專利名稱：一種高產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，具體講是以 植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為手段，通過在細(xì)胞培養(yǎng)器中進(jìn)行的茶條槭懸浮細(xì) 胞培養(yǎng)，并在懸浮細(xì)胞中分離產(chǎn)生沒食子酸。本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
茶條槭(Acer ginnala Maxim)屬槭樹禾斗，槭樹屬；為落葉小 喬木或灌木，株高可達(dá)8-IO米；樹形優(yōu)美，葉型清秀，尤其是秋后 葉色鮮紅艷麗，極具觀賞價(jià)值，是園林綠化和觀賞樹種。茶條槭在我 國主要分布在東北山地、內(nèi)蒙古及華北山地，長江流域也有生長，在 黑龍江省主要分布在小興安嶺、完達(dá)山、張廣才嶺等山區(qū)，具耐寒抗 風(fēng)雪的特性，因此是一難得的東北地區(qū)綠化樹種。茶條槭嫩葉可制成 茶葉，具有生津止渴，退熱明目之功效；更主要的是茶條槭樹葉中含 有大量的沒食子酸(Gallic acid,GA)，即3、 4、 5—三羥基苯甲酸， 沒食子酸是醫(yī)藥、紡織、石油、化工、機(jī)械、國防、輕工業(yè)、塑料、 食品等工業(yè)的重要原料，在醫(yī)藥工業(yè)中，沒食子酸及其衍生物對冠心 病、腦血栓、胃潰瘍、抗菌、抗血吸蟲、抗病毒性肝炎、老年性癡呆、 抗腫瘤等顯示出多方面的功效，在化工、輕工、食品等方面，沒食子 酸作為原料均有廣泛的應(yīng)用。目前銷售價(jià)格在8 10萬元4—、現(xiàn)今市場對沒食子酸的需求量 越來越大，僅黑龍江省每年就計(jì)劃生產(chǎn)600噸，需茶條槭干葉8000 噸左右。這種方式使茶條槭基因資源遭到了很大浪費(fèi)和破壞，原料的 質(zhì)量和數(shù)量很難得到保證，此外，葉片也受到季節(jié)的限制，同時(shí)，天 然樹葉中沒食子酸含量很低。因此沒食子酸的原料保障就成為其是否 能成功走向市場的最為關(guān)鍵因素，植物細(xì)胞培養(yǎng)是解決問題的有效途 徑之一。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮細(xì)胞，來代
替茶條槭葉片。此細(xì)胞生長快、周期短、不受季節(jié)限制、產(chǎn)沒食子酸。 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明經(jīng)過多年的時(shí)間，在分析、研究國內(nèi) 外沒食子酸研究成果的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)的研究了植物組織細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 技術(shù)應(yīng)用到茶條槭有效次生代謝產(chǎn)物沒食子酸的理論、技術(shù)及可行 性，包括從材料選擇、外植體誘導(dǎo)、懸浮培養(yǎng)系的建立過程，完成了 實(shí)驗(yàn)室研究，建立了茶條槭懸浮培養(yǎng)體系，獲得了大量的茶條槭懸浮 培養(yǎng)細(xì)胞，并檢測此細(xì)胞產(chǎn)沒食子酸。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是取茶條槭組培苗的幼嫩葉片或莖 段，在固體培養(yǎng)基中得到愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基 中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)并篩選高效合成沒食子酸的懸浮細(xì)胞系。培養(yǎng)選出的 細(xì)胞系，收獲細(xì)胞，提取沒食子酸。選出的細(xì)胞系采用繼代保存和-196 "C液氮中保存。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、 本發(fā)明用茶條槭懸浮細(xì)胞代替葉片，保護(hù)了環(huán)境資源。2、 本發(fā)明的茶條槭懸浮細(xì)胞生長快、周期短、不受季節(jié)限制。3、 本發(fā)明的茶條槭懸浮細(xì)胞生產(chǎn)沒食子酸比用茶條槭葉片生產(chǎn)沒食子酸提高了81.6倍。4、 本發(fā)明的茶條槭懸浮細(xì)胞成本低，所需勞動力少。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述-本發(fā)明取茶條槭組培苗的幼嫩葉片和莖段為外植體，接種于WPM+TDZ0. 01 mg/L +6-BA0. 1 mg/L固體培養(yǎng)基中，23-25。C，光照培 養(yǎng)15天獲得愈傷組織。然后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入WPM+TDZ0, 002-0. 01mg/L +6-BAO. 05-0. 15 mg/L固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，7-15天1繼代。選擇長勢好的愈傷組織轉(zhuǎn)入3倍的大量元素WPM液體培養(yǎng)基中， 激素為TDZO. 004mg/L和6-BAO. lmg/L，蔗糖為2%， pH值為5. 8-6. 0，培養(yǎng)條件.-23-25。C， 120轉(zhuǎn)/min，光照8h/d，光照強(qiáng)度16001,x。 28天為一周期，3代后吸取懸浮液轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基上鋪板，3周后長 成細(xì)胞系，分別取不同顏色和質(zhì)地的生長旺盛細(xì)胞系進(jìn)行一個(gè)繼代的
