專利名稱：生產(chǎn)l－賴氨酸的方法
本申請是申請日為1997年6月5日，申請?zhí)枮?7112960.6，發(fā)明名稱為“生產(chǎn)L-賴氨酸的方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
本發(fā)明涉及用培養(yǎng)普通發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的棒桿菌的變異菌株或借助于基因工程技術(shù)得到的類似菌株生產(chǎn)L-賴氨酸的方法。
用于飼料添加劑的L-賴氨酸通常用棒桿菌的生產(chǎn)L-賴氨酸的變異菌株發(fā)酵方法生產(chǎn)的。目前許多已知的L-賴氨酸產(chǎn)生菌都是由屬于棒桿菌的野生型菌株經(jīng)過人工誘變得到。
對于棒桿菌，已經(jīng)公開的載體質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中可以自主復(fù)制并有抗藥標(biāo)記基因(見美國專利No.4,514,502)、也闡明了引進(jìn)基因到細(xì)菌細(xì)胞中的方法(實施例、日本專利申請?zhí)卦S公開No.2-207791)。同時提出用上述技術(shù)培育L-蘇氨酸或L-異亮氨酸產(chǎn)生菌的可能性(見美國專利No.4,452,890和No.4,442,208)。關(guān)于L-賴氨酸產(chǎn)生菌的育種，已知技術(shù)將參與L-賴氨酸生物合成的基因引入到載體質(zhì)粒中并在細(xì)菌細(xì)胞中擴增。(實施例、日本專利申請?zhí)卦S公開No.56-160997)。
已知的L-賴氨酸生物合成的基因包括，實施例，二氫二皮考啉酸還原酶基因(日本專利申請?zhí)卦S公開No.7-75578)、參與L-賴氨酸生物合成的克隆二氨庚二酸脫氫酶基因(Ishino，S.等人，NucleicAcids Res.，15，3917(1987))、以及磷烯醇丙酮酸羧化酶基因(日本專利申請?zhí)卦S公開No.60-87788)、二氫二皮考啉酸合成酶基因(日本專利公開No.6-55149)、二氨庚二酸脫羧酶基因(日本專利申請?zhí)卦S公開No.60-62994)；這些基因的擴增影響L-賴氨酸的生產(chǎn)力。
如上所述，借助于L-賴氨酸生物合成基因的擴增已經(jīng)得到改善L-賴氨酸生產(chǎn)力的某些成功結(jié)果。然而，雖然基因的擴增能夠改善L-賴氨酸的生產(chǎn)力，但是某些基因的擴增卻降低了細(xì)菌生長速度，導(dǎo)致降低L-賴氨酸的生產(chǎn)速度。
還沒有一個報告說明以增強L-賴氨酸生物合成基因來改善細(xì)菌的生長。目前，還不知道誰能成功地用結(jié)合各種L-賴氨酸生物合成基因的方法在棒桿菌中不抑制菌的生長從而明顯提高L-賴氨酸產(chǎn)量。
本發(fā)明的目的是，用增強棒桿菌內(nèi)組合的多種L-賴氨酸生物合成基因方法，改善L-賴氨酸生產(chǎn)力但不降低菌的生長速度。
當(dāng)產(chǎn)品是由微生物發(fā)酵得到時，與引進(jìn)的原料有關(guān)的生產(chǎn)速度及產(chǎn)品的產(chǎn)量是極其重要的因素。增加單位發(fā)酵設(shè)備生產(chǎn)速度可以明顯降低生產(chǎn)成本。發(fā)酵速度與發(fā)酵產(chǎn)量彼此相融是在工業(yè)生產(chǎn)中極其重要的。本發(fā)明提出了解決棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸中存在的上述問題。
本發(fā)明的原理是基于這樣一個事實通過增強二氨庚二酸脫羧酶的DNA編碼順序(必要時，下文二氨庚二酸脫羧酶稱作“DDC”，DDC蛋白的編碼基因稱作“LysA”)和二氨庚二酸脫氫酶的DNA編碼順序(必要時，二氨庚二酸脫氫酶”稱作“DDH”，DDH蛋白的編碼基因稱作“ddh”)兩者與每一個單獨增強DNA順序比較，可以改善棒桿菌的生長，也改善了L-賴氨酸的生產(chǎn)速度。
換句話說，本發(fā)明是基于包括二氨庚二酸脫氫酶的DNA編碼順序和二氨庚二酸脫羧酶的DNA編碼順序在內(nèi)的重組DNA在棒桿菌中的自主復(fù)制。
另一方面，本發(fā)明提供了載有增強了的二氨庚二酸脫氫酶的和二氨庚二酸脫羧酶的DNA編碼順序的棒桿菌。
還有，本發(fā)明提供了生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括上述棒桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)以產(chǎn)生和積累L-賴氨酸、并從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸的步驟。
本發(fā)明提到的棒桿菌是在Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology，8th ed.，頁599(1974)手冊中定義的一組微生物，它們是不能形成芽孢、非耐酸的好氧革蘭氏陽性桿菌。棒桿菌包括屬于棒桿菌屬的細(xì)菌、已經(jīng)歸類于短桿菌屬的細(xì)菌但目前合并到棒桿菌屬中的細(xì)菌，以及與棒桿菌屬細(xì)菌有著密切的親緣關(guān)系的屬于短桿菌屬的細(xì)菌。
根據(jù)本發(fā)明，可以改善棒桿菌的生長速度和生產(chǎn)L-賴氨酸的能力。本發(fā)明可以應(yīng)用到普通的L-賴氨酸產(chǎn)生菌，也可用于具有高產(chǎn)L-賴氨酸的能力的菌株。


圖1.描述構(gòu)建攜帶lysA的質(zhì)粒p299LYSA的方法。
圖2.描述構(gòu)建攜帶lysA和Brevi.-ori的質(zhì)粒pLYSAB的方法。
圖3.描述構(gòu)建攜帶ddh和Brevi.-ori的質(zhì)粒pPK4D的方法。
圖4.描述構(gòu)建攜帶ddh和lysA的質(zhì)粒p399DL的方法。
圖5.描述構(gòu)建攜帶ddh、lysA和Brevi.-ori的質(zhì)粒pDL的方法。
圖6.描述構(gòu)建攜帶lysC的質(zhì)粒p399AKYB和p399AK9B的方法。
圖7.描述構(gòu)建攜帶dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pDPRB的方法。
圖8.描述構(gòu)建攜帶dapA和Brevi.-ori的質(zhì)粒pDPSB的方法。
圖9.描述構(gòu)建攜帶lysC、dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pCRCAB的方法。
圖10.描述構(gòu)建攜帶突變型lysC、dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pCB的方法。
圖11.描述構(gòu)建攜帶dapA、dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pAB的方法。
圖12.描述構(gòu)建攜帶突變型lysC、dapA、dapB和Brevi.-ori的質(zhì)粒pCAB的方法。
圖13.描述構(gòu)建攜帶突變型lysC、dapA、dapB、Brevi.-ori和lysA的質(zhì)粒pCABL的方法。
圖14.描述構(gòu)建攜帶突變型lysC、dapA、dapB、ddh、lysA和Brevi.-ori的質(zhì)粒pCABDL的方法。
本發(fā)明詳細(xì)說明如下<1>用于本發(fā)明的L-賴氨酸生物合成基因的制備用于本發(fā)明的L-賴氨酸生物合成基因可以分別地由下列步驟得到從細(xì)菌作為DNA供體制備染色體DNA、用載體質(zhì)?；蝾愃莆飿?gòu)建染色體DNA文庫、從文庫中篩選載有所需基因的菌株、從篩選的菌株回收基因插入的重組DNA。用于本發(fā)明的L-賴氨酸生物合成基因的DNA供體沒有特殊的限制，只要所需的L-賴氨酸生物合成基因能夠表達(dá)在棒桿菌細(xì)胞的功能酶蛋白。但是，DNA的供體最好是棒桿菌。
已經(jīng)知道來源棒桿菌的lysA和ddh兩種基因的順序。因此，可以根據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)方法經(jīng)過擴增得到這些基因(PCR；參見White，T.J.等人，Trends Genet.，5，185(1989))。
用于本發(fā)明的每一種L-賴氨酸生物合成基因可以采用下面例舉的某些方法得到。
(1)突變型lysA的制備根據(jù)例如Saito和Miura的方法(H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963))，制備染色體DNA，并根據(jù)聚合酶鏈反應(yīng)方法(PCR；參見White，T.J.等人，Trends Genet.，5，185(1989))擴增lysA，可以從棒桿菌的染色體中分離出lysA。DNA的供體沒有特殊的限制，然而用Brevibacterium lactofermentumATCC 13869菌株來舉例說明。
在棒桿菌中，lysA和argS一起形成一個操縱子(精氨酰-tRNA合成酶基因)并且lysA處于argS的下游。lysA的表達(dá)由處于argS上游的啟動子調(diào)節(jié)(參見Journal of Bacteriology，Nov.，7356-7362(1993))。谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)的這些基因的DNA順序是已知的(參見MolecularMicrobiology，4(11)，1819-1830(1990)；Molecular and General Genetics，212，112-119(1988))，在該基礎(chǔ)上，可以制備PCR的DNA引物。這樣的DNA引物，特以23-mers of DNA為例，它們的核苷酸順序分別顯示在順序表SEQ ID NO1(相當(dāng)于Molecular Microbiology，4(11)，1819-1830(1990)描述的核苷酸順序中的核苷酸數(shù)11-33)和SEQ ID NO2(相當(dāng)于Molecular and General Genetics，212，112-119(1988)描述的核苷酸順序中的核苷酸數(shù)1370-1392)。
下文描述的實例中，為了增強lysA，采用含有啟動子、argS和lysA的DNA片斷。然而，argS對本發(fā)明來說是不必要的。因為容許用lysA剛好連接在啟動子的下游的DNA片斷。
在SEQ ID NO3中舉例，含有argS和lysA的DNA片斷的核苷酸順序和按核苷酸順序推導(dǎo)的氨基酸編碼順序。由argS編碼的氨基酸順序?qū)嵤├@示在SEQ ID NO4中，由lysA編碼的氨基酸順序?qū)嵗@示在SEQ ID NO5中。除了編碼這些氨基酸順序的DNA片斷以外，本發(fā)明也可同樣使用實質(zhì)上與在SEQ ID NO5中氨基酸順序相同的其他DNA片斷，即具有由于例如取代、缺失或插入一個或多個對DDC活性沒有實質(zhì)性影響的氨基酸而產(chǎn)生變異的氨基酸順序。
可根據(jù)普通方法使用應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的380B型DNA合成儀和磷酸酰胺酯方法(參見Tetrahedron Letters(1981)，22 1859)合成DNA。根據(jù)廠家提供的方法用Taq DNA聚合酶和Takara Shuzo公司生產(chǎn)的PJ2000型DNA擴增儀可以實行PCR。
最好是將經(jīng)PCR擴增的lysA與在大腸桿菌和/或棒桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體DNA相連，以制備重組DNA，而且預(yù)先將制備好的重組DNA引入大腸桿菌細(xì)胞中。這樣的準(zhǔn)備工作使下列操作容易進(jìn)行。在大腸桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的載體最好是能在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體，包括例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398和RSF1010。
當(dāng)具備能使質(zhì)粒在棒桿菌中自主復(fù)制的DNA片斷插入這些載體時，它們可用作在大腸桿菌和/或棒狀兩種細(xì)菌中都可以自主復(fù)制的所謂穿梭載體。
這樣的穿梭載體如下所示。在國際儲存文庫權(quán)威機構(gòu)中藏有每一種載體的微生物和它們的在園括號中的登記號碼。
pHC4大腸桿菌AJ12617(FERM BP-3532)pAJ655大腸桿菌AJ11882(FERM BP-136)
谷氨酸棒桿菌SR8201(ATCC 39135)PAJ 1844大腸桿菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒桿菌SR8202(ATCC 39136)PAJ611大腸桿菌AJ11884(FERM BP-138)PAJ3148谷氨酸棒桿菌SR8203(ATCC 39137)PAJ440枯草桿菌AJ11901(FERM BP-140)可用如下方法從儲存的微生物得到這些載體。在對數(shù)生長期收集的細(xì)胞用溶菌酶和SDS裂解，溶菌產(chǎn)物在30,000×g下離心分離得到上清液。將聚乙二醇加入上清液中，借助氯化銫-溴化乙錠平衡密度梯度離心進(jìn)行分部分離和純化。
根據(jù)例如D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology，68，326(1979)或用氯化鈣處理受體細(xì)胞以增加DNA的透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))引入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
(2)ddh的制備用PCR方法從棒桿菌的染色體中制備含有ddh的DNA片斷。DNA的供體沒有專門的限制，然而，例舉的菌株是BrevibacteriumlactofermentumATCC 13869菌株。
已知谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)的DDH基因(Ishino、S.等人，Nucleic Acids Res.，15，3917(1987))，在此基礎(chǔ)上可以制備PCR的引物。這樣的DNA引物以分別具有順序表的SEQ ID NO6和NO7中所示核苷酸順序的20-mers DNA為具體的實例。DNA的合成、PCR以及攜帶ddh的質(zhì)粒的制備都可以用與上述用于lysA的同樣方法進(jìn)行。
含有ddh的DNA片斷的核苷酸順序以及由核苷酸順序推導(dǎo)出來的氨基酸順序在SEQ ID NO8中說明。SEQ ID NO9只顯示氨基酸順序。除了編碼該氨基酸順序的DNA片斷外，本發(fā)明也可以同樣使用編碼與SEQ ID NO9中所示的基本相同的氨基酸順序(即具有基于例如取代、缺失或插入一個或多個對DDH活性沒有實質(zhì)性影響的氨基酸的變異體的氨基酸順序)的DNA片斷。
<2>本發(fā)明的棒桿菌和重組DNA本發(fā)明的棒桿菌含有用增強的編碼二氨庚二酸脫羧酶(lysA)的DNA順序和編碼二氨庚二酸脫氫酶(ddh)的DNA順序。術(shù)語“增強DNA順序””含義例如是用增加基因的拷貝數(shù)、使用強啟動子、使用具有高比活性酶的編碼基因或混合這些方法等提高細(xì)胞內(nèi)由DNA順序編碼的酶活性。
上面描述過DNA順序的棒桿菌是產(chǎn)生L-賴氨酸的棒桿菌，其實例包括產(chǎn)生L-賴氨酸的野生菌株、人工突變菌株和用基因工程增強了L-賴氨酸生產(chǎn)力的棒桿菌。即使細(xì)菌L-賴氨酸的生產(chǎn)力很低，也可以通過增強lysA和ddh提高L-賴氨酸的生產(chǎn)力。如果細(xì)菌的L-賴氨酸生產(chǎn)力高，通過增強lysA和ddh可能會使其L-賴氨酸生產(chǎn)效率有更大的提高。
(1)屬于棒桿菌的L-賴氨酸產(chǎn)生菌株用于引進(jìn)lysA和ddh的棒桿菌包括例如下列L-賴氨酸產(chǎn)生菌株嗜乙酰乙酸棒桿菌Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870；嗜乙酰谷氨酸棒桿菌CorynebacteriumATCC15806；美棒桿菌(Corynebacterium callunae)ATCC 15991；谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032；叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020；(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869；(Corynebacterium lilium)ATCC 15990；黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067；Corynebacterium melassecolaATCC 17965；Brevibacterium saccharolyticumATCC 14066；
Brevibacterium immariophilumATCC 14068；Brevibacterium roseumATCC 13825；Brevibacterium thiogenitalisATCC 19240；嗜氨微桿菌Microbacterium ammoniaphilumATCC 15354；Corynebacterium thermoaminogenesAJ12340(FERM BP-1539)。
