專利名稱：光學(xué)活性叔亮氨酸的拆分方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從叔亮氨酸的消旋體拆分制備光學(xué)純的S-叔亮氨酸或R-叔亮氨酸的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種通過生物酶從衍生的消旋體叔亮氨酸拆分制備光學(xué)純的S-叔亮氨酸和R-叔亮氨酸的方法。
背景技術(shù)：
叔亮氨酸是一種非蛋白原的手性氨基酸，是一種重要的醫(yī)藥中間體，在手性合成、多肽的合成等方面有廣泛的應(yīng)用。
有關(guān)光學(xué)純叔亮氨酸的合成，主要有化學(xué)合成法與生物酶法，生物酶法又有兩種方法，酶催化和酶拆分。文獻(xiàn)中如《氨基酸與生物資源》(2003，25(4)，14-19)有詳細(xì)的報(bào)道。
常采用的叔亮氨酸的拆分方法為未衍生的或經(jīng)過衍生的(RS)叔亮氨酸，比如特丁酰衍生化(RS)叔亮氨酸，加入適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)拆分劑，如手性苯乙胺、10-樟腦磺酸、衍生的苯基乙磺酸。
以苯乙胺拆分特丁?；辶涟彼崤e例說明拆分過程，(RS)特丁?；辶涟彼幔尤?S)-苯乙胺反應(yīng)生成(RS)特丁?；辶涟彼?S)-苯乙胺鹽，重結(jié)晶，得(R)特丁?；辶涟彼酳-苯乙胺鹽，酸性條件下分離除去S-苯乙胺，(R)特丁酰基叔亮氨酸，繼續(xù)水解，脫特丁酰基，得(R)叔亮氨酸。
(RS)特丁?；辶涟彼幔尤?R)-苯乙胺反應(yīng)，生成(RS)特丁酰基叔亮氨酸(R)-苯乙胺鹽，重結(jié)晶，得(S)特丁酰基叔亮氨酸R-苯乙胺鹽，酸性條件下分離除去R-苯乙胺，(S)特丁?；辶涟彼?，繼續(xù)水解，脫特丁酰基，得(S)叔亮氨酸。
按照上述方法對(duì)叔亮氨酸的拆分，雖然光學(xué)純度可達(dá)95％以上，但產(chǎn)率僅23％，而且過程較長(zhǎng)，操作繁瑣，有機(jī)溶劑用量大，不適于工業(yè)化生產(chǎn)。
生物酶催化合成光學(xué)純叔亮氨酸，是利用酶的高度選擇性，反應(yīng)條件溫和，操作步驟短，有機(jī)溶劑用量小等優(yōu)點(diǎn)。但只能得到一種構(gòu)型的光學(xué)純叔亮氨酸-(S)叔亮氨酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過生物酶從叔亮氨酸的消旋體拆分制備光學(xué)純叔亮氨酸，即S-叔亮氨酸和R-叔亮氨酸的方法。本發(fā)明采用的酶，價(jià)格適中，便于工業(yè)化生產(chǎn)，整個(gè)生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單，環(huán)境污染小。
本發(fā)明的方法，包括以下步驟1)RS-叔亮氨酸與苯乙酰氯反應(yīng)，生成RS-苯乙酰基叔亮氨酸；2)利用米曲霉氨基酰化酶，選擇性水解脫去S-苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙?；?，生成S-叔亮氨酸，反應(yīng)溫度10-50℃，反應(yīng)時(shí)間6-240小時(shí)；3)過濾分離出固定化酶，反復(fù)使用；4)加入有機(jī)溶劑，使未反應(yīng)R-苯乙?；辶涟彼幔窒喾蛛x；5)水相中S-叔亮氨酸經(jīng)濃縮，結(jié)晶；6)油相中R-苯乙?；辶涟彼岷蠹尤胨?，水解，得R-叔亮氨酸。
本發(fā)明的方法中，采用固定化米曲霉氨基?；?EC3.5.1.14)。
本發(fā)明的方法中，未反應(yīng)的R-苯乙?；辶涟彼?，在堿性條件下，原位消旋，生成RS-苯乙酰基叔亮氨酸，再經(jīng)上述酶水解，生成S-叔亮氨酸。
本發(fā)明的方法中，所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、苯、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚，優(yōu)選為乙酸乙酯。
本發(fā)明的方法中，所述的酸為硫酸、鹽酸、磷酸。優(yōu)選為鹽酸。
本發(fā)明的方法中，所述的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸鋰、氫氧化鈣。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明中采用固定化米曲霉氨基?；?，有高的選擇性，使得S-叔亮氨酸的收率達(dá)到96％，光學(xué)純度達(dá)到99％ee以上。