懸浮培養(yǎng)，擴(kuò)大繁殖后，重新繼代，1個(gè)周期后收集細(xì)胞，測定沒 食子酸含量，篩選沒食子酸含量高且細(xì)胞生長迅速的懸浮細(xì)胞系。懸浮細(xì)胞系的超低溫保存取培養(yǎng)14d的細(xì)胞進(jìn)行超低溫保存； 10。/。二甲基亞砜(DMS0)+8。/。葡萄糖作為冰凍保護(hù)劑；按如下程序降溫在(TC中預(yù)處理30min后移入-2(TC中停留180min，然后轉(zhuǎn)入-7(TC中 停留30min，最后投入-196。C液氮中保存。實(shí)例l:在無菌條件下，取圖1所示茶條槭愈傷組織20g/L，加入 到50-100ml的3WPM液體培養(yǎng)基中，激素為TDZO. 004mg/L和 6-BA0. lmg/L，蔗糖為2%， pH值為5.8-6.0。按上述培養(yǎng)條件進(jìn)行培 養(yǎng)，培養(yǎng)后得到如圖2所示的細(xì)胞系，收集細(xì)胞得到結(jié)果為鮮重達(dá) 47.82g，干重可達(dá)2. 23g，沒食子酸含量達(dá)0. 229%。實(shí)例1說明懸浮細(xì)胞生長速度快、周期短、沒食子酸含量高。


圖l適于茶條槭懸浮培養(yǎng)的愈傷組織圖2高效生產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系圖3沒食子酸標(biāo)樣液相色譜4懸浮培養(yǎng)茶條槭樣品沒食子酸液相色譜圖。
權(quán)利要求
1、一種高產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞系，其特征在于該細(xì)胞是產(chǎn)茶條槭次生代謝產(chǎn)物——沒食子酸的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，其 特征在于該懸浮細(xì)胞是茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，其 特征在于此懸浮培養(yǎng)細(xì)胞能產(chǎn)生沒食子酸。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，其 特征在于此懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在3倍大量元素WPM培養(yǎng)基上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞， 其特征在于在3WPM培養(yǎng)基上添加TDZ—0. 002 0. 01mg/L、 6-BA— 0. 05 0. 15 mg/L，蔗糖為2 3%， pH值5. 8-6.0。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞， 其特征在所說的TDZ為噻重氮基苯基脲，6-BA為6-芐基氨基嘌呤。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，其 特征在于此懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在23-25°C， 110 130轉(zhuǎn)/min，光照8 10h/d，光照強(qiáng)度1400 1700Lx條件下培養(yǎng)，7-15天繼代1次。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)沒食子酸的茶條槭懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。其特征在于將適量的茶條槭愈傷組織接種于WPM+TDZ0.002-0.01mg/L+6-BA0.05-0.15mg/L固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，15-20天1繼代。選擇長勢好的愈傷組織轉(zhuǎn)入3倍的大量元素WPM液體培養(yǎng)基中，激素為TDZ0.002-0.010mg/L和6-BA0.05-0.15mg/L，蔗糖為2-3％，pH值為5.8-6.0，接種量鮮重為20-40g/L。23-25℃，110-130轉(zhuǎn)/min，光照8-10h/d，光照強(qiáng)度1400-1700Lx，7-15天1繼代，20-30天為一周期，1個(gè)周期后收集細(xì)胞。鮮重達(dá)478.2g/L，干重可達(dá)22.3g/L，沒食子酸含量達(dá)2.29％，沒食子酸產(chǎn)量0.51g/L，一年可收獲6.1227g/L。本發(fā)明是第一次在茶條槭植物中能通過細(xì)胞工程方法高產(chǎn)沒食子酸的懸浮細(xì)胞。解決了沒食子酸生產(chǎn)上的原料問題，易操作，周期短，成本低，能節(jié)省大量人力、物力、提高勞動生產(chǎn)率，進(jìn)而保護(hù)環(huán)境，保護(hù)茶條槭植物資源。
文檔編號C12N5/04GK101210231SQ20071014487
公開日2008年7月2日 申請日期2007年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者曾凡鎖, 李淑娟, 由香玲, 范桂枝, 杰 董, 詹亞光, 齊鳳慧 申請人:東北林業(yè)大學(xué);詹亞光;齊鳳慧