除了上述的菌株外，那些可用作增強lysA和ddh的宿主菌株，包括例如由上述菌株衍生來的有L-賴氨酸生產(chǎn)力的突變株。這樣的人工突變株包括下列菌株S-(2-氨乙基)半胱氨酸(下文縮寫為“AEC”)抗性突變株(Brevibacterium lactofermentumAJ11082(NRRL B-11470)，日本專利公告No.56-1914、56-1915、57-14157、57-14158、57-30474、58-10075、59-4993、61-35840、62-24074、62-36673、5-11958、7-112437、和7-112438)；其生長需要一種氨基酸(諸如L-高絲氨酸)的突變株(日本專利公告No.48-28078和No.56-6499)；表現(xiàn)AEC抗性并需要一種氨基酸(諸如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨酸)的突變株(美國專利No.3,708,395和No.3,825,472)；對DL-α-氨基-ε-己內(nèi)酰胺、α-氨基-月桂內(nèi)酰胺、天門冬氨酸-類似物、磺胺藥物、醌類(quinoid)、和N-月桂亮氨酸有抗性的L-賴氨酸產(chǎn)生突變株；對oxyaloacetate脫羧酶或呼吸系統(tǒng)的酶的抑制劑有抗性的L-賴氨酸產(chǎn)生突變株；(日本專利申請?zhí)卦S公開No.50-53588、50-31093、52-102498、53-9394、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995、和56-39778，和日本專利公告No.53-43591和53-1833)；需要肌醇或乙酸的L-賴氨酸產(chǎn)生突變株(日本專利申請?zhí)卦S公開No.55-9784和56-8692)；對氟丙酮酸或不低于34℃的溫度敏感的L-賴氨酸產(chǎn)生突變株；(日本專利申請?zhí)卦S公開No.55-9783和53-86090)；和對乙二醇有抗性并生產(chǎn)L-賴氨酸、屬于短桿菌屬和棒桿菌屬的生產(chǎn)突變株(美國專利No.4,411,997)。
(2)通過基因重組增強L-賴氨酸生產(chǎn)力的L-賴氨酸產(chǎn)生棒桿菌如果用基因工程方法，例如引入具有突變的酶(使其對反饋抑制不敏感，在參與L-賴氨酸生物合成的酶中，野生型的該酶受反饋抑制)的編碼基因，或增強除lysA和ddh外的L-賴氨酸的生物合成的基因來增強了棒桿菌的L-賴氨酸生產(chǎn)，那么通過增強lysA和ddh可以進(jìn)一步提高L-賴氨酸的生產(chǎn)速度。
L-賴氨酸生產(chǎn)力增強的棒桿菌包括含有編碼對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制不敏感的天門冬氨酸激酶的DNA順序(天門冬氨酸激酶下文稱為“AK”、編碼AK蛋白的基因下文稱為“l(fā)ysC”，必要時對編碼L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制不敏感的AK蛋白的基因)和編碼二氫二皮考啉酸還原酶的增強的DNA順序(二氫二皮考啉酸還原酶下文稱為“DDPR”、必要時編碼DDPR蛋白的基因下文稱為“dapB”)的棒桿菌，以及還含有編碼二氫二皮考啉酸合成酶的增強的DNA順序(二氫二皮考啉酸合成酶下文稱“DDPS”、必要時編碼DDPS蛋白的基因下文稱為“dapA”)的棒桿菌。用于本發(fā)明的每一個L-賴氨酸的生物合成基因可按照下面例舉的某些方法得到。
(i)突變型lysC的制備含有突變型lysC的DNA片斷可以由L-賴氨酸和L-蘇氨酸對AK活性的協(xié)同反饋抑制作用實質(zhì)上不敏感的突變菌株制備(InternationalPublication No.WO 94/25605)。例如用常用的突變處理(諸如紫外線照射)和突變劑(諸如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)處理，由一組源于經(jīng)過誘變處理的棒桿菌的野生型細(xì)胞，能夠得到這樣的突變型。AK的活性可用Miyajima(Miyajima，R.等人，The Journal of Biochemistry(1968)，63(2)，139-148)的方法測定。這樣的突變株的最優(yōu)選的代表是由Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869(現(xiàn)更名為Corynebacteriumglutamicum)的野生型菌株經(jīng)過突變處理得到L-賴氨酸產(chǎn)生菌AJ3445(FERM P-1944)。
另一種方法，體外誘變處理含有野生型lysC的質(zhì)粒DNA也能夠得到突變型lysC。另一方面，具體突變得到L-賴氨酸和L-蘇氨酸對AK的協(xié)同反饋抑制不敏感的資料已為人知(國際專利No.WO94/25605)。因此，根據(jù)這些資料突變型lysC也可以由野生型的lysC通過例如位點誘變方法得到。
含有l(wèi)ysC的DNA片斷可用PCR方法由棒桿菌的染色體制備。根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌的順序(參見Moleculal Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204；Mol.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)，為了擴增例如大約1,643bp的lysC編碼區(qū)域，例舉具有在順序表SEQ ID NO10和NO11中所示核苷酸順序的23-mer和21-mer的單鏈DNA作為DNA引物。合成DNA、PCR、制備攜帶得到的lysC的質(zhì)粒都能夠用上述制備lysA的相同方法進(jìn)行。
按照上述方法，從AK野生型菌株分離lysA時，可得到野生型lysC，而從AK突變菌株分離lysA時，可得到突變型lysC。
含有野生型lysC的DNA片斷的核苷酸順序的實例是顯示在順序表SEQ ID NO12上。由核苷酸順序推導(dǎo)出野生型AK蛋白的α-亞基的氨基酸順序，與DNA順序一起顯示在順序表SEQ ID NO13上。SEQ ID NO14只顯示氨基酸順序。由核苷酸順序推導(dǎo)出的野生型AK蛋白β-亞基的氨基酸順序，與DNA順序一起顯示在順序表SEQ IDNO15上。SEQ ID NO16只顯示氨基酸順序。在每一個亞基中，GTG用作起始密碼子，而相應(yīng)的氨基酸用蛋氨酸表示。然而，該代表不僅僅是蛋氨酸，還有纈氨酸或甲酰蛋氨酸。
用于本發(fā)明的突變型lysC沒有特別的限制，只是它編碼對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制作用不敏感的AK。然而，突變型lysC的實例是具有突變的突變型lysC，其中從N-端算起第279個丙氨酸殘基換成除了丙氨酸和α-亞基中的酸性氨基酸外的氨基酸殘基，而且在野生型AK的氨基酸順序中第30個丙氨酸殘基換成除了丙氨酸和β-亞基中的酸性氨基酸外的氨基酸殘基。野生型AK的氨基酸順序具體包括作為α-亞基顯示在順序表SEQ ID NO14中的氨基酸順序、作為β-亞基顯示在順序表SEQ ID NO16中的氨基酸順序。
除了丙氨酸和酸性氨基酸以外，作為優(yōu)選的氨基酸殘基有蘇氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸和纈氨酸殘基。
與待替換的氨基酸殘基相應(yīng)的密碼子對其類型沒有特別的限制，只要它編碼氨基酸殘基。假定野生型AK的氨基酸順序可能由于細(xì)菌的種間和菌株間的差異而有輕微的不同。具有突變(由例如在一個或多個上述與活性否關(guān)的位點上替換、缺失、或插入一個或多個氨基酸殘基而引起的)的AK也可用于本發(fā)明中。具有突變(由例如替換、缺失、或插入一個或多個氨基酸殘基而引起的)的其它AK，只要對AK的活性和對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制作用不敏感基本上沒影響，也可以用于本發(fā)明。
由引入一個突變型lysC質(zhì)粒p399AK9B到Brevibacteriumlactofermentum野生型菌株AJ12036(FERM BP-734)中得到AJ12691菌株；AJ12691菌株已經(jīng)于1992年4月10日保藏在國際貿(mào)易工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)技術(shù)署國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(郵政編碼305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登記號為FERM P-12918；AJ12961菌株按照布達(dá)佩斯條約于1995年2月10日轉(zhuǎn)移到國際保藏中心，登記號為FERM BP-4999。
(ii)dapB的制備含有dapB的DNA片斷可借助PCR由棒桿菌的染色體制備。DNA供體沒有特別的限制，然而，最好是Brevibacterium lactofermentumATCC 13869菌株。
對于Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869菌株已經(jīng)知道DDPR的DNA編碼順序(Journal of Bacteriology，175(9)，2743-2749(1993))，在此基礎(chǔ)上可以制備PCR的DNA引物。這樣的DNA引物具體以23-mers的DNA為例，它們的核苷酸順序分別顯示在順序表SEQID NO21和22中。合成DNA、PCR、制備攜帶得到的dapB的質(zhì)粒都能夠用上述制備lysC相同的方法進(jìn)行。
含有dapB的DNA片斷的核苷酸順序和由核苷酸順序推導(dǎo)出的氨基酸順序顯示在SEQ ID NO23中。SEQ ID NO24只顯示氨基酸順序。除了編碼該氨基酸順序的DNA片斷外，本發(fā)明也可以同樣采用編碼氨基酸順序與顯示在SEQ ID NO24中基本相同的氨基酸順序的DNA片斷，即具有突變(由例如替換、缺失、或插入一個或多個氨基酸殘基而引起的)的氨基酸順序，只要對DDPR活性沒有實質(zhì)性影響。
將攜帶dapB(下文實例得到)的pCRDAPB質(zhì)粒引入到大腸桿菌JM109菌株中得到轉(zhuǎn)化菌株AJ13107，按照布達(dá)佩斯條約，此菌株進(jìn)行國際保藏，已經(jīng)于1995年5月26日保藏在國際貿(mào)易工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)技術(shù)署國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(郵政編碼305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登記號為FERM BP-5114。
(iii)dapA的制備含有dapA的DNA片斷可借助PCR由棒桿菌的染色體制備。DNA供體沒有特別的限制，然而，以Brevibacterium lactofermentumATCC 13869菌株為例。
已經(jīng)知道谷氨酸棒桿菌編碼DDPS的DNA順序(參見Nucleic AcidResearch，18(21)，6421(1990)；EMBL登記號X53993)，在此基礎(chǔ)上可以制備PCR的DNA引物。這樣的DNA引物具體以23-mers的DNA為例，它們的核苷酸順序分別顯示在順序表SEQ ID NO17和18中。合成DNA、PCR、制備攜帶得到的dapA的質(zhì)粒都能夠用上述制備lysC相同的方法進(jìn)行。
含有dapA的DNA片斷的核苷酸順序和由核苷酸順序推導(dǎo)出的氨基酸順序顯示在SEQ ID NO19中。SEQ ID NO20只顯示氨基酸順序。除了編碼該氨基酸順序的DNA片斷外，本發(fā)明也可以采用編碼氨基酸順序與顯示在SEQ ID NO20中基本相同的氨基酸順序的DNA片斷，即具有突變(由例如替換、缺失、或插入一個或多個氨基酸殘基而引起的)的氨基酸順序，只要對DDPR活性沒有實質(zhì)性影響。
將攜帶dapA(由后面的實施例中得到)的pCRDAPA質(zhì)粒引入到大腸桿菌JM109菌株中得到轉(zhuǎn)化菌株AJ13106，按照布達(dá)佩斯條約，此菌株進(jìn)行國際保藏，已經(jīng)于1995年5月26日保藏在國際貿(mào)易工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)技術(shù)署國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(郵政編碼305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登記號為FERM BP-5113。
在特定的實施方案中，為了增強如上述的L-賴氨酸產(chǎn)生棒桿菌的lysA和ddh，基因是用質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)座子或噬菌體載體等引入到宿主中。在引入中，即使用低拷貝型載體，也預(yù)期能夠達(dá)到某種程度的增強。然而，還是優(yōu)選多拷貝型載體。這樣的載體包括例如上述的質(zhì)粒載體、pAJ655、pAJ1844、pAJ611、pAJ3148、和pAJ440。此外，由棒桿菌衍生的轉(zhuǎn)座子記載在國際專利No.WO 92/02627 and WO93/18151；歐州專利公告No.445385；日本專利申請?zhí)卦S公開No.6-46867；Vertes，A.A.等人，Mol.Microbiol.，11，739-746(1994)；Bonamy，C.，等人，Mol.Microbiol.，14，571-581(1994)；Vertes，A.A.等人，Mol.Gen.Genet.，245，397-405(1994)；Jagar，W.等人，F(xiàn)EMS Microbiology Letters，126，1-6(1995)；日本專利申請?zhí)卦S公開No.7-107976和7-327680等資料上。
例如用引進(jìn)含有l(wèi)ysA和ddh的重組DNA到宿主棒桿菌中，并在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制，能夠得到根據(jù)本發(fā)明增強了lysA和ddh的棒桿菌。例如用插入lysA和ddh到載體(諸如上述的質(zhì)粒載體、轉(zhuǎn)座子或噬菌體載體之類)中，可以得到重組DNA。
lysA和ddh基因的每一個都可以通過不同的載體分別連續(xù)引入宿主中。或者，兩種基因可用一個載體一起引入宿主中。當(dāng)使用不同的載體時，基因可以任何次序引入，可是，應(yīng)優(yōu)選具有能在宿主中穩(wěn)定分配并停留的機制的載體，以及能夠彼此共存的載體。
在采用質(zhì)粒定為載體的情況下可以按照電子脈沖方法(Sugimoto等人，日本專利申請?zhí)卦S公開No.2-207791)將重組DNA引入宿主中。引入一個帶轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒到宿主中并使轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)位，可以利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行基因擴增。
并且，當(dāng)突變型lysC、dapA和dapB引進(jìn)到棒桿菌中時，每一個lysA和ddh的基因都可以用不同的載體分別連續(xù)引入宿主中，或者，兩種或多種基因可用一個載體一起引入宿主中。
<3>生產(chǎn)L-賴氨酸的方法通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含上述增強的L-賴氨酸生物合成基因的棒桿菌，能夠在培養(yǎng)物中產(chǎn)生、積累和回收L-賴氨酸，從而有效地生產(chǎn)L-賴氨酸。
所用培養(yǎng)基的實例是普通的含有碳源、氮源、無機離子、和可選的其它有機成份的培養(yǎng)基。
作為碳源，可能用糖類(諸如葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和淀粉水解物之類)、有機酸(諸如富馬酸、檸檬酸和琥珀酸之類)。
作為氮源，可能用無機銨鹽(諸如硫銨、氯化銨和磷酸銨之類)、有機氮(諸如大豆水解物之類)、氨氣、氨水。
有機微量營養(yǎng)源，需要含有適量的所需物質(zhì)諸如維生素B1和L-高絲氨酸或酵母浸汁等。此外，如果所需還可以加入少量的磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等等。
最好在好氧條件下培養(yǎng)大約30-90小時。在培養(yǎng)期間，培養(yǎng)溫度最好控制在25-37℃，pH值最好控制在5-8。無機或有機、酸或堿物質(zhì)、或氨氣等都可用來調(diào)節(jié)pH值?？梢酝ㄟ^組合普通的離子交換樹脂方法、沉淀方法或其他已知的方法從培養(yǎng)物中回收L-賴氨酸。
實施例下面參考實施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
實施例1從Brevibacterium lactofermentum中制備lysA<1>制備lysA和構(gòu)建攜帶lysA的質(zhì)粒Brevibacterium lactofermentumATCC 13869野生型菌株作為染色體DNA的供體。按照普通的方法從ATCC 13869菌株制備染色體DNA。按照PCR方法從染色體DNA上擴增含有argS、lysA和含有這些基因的操縱子的啟動子DNA片斷。關(guān)于用來擴增的DNA引物，根據(jù)Corynebacterium qlutamicum已知順序，具有分別顯示在順序表SEQ ID NO1和2的核苷酸順序的20-mers合成DNA用來擴增編碼精氨酸-tRNA合成酶和DDC的大約3.6kb的區(qū)間(參見MolecularMicrobiology，4(11)，1819-1830(1990)；Molecular and General Genetics，212，112-119(1988))。
根據(jù)普通方法使用380B型DNA合成儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn))和磷酸酰胺酯方法(參見Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)合成DNA。
根據(jù)廠家提供的方法用Taq DNA聚合酶和PJ2000型DNA擴增儀(Takara Shuzo公司生產(chǎn))，通過PCR擴增基因。pHSG399用作擴增的3,579bp基因片斷的克隆載體。用限制酶SamI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化pHSG399，并與含有已擴增lysA的DNA片斷連接。如上述得到的含有來源于ATCC 13869菌株的lysA的質(zhì)粒定為p399LYSA。
用KpnI和BamHI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化p399LYSA來提取含有l(wèi)ysA的DNA片斷。該DNA片斷與用KpnI和BamHI消化的pHSG299連接。得到的質(zhì)粒定為p299LYSA。構(gòu)建p299LYSA的過程示于圖1中。
