專利名稱：：在脊椎動物中作為遺傳操作和分析工具的piggyBac的制作方法在脊推動物中作為遺傳操作和分析工具的/&gv5flc1.發(fā)明領域本發(fā)明涉及其基因組包含p/ggv5ac家族轉座子系統(tǒng)的一種或多種因子的轉基因脊推動物(包括哺乳動物)細胞和轉基因非人脊推動物，包括非人哺乳動物，以及制備和使用所述細胞和動物的方法。本發(fā)明還涉及可用于實施這些方法的試劑盒。2.
背景技術：
：轉座因子或轉座子是在許多后生動物(包括蠕蟲、昆蟲和人)中鑒別出來的移動遺傳單位。在人和小鼠中，轉座子來源的序列占基因組的40。/。以上(Lander等，2001,Nature409:860-921;Waterston等，2002,Nature420:520-562)，表明了轉座在進化中的重要性。自從McClintock(McClintock,1950,Proc.Nafl.Acad.Sci.USA36:344-345)在玉米中發(fā)現(xiàn)了第一種轉座子，轉座因子已成為在許多生物中進行遺傳分析的非常寶貴的工具。在原核生物中，基于轉座子的誘變已導致發(fā)現(xiàn)了對微生物致病原因重要的基因(Hutchison等，1999,Science286:2165-2169;Vilen等，2003,J.Virol.77:123-134)。在真核生物中，導入P-因子介導的轉基因和插入誘變使果蠅遺傳學取得了顯著進步(Rubin和Spradling:1982,Science218:348-353)。包括P-因子在內的許多轉座子在其天然宿主以外都是無功能的，提示宿主因子參與轉座(Handler等，1993,ArchivesofInsectBiochemistry&Physiology22:373-384)。包括Tel/Mariner家族成員在內的幾種轉座子系統(tǒng)已應用于小鼠和斑馬魚(Z)am'orw/o)。利用比4支系統(tǒng)發(fā)育學方法已經(jīng)證明合成的Tel樣轉座子睡美人(S/eepwg5eaw(y在小鼠和人的細胞中有活性(Ivies等，1997，Cell91:501-510;Luo等，1998,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA95:10769-10773)。雖然已在小鼠中檢驗了諸如S/e印/"g和M/"oy的轉座子的插入誘變(Dupuy等，2001,Genesis30:82-88;Fischer等，2001,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA98:6759-6764;Horie等，2001,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA98:9191-9196;Zagomiou等，2001,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA98:11474-11478),但由于新轉座子插入主要集中在原始位點周圍以及以低效率發(fā)生的事實，這些轉座子在小鼠遺傳學中的普遍應用仍然有限(Drabek等，2003,Genomics81:108-111;Dupuy等，2001,Genesis30:82-88;Fischer等，2001,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA98:6759-6764;Horie等，2001,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA98:9191-9196;Hone等，2003，Mol.CellBiol.23:9189-9207;Zagomiou等，2001,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA98:11474-11478)。戸ggyBac因子是2472bp的轉座子，具有13bp的反向末端重復("ITR")和594個氨基酸的轉座酶(Cary等，Virology,Volume161,8-17，1989)。業(yè)已表明，粉紋夜蛾(7hc/7C^/uy/am)的//ggy5ac轉座因子(Cary等，Virology,161巻，8-17,1989)是地中海實蠅(Cera"toca/Ztoto)中的有效基因轉移載體(Handler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95巻，7520-7525,1998)。處于戶gg)^ac啟動子調節(jié)下的未修飾轉座酶輔助質粒(helper)的應用表明p/g幻必ac保留了在地中海果蠅(medfly)中的自主功能，因為轉錄調節(jié)以及酶活性得以保留。此觀察結果是絕無僅有的，因為所有其它成功的昆蟲種系轉化都被局限于使用分離自相同的或另一種雙翅類昆蟲的載體的雙翅類昆蟲物種。地中海果蠅的最初轉化(Loukeris等，Science,270巻，2002-2005,1995)使用得自海德氏果蠅(D冊o盧/a/;^e/)的載體(Franz和Savakis,Nucl.AcidsRes.,19巻，6646,1991)，而i矣及斑蚊04ecfeyaegypf/)已由家蠅(Mwcatfowe幼ca)(Warren等，Genet.Res.Camb.,Volume64,87-97,1994)的Hermes(Jasinskiene等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95巻，3743-3747,1998)禾口毛里i荅尼亞果蟲龜(Z^ayo//z7a附aMr/"awa)(Jacobson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83巻，8684-8688,1986)的mariner(Coates等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95巻，3748-3751,1998)轉化。黑腹果蠅(DmopMa附e/awoga對er)也已用//ermes(O'Brochta等，InsectBiochem.Molec.Biol.,26巻，739-753,1996)、man"er(Lidholm等，Genetics,134巻,859-868，1993)、(Franz等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,91巻,4746-4750,1994)以及最初在其自身基因組中發(fā)現(xiàn)的尸和/^6o轉座子(Rubin和Spradling,1989;Blackman等，EMBOJ.,8巻，211-217,1989)轉j匕。黑果蟲雖(Z)royo//n7"wW/z》也已用(Lozovskaya等，Genetics,143巻，365-374,1995;Gomez&Handler,InsectMol.Biol.,6巻，1-8,1997)和wah船r(Lohe等，Genetics,143巻，365-374,19%)轉化。盡管對雙翅類昆蟲載體的局限部分緣于由非雙翅類昆蟲物種獲得的轉座子系統(tǒng)數(shù)目有限，但鑒于功能性轉座子可能對宿主基因組具有有害作用，對轉座子功能的系統(tǒng)發(fā)生限制并不出乎意料。實際上，這可由作用于物種間、宿主物種的品系間乃至生物內的細胞類型間的轉座子移動的高水平調節(jié)反映出來(Berg和Howe,MobileDNA,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.1989)。//ggyBac(PB)屬于DNA轉座子，其因子一般通過切割和粘貼機制由由一個基因組位點切離，并整合入另一個基因組位點。其是一個2472-bp的轉座子，具有13-bp的反向末端重復(ITR)和594個氨基酸的轉座酶(Cary等，1989,Virology172:156-169;Fraser等，1995,Virology211:397-407;Fmser等，1996,InsectMolecularBiology5:141-151)。/^'ggy萬ac因子已用于黑腹果蟲乾(Dn^o;/2z7ame/a"ogoster)和其它昆蟲的遺傳分析。已發(fā)現(xiàn)轉座子插入到4核苷酸TTAA位點中，該TTAA位點在插入處重復(Fraser等，1995,Virology211:397-407;Fmser等，1996,InsectMolecularBiology5:141-151)。因為其特有的轉座酶和TTAA耙位點序列，所以已表明該轉座子為一個新DNA轉座子家族""^gg)^ac家族的創(chuàng)始成員(Robertson,2002,載于MobileDNAII,Craig等編輯，(Washington,D.C.,ASMPress),1093-1110頁)。p/ggySac已用于轉化覆蓋4個昆蟲目的10多種物種的種系(Handler,2002,InsectBiochemistry&MolecularBiology32:1211-1220;Sumitani等，2003,InsectBiochem.Mol.Biol.33:449-458)。作為誘變劑，戶,ggy5ac在果蠅屬(Dmsop/2,7a)中的轉座效率至少和P因子等效(Thibault等，2004,Nat.Genet.36:283-287)。在紅色面象蟲(7V歸畫ca咖薩)中，/7,^y5"c轉座也在非同源染色體間有效發(fā)生(Lorenzen等，2003,InsectMol.Biol.12:433-440)。在從真菌到哺乳動物的許多系統(tǒng)發(fā)育地位不同的物種基因組中都發(fā)現(xiàn)有很多戸ggySac樣序列，進一步表明了其活性可能并不僅局限在昆蟲中(Sarkar等，2003,Mol.Genet.Genomics270:173-180)。事實上，最近已發(fā)現(xiàn)//ggySac能在渦蟲(GZraratof,gn'"a)中轉座(Gonzalez-Estevez等，2003,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA100:14046-14051)。本文的論述或提及的參考文獻不應被解釋為承認這些參考文獻是本發(fā)明的先有技術。3.發(fā)明概述本發(fā)明基于出乎意料發(fā)現(xiàn)pggv5ac在脊推動物(包括哺乳動物)細月包中于體內和離體均可有效移位。AggvBac轉座幾乎獨有地依照精確的切割和粘貼方式發(fā)生在TTAA位點。當將p/gg}^ac轉座子導入到受精卵中時，其可整合入小鼠基因組中，而沒有明顯的染色體區(qū)域偏好，優(yōu)選插入到轉錄單位中。另外，pggySac因子可攜帶多個標記基因，并允許這些基因在不同的插入位點表達。因此，戸gg)^ac轉座子系統(tǒng)和"/7/ggySac樣，，轉座子家族的其它成員是在小鼠和其它脊推動物中進行有效遺傳操作和分析的有價值的新工具。本發(fā)明提供制備轉基因非人脊推動物的方法，所述脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含；&gy5ac樣轉座子和/或p/ggy5ac樣轉座酶。