)移至另一離心管中。(6) 按0.5ml異丙醇/mLTrizol加入異丙醇，混勻室溫放置10min。(7) 4°C 12000g離心10min，去上清，RNA沉淀于管底。(8) 加入適量75%的乙醇溫和振蕩離心管，懸浮屏洗滌沉淀。(9) 4°C 12000g離心5min，去上清，RNA沉淀于管底。(10) 室溫干燥(晾干)5 10min,用20pLDEPC-H20或TE緩沖液溶 解RNA，用常規(guī)方法測(cè)定其含量。2. 反轉(zhuǎn)錄法合成總cDNA(1 )取1 一2嗎總RNA，加入DEPC處理的水至9.5 ^L， 70。C ， 5 —10 min，冰上存。(2) 50 )iL反應(yīng)體系2.5 )iL Oligo dT (20pmol/L)， 5 uL 10x RNA PCR buffer, 10 |iL MgCl2 (25mmol/L)， 5 dNTP (各10mmol/L)， 1.25 Rnase 抑制劑(40U/jiL) ， 2.5 AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5U/pL)，加入9.5 處理后的總 RNA。(3) 反應(yīng)條件30°C， lOmin， 42°C 15min， 99°C 5 min， 4°C 10min，產(chǎn) 物保存于-7(TC備用。3. 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增hPC cDNA和forin cDNA (1)設(shè)計(jì)如下特異引物用于PCR擴(kuò)增，使引物終濃度為20pM。 hPC上游引物'.5-GTCGGTACCATG TGGCAGCTCACAAG-3、 hPC下游引物5、-GGTCTCGAG CTAAGGTGCCCAGCTCT國(guó)3、Fu上游引物5、-TCTCTAGAATGGAGCTGAGGCCCTGGTTG國(guó)3、 Fu下游引物5、-GTGATATCTCAGAGGGCGCTCTGGTCTTTGAT-3、(2) lOOpL反應(yīng)體系中連續(xù)加入10xPCR buffer 10 pL， dNTP (各 2.5mmol/L) 16pL，上游引物ljiL，下游引物l)iL， 2中合成的cDNA產(chǎn)物2pL， 補(bǔ)加dH20至100 pL。(3) PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性5min， 95。C變性30s， 55-66°C退火30s， 72°C延伸3min， 30個(gè)循環(huán)，72。C再延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳證實(shí)正確后(附 圖1)，保存于-7(TC備用。4. PCR產(chǎn)物純化將PCR產(chǎn)物純化，使用商用試劑盒，如BIOTECH公司PCR產(chǎn)物快速純 化KIT。(1) 標(biāo)準(zhǔn)瓊脂電泳分離上述PCR產(chǎn)物，瓊脂糖濃度為1%， 100V穩(wěn)壓狀 態(tài)，電泳40 min。(2) 在紫外燈下，切取凝膠上相應(yīng)的DNA片斷，并稱重。(3) 按試劑盒要求， 一定比例加入溶膠緩沖液，于55-65"C溶膠，期間間 隔晃動(dòng)以充分溶解膠塊。(4) 添加溶膠后樣品于吸附柱子上，吸附DNA，用washing buffer漂洗2次。(5) 加入dH20于吸附柱子中，離心洗脫DNA，于-2(TC保存。5. cDNA的克隆將PCR純化產(chǎn)物用適當(dāng)酶切后，與相同酶切后的克隆載體進(jìn)行連接反應(yīng)。 (l)連接反應(yīng)lpLPCR純化產(chǎn)物，0.5pL載體質(zhì)粒，0.5pLT4DNALigase酶，lpL 10xT4DNALigase Buffer, 7jaLdH20。 14-16。C過夜孵育。(2) 細(xì)菌轉(zhuǎn)化取5-10pl上述連接反應(yīng)產(chǎn)物，用常規(guī)CaCl2化學(xué)法，熱 刺激轉(zhuǎn)化感受態(tài)"W5a。(3) 轉(zhuǎn)化菌鋪板于氨芐抗性(100^ig/mLAmp+)的固體細(xì)菌培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)。(4) 次日，挑取單菌落，接種于3-5mL液體LB培養(yǎng)液中，37"C保溫10-15h。(5) 常規(guī)堿裂解法小提質(zhì)粒，酶切分析鑒定重組質(zhì)粒的正確性。 6.基因序列測(cè)定將限制性酶切分析正確的重組陽性質(zhì)粒，純化后送至基因測(cè)序公司進(jìn)行基 因序列測(cè)定。本基因序列在上海INVITROGEN公司完成了測(cè)序，應(yīng)用國(guó)際上 通用BLAST基因序列軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果分析表明，所克隆的序列與國(guó)際GENE BANK中目標(biāo)蛋白基因序列完全一致，其完整的堿基序列如人蛋白C堿基序列 SEQIDNo.2、 Furin堿基序列SEQIDNo.3。(二)目標(biāo)基因蛋白(以人蛋白C基因?yàn)槔?腺病毒載體的構(gòu)建和病毒載 體生產(chǎn)(1 )用限制性內(nèi)切酶《;wl和Iol雙酶切hPC cDNA序列，同樣酶切載 體質(zhì)粒(如，； 57^"/e)，按(一)5步驟連接、轉(zhuǎn)化，獲得重組子(如/ 幼w"/e-Z^C)。