將能夠使質(zhì)粒在棒桿菌中自主復(fù)制的DNA片斷(下文稱為“Brevi.-ori”)引入p299LYSA中，以制備可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶lysA的質(zhì)粒。Brevi.-ori是從含Brevi.-ori的質(zhì)粒載體pHK4制備的，而且可在大腸桿菌和棒桿菌的細(xì)胞中自主復(fù)制。pHK4是通過用KpnI和BamHI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化pHC4、提取Brevi.-ori片斷、并使其與用KpnI和BamHI消化過的pHSG298連接而構(gòu)建的(日本專利申請?zhí)卦S公開No.5-7491)。pHK4使宿主對卡那霉素有抗性。含有pHK4的大腸桿菌HB101定為大腸桿菌AJ13136，已經(jīng)于1995年8月1日保藏在國際貿(mào)易工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)技術(shù)署國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(郵政編碼305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登記號為FERM BP-5186。
pHK4用限制酶BamHI消化，并且使切開端成平端。用DNA平齊試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))按照設(shè)計的方法實現(xiàn)平端形成。平端形成后，連接磷酸化KpnI接頭以進(jìn)行修飾，這樣只有用KpnI消化才可能從pHK4中切出相應(yīng)于Brevi.-ori部分的DNA片斷。用KpnI消化該質(zhì)粒，將產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片斷與也用KpnI消化的p299LYSA連接，以制備在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶lysA的質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒定為pLYSAB。構(gòu)建的pLYSAB方法示于圖2上。
<2>測定來自Brevibacterium lactofermentum的lysA的核苷酸順序制備p299LYSA的質(zhì)粒DNA，按照Sanger等人的方法測定核苷酸順序(例如F.Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，74，5463(1977))。測定的核苷酸順序與由核苷酸順序推導(dǎo)出編碼的氨基酸順序顯示在SEQ ID NO3中。關(guān)于核苷酸順序，由argS編碼的氨基酸順序和由lysA編碼的氨基酸順序分別顯示在SEQ ID NO4和5中。
實施例2從Brevibacterium lactofermentum制備ddhddh基因是用兩個寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO6和7，根據(jù)Brevibacterium lactofermentum已知的ddh基因的核苷酸順序制備的)，通過PCR方法擴增Brevibacterium lactofermentumATCC 13869的染色體DNA的ddh基因而得到(Ishino，S.等人，Nucleic Acids Res.，15，3917(1987))。所得的擴增的DNA片斷用EcoT22I和AvaI消化并切成平端。然后，該片斷插入pMW119的SamI位點得到質(zhì)粒pDDH。
接著，pDDH用SalI和EcoRI消化后，生成平端。然后，得到的片斷與用SamI消化的pUC18連接。這樣得到的質(zhì)粒定為pUC18DDH。
將Brevi.-ori引入pUC18DDH中以構(gòu)建可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶ddh的質(zhì)粒。pHK4用限制酶KpnI和BamHI消化，并且使切開端成平端。用DNA平齊試劑盒(Takara Shuzo生產(chǎn))按照設(shè)計的方法形成平端。平端形成后，連接磷酸化PstI接頭(Takara Shuzo生產(chǎn))，這樣它可插入pHSG299的PstI位點。按上述構(gòu)建的質(zhì)粒定為pPK4。接著，pUC18DDH用XbaI和KpnI消化，得到的片斷與用KpnI和XbaI消化的pPK4連接。這樣就構(gòu)建了可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶ddh的質(zhì)粒。該質(zhì)粒定為pPK4D。構(gòu)建pPK4D的過程示于圖3中。
實施例3攜帶ddh和lysA的質(zhì)粒的構(gòu)建攜帶ddh的質(zhì)粒pUC18DDH用EcoRI消化然后平端化，再用XbaI消化以提取含ddh的DNA片斷。該ddh片斷與含有l(wèi)ysA的的質(zhì)粒p399LYSA(用BamHI消化，然后平端化，再用XbaI消化)連接。該質(zhì)粒定為p399DL。構(gòu)建p399DL的過程示于圖4中。
將Brevi.-ori引入p399DL中。pHK4用限制酶XbaI和BamHI消化，并且使切開端成平端。平端形成后，連接磷酸化XbaI接頭以進(jìn)行修飾，這樣只有用XbaI消化pHK4才可能從pHK4中切出相應(yīng)于Brevi.-ori部分的DNA片斷。該質(zhì)粒用XbaI消化，產(chǎn)生的Brevi.-oriDNA片斷與也用XbaI消化的p399DL連接，構(gòu)建了可在棒桿菌中自主復(fù)制含有ddh和lysA的質(zhì)粒。該質(zhì)粒定為pDL。構(gòu)建pDL的過程示于圖5中。
實施例4由Brevibacterium lactofermentum制備突變型lysC、dapA和dapB<1>由Brevibacterium lactofermentum菌株制備野生型lysC基因和突變型lysC基因(1)制備野生型lysC和突變型lysC以及制備攜帶它們的質(zhì)粒Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869菌株和由其經(jīng)過誘變處理得到的L-賴氨酸產(chǎn)生突變型菌株AJ3445(FERM p-1944)作為染色體DNA的供體。由于AJ3445菌株已經(jīng)經(jīng)過誘變處理，所以lysC產(chǎn)生了變化而對賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同抑制作用基本上不敏感(Journal ofBiochemistry，68，701-710(1970))。
從染色體DNA按照PCR方法進(jìn)行擴增含有l(wèi)ysC的DNA片斷(聚合酶鏈反應(yīng)；參見White，T.J.等人，Trends Genet.，5，185(1989))。關(guān)于擴增的DNA引物，為了擴增編碼lysC的大約1,643bp區(qū)域，根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌的順序(參見Molecular Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204；和Mol.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)，合成具有顯示在SEQ ID NO10和11中核苷酸順序的單鏈23-mer和21-mer DNA。
已擴增的1,643kb的基因片斷用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。然后按照普通方法純化從凝膠上切出的片斷，再用限制酶NruI和EcoRI(TakaraShuzo公司生產(chǎn))進(jìn)行消化。
pHSG399(參見Takeshita，S.等人，Gene(1987)，61，63-74)作為基因片斷的克隆載體。用限制酶SamI和EcoRI(Takara Shuzo生產(chǎn))消化pHSG399，并與已擴增lysC的片斷連接。DNA是用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))及其方法連接的。這樣，質(zhì)粒制備成功，其中從谷氨酸棒桿菌染色體擴增的lysC片斷分別與PHSG399連接。攜帶來源于ATCC 13869(野生型菌株)的lysC的質(zhì)粒定為p399AKY。攜帶來源于AJ3463(L-賴氨酸產(chǎn)生菌)的lysC的質(zhì)粒定為p399AK9。
將Brevi.-ori引入制備的p399AKY和p399AK9中，分別構(gòu)建了可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶lysC的質(zhì)粒。pHK4用限制酶KpnI和BamHI(Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化，并且使切開端成平端。平端形成使用DNA平齊試劑盒及其方法進(jìn)行的(Takara Shuzo公司生產(chǎn))。平端形成后，連接磷酸化BamHI接頭以進(jìn)行修飾，這樣只有用BamHI消化才可能從pHK4中切出相應(yīng)于Brevi.-ori的DNA片斷。用BamHI消化該質(zhì)粒，將產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片斷與用BamHI消化的p399AKY和p399AK9連接，制備可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶lysC的質(zhì)粒。
來源于p399AKY的攜帶野生型lysC質(zhì)粒定為p399AKYB，來源于p399AK9的攜帶突變型lysC的質(zhì)粒定為p399AK9B。構(gòu)建p399AKYB和p399AK9B的過程示于圖6中。通過引進(jìn)突變型lysC的質(zhì)粒p399AK9B到Brevibacterium lactofermentum野生型菌株(AJ12036菌株，F(xiàn)ERM BP-734)得到的菌株AJ12691已經(jīng)于1992年4月10日保藏在國際貿(mào)易工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)技術(shù)署國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(郵政編碼305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登記號為FERM P-12918；按照布達(dá)佩斯條約，此菌株已經(jīng)于1995年2月10日轉(zhuǎn)入國際保藏中心，登記號為FERMBP-4999。
(2)來自Brevibacterium lactofermentum的野生型lysC基因和突變型lysC的核苷酸順序的測定為了測定野生型和突變型lysC的核苷酸順序，分別從各自的轉(zhuǎn)化體制備攜帶野生型lysC的質(zhì)粒p399AKYB和攜帶突變型lysC的質(zhì)粒p399AK9B。核苷酸順序的測定是按照Sanger等人的方法(例如F.sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，74，5463(1977))進(jìn)行的。
由p399AKY編碼的野生型lysC的核苷酸順序顯示在順序表SEQID NO12上。另一方面，由p399AK9編碼的突變型lysC的核苷酸順序與野生型lysC比較，顯示在順序表SEQ ID NO12上的只有一個核苷酸第1051個G變成A。已知谷氨酸菌株的lysC有兩個亞基(α，β)，編碼在同一DNA鏈的同一閱讀框架內(nèi)(參見Kalinowski，J.等人，Molecular Microbiology(1991)5(5)，1197-1204)。從同源性判斷，預(yù)期經(jīng)順序分析的基因也有編碼在同一DNA鏈的同一閱讀框架內(nèi)的兩個亞基(α，β)。
由核苷酸順序推導(dǎo)出的野生型AK蛋白α-亞基的氨基酸順序與DNA順序一起顯示在順序表SEQ ID NO13中。單獨氨基酸順序顯示在順序表SEQ ID NO14中。由核苷酸順序推導(dǎo)出的野生型AK蛋白β-亞基的氨基酸順序與DNA順序一起顯示在順序表SEQ ID NO15中。SEQ ID NO16只顯示氨基酸順序。在每一個亞基中，GTG都用作起始密碼子，而相應(yīng)的氨基酸用蛋氨酸表示?？墒?，這種表示是指蛋氨酸、纈氨酸或甲酰蛋氨酸。
另一方面，突變型lysC順序上的突變是指發(fā)生了氨基酸的替代，因此，α-亞基的第279個丙氨酸殘基換成蘇氨酸殘基，而且在野生型AK蛋白的β-亞基氨基酸順序中第30個丙氨酸殘基換成蘇氨酸殘基(SEQ ID NO14、16)。
<2>由Brevibacterium lactofermentum制備dapB(1)制備dapB和構(gòu)建攜帶dapB的質(zhì)粒Brevibacterium lactofermentum的野生型菌株ATCC 13869作為染色體DNA的供體。根據(jù)普通方法由ATCC 13869菌株制備染色體DNA。按照PCR方法從染色體DNA中含擴增dapB的DNA片斷。關(guān)于擴增的DNA引物，為了經(jīng)過擴增達(dá)到大約2.0kb編碼DDPR，根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌的順序(參見Jounal of bacteriology，157(9)，2743-2749(1993))，分別合成具有顯示在核苷酸順序表SEQ ID NO21和22中核苷酸順序的23-mer DNA。DNA的合成和pCR是用與實施例1中敘述的同樣方法進(jìn)行。pCR-Script(Invitrogen生產(chǎn))作為已擴增的2,001bp基因片斷的克隆載體，并與已擴增的dapB片斷連接。這樣構(gòu)建了由菌株染色體擴增的2,001bp的dapB片斷與pCR-Script連接的質(zhì)粒。如上述得到的、含有來源于ATCC 13869的dapB的質(zhì)粒定為pCRDAPB。由引入pCRDAPB到大腸桿菌JM109中得到的轉(zhuǎn)化體菌株AJ13107已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約于1995年5月26日保藏在國際貿(mào)易工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)技術(shù)署國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所(郵政編碼305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登記號為FERM BP-5114。
含有DDPR結(jié)構(gòu)基因的1,101bp片斷是通過用EcoRV和SphI消化pCRDAPB提取得到的。該片斷與用HincII和SphI消化的pHSG399連接制備成質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒定為p399DPR。
Brevi.-ori引入制成的p399DPR中，構(gòu)建可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶dapB的質(zhì)粒。pHK4用限制酶KpnI(Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化，并且使切開端成平端。平端形成使用DNA平齊試劑盒及其方法進(jìn)行(Takara Shuzo公司生產(chǎn))。平端形成后，連接磷酸化BamHI接頭(Takara Shuzo公司生產(chǎn))以進(jìn)行修飾，這樣只有用BamHI消化pHK4才可能從pHK4中切出相應(yīng)于Brevi.-ori的DNA片斷。該質(zhì)粒用BamHI消化，產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片斷與用BamHI消化的p399DPR連接，構(gòu)建了可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶dapB的質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒定為pDPRB。構(gòu)建pDPRB的過程示于圖7中。
(2)測定來源于Brevibacterium lactofermentum的dapB的核苷酸順序從含有pDPRB的AJ13107菌株制備質(zhì)粒DNA，并以與實施例1中相同的方法測定它的核苷酸順序。測定的核苷酸順序和由其推導(dǎo)出的氨基酸順序顯示在SEQ ID NO23中。SEQ ID NO24只顯示氨基酸順序。
<3>從Brevibacterium lactofermentum制備dapA(1)制備dapA并構(gòu)建攜帶dapA的質(zhì)粒Brevibacterium lactofermentum野生型菌株ATCC 13869用作染色體DNA的供體。用普通方法由ATCC 13869菌株制備染色體DNA。斷用PCR方法從染色體DNA擴增含有dapA的DNA片斷。關(guān)于擴增的DNA引物，為了擴增編碼DDPS的大約1.5kb區(qū)間，需根據(jù)已知的谷氨酸棒桿菌的順序，分別合成具有顯示在核苷酸順序表SEQ IDNO17和18上核苷酸順序的23-mer DNA(參見Nucleic AcidResearch，18(21)，6421(1990)；EMBL登記號No.X53993)。合成DNA和PCR是用與實施例1中敘述的同樣方法進(jìn)行。pCR-1000(Invitrogen生產(chǎn)，參見Bio/Technology，9，657-663(1991))作為已擴增的1,411bp基因片斷的克隆載體，與已擴增的dapA片斷連接。DNA的連接是用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))和其方法實行的。由Brevibacterium lactofermentum染色體擴增的1,411bpdapA片斷與pCR-1000連接，這樣就構(gòu)建了一個質(zhì)粒。如上述得到的、含有來源于ATCC 13869菌株的dapA的質(zhì)粒定為pCRDAPA。由引入pCRDAPA到大腸桿菌JM109中得到的轉(zhuǎn)化體菌株AJ13106已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約于1995年5月26日保藏在國際貿(mào)易工業(yè)部的工業(yè)科學(xué)技術(shù)署國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所郵政編碼305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登記號為FERM BP-5113。