因此，本文提供將;/ggv^c樣轉座子和轉座酶導入動物中的方法，還4是供移動或固定^ggyBac樣轉座子的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生轉基因非人脊椎動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含攜帶至少1.5kb的插入片段的/7,'ggv^7c樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)將含攜帶至少1.5kb的插入片段的p!ggv6ac樣轉座子的核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的、編碼；/g幻^ac樣轉座酶的核苦酸序列，離體(exv/w)導入非人脊推動物胚胎或受精卵中；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊稚動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母(fostermother)中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊^^動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物；由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中包含攜帶至少1.5kb的插入片段的pz'ggySac樣轉座子的轉基因非人脊推動物。作為將含攜帶至少1.5kb的插入片段的"gg^ac樣轉座子的核酸離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中的備選方案，可導入含pggv5ac樣轉座子的重疊部分的多種核酸，只要該重疊足以在導入所述核酸的細胞內部發(fā)生同源重組。此備選方案尤其可用于將攜帶大插入片段的；z'gg)^ac樣轉座子導入細胞基因組中。因此，在這些實施方案中，第一個核酸應具有^ggyBac樣轉座子的左末端和至少一部分插入片段，而第二種核酸應具有/^'gg^ac樣轉座子的右末端和至少一部分插入片段。如果僅使用兩種核酸，則第一種核酸具有的插入片段部分和第二種核酸具有的插入片l殳部分重疊。如果使用第三種核酸，則第三種核酸應在一個末端與第一種核酸具有重疊區(qū)，在另一個末端與第二種核酸具有重疊區(qū)。圖14B圖解了此實施方案?？蓱么艘远喾N重疊核酸(例如2、3、4、5、6種或更多種)進行同源重組的基本原理，將具有大插入片段的p/gg)必"c樣轉座子導入到脊推動物細胞和生物的基因組中。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生轉基因非人脊椎動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含戶'ggv5ac樣轉座子，所述p/ggy^c樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀，所述方法包括以下步驟(a)將含戸'ggy5ac樣轉座子的核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的、編碼AggySac樣轉座酶的核苷酸序列，離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中，所述p/gg^ac樣轉座子包含編碼蛋白的核普酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊稚動物中的性狀；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊稚動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊稚動物；由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中包含p/ggv5ac樣轉座子的轉基因非人脊推動物，所述pgg)^ac樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀。本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生轉基因非人脊推動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含F(xiàn)ggvSac樣轉座子，其中所述//ggv5ac樣轉座子位于串聯(lián)體(concatamer)中，所述串聯(lián)體包含多個戸'g幻Wac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)將含;/gg^ac樣轉座子的線性化核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的、編碼p!ggyBac樣轉座酶的核苷酸序列，離體導入非人脊稚動物胚胎或受精卵中；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物，由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中含位于串聯(lián)體內的^ggyS"c樣轉座子的轉基因非人脊推動物，所述串聯(lián)體含多個p/ggySac樣轉座子。本發(fā)明再提供一種產(chǎn)生轉基因非人脊推動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含編碼^ggy^fc樣轉座酶的核苷酸序列，其中所迷編碼；^ggySac樣轉座酶的核苷酸序列位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核苷酸序列都編碼^ggvSac樣轉座酶，所述方法包括以下步驟(a)將含編碼戸gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列的線性化核酸離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊稚動物，由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中含編碼；/gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列的轉基因非人脊推動物，其中所述編碼/7ZggV^7C樣轉座酶的核苷酸序列位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個核普酸序列，其中每個核普酸序列都編碼p/ggyto樣轉座酶。本發(fā)明還又提供一種產(chǎn)生轉基因非人脊推動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的p《gy^c樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)分別將(i)含F(xiàn)gg^ac樣轉座子的核酸；和(ii)F'ggyBac樣轉座酶多肽離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中，導入量有效誘導所述p/g幻必flc樣轉座子整合入所述胚胎的一種或多種細胞的基因組中，或整合入所述卵母細胞或胚胎所來源的一種或多種細胞的基因組中；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物；由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中含固定的p/ggy5ac樣轉座子的轉基因非人脊牙,動物。本發(fā)明還又提供一種產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞的方法，所述細胞的基因組包含攜帶至少1.5kb的插入片段的^ggy5ac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)將含攜帶至少1.5kb的插入片段的;ig幻必ac樣轉座子的核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的、編碼pggV^c樣轉座酶的核苷酸序列導入到培養(yǎng)的脊推動物細胞中；和(b)在其中表達p/ggySac樣轉座酶的條件下培養(yǎng)所述細胞，這樣p/ggyBac樣轉座子被整合入所述培養(yǎng)的脊推動物細胞的基因組中，由此產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞，其基因組包含攜帶至少1.5kb的插入片段的戶'ggy5ac樣轉座子。作為將含攜帶至少1.5kb的插入片段的//gg)^ac樣轉座子的核酸導入培養(yǎng)的脊推動物細胞中的備選方案，可導入含p/gg)必ac樣轉座子的重疊部分的多種核酸，只要該重疊足以在導入所述核酸的細胞內部發(fā)生同源重組。如上所述，通過^f吏用僅含部分p/gg)^ac樣轉座子及其插入片段的多種核酸，該備選方案尤其可用于產(chǎn)生攜帶大插入片段的Wgg^ac樣轉座子并將其導入到細胞基因組中。本發(fā)明還又提供產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞的方法，所述細胞的基因組包含//ggv萬"c樣轉座子，所述pggy5ac樣轉座子包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列，所述方法包括以下步驟(a)將含p/ggv5ac樣轉座子的核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的、編碼戸'ggySac樣轉座酶的核苷酸序列導入到培養(yǎng)的脊推動物細胞中，所述p/ggySacc樣轉座子包含編碼在脊椎動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列；(b)在其中表達pzgg)^ac樣轉座酶的條件下培養(yǎng)所述細胞，這樣^ggvBac樣轉座子被整合入所述培養(yǎng)的脊推動物細胞的基因組中，由此產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞，其基因組包含戶'g幻必ac樣轉座子，所述p/ggvSacc蛋白的核苦酸序列。本發(fā)明還又提供產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞的方法，所述細胞的基因組包含戶/gg^ac樣轉座子，其中所述WggvSac樣轉座子位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個/7iggy5ac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)將含^ggy^c樣轉座子的線性化核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的、編碼尸gg^ac^^羊轉座酶的核苷酸序列導入到培養(yǎng)的脊推動物細胞中；(b)在其中表達^gg)^ac樣轉座酶的條件下培養(yǎng)所述細胞，這樣pggWac樣轉座子被整合入所述培養(yǎng)的脊推動物細胞的基因組中，由此產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊椎動物細胞，其基因組含/&gy萬flc樣轉座子，其中所述p/ggy^7c樣轉座子位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個戶/ggySac樣轉座子。