(2) 將fiirin cDNA序列用^Z)"I和五co^V酶切后連入相同酶切的pIRES 質(zhì)粒，然后用lol和酶切出約3kb大小的片段，經(jīng)純化后插入相同酶 切的p57z敏/e-;2尸C中，獲得p57m///e-/LPF。(3) 將質(zhì)粒重組子(/^/^W/^/lPF)與含有腺病毒基因組的骨架質(zhì)粒一起構(gòu)建獲得重組人蛋白C腺病毒載體(圖2)。(4)用重組腺病毒載體(如A^戶F)在HEK293、 911細(xì)胞系中生產(chǎn)病毒 載體以及大量擴(kuò)增(圖3)。(三) 重組人蛋白C基因腺病毒載體導(dǎo)入動(dòng)物乳腺將重組人蛋白C基因腺病毒載體導(dǎo)入動(dòng)物乳腺組織，獲得乳腺中人蛋白C 基因的表達(dá)。(四) 乳汁中人蛋白C的檢測(cè)與生物活性鑒定常規(guī)Western Blot、 ELISA酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乳汁中重組hAPC蛋白的表達(dá)。 所用一抗為鼠抗人蛋白C單克隆抗體，二抗為HRP辣根過氧化酶標(biāo)記抗鼠IgG， 人蛋白C標(biāo)準(zhǔn)品為American diagnostica inc.產(chǎn)品。人活化蛋白C生物學(xué)活性檢測(cè)，通過與標(biāo)準(zhǔn)人活化蛋白C的抗凝血時(shí)間確 定其活性大小。[實(shí)施例2神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor, NGF-P )是促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化 的細(xì)胞因子，其在臨床應(yīng)用中具有重要的作用。神經(jīng)生長(zhǎng)因子的主要功能因子 是其P亞單位，其前體氨基酸序列如SEQ ID No.4。利用本發(fā)明進(jìn)行重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生產(chǎn)，其具體操作過程如蛋白C, 其中PCR擴(kuò)增采用的引物如下Ngf: 5 、 -GTGGTACCGCATAGCGTAATGTCCAT-3 、 NgR: 5 、 -GTCTCGAGTCGGCAGGTCAGGC-3 、經(jīng)連接、重組獲得的重組腺病毒轉(zhuǎn)染乳腺后，經(jīng)用抗NGF-e抗體檢測(cè)證實(shí)在動(dòng) 物乳汁中獲得了成熟的NGF-P 。利用大鼠PC12細(xì)胞經(jīng)體外鑒定，所獲得的NGF-3具有與標(biāo)準(zhǔn)品同樣的生物活性。 [實(shí)施例3酵母Kex2內(nèi)肽酶是與人flirin具有相似作用的絲氨酸裂解酶，我們將其與 蛋白C基因用IRES序列連接后，導(dǎo)入穿梭載體中，再經(jīng)同源重組獲得的重組 腺病毒同樣具有體外感染能力，并且用其感染動(dòng)物乳腺后，同樣獲得了具有活 性的蛋白C,其活性相當(dāng)于連接furin基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染動(dòng)物乳腺所獲得的 蛋白C的70%左右。此外應(yīng)當(dāng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì) 本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，以此方法或技術(shù)產(chǎn)生的各種活化蛋白藥物同樣屬于 本申請(qǐng)所屬權(quán)利要求書所限定的范圍之內(nèi)。序列表<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)<120> —種體外生產(chǎn)活性蛋白的方法 <130> no <160> 4<210> 1 <211> 461 <212> protein <213>人蛋白C <400〉MWQLTSLLLFVATWGISGTPAPLDSVFSSSERAHQVLRIRKRANSFLEEL 50 RHSSLERECIEEICDFEEAKEIFQNVDDTLAFWSKHVDGDQCLVLPLEHP 100 CASLCCGHGTCIDGIGSFSCDCRSGWEGRFCQREVSFLNCSLDNGGCTHY 150 CLEEVGWRRCSCAPGYKLGDDLLQCHPAVKFPCGRPWK脂EKKRSHLKRD 200 TEDQEDQVDPRLIDGKMTRRGDSPWQVVLLDSKKKLACGAVLIHPS群LT 250 AAHCMDESKKLLVRLGEYDLRRWEKWELDLDIKEVFVHPNYSKSTTDNDI 300 ALLHLAQPATLSQTIVPICLPDSGLAERELNQAGQETLVTGWGYHSSREK 350 EAK脂RTFVLNFIKIPVVPHNECSEVMS醒VSE麗LCAGILGDRQDACEG 400 DSGGPMVASFHGTWFLVGLVSWGEGCGLLHNYGVYTKVSRYLDWIHGHIR 450 DKEAPQKSWAP 461<210> 2 <211> 1366 <212> DNA <213>人蛋白C <400>atgtggcagctcacaagcctcctgctgttcgtggccacctggggaatttccggcacacca 60 gctcctcttgactcagtgttctccagcagcgcgcgtgcccaccaggtgctgcggatccgc 