將Brevi.-ori引入制成的pCRDAPA中以構(gòu)建可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶dapA的質(zhì)粒。pHK4用限制酶KpnI和BamHI(Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化，并且使切開端成平端。平端形成使用DNA平齊試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))及其方法進(jìn)行的。平端形成后，連接磷酸化SmaI接頭(Takara Shuzo公司生產(chǎn))以進(jìn)行修飾，這樣只有用SmaI消化pHK4才可能從pHK4中切出相應(yīng)于Brevi.-ori的DNA片斷。該質(zhì)粒用SmaI消化，產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片斷與也用SmaI消化的pCRDAPA連接，制備了可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶dapA的質(zhì)粒。該質(zhì)粒定為pDPSB。構(gòu)建pDPSB(Kmr)的過程示于圖8中。
(2)測定來自Brevibacterium lactofermentum菌株的dapA的核苷酸順序從含有pCRDAPA的菌株AJ13106制備質(zhì)粒DNA并以與實施例1中相同的方法測定它的核苷酸順序。測定的核苷酸順序和由其推導(dǎo)出的氨基酸順序顯示在SEQ ID NO19中。SEQ ID NO20只顯示氨基酸順序。
<4>構(gòu)建攜帶突變型lysC和dapA二者的質(zhì)粒攜帶突變型lysC、dapA和棒桿菌的復(fù)制起始區(qū)的質(zhì)粒是由攜帶dapA的pCRDAPA質(zhì)粒以及攜帶lysC和Brevi.-ori的p399AK9B質(zhì)粒構(gòu)建。p399AK9B用SalI完全消化，并且使切開端成平端。連接EcoRI接頭以此構(gòu)建SalI位點被修飾到EcoRI位點的質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒定為p399AK9BSE。突變型lysC和Brevi.-ori是作為一個片斷用EcoRI部分消化p399AK9BSE而切出。該片斷再與用EcoRI消化的pCRDAPA質(zhì)粒連接。得到的質(zhì)粒定為pCRCAB。該質(zhì)?？稍诖竽c桿菌和棒桿菌中自主復(fù)制，并使宿主具有對卡那霉素的抗性，此質(zhì)粒攜帶突變型lysC和dapA二者。構(gòu)建pCRCAB的過程示于圖9中。
<5>構(gòu)建攜帶突變型lysC和dapB二者的質(zhì)粒攜帶突變型lysC和dapB的質(zhì)粒是由攜帶突變型lysC的p399AK9質(zhì)粒和攜帶dapB的p399DPR質(zhì)粒構(gòu)建的。含有DDPR結(jié)構(gòu)基因的1,101bp片斷是用用EcoRV和SphI消化p399DPR提取的。該片斷與用SalI消化的p399AK9連接并使切開端成平端，再用SphI消化，構(gòu)建成的攜帶突變型lysC和dapB二者的質(zhì)粒，該質(zhì)粒定為p399AKDDPR。
下一步，Brevi.-ori引入制成的p399AKDDPR。含有Brevi.-ori的pHK4質(zhì)粒用限制酶KpnI(Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化，并且使切開端成平端。平端形成使用DNA平齊試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))及其方法進(jìn)行的。平端形成后，連接磷酸化BamHI接頭(Takara Shuzo公司生產(chǎn))以進(jìn)行修飾，這樣只有用BamHI消化pHK4才可能從pHK4中切出相應(yīng)于Brevi.-ori的DNA片斷。該質(zhì)粒用BamHI消化，產(chǎn)生的Brevi.-ori DNA片斷與也用BamHI消化的p399AKDDPR連接，制備了可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶突變型lysC和dapB的質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒定為pCB。構(gòu)建pCB的過程示于圖10中。
<6>構(gòu)建攜帶dapA和dapB二者的質(zhì)粒攜帶dapA的pCRDAPA質(zhì)?？捎肒pnI和EcoRI消化以提取含有dapA的DNA片斷，并且該片段與用KpnI和EcoRI消化的載體質(zhì)粒pHSG399連接。得到的質(zhì)粒定為p399DPS。
另一方面，攜帶dapB的pCRDAPB質(zhì)粒用SacII和EcoRI消化以提取含有DDPR編碼區(qū)的2,0bp DNA片斷，并且該片段與用SacII和EcoRI消化的載體質(zhì)粒p399DPS連接，構(gòu)建了攜帶dapA和dapB二者的質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒定為p399AB。
下一步，Brevi.-ori引入制成的p399AB。攜帶Brevi.-ori的pHK4質(zhì)粒用限制酶BamHI(Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化，并且使切開端成平端。平端形成使用DNA平齊試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))及其方法進(jìn)行的。平端形成后，連接磷酸化KpnI接頭(Takara Shuzo公司生產(chǎn))以進(jìn)行修飾，這樣只有用KpnI消化pHK4才可能從pHK4中切出相應(yīng)于Brevi.-ori的DNA片斷。該質(zhì)粒用KpnI消化，產(chǎn)生的Brevi.-oriDNA片斷與用KpnI消化的p399AB連接，構(gòu)建了可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶dapA和dapB的質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒定為pAB。構(gòu)建pAB的過程示于圖11中。
<7>構(gòu)建同時攜帶突變型lysC、dapA和dapB的質(zhì)粒為了提取dapA基因片斷，p399DPS用EcoRI和SphI消化并形成平端。該片斷與用SpnI消化的p399AK9質(zhì)粒連接并平端以構(gòu)建突變型lysC和dapA共存的質(zhì)粒p399CA。
為了提取包括dapB的2.0kb的DNA基因片斷，載體質(zhì)粒pCRDAPB用EcoRI消化、形成平端、接著用SacI消化。攜帶突變型lysC和dapA的質(zhì)粒p399CA用SpeI消化并平端，然后再用SacI消化并與提取的dapB片斷連接，得到了一個同時攜帶突變型lysC、dapA和dapB的質(zhì)粒。該質(zhì)粒定為p399CAB。
下一步，Brevi.-ori引入制成的p399CAB。含有Brevi.-ori的pHK4質(zhì)粒用限制酶BamHI(Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化，并且使切開端成平端。平端形成使用DNA平齊試劑盒(Takara Shuzo公司生產(chǎn))及其方法進(jìn)行的。平端形成后，連接磷酸化KpnI接頭(Takara Shuzo公司生產(chǎn))以進(jìn)行修飾，這樣只有用KpnI消化pHK4才可能從pHK4中切出相應(yīng)于Brevi.-ori的DNA片斷。該質(zhì)粒用KpnI消化，產(chǎn)生的Brevi.-oriDNA片斷與也用KpnI消化的p399CAB連接，構(gòu)建了可在棒桿菌中自主復(fù)制、攜帶突變型lysC、dapA和dapB的質(zhì)粒。制備的質(zhì)粒定為pCAB。構(gòu)建pCAB的過程示于圖12中。
<8>構(gòu)建同時攜帶突變型lysC、dapA、dapB和lysA的質(zhì)粒攜帶lysA的p299LYSA質(zhì)粒用KpnI和BamHI消化和形成平端，然后提取lysA基因片斷。該片斷與用HpaI(Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化的pCAB連接并形成平端以構(gòu)建可在棒桿菌細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制、攜帶突變型lysC、dapA、dapB和lysA的質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒定為pCABL。構(gòu)建pCABL的過程示于圖13中。請注意，lysA片斷插入pCABL含有dapB的DNA片斷的HpaI位點，然而，HpaI位點處于dapB基因啟動子的上游(在SEQ ID NO23中的核苷酸酸序號為611-616)，dapB基因并未分割。
<9>構(gòu)建同時攜帶突變型lysC、dapA、dapB、ddh和lysA的質(zhì)粒pHSG299用XbaI和KpnI消化，并與用XbaI和KpnI消化的攜帶ddh和lysA的p399DL質(zhì)粒連接，構(gòu)建的質(zhì)粒定為p299DL。p299DL用XbaI和KpnI消化并形成平端。平端形成后，提取攜帶ddh和lysA的DNA片斷。該DNA片斷與同時攜帶lysC、dapA和dapB并用HpaI消化和形成平端的pCAB質(zhì)粒連接以構(gòu)建同時攜帶突變型lysC、dapA、dapB、ddh和lysA、可棒桿菌細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制的質(zhì)粒。構(gòu)建的質(zhì)粒定為pCABDL。構(gòu)建pCABDL的過程示于圖14上。
實施例5將攜帶L-賴氨酸的生物合成基因的質(zhì)粒引入Brevibacterium lactofermentum的L-賴氨酸產(chǎn)生菌中如上述構(gòu)建的攜帶L-賴氨酸的生物合成基因的質(zhì)粒，即pLYSAB(Cmr)、pPK4D(Cmr)、p399AK9B(Cmr)、pDPSB(Kmr)pDPRB(Cmr)、pCRCAB(Kmr)、pAB(Cmr)、pDL(Cmr)、pCB(Cmr)pCAB(Cmr)、pCABL(Cmr)和pCABDL(Cmr)分別引入Brevibacteriumlactofermentum的L-賴氨酸產(chǎn)生菌AJ11082(NRRL B-11470)中。AJ11082菌株對AEC有抗性。采用電脈沖方法引入質(zhì)粒(Sugimoto等人，日本專利特許公開No.2-207791)。轉(zhuǎn)化體是根據(jù)各自質(zhì)粒具有的抗藥標(biāo)記選擇。當(dāng)引進(jìn)攜帶氯霉素抗性基因的質(zhì)粒時，轉(zhuǎn)化體可在含有5ug/ml氯霉素的完全培養(yǎng)基上選擇，當(dāng)引進(jìn)攜帶卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒時，轉(zhuǎn)化體可在含有25ug/ml卡那霉素的完全培養(yǎng)基上選擇。
實施例6L-賴氨酸的生產(chǎn)從實施例5中得到的每種轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在L-賴氨酸產(chǎn)生培養(yǎng)基中以估計它的生產(chǎn)力。L-賴氨酸產(chǎn)生培養(yǎng)基含有下列成份。溶解除碳酸鈣外的下列組分(每升)，以能夠用KOH調(diào)至pH8.0。培養(yǎng)基在115℃下滅菌15分鐘，碳酸鈣(50g)在干燥熱空氣中單獨滅菌后加入滅菌的培養(yǎng)基中。
葡萄糖100g(NH4)2SO455gKH2PO 1gMgSO4·7H2O1g生物素500ug維生素B12000ugFeSO4·7H2O0.01gMnSO4·7H2O0.01g尼克酰胺 5mg蛋白水解物(Mamenou) 30ml碳酸鈣50g各種類型轉(zhuǎn)化體和原始菌種中的每種在含有上述成份的培養(yǎng)基中在31.5℃往返式搖床上培養(yǎng)。培養(yǎng)48或72小時后的L-賴氨酸的產(chǎn)量和72小時后的增長(OD562)示于表1中。表中l(wèi)ysC*代表突變型lysC。增長是定量測定101倍稀釋后在560nm處的OD值。
表1培養(yǎng)40小時或72小時后L-賴氨酸的積累
正如上表所示，當(dāng)單獨增強lysA、ddh、突變型lysC、dapA或dapB時，培養(yǎng)72小時后L-賴氨酸產(chǎn)量高于或等于原始菌株的產(chǎn)量，但是培養(yǎng)40小時后產(chǎn)量卻低于原始菌株的。這就是說，在短期培養(yǎng)中L-賴氨酸的生產(chǎn)速度降低了。同樣地，當(dāng)使用突變型lysC和dapA結(jié)合或dapA和dapB結(jié)合增強時，培養(yǎng)72小時后L-賴氨酸產(chǎn)量高于或等于原始菌株的產(chǎn)量，但是培養(yǎng)40小時后產(chǎn)量卻低于原始菌株的。因此，在短期培養(yǎng)中L-賴氨酸的生產(chǎn)速度降低了。
另一方面，只有當(dāng)lysA和ddh結(jié)合增強時，生長得到了改善，在短期培養(yǎng)中L-賴氨酸的生產(chǎn)速度也成功地得到了恢復(fù)，并且在長期培養(yǎng)中L-賴氨酸的積累量也得到提高。
而且，在dapB和突變型lysC一起在菌株中增強的情況下，以及dapA和它們同時在菌株中增強時，與原始菌株比較生長得到了改善，而且L-賴氨酸的生產(chǎn)速度也增加了。在這三個基因同時在菌株中增強時，通過進(jìn)一步增強lysA和ddh時，L-賴氨酸的生產(chǎn)速度和L-賴氨酸積累量都進(jìn)一步得到提高。
順序表(1)一般資料(i)申請者AJINOMOTO CO.，有限公司(ii)發(fā)明的題目生產(chǎn)L-賴氨酸的方法(iii)順序數(shù)目24(iv)通訊地址(A)地址(B)街道(C)城市(E)國家(F)郵政編碼(v)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)流通的申請資料(A)申請?zhí)?B)存檔日期(C)分類(vii)前申請資料(A)申請?zhí)柎aJP 8-142812(B)存檔日期1996年6月5日(viii)委托/代理資料(A)名稱(B)登記號碼(ix)電訊資料(A)電話
(B)傳真(2)SEQ ID NO1的資料(i)順序特性(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向否(xi)順序說明SEQ ID NO1GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG23(2)SEQ ID NO2的資料(i)順序特性(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向是(xi)順序說明SEQ ID NO2CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA23(2)SEQ ID NO3的資料(i)順序特性
(A)長度3579個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)有機體Brevibacterium lactofermentum(B)菌株ATCC 13869(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置533..2182(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置2182..3522(xi)順序說明SEQ ID NO3
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT 60TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA 120GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT 180GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC 240GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC 300AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC 360CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA 420CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA 480AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG 535Met1ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT583Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val5 10 15TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT631Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val20 25 30GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT679Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile35 40 45GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT727Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala50 55 60 65ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT775Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala70 75 80GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA823Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala85 90 95CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA871Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly100 105 110AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT919Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser115 120 125
GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC967Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala130 135 140 145GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG1015Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val150 155 160ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC1063Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe165 170 175GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC1111Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp180 185 190GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA1159Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu195 200 205AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT1207Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu210 215 220 225TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC1255Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser230 235 240CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC1303Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser245 250 255CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC1351Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp260 265 270AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC1399Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr275 280 285GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC1447Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp290 295 300 305GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC1495Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser310 315 320
CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT1543Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly325 330 335TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA1591Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro340 345 350GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC1639Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg Asp355 360 365GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA1687Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu370 375 380 385GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG1735Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu390 395 400ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG1783Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp405 410 415GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC1831Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly His420 425 430GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC1879Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr435 440 445GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT1927Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp450 455 460 465CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT1975Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala470 475 480GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT2023Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala485 490 495GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT2071Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val500 505 510
GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA2119Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala515 520 525GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC2167Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser530 535 540 545GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA 2214Ala Pro Glu Lys Met Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu550 1 5CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC2262Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly10 15 20 25GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC2310Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr30 35 40GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT2358Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys45 50 55CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA2406Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala60 65 70TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG2454Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu75 80 85GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG2502Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu90 95 100 105GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA2550Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys110 115 120GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG2598Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val125 130 135GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT2646Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala140 145 150
GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC2694Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile155 160 165GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG2742Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys170 175 180 185TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC2790Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala190 195 200GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT2838Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val205 210 215GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC2886Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg220 225 230GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT2934Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu235 240 245CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT2982Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala250 255 260 265GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA3030Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala270 275 280GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT3078Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu285 290 295GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC3126Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr300 305 310GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC3174Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg315 320 325CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA3222Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala330 335 340 345
CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA3270Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu350 355 360GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC3318Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly365 370 375GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC3366Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly380 385 390GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC3414Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser395 400 405TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT3462Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala410 415 420 425GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC3510Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu430 435 440TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC3562Ser Leu Glu Ala445GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579(2)SEQ ID NO4的資料(i)順序特性(A)長度550個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序說明SEQ ID NO4Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu1 5 10 15Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val20 25 30Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn35 40 45