本發(fā)明還又提供產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞的方法，所述細胞的基因組包含編碼p/ggvSac樣轉座酶的核普酸序列，其中所述編碼//gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核苷酸序列都編碼戸'ggyBac樣轉座酶，所述方法包括以下步驟(a)將含編碼;/gg)^ac樣轉座酶的核苦酸序列的線性化核酸導入到培養(yǎng)的脊推動物細胞中；和(b)在其中編碼pzggySac樣轉座酶的核苷酸序列被整合入所述培養(yǎng)的脊推動物的基因組中的條件下培養(yǎng)所述細胞，由此產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞，其基因組含編碼/^ggySac樣轉座酶的核苷酸序列，其中編碼所述p'ggySac樣轉座酶的所迷核苦酸序列位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核普酸序列都編碼；/ggy萬"c樣轉座酶。本發(fā)明還又提供在非人脊^f,動物中移動pgg)必ac樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊推動物與第二種轉基因非人脊推動物交配，以產(chǎn)生一個或多個子代，所迷第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含//gg^ac樣轉座子，其中所述pggy5ac樣轉座子攜帶至少1.5kb的插入片段，所述笫二種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含編碼戶gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其一種或多種細胞的基因組中既包含所述/^ggWac樣轉座子又包含所述編碼/^ggyBac樣轉座酶的核苷酸序列的子代，使得戸'ggy5ac樣轉座酶被表達，pzggvBflc樣轉座子被移動；由此在非人脊推動物中移動戶ggv^7c樣轉座子。所述第一種和第二種轉基因非人脊推動物可按照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。本發(fā)明還又提供在非人脊稚動物中移動p'ggv^(c樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊推動物與第二種轉基因非人脊推動物交配，以產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含p/ggySac樣轉座子，其中所述;《g)^ac樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀，所述第二種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含編碼//ggySac樣轉座酶的核香酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其一種或多種細胞的基因組中既包含所述p,'ggy^c樣轉座子又包含所述編碼；/ggv5ac樣轉座酶的核苷酸序列的子代，使得Z^ggV紐樣轉座酶被表達，p/'g^"c樣轉座子被移動；由此在非人脊推動物中移動/7/ggy^7c樣轉座子。所述第一種和第二種轉基因非人脊推動物可按照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。本發(fā)明還又提供在非人脊推動物中移動^gg)^ac樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊推動物與第二種轉基因非人脊稚動物交配，以產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含;/ggy^c樣轉座子，其中所述p/gg)^ac樣轉座子位于串i[關體中，所述串聯(lián)體包含多個戸ggv5ac樣轉座子，所述第二種轉基因非人脊椎動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含編碼戶gg)^ac樣轉座酶的核苷酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其一種或多種細胞的基因組中既包含所述Wgg)^ac樣轉座子又包含所述編碼pzggWac樣轉座酶的核苷酸序列的子代，使得p/ggvSac樣轉座酶被表達，^ggySflc樣轉座子祐L移動；由此在非人脊推動物中移動內gg)^ac樣轉座子。所述第一種和第二種轉基因非人脊推動物可按照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。本發(fā)明還又提供在非人脊推動物中固定p/ggy^2c樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊推動物與第二種成年脊推動物交配，以產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊稚動物在其一種或多種細胞的基因組中既包含(i)含至少2kb的插入片段的//ggyS"c樣轉座子，又包含(ii)編碼p'ggySac樣轉座酶的核苷酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其基因組中不包含編碼pggySac樣轉座酶的核苷酸序列、而在其一種或多種細胞的基因組中包含p/gg)^ac樣轉座子的子代，使得；/gg)^ac樣轉座子被固定在所述子代中，由此在非人脊推動物中固定p/ggySac樣轉座子。所述第一種轉基因非人脊^t食動物可按照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。所述第二種轉基因非人脊^^動物不一定是轉基因動物；但是，如果是轉基因的，則其可按照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。本發(fā)明還又提供在非人脊稚動物中固定/7,gg)^ac樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊堆動物與第二種成年脊推動物交配，以產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中既包含(i)p/ggvSac樣轉座子，其包含編碼蛋白的核苷酸序列，所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀，又包含(ii)編碼p/ggy^7c樣轉座酶的核苦酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其基因組中不包含編碼pggv5ac樣轉座酶的核苷酸序列、而在其一種或多種細胞的基因組中包含pzggvBac樣轉座子的子代，使得/^ggySac樣轉座子被固定在所述子代中，由此在非人脊稚動物中固定//gg)^ac樣轉座子。所述第一種轉基因非人脊推動物可^fe照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。所述第二種轉基因非人脊推動物不一定是轉基因動物；但是，如果是轉基因的，則其可按照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。本發(fā)明還又提供在非人脊推動物中固定J^ggyBac樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊推動物與第二種成年脊推動物交配，以產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中既包含(i)p/ggvSac樣轉座子，其中所述p/gg)^ac樣轉座子位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個pggvBac樣轉座子，又包含(ii)編碼^ggvBac樣轉座酶的核苷酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其基因組中不包含編碼/^ggySac樣轉座酶的核苷酸序列、而在其一種或多種細胞的基因組中包含樣轉座子的子代，使得p/ggvSac樣轉座子被固定在所述子代中，由此在非人脊椎動物中固定^ggyBac樣轉座子。所述第一種轉基因非人脊稚動物可按照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。所述第二種轉基因非人脊推動物不一定是轉基因動物；但是，如果是轉基因的，則其可按照本文描述的任一種方法產(chǎn)生。本發(fā)明還又提供產(chǎn)生轉基因非人脊推動物的方法，所述轉基因非人脊稚動物在其一種或多種細胞的基因組中含固定的pzggy5ac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生一種轉基因非人脊推動物，所述轉基因非人脊推動物在其多種種系細胞的基因組中既包含(i)p/g幻必"c樣轉座子，又包含(ii)編碼pggy^c樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苦酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述戸ggy6ac樣轉座子和所述編碼piggyBac樣轉座酶的核苷酸序列中的至少一個在包含多個；&gyS"c樣4爭座子的串聯(lián)體中，或在包含多個核苷酸序列的串聯(lián)體中，所述核苷酸序列每個都編碼戸ggv^c樣轉座酶，所述產(chǎn)生一種轉基因非人脊推動物包括以下步驟將一種或多種核酸離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中，所述一種或多種核酸包含(i)p'ggy^c樣轉座子和(ii)編碼pggy5ac樣轉座酶的核苷酸序列，所迷核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述一種或多種核酸中的至少一種被線性化；在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊稚動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和在足以允許所逸胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物，該動物在其多種種系細胞的基因組中既包含(i)/^ggySac樣轉座子，又包含(ii)編碼pgg^ac樣轉座酶的核苦酸序列，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述p'gg)^ac樣4爭座子和所述編碼p'g幻必ac樣轉座酶的核苷酸序列中的至少一個在包含多個p/ggy^c樣轉座子的串聯(lián)體中，或在包含多個每個都編碼p/ggy^rc樣轉座酶的核苷酸序列的串聯(lián)體中；(b)讓步驟(a)的回收的轉基因非人脊推動物生長至成年；(c)使步驟(b)的成年轉基因非人脊推動物與第二個成年脊稚動物交配，以產(chǎn)生一個或多個子代；(d)鑒別步驟(c)的所述一個或多個子代中至少一個在其基因組中不包含編碼；/ggv5ac樣轉座酶的核香酸序列但在其一種或多種細胞的基因組中包含p/gg)^ac樣轉座子的子代，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述一個或多個子代均為轉基因非人脊推動物，所述動物在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的/7,ggy5ac樣轉座子；由此產(chǎn)生轉基因非人脊推動物，所述動物在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的^g幻/^/c樣轉座子。