2)本發(fā)明中采用固定化米曲霉氨基?；?，可以多次循環(huán)使用50次以上，活性降低少，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
3)本發(fā)明中充分利用R-苯乙?；辶涟彼幔趬A性條件下，原位消旋，生成RS-苯乙?；辶涟彼?，再經(jīng)上述酶水解，生成S-叔亮氨酸。S-叔亮氨酸的市場(chǎng)需求量比R-叔亮氨酸大，使得生產(chǎn)成本降低。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1 固定化米曲霉氨基?；?EC3.5.1.14)，固定化條件為固定液中含明膠1％，戊二醛0.5％，60mg氨基?；赣?0ml固定液；固定時(shí)間為2小時(shí)。固定化后，酶活性2800U/g(干固定化酶)，酶保留活性保留80％。
實(shí)施例2 RS-叔亮氨酸200g，加入至2000毫升三頸瓶中，加入2N氫氧化鈉溶液850ml，冰浴攪拌下，滴加乙酰氯240g的丙酮溶液400ml，溫度不超過20℃，滴加完后反應(yīng)2小時(shí)，濃縮除去丙酮，用6N的鹽酸溶液中和至PH＝4，1000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并乙酸乙酯，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮除去溶劑，得RS-苯乙?；辶涟彼?05g，收率85％。
實(shí)施例3 于2000ml反應(yīng)瓶中，加入將實(shí)施例2的RS-苯乙酰叔亮氨酸120g(510.6mmol)和水1500ml，固定化米曲霉氨基酰化酶10-30g，選擇性水解脫S-苯乙?；辶涟彼岬谋揭阴；蒘-叔亮氨酸，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間6小時(shí)；過濾分離固定化酶，乙酸乙酯3×300ml萃取未反應(yīng)R-苯乙?；辶涟彼?，水相經(jīng)濃縮，結(jié)晶，得S-叔亮氨酸63g，收率96％，光學(xué)純度99.2％ee；乙酸乙酯無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后得到R-苯乙?；辶涟彼?。
實(shí)施例4 于2000ml反應(yīng)瓶中，加入將實(shí)施例2的RS-苯乙酰叔亮氨酸120g(510.6mmol)和水1500ml，固定化米曲霉氨基?；?0-30g，選擇性水解脫S-苯乙?；辶涟彼岬谋揭阴；?，生成S-叔亮氨酸，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)；過濾分離固定化酶，乙酸乙酯3×300ml萃取未反應(yīng)R-苯乙?；辶涟彼?，水相經(jīng)濃縮，結(jié)晶，得S-叔亮氨酸51g，收率90％，光學(xué)純度99.0％ee；乙酸乙酯無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后得到R-苯乙?；辶涟彼?。
實(shí)施例5 于2000ml反應(yīng)瓶中，加入將實(shí)施例2的RS-苯乙酰叔亮氨酸120g(510.6mmol)和水1500ml，固定化米曲霉氨基?；?0-30g，選擇性水解脫S-苯乙?；辶涟彼岬谋揭阴；蒘-叔亮氨酸，反應(yīng)溫度10℃，反應(yīng)時(shí)間37小時(shí)；過濾分離固定化酶，加入乙酸乙酯3×300ml分三次萃取未反應(yīng)R-苯乙?；辶涟彼幔嘟?jīng)濃縮，結(jié)晶，得S-叔亮氨酸53g，收率91％，光學(xué)純度99.1％ee；乙酸乙酯無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后得到R-苯乙酰基叔亮氨酸。
實(shí)施例6 將實(shí)施例3中的97.2％ee的R-苯乙?；辶涟彼?1.3g(258.6mmol)、20.7g(517.2mmol)NaOH加入到水和異丙醇中，加熱回流2小時(shí)，冷卻，加入43ml 6M鹽酸攪拌中和，用3×100ml乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)溶劑，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得到消旋的苯乙?；辶涟彼幔涔鈱W(xué)純度為1.3％ee，收率92.4％。
實(shí)施例7 將實(shí)施例3中的97.2％ee的R-苯乙?；辶涟彼?1.3g(258.6mmol)、20.7g(517.2mmol)NaOH加入到水中，加熱回流5小時(shí)，冷卻，加入43ml 6M鹽酸攪拌中和，用3×100ml乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)溶劑，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得到消旋的苯乙?；辶涟彼?，其光學(xué)純度為51％ee，收率87.6％。