Ile Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu50 55 60Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser65 70 75 80Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala85 90 95Ala Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe100 105 110Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val115 120 125Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala130 135 140Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys145 150 155 160Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg165 170 175Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu180 185 190Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val195 200 205Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu210 215 220Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser225 230 235 240Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn245 250 255Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys260 265 270Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser275 280 285Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly290 295 300Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe305 310 315 320Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His325 330 335
Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys340 345 350Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg355 360 365Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr370 375 380Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser385 390 395 400Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu405 410 415Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly420 425 430His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val435 440 445Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly450 455 460Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala465 470 475 480Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu485 490 495Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys500 505 510Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala515 520 525Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val530 535 540Ser Ala Pro Glu Lys Met545 550(2)SEQ ID NO5的資料(i)順序特性(A)長度445個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序說明SEQ ID NO5
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro1 5 10 15Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val20 25 30Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val35 40 45Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe50 55 60Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys65 70 75 80Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala85 90 95Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser100 105 110Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala115 120 125Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu130 135 140Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp145 150 155 160Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe165 170 175Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser180 185 190Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu195 200 205Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala210 215 220Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln225 230 235 240Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly245 250 255Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu275 280 285Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile290 295 300Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp305 310 315 320Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly325 330 335Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp340 345 350Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg355 360 365Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu370 375 380Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala385 390 395 400Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr405 410 415Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu420 425 430Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala435 440 445(2)SEQ ID NO6的資料(i)順序特性(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向否(xi)順序說明SEQ ID NO6CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20
(2)SEQ ID NO7的資料(i)順序特性(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向是(xi)順序說明SEQ ID NO7TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20(2)SEQ ID NO8的資料(i)順序特性(A)長度1034個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)有機體Brevibacterium lactofermentum(B)菌株ATCC 13869(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置61..1020(xi)順序說明SEQ ID NO8ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC 60ATG ACC AAC ATC CGC GTA GCT ATC GTG GGC TAC GGA AAC CTG GGA CGC108Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg1 5 10 15AGC GTC GAA AAG CTT ATT GCC AAG CAG CCC GAC ATG GAC CTT GTA GGA156Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly20 25 30ATC TTC TCG CGC CGG GCC ACC CTC GAC ACA AAG ACG CCA GTC TTT GAT204Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp35 40 45
GTC GCC GAC GTG GAC AAG CAC GCC GAC GAC GTG GAC GTG CTG TTC CTG252Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu50 55 60TGC ATG GGC TCC GCC ACC GAC ATC CCT GAG CAG GCA CCA AAG TTC GCG300Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala65 70 75 80CAG TTC GCC TGC ACC GTA GAC ACC TAC GAC AAC CAC CGC GAC ATC CCA348Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro85 90 95CGC CAC CGC CAG GTC ATG AAC GAA GCC GCC ACC GCA GCC GGC AAC GTT396Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val100 105 110GCA CTG GTC TCT ACC GGC TGG GAT CCA GGA ATG TTC TCC ATC AAC CGC444Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg115 120 125GTC TAC GCA GCG GCA GTC TTA GCC GAG CAC CAG CAG CAC ACC TTC TGG492Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp130 135 140GGC CCA GGT TTG TCA CAG GGC CAC TCC GAT GCT TTG CGA CGC ATC CCT540Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro145 150 155 160GGC GTT CAA AAG GCA GTC CAG TAC ACC CTC CCA TCC GAA GAC GCC CTG588Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu165 170 175GAA AAG GCC CGC CGC GGC GAA GCC GGC GAC CTT ACC GGA AAG CAA ACC636Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr180 185 190CAC AAG CGC CAA TGC TTC GTG GTT GCC GAC GCG GCC GAT CAC GAG CGC684His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg195 200 205ATC GAA AAC GAC ATC CGC ACC ATG CCT GAT TAC TTC GTT GGC TAC GAA732Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu210 215 220GTC GAA GTC AAC TTC ATC GAC GAA GCA ACC TTC GAC TCC GAG CAC ACC780Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr225 230 235 240
GGC ATG CCA CAC GGT GGC CAC GTG ATT ACC ACC GGC GAC ACC GGT GGC828Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly245 250 255TTC AAC CAC ACC GTG GAA TAC ATC CTC AAG CTG GAC CGA AAC CCA GAT876Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp260 265 270TTC ACC GCT TCC TCA CAG ATC GCT TTC GGT CGC GCA GCT CAC CGC ATG924Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met275 280 285AAG CAG CAG GGC CAA AGC GGA GCT TTC ACC GTC CTC GAA GTT GCT CCA972Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro290 295 300TAC CTG CTC TCC CCA GAG AAC TTG GAC GAT CTG ATC GCA CGC GAC GTC1020Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val305 310 315 320TAATTTAGCT CGAG1034(2)SEQ ID NO9的資料(i)順序特性(A)長度320個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序說明SEQ ID NO9Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg1 5 10 15Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly20 25 30Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp35 40 45Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu50 55 60Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala65 70 75 80Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro85 90 95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val100 105 110Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg115 120 125Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp130 135 140Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro145 150 155 160Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu165 170 175Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr180 185 190His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg195 200 205Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu210 215 220Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr225 230 235 240Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly245 250 255Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp260 265 270Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met275 280 285Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro290 295 300Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val305 310 315 320(2)SEQ ID NO10的資料(i)順序特性(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸
(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向否(xi)順序說明SEQ ID NO10TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT23(2)SEQ ID NO11的資料(i)順序特性(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向是(xi)順序說明SEQ ID NO11ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21(2)SEQ ID NO12的資料(i)順序特性(A)長度1643個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)有機體Brevibacterium lactofermentum(B)菌株ATCC 13869(xi)順序說明SEQ ID NO12TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643(2)SEQ ID NO13的資料(i)順序特性(A)長度1643個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)有機體Brevibacterium lactofermentum ermentum(B)菌株ATCC 13869(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置217..1482(xi)順序說明SEQ ID NO13TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG234Met Ala Leu Val Val Gln1 5AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC282Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val10 15 20GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT330Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val25 30 35GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA378Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala40 45 50GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG426Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu55 60 65 70ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG474Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu75 80 85TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG522Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val90 95 100CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG570Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro105 110 115GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT618Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala120 125 130GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT666Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly135 140 145 150CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC714Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn155 160 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT762Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala170 175 180GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC810Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe185 190 195GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG858Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu200 205 210CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC906Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg215 220 225 230TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG954Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu235 240 245GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG1002Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys250 255 260TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG1050Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu265 270 275GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC1098Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp280 285 290ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC1146Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile295 300 305 310ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG1194Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu315 320 325AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC1242Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp330 335 340CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA1290Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro345 350 355
GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC1338Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn360 365 370ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT1386Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg375 380 385 390GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG1434Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln395 400 405CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA1482Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg410 415 420AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643(2)SEQ ID NO14的資料(i)順序特性(A)長度421個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序說明SEQ ID NO14Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330 335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420(2)SEQ ID NO15的資料(i)順序特性(A)長度1643個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)有機體Brevibacterium lactofermentum(B)菌株ATCC 13869(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置964..1482(xi)順序說明SEQ ID NO15TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu1 5 10 15GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC1056Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala20 25 30AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT1104Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val35 40 45CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC1152Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe50 55 60ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG1200Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys65 70 75CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC1248Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val80 85 90 95GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT1296Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val100 105 110ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA1344Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu115 120 125TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT1392Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp130 135 140GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC1440Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly145 150 155GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA1490Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg160 165 170AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610
TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643(2)SEQ ID NO16的資料(i)順序特性(A)長度172個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序說明SEQ ID NO16D NO16Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala1 5 10 15Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys20 25 30Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu35 40 45Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr50 55 60Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu65 70 75 80Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly85 90 95Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr100 105 110Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu115 120 125Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp130 135 140Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly145 150 155 160Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg165 170(2)SEQ ID NO17的資料(i)順序特性(A)長度23個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向否(xi)順序說明SEQ ID NO17GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC(2)SEQ ID NO18的資料(i)順序特性 23(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向是(xi)順序說明SEQ ID NO18GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG(2)SEQ ID NO19的資料(i)順序特性(A)長度1411個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)有機體Brevibacterium lactofermentum(B)菌株ATCC 13869(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置311..1213(xi)順序說明SEQ ID NO19CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT 60TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGCC CGTATGTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC 120
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GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG877Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr175 180 185GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT925Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu190 195 200 205GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC973Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro210 215 220ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC1021Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val225 230 235CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA1069Arg Ala Arg Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln240 245 250GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG1117Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln255 260 265GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA AAT GAG1165Gly Ile Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu270 275 280 285CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA1213Gln Glu Leu Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu290 295 300TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA 1273AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA 1333CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC 1393TCAAGGATCC CAACATTC1411(2)SEQ ID NO20的資料(i)順序特性(A)長度301個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序說明SEQ ID NO20