本發(fā)明還又提供產(chǎn)生轉基因非人脊堆動物文庫的方法，所迷文庫的每個在其一種或多種細胞的基因組中均含固定的；/ggy5ac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生一種轉基因非人脊推動物，所述轉基因非人脊推動物在其多種種系細胞的基因組中既包含(i)//ggy^7c樣轉座子，又包含(ii)編碼//ggy萬oc樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苦酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述//ggv5ac樣轉座子和所述編碼/^gg)^ac樣轉座酶的核苷酸序列中的至少一個在包含多個WggyBac樣轉座子的串聯(lián)體中，或在包含多個每個都編碼pgg^ac樣轉座酶的核苷酸序列的串聯(lián)體中，所述產(chǎn)生一種轉基因非人脊推動物包括以下步驟將一種或多種核酸離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中，所述一種或多種核酸包含(i)戸'ggy^7c樣轉座子和(ii)編碼p'ggySac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述一種或多種核酸中的至少一種被線性化；在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物，該動物在其多種種系細胞的基因組中既包含(i)p/ggvSac樣轉座子，又包含(ii)編碼戸gg^"c樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述；/ggvBac樣轉座子和所述編碼；!'ggyBac樣轉座酶的核苷酸序列中的至少一個在包含多個//gg)^aC樣轉座子的串聯(lián)體中，或在包含多個每個都編碼；zgg)^ac樣轉座酶的核苦酸序列的串聯(lián)體中；(b)使步驟(a)的回收的轉基因非人脊推動物生長至成年；(c)使步驟(b)的成年轉基因非人脊推動物與第二個成年脊推動物交配，以產(chǎn)生一個或多個子代；(d)鑒別步驟(c)的兩個或多個子代，其中每個均在其基因組中不包含編碼^ggySac樣轉座酶的核苷酸序列，但在其一種或多種細胞的基因組中包含p/ggy5ac樣轉座子，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述兩個或多個子代均為轉基因非人脊推動物，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的戸ggy^c樣轉座子，由此產(chǎn)生轉基因非人脊推動物的文庫，其中每個均在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的尸/ggy^rc樣轉座子。在某些方面，本發(fā)明還提供一種轉基因非人脊推動物，所述動物在其一種或多種細胞的基因組中包含^gg)必ac樣轉座子和/或/7/gg^ac樣轉座酶。在某些實施方案中，所述轉座子攜帶至少1.5kb的插入片段；包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀；和/或在包含多個p/ggySac樣轉座子的串聯(lián)體中。在某些方面，本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)的脊推動物細胞，所述細胞在其基因組中包含p/ggySac樣轉座子和/或p/g幻必ac樣轉座酶。在某些實施方案中，所述轉座子攜帶至少1.5kb的插入片段；包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀；在包含多個p/ggy5ac樣轉座子的串聯(lián)體中；和/或包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還提供本文描述的轉基因非人脊推動物或培養(yǎng)的脊推動物細胞的文庫。在某些實施方案中，所述文庫通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)。在某些實施方案中，轉基因非人脊稚動物的文庫包含至少6個、至少10個、至少20個、至少50個、至少100個或至少1000個成員，其中至少一些或優(yōu)選全部在基因組中的不同位置具有/^ggvBac樣轉座子。在某些實施方案中，培養(yǎng)的脊推動物細胞文庫包含至少10個、至少20個、至少50個或至少IOO個成員，其中至少一些或優(yōu)選全部在基因組中的不同位置具有；z'ggvSac樣轉座子。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供轉基因非人脊稚動物或培養(yǎng)的脊推動物細胞的文庫，其基因組具有//gg)^ac樣轉座子，其中所述轉座子攜帶至少1.5kb的插入片段；所包含的核苦酸序列編碼改變轉基因非人脊推動物中性狀的蛋白；在包含多個；/ggy5ac樣轉座子的串聯(lián)體中；和/或包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明的方法和組合物可用于治療或預防疾病或障礙。因此，在某些方面，本發(fā)明提供治療或預防疾病或障礙的方法，所述方法包括將重組脊推動物細胞施用給需要此治療或預防的受治療者的步驟，其中所述細胞的基因組包含WggySac樣轉座子，所述//ggv^jfcc樣轉座子包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苦酸序列。在其它方面，本發(fā)明提供將核酸傳遞給需要治療或預防的受治療者的一種或多種細胞的方法，所述核酸編碼在脊椎動物疾病的治療或預防中有價值的蛋白，所述方法包括施用重組病毒的步驟，所述病毒的基因組包含(i)含編碼所述蛋白的核苷酸序列的p/ggyS"c樣轉座子；和(ii)編碼/z'g幻Wac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至引導^ggvB"c樣轉座酶在所述受治療者的所述一種或多種細胞中表達的啟動子；使得p/ggv萬"c樣轉座子在所述施用后^1整合入所述受治療者的所述一種或多種細胞的基因組中，由此將編碼在脊推動物疾病的治療或預防中有價值的蛋白的核酸傳遞給需要此治療或預防的受治療者。在某些實施方案中，所述病毒可為逆轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒。本發(fā)明還提供一種重組病毒，例如逆轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒，其基因組包含(i)含編碼所述蛋白的核苷酸序列的/^gv^rc樣轉38座子，和(ii)編碼//ggy萬ac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苦酸序列有效連接至啟動子。由于戸'gg)^ac樣轉座子的精確切離，所以本發(fā)明方法可用于確定由在其一種或多種細胞的基因組中包含/7ggy5ac樣轉座子的轉基因非人脊推動物所展示出的表型是否由所述/7Zggy^7C樣轉座子引起。在某些方面，所述方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生其中所述/zgg)^ac樣轉座子^L切離的所述轉基因非人脊推動物的一個或多個子代；(b)確定所述子代中的所述^ggvSac樣轉座子的切離和表型逆轉之間是否存在關聯(lián)，其中關聯(lián)表示所述表型由p/gg^ac樣轉座子引起，由此確定由在其一種或多種細胞的基因組中包含p/ggy6ac樣轉座子的轉基因非人脊稚動物展示出的表型是否由所述//ggyS"c樣轉座子引起。本發(fā)明的戶gg)必ac樣轉座子可用于增強子捕獲。因此，本發(fā)明提供由非人脊推動物或培養(yǎng)的脊椎動物細胞分離增強子的方法。在某些方面，所述方法包括以下步驟(a)在其一種或多種細胞或組織的基因組中包含pggyBac樣轉座子的轉基因非人脊椎動物中，評價在該轉基因非人脊推動物或由其獲得的子代的所述一種或多種細胞或組織中的報告基因表達，其中所述轉座子含處于最小啟動子控制下的報告基因；和(b)分離所述;7/ggy萬ac樣轉座子側翼的核酸，所述核酸負責報告基因在所述一種或多種細胞或組織中的表達；由此由非人脊稚動物分離出增強子。在其它方面，所迷方法可用于由培養(yǎng)的重組脊稚動物細胞分離增強子，其中所述重組細胞包含pz'ggyBac樣轉座子，所述;/ggV^7c樣轉座子含處于最小啟動子控制下的報告基因，所述方法包括以下步驟(a)在所述重組脊椎動物細胞或其子代中評價^^告基因的表達；和(b)分離所述//gg)^ac樣轉座子側翼的核酸，所述核酸負責報告基因在重組脊推動物細胞中的表達；由此由培養(yǎng)的重組脊稚動物分離出增強子。本發(fā)明方法是產(chǎn)生嵌合非人脊推動物的有用方法。因此，在某些方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生轉基因非人脊推動物的方法，所述動物的細胞是pzggv5ac樣轉座子鑲嵌體，所述方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生一種轉基因非人胚胎，所述胚胎在其基因組中包含(i);7ggv^7c樣轉座子純合型的遺傳基因座，其中所述^ggv^ac樣轉座子包含位點特異性重組酶識別序列，和(ii)編碼所述位點特異性重組酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至啟動子；(b)在其中表達位點特異性重組酶和發(fā)生增殖的條件下培養(yǎng)轉基因非人胚胎；由此產(chǎn)生其細胞為//ggy^/c樣轉座子鑲嵌體的非人轉基因脊推動物。通過這些方法產(chǎn)生的嵌合動物也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明還提供含適于實施本發(fā)明的材料的試劑盒。因此，在某些方面，本發(fā)明提供的試劑盒包含(a)在一個或多個容器中的一種或多種核酸，所述核酸包含(i)p/ggyS"c樣轉座子和(ii)編碼^'ggy^ac樣轉座酶的核苷酸序列；和(b)在第二個容器中的(i)培養(yǎng)的脊推動物細胞或(ii)非人脊推動物卵母細胞。在具體的實施方案中，戸'ggy^rc樣轉座子攜帶至少1.5kb的插入片段，和/或攜帶編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的插入片段。在某些方面，在本發(fā)明試劑盒中的至少一種核酸4皮線性化。在本文要求保護的方法和組合物的某些實施方案中，p/gg^"c樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀。在本文要求保護的方法和組合物的某些方面，包含pggv5ac樣轉座子的核酸被線性化，使得一種或多種所述細胞的基因組包含位于串聯(lián)體中的所述p/ggvSac樣轉座子，所述串聯(lián)體包含多個戸gg)^ac樣轉座子。在本文要求保護的方法和《且合物的其它方面，包含編碼//ggy6ac樣轉座酶的核苦酸序列的核酸—皮線性化，使得一種或多種所述細胞的基因組包含位于串聯(lián)體內的所述編碼Agg3^ac樣轉座酶的核苷酸序列，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核苷酸序列都編碼樣轉座酶。