120 aaacgtgccaactccttcctggaggagctccgtcacagcagcctggagcgggagtgcata 180 gaggagEitctgtgacttcgaggaggccaaggaaattttccaaaatgtggatgacacactg 240 gccttctggtccaagcacgtcgacggtgaccagtgcttggtcttgcccttggagcacccg 300 tgcgccagcctgtgctgcgggcacggcacgtgcatcgacggcatcggcagcttcagctgc 360 gactgccgcagcggctgggagggccgcttctgccagcgcgaggtgagcttcctcaattgc 420 tcgctggacaacggcggctgcacgcattactgcctagaggaggtgggctggcggcgctgt 480 agctgtgcgcctggctacaagctgggggacgacctcctgcagtgtcaccccgcagtgaag 520 ttcccttgtgggaggccctggaagcggatggagaagaagcgcagtcacctgaaacgagac 580 acagaagaccaagaagaccaagtagatccgcggctcattgatgggaagatgaccaggcgg 640 ggagacagcccctggcaggtggtcctgctggactcaaagaagaagctggcctgcggggca 700 gtgctcatccacccctcctgggtgctgacagcggcccactgcatggatgagtccaagaag 760 ctccttgtcaggct"tggagagtatgacctgcggcgctgggagaagtgggagctggacctg 820 gacatcaaggaggtcttcgtccaccccaactacagcaagagcaccaccgacaatgacatc 880 gcactgctgcacctggcccagcccgccaccctctcgcagaccatagtgcccatctgcctc 940 ccggacagcggccttgcagagcgcgagctcaatcaggccggccaggagaccctcgtgacg 1000ggctggggctaccacagcagccgagagaaggaggccaagagaaaccgcaccttcgtcctc 1060aacttcatcaagattcccgtggtcccgcacaatgagtgcagcgaggtcatgagcaaca/tg 1120gtgtctgagaacatgctgtgtgcgggcatcctcggggaccggcaggatgcctgcgagggc 1180gacagtggggggcccatggtcgcctccttccacggcacctggttcctggtgggcctggtg 1240agctggggtgagggctgtgggctccttcacaactacggcgtttacaccaaagtcagccgc 1300tacctcgactggatccatgggcacatcagagacaaggaagccccccagaagagctgggca 1360 ccttag 1366<210> 3 <211〉 2445 <212> DNA <213>Furin <400>atggagctgaggccctggttgctatgggtggtagcagcaacaggaaccttggtcctgcta 60 gcagctgatgctcagggccagaaggtcttcaccaacacgtgggctgtgcgcatccctgga 120 ggcccagcggtggccaacagtgtggcacggaagcatgggttcctcaacctgggccagatc 180 ttcggggactattaccacttctggcatcgaggagtgacgaagcggtccctgtcgcctcac 240 cgcccgcggcacagccggctgcagagggagcctcaagtacagtggctggaacagcaggtg 360 gcaaELgcgacggactaaacgggacgtgtaccaggagcccacaggiccccaagtttcctcag 400 cagtggtacctgtctggtgtcactcagcgggacctgaatgtgaaggcggcctgggcgcag 460 ggctacacagggcacggcattgtggtctccattctggacgatggcatcgagaagaaccac 520 ccggacttggcaggcaattatgatcctggggccagttttgatgtcaatgaccaggaccct 580gacccccagcctcggtacacaicagatgaatgacaacaggcacggcacacggtgtgcgggg 640 gaagtggctgcggtggecaacaacggtgtctgtggtgtaggtgtggcctacaacgcccgc 700 attggaggggtgcgcatgctggatggcgaggtgac卿tgcagtggaggcacgctcgctg 760 ggcctgaaccccaaccacatccacatctacagtgccagctggggccccgaggatgacggc 840 aagacagtggatgggccagcccgcctcgccgaggaggccttcttccgtggggttagccag 900 ggccgaggggggctgggctccatctttgtctgggcctcggggaacgggggccgggaacat 960 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gaaggcttctccctgcaccagaagagctgtgtccagcactgccctccagggttcgccccc 1920<formula>formula see original document page 19</formula>