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr1 5 10 15Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp20 25 30Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu35 40 45Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr50 55 60Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly65 70 75 80Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr85 90 95Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu100 105 110Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu115 120 125Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu130 135 140Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met145 150 155 160Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys165 170 175Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala180 185 190Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly195 200 205Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu210 215 220Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg225 230 235 240Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu245 250 255Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn260 265 270Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu275 280 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu290 295 300(2)SEQ ID NO21的資料(i)順序特性(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向否(xi)順序說明SEQ ID NO21GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA23(2)SEQ ID NO22的資料(i)順序特性(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型其他核酸(A)說明/desc＝“合成DNA”(iv)反向是(xi)順序說明SEQ ID NO22CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT23(2)SEQ ID NO23的資料(i)順序特性(A)長度2001個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型基因組DNA(vi)初始來源(A)有機體Brevibacterium lactofermentum
(B)菌株ATCC 13869(ix)特點(A)名稱/關(guān)鍵CDS(B)位置730..1473(xi)順序說明SEQ ID NO23GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT 60GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG 120ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC 180TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC 240AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG 300GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC 360ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG TCACAACTGG 420AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA 480AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT 540AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT 600GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT 660TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA 720AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT 768Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg1 5 10GTT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG816Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu15 20 25CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC864Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp30 35 40 45AAC GGC GCT GAA GTT GTC GTT GAC TTC ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG912Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met50 55 60GGC AAC CTG GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCT GCG GTT GTT GGA960Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly65 70 75ACC ACG GGC TTC GAT GAT GCT CGT TTG GAG CAG GTT CGC GCC TGG CTT1008Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu80 85 90
GAA GGA AAA GAC AAT GTC GGT GTT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC1056Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile95 100 105TCT GCG GTG TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC TTC TTC1104Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe110 115 120 125GAA TCA GCT GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC CCC AAC AAG CTG GAT GCA1152Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala130 135 140CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA CGC1200Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg145 150 155AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT1248Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu160 165 170GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC1296Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val175 180 185CGC ATG TCC GGC ATG GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG1344Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln190 195 200 205GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT1392Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe210 215 220GCA CCA GGT GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC1440Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly225 230 235CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC 1493Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu240 245GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT 1553GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT 1613TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA 1673GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA 1733CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC 1793GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT 1853
GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG 1913TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC 1973GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG 2001(2)SEQ ID NO24的資料(i)順序特性(A)長度248個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線形(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)順序說明SEQ ID NO24Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln1 5 10 15Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala20 25 30Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala35 40 45Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu50 55 60Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly65 70 75 80Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys85 90 95Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val100 105 110Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala115 120 125Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly130 135 140Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala145 150 155 160Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser165 170 175Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser180 185 190Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
195 200 205Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly210 215 220Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val225 230 235 240Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu24權(quán)利要求
1.能夠在棒桿菌細(xì)胞中自主復(fù)制的重組DNA，包括編碼二氨庚二酸脫羧酶的DNA順序和編碼二氨庚二酸脫氫酶的DNA順序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA，其中表明了編碼二氨庚二酸脫羧酶的所述DNA順序編碼顯示在序列表的SEQ ID NO5中的氨基酸順序，或編碼顯示在SEQ ID NO5的氨基酸順序，其中有一個或多個的氨基酸經(jīng)取代、缺失或插入。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的重組DNA，其中表明了編碼二氨庚二酸脫氫酶的所述DNA順序編碼顯示在序列表的SEQ ID NO9中的氨基酸順序，或編碼顯示在SEQ ID NO9的氨基酸順序，其中有一個或多個的氨基酸的取代、缺失或插入。
4.棒桿菌，其中增強了編碼二氨庚二酸脫羧酶的所述DNA順序和編碼二氨庚二酸脫氫酶的所述DNA順序。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的棒桿菌，它是通過引入權(quán)利要求1中定義的重組DNA轉(zhuǎn)化的。
6.生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)權(quán)利要求4定義的所述棒桿菌，在培養(yǎng)物中生產(chǎn)和積累L-賴氨酸以及從培養(yǎng)物中收集L-賴氨酸的步驟。
7.生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基上培養(yǎng)權(quán)利要求5定義的所述棒桿菌，在培善物中生產(chǎn)和積累L-賴氨酸以及從培善養(yǎng)物中收集L-賴氨酸的步驟。
8.一種棒桿菌，其中的一道編碼二氨庚二酸脫羧酶的DNA順序以及一道編碼二氨庚二酸脫氫酶的DNA順序是通過增加所述兩道DNA順序的拷貝數(shù)、通過使用強促進(jìn)子，或其組合，而得到增強。
全文摘要
增強編碼二氨基庚二酸脫羧酶的DNA和編碼二氨基庚二酸脫氫酶的DNA的棒桿菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以在培養(yǎng)物中生產(chǎn)和積累L－賴氨酸以及從培養(yǎng)物中回收L－賴氨酸。
文檔編號C12N9/04GK1908174SQ200610084130
公開日2007年2月7日 申請日期1997年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年6月5日
發(fā)明者平野圣子, 杉本雅一, 中野英一, 泉井正子, 早川敦, 吉原康彥, 中松亙 申請人:味之素株式會社