40在本文要求保護的方法和組合物的其它方面，p/ggySac樣轉座子包含由結合和/或修飾核酸的蛋白所識別的序列。在某些實施方案中，所述修飾核酸的蛋白是DNA結合蛋白、DNA-修飾蛋白、RNA結合蛋白或RNA-修飾蛋白。所述修飾核酸的蛋白還可為位點特異性重組酶的耙位點，例如FRT或lox重組酶的耙位點。在本發(fā)明的方法和組合物的其它方面，/^'ggv5ac樣轉座子包*擇標記。在其它方面，p/gg^ac樣轉座子包含報告基因。在一個具體實施方案中，^gg^ac樣轉座子既包含選擇標記，又包含報告基因。在另一個具體實施方案中，所述才艮告基因對導入轉座子的物種是內源的。在本發(fā)明的方法和組合物的其它方面，/^ggy^fc樣轉座子包含至少0.5kb、至少lkb或至少1.5kb的插入片段。在其它實施方案中，/7Zggy5ac樣轉座子包含至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少11.5kb、至少13kb、至少14kb或至少15kb的插入片段。在其它具體實施方案中，piggy5ac樣轉座子包含不超過15kb、不超過20kb、不超過25kb、不超過30kb、不超過35kb、不超過40kb、不超過45kb、不超過50kb、不超過60kb、不超過75kb或不超過100kb的插入片段。在另外的具體實施方案中，/7/ggy5ac樣轉座子包含處于1.5-3kb、1.5-5kb、1.5-10kb、1.5-20kb、1.5-30kb、1.5-50kb、1.5-75kb、2-5kb、2-10kb、2-20kb、2-30kb、2-50kb、2-75kb、3-5kb、3-10kb、3-20kb、3-30kb、3-50kb、3-75kb、5-10kb、5-20kb、5-30kb、5-50kb、5-75kb、10-20kb、10-30kb、10-50kb或10-75kb之間的插入片段。在本發(fā)明的方法或組合物〃使戸'ggy5"c樣轉座子和編碼^ggySac樣轉座酶的核苷酸序列這二者導入到細胞或生物中時，p/ggySac樣轉座子和編碼戸ggyB"c樣轉座酶的核苷酸序列可在同一核酸中，或在獨立核酸上。在其中轉座子和轉座酶編碼區(qū)在獨立核酸上的實施方案中，含WggyBac樣轉座子的核酸是DNA，含pZgg)^ac樣轉座酶的核酸是RNA，使得p/ggySac樣轉座子被固定在所述細胞或生物的基因組中。備選地，包含p/ggySac樣轉座子和^ggy^rc樣轉座酶的核酸均可為DNA，使得可以產(chǎn)生其基因組包含編碼pgg)^ac樣轉座酶的核苦酸序列的細胞或生物。優(yōu)選地，編碼p/gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列有效連接至啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子引導在種系中的轉座酶表達，例如為遍在啟動子，或更優(yōu)選地為種系特異性啟動子。在一個實施方案中，所述種系特異性啟動子為雄性特異性啟動子(例如本文所述的魚精蛋白1(Prm)啟動子)。在另一個實施方案中，所述種系特異性啟動子為雌性特異性啟動子(例如ZP3啟動子)。本發(fā)明的治療或預防方法的受治療者優(yōu)選為非人脊推動物。在優(yōu)選實施方案中，所述受治療者是人或非人動物。在具體實施方案中，所述動物是寵物(例如貓、狗)或家畜(牛、馬)。在某些實施方案中，本發(fā)明的轉基因非人脊推動物是鳥(例如雞或其它禽類)或魚(例如斑馬魚)。在其它實施方案中，所述脊推動物是非人哺乳動物，包括但不限于非人靈長類動物、牛、貓、狗、馬、綿羊、小鼠、大鼠、豚鼠、熊貓和豬。在具體實施方案中，所述轉基因非人脊推動物是家畜。本發(fā)明的重組細胞可為任意脊稚動物細胞。在具體實施方案中，所述細胞是禽(例如雞或其它禽類)或魚(例如斑馬魚)源的細胞。在其它實施方案中，所述細胞是哺乳動物源的，包括但不限于靈長類動物(包括但不限于人細胞和黑猩猩細胞)、牛、貓、狗、馬、綿羊、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、貂、熊貓和豬。在其它實施方案中，所述細胞是蛙類細胞，例如非洲爪蟾(^e"o/iw/aew力細胞。在一個具體實施方案中，細胞來源是家畜。所述細胞可為正常的或患病的，并可為任意不同的類型或狀態(tài)。在本發(fā)明的某些實施方案中，帶有戶gg)必flc樣轉座子和/或轉座42酶編碼序列的核酸被線性化，然后將其導入到細胞或生物中，使得所述核酸作為串聯(lián)體被插入到所述細胞或生物的基因組中。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法和組合物中所使用的p/gg)必ac樣轉座子是P'.gg)^c轉座子，和/或p/ggy5ac樣轉座酶是/7z'ggy5ac轉座酶。.本發(fā)明還提供涵蓋本文所述特征的任意排列的實施方案。在本文列出的所有值之間的所有值和范圍，例如就p/ggySac樣轉座子插入片段大小或細胞/生物文庫大小而言，也包括在本發(fā)明中。4.附圖簡述圖1，用于哺乳動物細胞和小鼠的戸ggV^7C二元轉座子系統(tǒng)的轉座子載體和轉座酶構建物。(圖1A)PB供體構建物。將由各種啟動子驅動的標記或內源基因(陰影框，箭頭表示轉錄方向)置于一對PB重復末端(PBL和PBR，黑色箭頭)之間。末端之上的箭頭顯示了用于反向PCR的引物的相對位置。還指示了轉座子的總長度?？招目虼碣|粒主鏈序列。M:Mfel;B:BamHI;S:Swal;A:Ascl;H:HindIII。(圖1B)PB轉座酶輔助質粒構建物。由巨細胞病毒(CMV)啟動子、p-肌動蛋白(Act)啟動子或魚精蛋白1(Prml)啟動子驅動的pgg)^ac轉座酶基因(PBase)后接牛生長激素polyA(BGHpA)或兔P-球蛋白polyA(rBGpA)。圖2，在哺乳動物培養(yǎng)細月包中的p/ggySac整合。(圖2A)在293細胞中增強的轉基因整合的統(tǒng)計學結果。計數(shù)來自由有或沒有輔助質粒的供體轉座子構建物的轉染的G418抗性克隆的數(shù)目。每個數(shù)目都是由3個轉染實驗獲得的平均值。條棒顯示標準偏差(PO.OOOl)。(圖2B)在小鼠^//7WS(5ES細胞中增強的轉基因整合的統(tǒng)計學結果?？寺∪?A)中一樣計數(shù)。(圖2C)小鼠ES細胞轉染實驗的實例。在G418選擇后用亞甲藍染色存活克隆。圖3，在小鼠中的pggv5ac因子轉座。(圖3A)在通過注射環(huán)形質粒所產(chǎn)生的所有幼崽中通過PCR基因分型測定的轉座子陽性的創(chuàng)始鼠(founder)的比率。實心條棒和空心條棒分別代表共注射供體質粒和輔助質?；蜃⑸鋯为毜墓w質粒獲得的結果。PB轉座酶的存在導致轉基因效率提升。(圖3B)尸萬/^c^RF/7陽性創(chuàng)始鼠的DNA印跡分析。在某些情況下，在一只創(chuàng)始鼠(AF0-41)中觀察到超過10個整合，而在野生型對照中沒有發(fā)現(xiàn)信號。(圖3C)DNA印跡分析表明PB因子的種系傳遞。在與野生型動物交配后，分析創(chuàng)始鼠及其子代。雄性創(chuàng)始鼠(AF0-61)的多個/^/"A:f-^i^/整合在其子代中分離。攜帶單個尸B/M〃-i^PP/轉座整合(通過DNA印跡和反向PCR結果判斷，表3中的A47T6)的雌性尸S/y4"-i^P/創(chuàng)始鼠(AF0-47)也將其轉座子傳遞給其一個子代(47-336)。圖4，尸ZggySac在小鼠種系中的精確切離和轉座。共注射/^附/-尸^^和尸5/^"-^77的雄性創(chuàng)始鼠用于分析種系轉座。(圖4A)尸^G4"-i^P/轉座子的放大結構?；蚪MDNA由曲線代表，而含PB轉座子的質粒串聯(lián)體顯示在對準的框中。限制位點M:M/w/;E:B:Sg///;A:爿cc65/。用于DNA印跡分析的探針的位置以實線表示。用于檢測切離事件的引物以箭頭指示。(圖4B)創(chuàng)始鼠(BF0-33)及其子代的DNA印跡分析揭示了1.3kb串聯(lián)體信號之外的條帶，因此暗示出現(xiàn)種系轉座。(圖4C)在用示于(圖4A)的引物進行PCR擴增后，在幾個子代中觀察到具有預期的精確切離后長度的陽性條帶。圖5,轉基因在p/ggy6ac載體中的表達。(圖5A)在子代中的/^/^"-7^/7表達在手提式長波UV燈照射下產(chǎn)生紅色熒光。顯示了攜帶相同單拷貝轉座子的2只陽性小鼠(箭頭)和2只陰性同窩小鼠(星號)。(圖5B)在創(chuàng)始鼠及其子代中的/^M"-i^P/表達。紅色熒光在創(chuàng)始鼠中是嵌合體。轉座子在子代中分離產(chǎn)生不同的RFP信號強度。星號標記轉基因陰性同窩小鼠。(圖5C)和(圖5D)2個轉基因在同一;/gg^ac載體中的共表達。由于酪氨酸酶的表達，尸S/^/4-7)t，y4rf-AF/7創(chuàng)始鼠在白光下顯示出灰色毛色，而轉基因陰性同窩小鼠保持白色(圖445C,分別在右側和左側)。當通過UV照射時，由此創(chuàng)始鼠觀察到紅色熒光(圖5D)。圖6,小鼠中的p/ggy5ac整合位點。(圖6A)來自100個PB整合位點的側翼序列的核苷酸組成。除了TTAA靶點特異性以外，在側翼序列中還觀察到T和A的富集。星號表示在與隨機采樣的TTAA對照的側翼序列相比時P0.05。(圖6B)PB插入在基因中的分布。圖解了位于外顯子、內含子、5'調節(jié)序列(鄰接轉錄起始位點的10kb)、3'調節(jié)序列(鄰接聚腺苷酸化位點的10kb)和全部4個區(qū)域(總計)中的PB插入的百分率。實心條棒指示所有已知和預測的基因的數(shù)據(jù)，空心條棒指示已知基因或EST的數(shù)據(jù)。(圖6C)PB插入在5'區(qū)中的分布。(圖6D)PB插入在3，區(qū)中的分布。(圖6E)在小鼠中93個整合位點的分析表明，PB整合看起來命中了除2個最小染色體(19和Y)之外的所有染色體。實心箭頭表示命中外顯子，黑色箭頭指示命中內含子，空心箭頭指示命中預測的基因間區(qū)域。圖7，在各種哺乳動物細胞系中增強的pggy^/c整合。圖8，；/gg)^ac可在不同物種中轉座。圖9,可在小鼠體細胞中切離和轉座。通過雜交獲得Act-PBase和PB串聯(lián)體雙陽性的小鼠。采用PB側翼引物的PCR檢測到轉座子由其原始位點切離。通過相同個體的反向PCR進一步揭示了新的轉座子插入。這些事件在其PB單陽性親本中未檢測到。因為DNA由尾部樣品提取，所以預期所迷切離和轉座發(fā)生在體細胞中。圖10，通過共注射p!gg7Bac轉座子和Pmr-/^gg>^ac轉座酶構建物而轉座。圖IIA-C，通過雜交轉座。圖11A,用雜交策略進一步檢驗雄性種系特異性啟動子(prai)。攜帶p,gg;^7c轉座子的小鼠與攜帶Pmr-尸S"M轉基因的小鼠雜交，結果表明雜交策略可用于誘導新的轉座。圖IIB，Act-PBase和PB串聯(lián)體雙陽性小鼠與野生型小鼠雜交。通過反向PCR和DNA印跡在該雜交的子代中檢測到新轉座事件。檢驗的全部3個新轉座均能穩(wěn)定傳遞至下一代。圖IIC，Pmr-PBase和PB串聯(lián)體雙陽性雄性小鼠(DF0-9)活躍地生產(chǎn)攜帶新轉座子插入的子代(由左圖的DNA印跡分析和反向PCR揭示)。約50%的新插入位于4號染色體上的推定原始位點附近，提示在PB跳躍時可能發(fā)生局部跳躍。攜帶非自主PB轉座子(串聯(lián)體或單拷貝)的小鼠與攜帶轉座酶的小鼠(例如在小鼠種系中特異性表達轉座酶的Pmr-PBase)雜交。轉座子/轉座酶雙陽性Fl小鼠(對Pmr-Pbase而言僅雄性小鼠)與野生型小鼠雜交。