權(quán)利要求
1. 一種體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，將目標(biāo)蛋白基因及其修飾蛋白基因共同構(gòu)建入穿梭載體中同一啟動(dòng)子的下游，產(chǎn)生融合基因，再利用分子重組的方式將含有此基因的表達(dá)框重組入腺病毒基因組骨架中，構(gòu)建成重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體，經(jīng)體外輔助細(xì)胞包裝后，將含有該融合基因的新型重組腺病毒導(dǎo)入動(dòng)物乳腺中，從動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞分泌的乳汁中獲得具有生物活性的目標(biāo)基因蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，所述的重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體是將目標(biāo)蛋白基因及其修飾蛋白基因按順序構(gòu)建 入同一啟動(dòng)子的下游，產(chǎn)生重組的復(fù)制缺陷型病毒載體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，所述 的目標(biāo)蛋白基因是絲氨酸裂解性蛋白中人蛋白C、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、胰島素、胰 島素樣生長(zhǎng)因子、胰島素前受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子P1、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白、 凝血因子、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、胞漿素、Clr和Cls中任一種。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，所述 的修飾蛋白基因是絲氨酸裂解酶中人fiirin、酵母Kex2內(nèi)肽酶、枯草桿菌蛋白 酶中的一種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，所述 的穿梭載體是指既能夠在原核細(xì)胞中擴(kuò)增又能在真核細(xì)胞中表達(dá)，而且能夠與 腺病毒骨架載體進(jìn)行重組的載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，所述的穿梭載體是p幼敏/e、 p57m"/e-cwv、 / DC3〃和； Z)C5"中的任一種。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，所述 腺病毒骨架載體為/^&a^、 /^//G/ox和￡7 JOe中的任一種。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，所述 真核細(xì)胞是HEK293細(xì)胞、911細(xì)胞、羊乳腺上皮細(xì)胞、兔腺上皮細(xì)胞、牛腺 上皮細(xì)胞、豬乳腺上皮細(xì)胞中的任一種。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，其特征在于，所述 輔助包裝細(xì)胞是指能輔助復(fù)制缺陷型腺病毒載體進(jìn)行包裝的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體外生產(chǎn)活性蛋白的方法，是將目標(biāo)蛋白基因及其修飾蛋白基因共同構(gòu)建入穿梭載體中同一啟動(dòng)子的下游，產(chǎn)生融合基因，再利用分子重組的方式將含有此基因的表達(dá)框重組入腺病毒基因組骨架中，構(gòu)建成重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體，經(jīng)體外輔助細(xì)胞包裝后，將含有該融合基因的新型重組腺病毒載體導(dǎo)入動(dòng)物乳腺中，從動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞分泌的乳汁中獲得具有生物活性的目標(biāo)基因蛋白。應(yīng)用該方法所產(chǎn)生的活性蛋白經(jīng)分離、純化、濃縮后，可直接作為藥物用于治療，大大降低了藥物研發(fā)成本，特別是人類昂貴藥物蛋白的研發(fā)，可產(chǎn)生巨額的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/861GK101245351SQ20071019922
公開日2008年8月20日 申請(qǐng)日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日
發(fā)明者李青旺, 波 肖, 胡建宏, 韓增勝 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)