實(shí)施例8 將實(shí)施例3中的97.2％ee的R-苯乙酰基叔亮氨酸61.3g(258.6mmol)、20.7g(517.2mmol)NaOH加入到水和丙三醇中，加熱回流4小時(shí)，冷卻，加入43ml 6M鹽酸攪拌中和，用3×100ml乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)溶劑，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑得到消旋的苯乙?；辶涟彼幔涔鈱W(xué)純度為5.3％ee，收率89.3％。
實(shí)施例9 將實(shí)施例3中的R-苯乙?；辶涟彼?1.3g(258.6mmol)，加入250ml 6M的鹽酸，攪拌回流8小時(shí)，冷卻，用5M氫氧化鈉溶液中和，溶液濃縮，結(jié)晶，得到R-叔亮氨酸30.1g，其光學(xué)純度為99％ee，收率90.4％。
實(shí)施例10 將實(shí)施例6-8中消旋的苯乙酰基叔亮氨酸，100g和水1500ml，固定化米曲霉氨基?；?0g，選擇性水解脫S-苯乙酰基叔亮氨酸的苯乙?；蒘-叔亮氨酸，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)；過濾分離固定化酶，乙酸乙酯3×300ml萃取未反應(yīng)R-苯乙?；辶涟彼?，水相經(jīng)濃縮，結(jié)晶，得S-叔亮氨酸56g，收率97％，光學(xué)純度99.2％ee；乙酸乙酯無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后得到R-苯乙酰基叔亮氨酸。
權(quán)利要求
1.一種光學(xué)活性叔亮氨酸拆分方法，包括以下步驟1)RS-叔亮氨酸與苯乙酰氯反應(yīng)，生成RS-苯乙?；辶涟彼幔?)利用米曲霉氨基?；?，選擇性水解脫去S-苯乙?；辶涟彼岬谋揭阴；蒘-叔亮氨酸，反應(yīng)溫度10-50℃，反應(yīng)時(shí)間1-240小時(shí)；3)過濾分離出固定化酶；4)加入有機(jī)溶劑，使未反應(yīng)R-苯乙?；辶涟彼?，分相分離；5)水相中S-叔亮氨酸經(jīng)濃縮，結(jié)晶；6)油相中R-苯乙酰基叔亮氨酸中加入酸，水解，得R-叔亮氨酸。
2.按照權(quán)利要求1所述的光學(xué)活性叔亮氨酸拆分方法，其中，所述的米曲霉氨基酰化酶，是固定化。
3.按照權(quán)利要求1所述的光學(xué)活性叔亮氨酸拆分方法，其中，油相中未反應(yīng)R-苯乙?；辶涟彼?，加入堿，原位消旋，生成RS-苯乙?；辶涟彼?，再經(jīng)酶水解，生成S-叔亮氨酸。
4.按照權(quán)利要求1所述的光學(xué)活性叔亮氨酸拆分方法，其中，所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、苯、甲苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚。
5.按照權(quán)利要求1所述的光學(xué)活性叔亮氨酸拆分方法，其中，所述的酸為硫酸、鹽酸、磷酸。
6.按照權(quán)利要求3所述的光學(xué)活性叔亮氨酸拆分方法，其中，所述的堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鋰、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸鋰、氫氧化鈣。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種光學(xué)活性叔亮氨酸拆分方法，將RS－叔亮氨酸與苯乙酰氯反應(yīng)，生成RS－苯乙?；辶涟彼?；利用固定化米曲霉氨基酰化酶，選擇性水解S－苯乙?；辶涟彼岬谋揭阴；?，生成S－叔亮氨酸；加入有機(jī)溶劑，使未反應(yīng)R－苯乙?；辶涟彼?，分相分離；水相中S－叔亮氨酸經(jīng)濃縮，結(jié)晶；油相中R－苯乙?；辶涟彼嶂屑尤胨幔?，得R－叔亮氨酸。本發(fā)明采用的酶，價(jià)格適中，便于工業(yè)化生產(chǎn)，整個(gè)生產(chǎn)過程簡(jiǎn)單，有利于對(duì)環(huán)境的保護(hù)。
文檔編號(hào)C12P41/00GK101074446SQ20061002085
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
發(fā)明者王德祥, 吳松福, 王麗杰, 袁莉, 李主全 申請(qǐng)人:成都威克藥業(yè)有限責(zé)任公司