在下一代(F2)中，使用DNA印跡和反向PCR來克隆新轉座位點。使用Pmr-Pbase和Act-Pbase這二者在嘗試的每個重組中均獲得新插入，即便在攜帶單拷貝轉座子的小鼠用作初始系(starterline)時也是如此。所分析的其中一種轉座源于5號染色體，而定位于l號染色體。圖12A-B,;/ggv5ac插入可報告基因表達譜。含lacZ的；/ggy^fc轉座子可報告它們所插入基因的表達譜。2個實例在F2力743(圖12A)中和OWO(圖12B)中插入。在圖12B中，顯示了攜帶lacZ報告基因的基于PB的外顯子捕獲栽體的結果。當轉座子被插入到GA川的第一個內含子中時，小鼠胚胎的lacZ染色顯示了與其他人報告的結果一致的OW0表達譜。圖13A-B,円gg)^"c插入可在小鼠中產(chǎn)生表型。兩個實例在P/W2基因中插入引起胚胎致死性(隱性的，在尸々W純合胚胎中引起灶性出血和全身水腫)(圖13A-B)，而在基因中插入引起眼部缺陷(顯性的)(圖13B)，就象傳統(tǒng)敲除法產(chǎn)生的突變小鼠一樣。圖14A-B圖解了應用；/ggy^7c樣轉座子系統(tǒng)將大段DNA插入脊推動物基因組中。圖14A顯示了攜帶一個或多個基因(由黑色箭頭指示)并被克隆入pz'ggyS"c樣轉座子的反向末端重復(ITR)中的質粒、粘粒、P1片段或BAC片段。在存在；7/ggySac樣轉座酶(環(huán)形)時，整個表達盒都將通過轉座被整合入基因組(實線)中。備選地，如圖14B所示，將大染色體區(qū)切成幾個部分重疊的片段，兩個最外部的部分每個都攜帶；7/ggy萬ac樣ITR。在存在^ggyB"c樣轉座酶時，這些片段應通過轉座和同源重組而整合入基因組(實線)中。5.發(fā)明詳述本發(fā)明提供了^gg)^ac樣轉座子系統(tǒng)在脊推動物細胞和非人脊推動物生物體中的應用。本發(fā)明提供經(jīng)工程化而表達/7/ggyS"c樣轉座子系統(tǒng)組分的脊推動物細胞和非人生物、制備此細胞和生物的方法、這些工程化的細胞和生物的文庫。本發(fā)明涉及將本發(fā)明的p/g幻Wac樣轉座子導入細胞基因組中。當細胞還包含^gg^"c樣轉座酶時，發(fā)生轉座子的有效摻入。如上所述，pzggySflc才羊專爭座酶可作為p/ggy5crc才羊4爭座酶蛋白或編石馬戸'ggy5ac才羊轉座酶的核酸提供給細胞。編碼p/ggv5ac樣轉座酶的核酸可采用RNA或DNA的形式。此外，編碼^gg)^"c樣轉座酶的核酸可穩(wěn)定地或瞬時地摻入細胞中，以利于pZgg)必ac樣轉座酶在細胞中短暫的或延長的表達。此外，啟動子或其它表達控制區(qū)可與編碼戸ggySac樣轉座酶的核酸有效連接，以定量或組織特異性方式調節(jié)該蛋白的表達。可使用本領域已知的各種凈支術中的任一種將本發(fā)明的p/ggyS"c樣轉座子導入一種或多種細胞中，所述技術包括但不限于微注射、將含轉座子的核酸與脂質嚢泡如陽離子脂質嚢泡組合、粒子轟擊、電穿孑L、DNA濃縮劑(例如磷酸鈣、聚賴氨酸或聚乙烯亞胺)或將轉座子摻入病毒載體中并使病毒載體與細胞接觸。在使用病毒載體的情況下，病毒載體可包括本領域已知的各種病毒載體中的任一種，包括選自逆轉錄病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體的病毒載體。本發(fā)明的戸'ggy5ac樣轉座子系統(tǒng)可容易地用于產(chǎn)生轉基因動物，其中所述動物在其一種或多種細胞中攜帶特定標記或表達特定蛋白。產(chǎn)生轉基因動物的方法是本領域已知的。在本發(fā)明的另一種應用中，本發(fā)明提供一種在細胞中移動p/ggy^ac樣序列的方法。在該方法中，；/g幻必ac樣轉座子^皮摻入到細胞的DNA中。另外的內ggyBac樣轉座酶或編碼p'ggvBac樣轉座酶的核酸被導入到細胞中，該蛋白能夠將所述核酸片段由細胞DNA中的第一個位置移動(即轉移)到該細"包DNA中的第二個位置。該方法允許核酸片段由基因組中的一個位置轉移到基因組中的另一個位置，或者例如由細胞中的質粒轉移到該細胞的基因組。在一個實施方案中，所述細胞是培養(yǎng)的。內gg)^ac樣轉座子的移動還可以在動物中發(fā)生，例如通過使2個成年動物交配，其中1個在其至少一些生殖細胞中帶有/^g幻必ac樣轉座子，而另1個在其至少一些生殖細胞中帶有pzgg^"c樣轉座酶編碼序列，由此產(chǎn)生既具有轉座子又具有轉座酶的子代。備選地，如下產(chǎn)生轉基因動物將/7zggv萬"c樣轉座子和轉座酶的核酸(在相同或獨立的核酸上)共注射入卵子或受精卵中，由此產(chǎn)生包含pgg)^ac樣轉座子和轉座酶編碼序列這二者的轉基因動物。轉座酶編碼序列可處于遍在啟動子或組織特異性啟動子控制之下，使得其在至少一些具有所述轉座子的細胞中表達。這使得所述轉座子可以移動。如果啟動子在種系中有活性，則動物的子代可遺傳移動的轉座子。為確保移動的轉座子的穩(wěn)定性，選擇不包含轉座酶編碼基因的子代。在這樣的子代中，所述轉座子被固定。含與PggWac樣轉座酶蛋白或編碼pggy5ac樣轉座酶的核酸組合的p/ggyBflc樣轉座子的本發(fā)明的^ggySac樣轉座子系統(tǒng)是用于種系轉化、產(chǎn)生轉基因動物、導入核酸至細胞的DNA中、插入誘變以及在各種脊推動物物種中的基因標記的強力工具。本發(fā)明還提供該系統(tǒng)在脊稚動物中作為有效遺傳操作和分析工具的應用，以及在醫(yī)學、藥學和畜牧業(yè)中的應用。5.1.饑'ggy丑fltc樣轉座子系統(tǒng)本發(fā)明涉及/^gg》Wac樣轉座子系統(tǒng)在脊推動物細胞中的應用。此系統(tǒng)用于將核酸序列導入到脊^^動物細胞的DNA中。p/ggySac樣轉座酶結合至內gg)必ac樣轉座子的反向重復序列中的識別位點，并催化所述轉座子摻入DNA如靶細胞的基因組DNA中。如在實施例中所述，戸'ggv6ac樣轉座子和p/gg^ac樣轉座酶編碼核酸的這種組合導致轉座子序列整合入細胞或生物中。p/ggvSac樣轉座子是可移動的，因為它們可在戸'ggy^c樣轉座酶存在的情況下由DNA上的一個位置轉移到DNA上的第二個位置。p,ggy^rc樣轉座子系統(tǒng)有兩個基本組分活性；z'gg)^7c樣轉座酶源和由所述轉座酶識別并移動的//gg^5ac樣ITR。ITR的移動使ITR之間的間插核酸也#:移動。因此，本發(fā)明的；/ggy5flc樣轉座子系統(tǒng)包含兩種組分pZggyBac樣轉座酶或編碼p/ggySac樣轉座酶的核酸，以及克隆的//ggK5ac樣轉座子，后者是含至少2個由pzggy5ac樣轉座酶識別的反向重復序列的核酸。當將這兩種組分放置在一起時，提供了活躍的轉座子活性。在使用時，轉座酶結合至反向重復序列，促進間插核酸序列整合入細胞的DNA中。因此，組合物方法的實施涉及一種二分p/ggy5ac樣轉座子系統(tǒng)，其包含p/ggy5ac沖羊轉座因子(transposonelement)和p/ggySoc樣轉座酶或編碼//ggySac樣轉座酶的核酸。戸ggy5ac樣組分可來源于p纟ggy5ac或任意相關的/^ggySac樣轉座子系統(tǒng)。在本發(fā)明的^gg)^"c樣轉座子中，左和右轉座子末端(其含由p'ggy^c樣轉座酶識別的5，和3'末端重復序列)側接插入片段，例如待插入到靶細胞基因組中的核酸或編碼選擇標記或表型標記的核酸，如下文更詳細的描述。位于或處于戸'gg)^"c樣4爭座子的左末端和右末端之間的插入片段的大小可大幅變化。實際上，發(fā)明人已得到了出乎意料發(fā)現(xiàn)/7,g幻必ac即便在攜帶14kb或以上的插入片段時仍可穩(wěn)定轉座。在具體的實施方案中，所述插入片段為至少0.5kb、至少1kb、至少1.5kb、至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少llkb、至少11.5kb、至少13kb、至少14kb或至少15kb。在其它具體實施方案中，p/ggy&c樣轉座子包含不超過15kb、不超過20kb、不超過25kb、不超過30kb、不超過35kb、不超過40kb、不超過45kb、不超過50kb、不超過60kb、不超過75kb或不超過100kb的插入片段。在另外的具體實施方案中，戸gg)^ac樣轉座子包含處于1.5-3kb、1.5-5kb、1.5-10kb、1.5-20kb、1.5-30kb、1.5-50kb、1.5-75kb、2-5kb、2-10kb、2-20kb、2-30kb、2-50kb、2-75kb、2.5-5kb、2.5-10kb、2.5-20kb、2.5-30kb、2.5-50kb、2.5-75kb、3-5kb、3-10kb、3-20kb、3-30kb、3-50kb、3-75kb、5-10kb、5-20kb、5畫30kb、5-50kb、5-75kb、10-20kb、10-30kb、10-50kb或10-75kb之間的插入片段。在插入片段的尺度大得足以使轉座子系統(tǒng)將轉座子整合入目標基因組中的能力失活的情況下，可在不同核酸上以重疊部分(例如兩個或三個或四個部分)提供轉座子，使得同源重組會使不同的核酸在細胞中重組，并在存在p&gy^7c樣轉座酶的情況下作為單個大轉座子整合入基因組中。因此，在這樣的實施方案中，第一種核酸會帶有p'ggvSac樣轉座子的左末端和至少一部分插入片段，第二種核酸會帶有;,gg)必ac樣轉座子的右末端和至少一部分插入片段。如果僅使用兩種核酸，則第一種核酸所帶有的插入片段部分和第二種核酸所帶有的插入片段部分重疊。如果使用第三種核酸，則第三種核酸應與第一種核酸在一個末端有重疊區(qū)，與第二種核酸在另一個末端有重疊區(qū)。圖14B圖解了此實施方案。采用多種(例如2、3、4、5、6個或更多種)重疊核酸進行同源重組的此基本原理可應用于將具有大插入片段的;zggySac樣轉座子導入脊推動物細胞或生物的基因組中。以此方式可將具有達50kb、60kb、75kb、100kb、120kb、140kb、160kb乃至更大的插入片段的轉座子導入到靶細胞的基因組中。此同源重組系統(tǒng)有利地允i午將大段DNA(例如含內含子、外顯子或調節(jié)元件的完整基因)插入到靶細胞中。每對核酸之間的重疊程度將取決于靶細胞的重組要求，但可小至約20個核苷酸至幾個kb。在具體的實施方案中，重疊的程度為至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少500個核香酸、至少750個核苷酸或至少1kb。在其它實施方案中，重疊的程度不超過750個核苦酸、不超過lkb、不超過1.5kb或不超過1.5kb。如上所述，本發(fā)明的//ggy^3c樣轉座子系統(tǒng)還包括^ggy5ac樣轉座酶活性源。p/ggvS"c樣轉座酶活性是結合至p/g0必ac樣轉座子的末端重復序列并介導轉座子整合入靶細胞基因組中的活性。任意合適的；/ggv5ac樣轉座酶活性都可用于題述方法，只要其滿足以上參數(shù)。/7&gV^c樣轉座酶活性可來自與p/ggy5ac樣轉座子自身相同的來源或不同的來源。/^gg^ac樣轉座酶活性的來源可變。在某些實施方案中，所述來源可為表現(xiàn)出^ggySac樣轉座酶活性的蛋白。但是，所述來源一般是編碼具有//gg^"c樣轉座酶活性的蛋白的核酸。當所述來源是編碼具有p/ggy5ac樣轉座酶活性的蛋白的核酸時，編碼轉座酶蛋白的核酸一般是如上所述的表達組件的一部分，其中額外的因子根據(jù)需要供轉座酶表達用。因此，轉座酶可整合入靶細胞的基因組中。但是，在某些實施方案中，轉座酶作為蛋白或RNA提供給細胞。一般來說，本發(fā)明的戸gg)^ac樣轉座子在載體上被導入到靶細胞中，所述載體例如為質粒、病毒型載體、線性DNA分子等。優(yōu)選地，/7/ggy5w樣轉座子包含插入片段，該插入片段含至少一部分可讀框。適宜的可讀框在5.14節(jié)中提供。在一個實施方案中，p/ggy75ac樣轉座子插入片段還包含調節(jié)區(qū)，例如轉錄調節(jié)區(qū)(例如啟動子、增強子、沉默子、基因座控制區(qū)或邊界元件)。適宜的調節(jié)區(qū)在5.11節(jié)中提供。優(yōu)選地，所述調節(jié)區(qū)連接至可讀框。在其中轉座酶活性源是編碼；《gv5ac樣轉座酶的核酸的某些實施方案中，pgg)^ac樣轉座子和編碼轉座酶的核酸存在于獨立的載體上，例如獨立的質粒。在某些其它實施方案中，轉座酶編碼序列可與轉座子存在于相同的載體上，例如在相同的質粒上。當存在于相同載體上時，；/ggy^fc樣轉座酶編碼區(qū)或結構域位于轉座子ITR之外。由其可獲得本發(fā)明的轉座因子和轉座酶因子的示例性轉座子系統(tǒng)列于以下的表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>列之外，p/gg^"c樣轉座酶可由在嚴格雜交條件下可與表1中提供的轉座酶編碼核酸雜交的DNA編碼，只要所編碼蛋白保留針對戸ggyS"c樣轉座子的轉座酶活性。在具體的實施方案中，轉座酶由與表l中提供的/7/ggy^rc樣轉座酶編碼序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列編碼。在某些實施方案中，可對pggy5ac樣轉座酶的氨基酸序列實施多種保守改變，而不改變pggv5ac才羊活性。這些改變稱為保守突變，即屬于具有特定大小或特征的氨基酸類別的氨基酸可被另一種氨基酸置換，特別是例如在與催化活性或DNA結合活性不相關的蛋白區(qū)域中。//級yS"c樣轉座酶的其它氨基酸序列包括具有含相對于本文所提供序列保守改變的氨基酸序列的轉座子，所述保守改變不顯著改變轉座酶的功能。對氨基酸序列的置換可選自該氨基酸所屬類別的其它成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。負電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。特別優(yōu)選的保守置換包括但不限于Lys置換Arg，反之亦然，以保持正電荷；Glu置換Asp，反之亦然，以保持負電荷；Ser置換Thr,使游離羥基得以保持；以及Gln置換Asn，以保持游離氨基。此外，可^"飾編碼^ggyBac樣轉座酶的特定DNA序列，以使用對特定細胞類型優(yōu)選的密碼子，例如對要導入轉座酶編碼序列的靶細胞優(yōu)選的密碼子。除了在表1中和在以下章節(jié)6中具體列舉的^ggv5ac樣轉座子序列以外，術語"戸ggy5ac樣轉座子"包括可由天然或人工轉座酶切離并再插入到基因組中的TTAA耙位點的任意DNA片段，以引起側接所述因子的靶位點重復(TSD)。在具體的實施方案中，該序列來源于列于表1或描述于以下章節(jié)6的戶ggyS"c或//ggv^c樣因子。535.2.制備p/ggy丑flc樣轉座酶系統(tǒng)的方法用于題述方法的wg幻Wac樣轉座子系統(tǒng)的各種因子，例如含pz'ggy5ac樣轉座子或轉座酶因子的載體，可通過限制酶剪切、連接和分子克隆的標準方法產(chǎn)生。一種用于構建題述載體的方法包括以下步驟。首先，用限制性內切核酸酶由初始來源(例如含p/gg^ac樣轉座子的載體)切取含所需組成核苷酸序列以及附加序列的純化的核酸片段。然后使用常規(guī)分離方法，例如通過瓊脂糖凝膠電泳，將含所需核普酸序列的片段與不同大小的不需要片段分離。由凝膠切取所需片段，以合適的配置連接在一起，以便產(chǎn)生含如本文所述的所需序列的環(huán)形核酸或質粒。在需要時，則在原核宿主如大腸桿菌中擴增如此構建的環(huán)形分子。涉及這些步驟的剪切、質粒構建、細胞轉化和質粒產(chǎn)生的方法對本領域技術人員而言是眾所周知的，限制和連接所需要的酶是商品化的(參見例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1982);Catalog1982-83,NewEnglandBiolabs,Inc.;Catalog1982-83,BethesdaResearchLaboratories,Inc.)。^口何構建用于題述方法的載體的其它實例提供于下文的章節(jié)6。5.3.使用p&gy丑flc樣轉座子系統(tǒng)將核酸整合入把細胞基因組中本文描述的方法可用于其中期望將外源核酸導入并穩(wěn)定整合入耙細胞或生物的基因組中的各種應用。目標生物包括脊推動物，其中所述脊推動物在許多實施方案中是哺乳動物。在某些實施方案中，本發(fā)明的脊椎動物是鳥(例如雞或其它禽類)或魚(例如斑馬魚)。在其它實施方案中，所述脊推動物是非人哺乳動物，包括但不限于非人靈長類動物、牛、貓、狗、馬、綿羊、小鼠、大鼠、倉鼠、貂、豚鼠、熊貓和豬。在其它實施方案中，所述生物是蛙類，例如非洲爪蟾(Ze"o/^/aew》。在一個具體實施方案中，所述轉基因非人脊推動物是家畜。在涉及將所述轉座子系統(tǒng)直4妾施用給多細胞生物的實施方案中，例如用于基因治療目的(在下文的5.4節(jié)中更詳盡地描述)，所述哺乳動物還可以是人。5.4.將p/ggy丑ac樣轉座系統(tǒng)導入多細胞生物中的方法//g幻必ac樣轉座子系統(tǒng)導入多細胞生物中的途徑取決于幾個參數(shù)，包括攜帶所述系統(tǒng)組分的載體的性質、傳遞載體的性質、生物性質，等等。該施用模式的共同特征在于其供體內傳遞轉座子系統(tǒng)組分至靶細胞用。在某些實施方案中，線性或環(huán)化DNA如質粒用作將轉座子系統(tǒng)傳遞至靶細胞的載體。在這^f的實施方案中，質?？稍谒詡鬟f溶媒如鹽水溶液中給予。備選地，可使用調節(jié)載體在多細胞生物中分布的物質。例如，在含題述系統(tǒng)組分的載體為質粒載體的情況下，可使用基于脂質如脂質體的載體，在此情況下基于脂質的載體可靶向特定細胞類型，用于所述載體的細胞或組織特異性傳遞。公開了這些方法的專利包括美國專利第5,877,302、5，840，710、5,830,430和5,827,703號，其公開內容在此引入作為參考。備選地，基于多聚賴氨酸的肽可用作載體，其可用或可不用靶向部分等修飾。(Brooks,A.I.等，1998，J.Neurosci.Methods80巻137-47頁；Muramatsu,T.,Nakamura,A.和H.M.Park1998,Int.J.Mol.Med.1巻55-62頁)。在其它實施方案中，所述系統(tǒng)組分可摻入到病毒載體上，例如腺病毒衍生載體、新培斯病毒衍生載體、逆轉錄病毒衍生載體等，雜種載體，諸如此類。以上載體和傳遞載體僅僅是示例?？墒褂萌我廨d體/傳遞載體組合，只要其供體內施用轉座子系統(tǒng)至多細胞生物和靶細胞用。在基因治療背景下適宜的載體/傳遞載體提供于以下的5.13節(jié)。因為可使用眾多不同類型的載體和傳遞載體，施用可經(jīng)由眾多不同途徑進行，其中代表性的施用途徑包括口服、局部、動脈內、靜脈內、腹膜內、肌內等。施用的具體模式至少部分取決于用于具有p/gg)必ac樣轉座子系統(tǒng)的載體的傳遞載體性質。在許多實施方案中，使用水基傳遞載體，例如鹽水溶液，血管內(例如動脈內或靜脈內)施用一種或多種具有/7&幻/^C樣轉座子系統(tǒng)的載體。將Wggy^c才羊轉座子系統(tǒng)的因子，例如p/ggy^ac樣轉座子和p&gy5ac樣轉座酶源，以體內方式給予多細胞生物，使得它們在足以使反向重復序列側翼核酸由攜帶所述轉座子的載體切離并且隨后切離的核酸被整合入靶細胞基因組中的條件下被導入到多細胞生物的靶細胞中。根據(jù)轉座子載體自身的結構，即載體是否包含具有p/gg^ac樣轉座酶活性的產(chǎn)物的編碼區(qū)，該方法還可包括將編碼必需轉座酶活性的第二種載體導入到靶細胞中。導入到細胞中的含轉座因子的載體核酸的量，以及在許多實施方案中導入到細胞中的編碼轉座酶的載體核酸的量，足以供預期的轉座子核酸切離和插入到靶細胞基因組中使用。因此，導入的載體核酸的量應提供足量的轉座酶活性和期望插入靶細胞中的足夠的核酸拷貝數(shù)。導入到靶細胞中的載體核酸量隨使用的具體導入方案(例如使用的具體體內施用方案)的效率而變。施用給多細胞生物的所述系統(tǒng)的各個組分的具體劑量隨轉座子核酸的性質而變，所述性質例如為表達組件和基因的性質、組分因子存在于其上的載體的性質、傳遞載體的性質等。劑量可由本領域技術人員憑經(jīng)驗容易地確定。例如，在其中；/gg)^oc樣轉座子系統(tǒng)組分存在于單獨質粒(在鹽水溶液載體中靜脈內施用給哺乳動物)上的小鼠中，在許多實施方案中施用的轉座子質粒的量通常在約0.5-40昭的范閨內，通常為約25fig,而施用的^g幻Wac樣轉座酶編碼質粒的量通常在約0.5-25pg的范圍內，通常為約lpg。一旦載體DNA連同需要的轉座酶一起已進入到靶細胞中，反向重復序列側翼的載體核酸區(qū)，即位于；Zggy5ac樣轉座酶所識別的反向重復序列之間的載體核酸，就凈皮所提供的轉座酶由載體上切離，并插入到耙細胞的基因組中。因此，將載體DNA導入到靶細胞之后發(fā)生轉座酶介導的切離，并將載體所攜帶的外源核酸插入到耙細胞基因組中。題述方法可用于將各種大小的核酸整合入靶細胞基因組中，如在上文的5.1節(jié)中所述。題述方法導致核酸穩(wěn)定整合入靶細胞基因組中。所謂穩(wěn)定整合指核酸保持存在于靶細胞基因組中不止短時間段，并于部分染色體遺傳物質上傳遞給靶細胞的子代。5.5.產(chǎn)生含p&gyB<ic樣轉座子的重組細胞的方法轉化細胞的建立要求DNA首先在物理上處于宿主細胞中。當前的轉化步驟使用各種技術將DNA導入細胞中。在一種形式的轉化中，通過使用微量移液管將DNA直接微注射入細胞中。備選地，可使用高速粒子轟擊將結合小DNA的^i子推進到細胞中。在另一種形式中，細胞因存在聚乙二醇而^^皮透化，因此使DNA通過擴散進入到細胞中。還可以通過將原生質體與含DNA的其它實體融合而將DNA導入到細胞中。這些實體包括微細胞、細胞、溶酶體或其它可融的脂質-表面體。電穿孔也是一種將DNA導入細胞中的可接受方法。在該技術中，細胞經(jīng)受高場強的電脈沖，高場強可逆地透化生物膜，允許外源DNA序列進入。一種按照本發(fā)明將轉化構建物導入細胞中的優(yōu)選方法是用構建物微注射受精卵。在生物發(fā)育過程中，側接轉座子反向重復序列的DNA序列被插入到受精卵基因組中，該DNA將被傳遞到所有的子代細胞，從而產(chǎn)生轉基因生物。先前已描述了微注射卵以產(chǎn)生轉基因動物，并用于產(chǎn)生轉化的哺乳動物(Hogan等，ManipulatingTheMouseEmbryo:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview,N.Y.,1986;Shirk等，載于BiotechnologyForCropProtection:Hedin等(編輯)，ACSBooks,WashingtonD.C.,135-146,1988;Morgan等，Annu.Rev.,Biochem.,62巻，191-217,1993;所有參考文獻都在此引入作為參考)。備選地，可經(jīng)由病毒將兩部分piggyBac樣轉座子系統(tǒng)傳遞至細胞，所述病毒包括逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰滲病毒和其它病毒。對于含側接反向末端重復序列(ITR)的目標轉基因的轉座子部分和轉座酶編碼基因，有幾種潛在的傳遞機制組合。例如，轉座子和轉座酶基因可一起包含在相同的重組病毒基因組上；單次感染傳遞；zg^^c樣系統(tǒng)的兩個部分，從而使轉座酶的表達引導轉座子由重組病毒基因組剪切下來，隨后整合入細胞染色體中。在另一個實例中，轉座酶和轉座子可通過病毒和/或非病毒系統(tǒng)如含脂質試劑的組合分別傳遞。在這些情況下，轉座子和/或轉座酶基因中的任一種都可以通過重組病毒傳遞。在每種情況下，所表達的轉座酶基因都指引轉座子由其載體DNA(病毒基因組)釋放出來，用于整合入染色體DNA中。本發(fā)明的p/gg》必"c樣轉座子系統(tǒng)可導入到脊推動物源的任意細胞系或原代細胞系中。在某些實施方案中，所述細胞是一種細胞系，例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、HeLa、VERO、BHK、Cos、MDCK、293、3T3、骨髓瘤(例如NSO、NSI)、HT-1080或W138細胞。脊推動物細胞也可為細胞融合事件的產(chǎn)物，例如雜交瘤細胞。在某些實施方案中，所述細胞可為多能細胞(即其后代可分化為幾種有限細胞類型的細胞，例如造血干細胞或其它干細胞)或全能細胞(即其后代可變成生物中的任意細胞類型的細胞，例如胚胎干細胞)。本發(fā)明還考慮了諸如卵母細胞、卵細胞以及一種或多種胚胎細胞的細胞。在其它實施方案中，所述細胞可為各種器官或組織來源的成熟細胞。這樣的細胞包括但不限于淋巴細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞、各種血液細胞以及生物體的各種細月包。5.6.產(chǎn)生含p&gy丑flc樣轉座子的重組動物的方法將上述;z'ggy5^樣轉基因導入到非人哺乳動物中。大部分非人哺乳動物是適宜的，包括諸如小鼠和大鼠的嚙齒動物、兔、羊科動物(例如綿羊和山羊)、豬科動物(例如豬)以及?？苿游?例如牛和水牛)。在某些基因轉移方法中，將轉基因導入到受精卵的原核中。對于某些動物，例如小鼠，體內進行受精，并經(jīng)手術取出受精卵。在其它動物中，尤其是牛中，優(yōu)選由活體或屠宰動物取出卵子，并在體外使卵受精。參見DeBoer等，WO91/08216。體外受精允許轉基因被導入處于細胞周期的最佳整合期(不遲于S期)的基本同步細胞中。轉基因通常通過微注射導入。參見美國專利第4,873,292號。然后在體外培養(yǎng)受精卵，直至獲得含約16-150個細胞的植入前胚胎。胚胎的16-32細胞期被描述為桑椹胚。含超過32個細胞的植入前胚胎稱為胚泡。這些胚胎通常在64細胞期顯示出嚢胚腔發(fā)育。培養(yǎng)受精卵至植入前期的方法描述于Gordon等(1984)MethodsEnzymol.101,414;Hogan等，ManipulationoftheMouseEmbryo:ALaboratoryManual,C.S.H.L.N.Y.(1986)(小鼠胚胎)；和Hammer等(1985)Nature315,680(兔和豬胚胎)；Gandolfi等(1987)J.Reprod.Fert.81,23-28;Rexroad等(1988)J.Anim.Sci.66,947-953(羊胚月臺)和Eyestone等(1989)J.Reprod.Fert.85,715-720;Camous等(l984)J.Reprod.Fert.72，779-785;和Heyman等(1987)Theriogenology27,5968(牛胚胎)(這些參考文獻就其所有用途整體引入作為參考)。有時植入前胚胎冷凍儲存一段時間，等待植入。將植入前胚胎轉移至適宜的雌性中，根據(jù)轉基因整合時的發(fā)育階段導致誕生轉基因動物或嵌合動物?？煞庇逗蟿游?，以形成真正的種系轉基因動物。備選地，可將轉基因導入到胚胎干細胞(ES)中。這些細胞得自體外培養(yǎng)的植入前胚胎。Bradley等(1984),Nature309,255-258(就其所有用途整體引入作為參考)。轉基因可通過電穿孔或微注射導入到這些細胞中。使轉化的ES細胞與來自非人動物的胚泡混合。ES細胞于胚胎中建群，在某些胚胎中形成所得嵌合動物的種系。參見Jaenisch,Science,240,1468-1474(1988)(就其所有用途整體引入作為參考)。備選地，ES細胞可用作供移植入去核受精卵中用的細胞核源，產(chǎn)生轉基因哺乳動物。對于含兩種或多種轉基因的轉基因動物的生產(chǎn)，例如在其中本發(fā)明的戶/gg)^ac樣轉座子和/7ZggySac樣轉座酶組分經(jīng)獨立核酸導入到動物中的實施方案中，可使用與對單個基因相同的方法同時導入轉基因。備選地，所述轉基因起初可導入到單獨的動物中，然后通過繁殖所述動物合并入相同基因組中。備選地，產(chǎn)生含其中一種轉基因的第一種轉基因動物。然后將第二種轉基因導入到來自該動物的受精卵或胚胎干細胞中。在某些實施方案中，將轉基因構建為重疊片段，要不然其長度會超過約50kb。將這樣的重疊片段同時導入到受精卵或胚胎干細胞中，并經(jīng)歷體內同源重組。參見Kay等，WO92/03917(就其所有用途整體引入作為參考)?？扇缦鲁Ｒ?guī)地產(chǎn)生轉基因哺乳動物將上述轉基因微注射到哺乳動物受精卵(原核期的受精卵)中，在幾次附加溫育后將受精卵植入雌性哺乳動物(受體哺乳動物)的輸卵管或直接植入其同步假孕子宮，并獲得幼崽。為查明產(chǎn)生的幼崽是否是轉基因的，可使用下述斑點印跡分析、PCR、免疫組織學分析、補體抑制分析等。由此產(chǎn)生的轉基因哺乳動物可如下繁殖常規(guī)交配并獲得幼崽，或將已初始化或未初始化的轉基因哺乳動物體細胞的核轉移至其核預先已被去核的受精卵中(核轉移)，將卵植入受體哺乳動物的輸卵管或子宮中，并獲得克隆幼崽。如果納入選擇標記作為所導入DNA序列的一部分，則可由未轉細胞DNA中的DNA的細胞和/或生物)。選擇標記包括例如提供抗生素抗性的基因；改變宿主生理的基因，例如綠色熒光蛋白，以產(chǎn)生改變的可見表型；等等。含這些基因的細胞和/或生物能夠在殺死未轉化細胞/生物的抗生素、殺蟲劑或除草劑濃度存在下存活，或產(chǎn)生改變的可見表型。使用熟悉本領域的技術人員已知的標準技術，例如DNA印跡分析和聚合酶鏈反應，可由專爭基因細胞和/或生物中分離出DNA，以證實所導入的DNA已凈皮插入。5.7.攜帶位點特異性重組酶識別位點的jp/jaev必ac樣轉座子本發(fā)明的；/gg)必ac樣轉座子系統(tǒng)可用于在非人脊推動物的染色體中隨機插入位點特異性重組酶識別序列，以利于產(chǎn)生突變型和/或鑲嵌型動物。在具體的實施方案中，位點特異性重組酶是Cre-loxP系統(tǒng)或FLP-FRT系統(tǒng)(參見Kilby，1993,TrendsGenet9(12):413-421和其中引用的參考文獻)。兩個整合在不同染色體上的位點特異性重組酶識別序列之間的重組產(chǎn)生在這些染色體之間轉座。這樣的轉座是建立導致發(fā)育異?；蚰[瘤發(fā)生的突變的常見方法。兩個雙位點特異性重組酶識別序列之間在直向重復方向的重組可引起間插DNA序列(例如基因)的切離。盡管這樣的事件是潛在可逆的，但被切離DNA序列在細胞分裂過程中消失或因降解而消失使突變不可逆。在任意基因中的無歲文突變都可以此方式建立，可在特定細胞和/或特定發(fā)育階段中研究基因功能。兩個雙位點特異性重組酶識別序列之間在反向重復方向的重組可引起間插序列或基因的倒置。倒置可引起基因活化或失活。如果基因活性是可檢測的(例如選擇標記、組織化學標記、報告基因)，則可通過檢測基因活化或失活鑒別標記細胞及其后代的重組事件來跟蹤細胞譜系?？赏ㄟ^監(jiān)測位點特異性重組酶識別序列的整合位點的差異跟蹤細胞譜系，而與基因活性無關。整合在染色體上的位點特異性重組酶識別序列和整合在染色體外遺傳物質上的位點特異性酶識別序列之間的重組可使遺傳物質插入到染色體中。以此方式建立的插入會提供建立轉基因非人動物的方法，該轉基因非人動物在其基因組中由染色體位點特異性重組酶識別序列確定的位點處具有位點特異性整合的單拷貝轉基因。優(yōu)選地，間插序列或遺傳物質含基因，例如發(fā)育基因、必需基因、細胞因子基因、神經(jīng)遞質基因、神經(jīng)遞質受體基因、癌基因、腫瘤抑制基因、選擇標記或組織化學標記或其部分。重組可分別通過調節(jié)區(qū)與基因的鄰接或調節(jié)區(qū)與基因的分離而引起基因活化或失活。5.8.外顯子捕獲本發(fā)明的p&gV^c樣轉座子系統(tǒng)還可用于外顯子捕獲克隆或啟動子捕獲程序，以檢測各種組織中的差別基因表達。參見例如D.Auch和Reth等，"ExonTrapCloning:UsingPCRtoRapidlyDetectandCloneExonsfromGenomicDNAFragments",NucleicAcidsResearch,18巻，第22期，6743頁；Buckler等，1996,Pro"Nat'lAcad.Sci.USA88:4005-4009(1991);Henske等，Am.J.Hum.Genet59:400-406。在這些實施方案中，；/ggy5ac樣轉座子優(yōu)選包含側接外顯子剪接供體和受體位點的檢測標記基因，例如GFP或親和標記。因此，由標記基因編碼的蛋白在由其中插入了/^ggvSac樣轉座子的遺傳基因座所編碼的蛋白中被翻譯，使得可檢測由遺傳基因座編碼的蛋白。5.9.多肽合成應用本文公開的產(chǎn)生轉基因動物和鑲嵌動物以及重組細胞的方法可用于合成多肽，例如目標蛋白。在這些應用中，產(chǎn)生其某些或全部細胞的基因組含p/ggyBac樣轉座子連同必需和/或期望的表達調節(jié)序列如啟動子等(即表達組件)的轉基因型或鑲嵌型動物，以用作表達所述多肽的表達宿主，其中所述;/gg^ac樣轉座子含編碼目標多肽的插入片段。同樣，在這些方法中可使用含此/7/ggySac樣轉座子的培養(yǎng)的脊推動物細胞。然后，讓轉基因型或鑲嵌型動物或重組細胞經(jīng)歷足以表達p/ggv^/c樣轉座子所帶有的插入片段編碼多肽的條件。然后使用任意常規(guī)方法收集表達的蛋白，并在必要時純化。在轉基因型或鑲嵌型動物背景下，本發(fā)明的方法提供了一種在動物中表達目標蛋白或產(chǎn)生能夠高水平表達目標蛋白的細胞系的手段。因此，用本發(fā)明產(chǎn)生的動物和細^^包可用作用于目標蛋白生產(chǎn)的"生物反應器"。目標蛋白對所述細胞或動物來說可為內源的或外源的。另外，本文描述的方法可用于改良牲畜的性狀。5.10.治療應用本發(fā)明的方法可用于治療應用，其中戶/ggy^c樣轉座子用于將治療性核酸如基因穩(wěn)定整合入靶細胞基因組中，即基因治療應用。p/gg)^flC樣轉座子系統(tǒng)可用于將各種各樣的治療性核酸傳遞給受治療者。治療性目標核酸包含替代靶宿主細胞中的缺陷基因(例如？1起遺傳缺陷型病癥的基因)的基因或可讀框；在癌癥治療中有治療用途的基因；等等。示例性的治療有益編碼序列公開于5.13節(jié)。如上文所述的題述方法的重要特征在于題述方法可用于體內基因治療應用。所謂體內基因治療應用指其中期望治療性基因表達的一種或多種耙細胞在與轉座子系統(tǒng)接觸前并未從宿主中取出。相反，包含轉座子系統(tǒng)的載體直接施用給多細胞生物，并由耙細胞攝取，之后發(fā)生所述基因在靶細胞基因組中的整合。5.11.啟動子在本發(fā)明的一個實施方案中，插入到Wggy5ac樣轉座子中的核酸編碼有效連接至調節(jié)ORF表達的元件的可讀框("ORF，)。另外，調節(jié)元件對于調節(jié)；/gg^ac樣轉座酶的表達而言是理想的，特別是在其中編碼轉座酶的核酸被導入到動物基因組中的本發(fā)明實施方案中。優(yōu)選地，；/ggy5ac樣轉座子中的表達組件包含轉錄調節(jié)元件，其供轉座子帶有的ORF表達用。具體轉錄調節(jié)元件的實例包括如Dijkema等，EMBOJ.(1985)4:761所述的SV40因子；如Gorman等，Proc.Nat'lAcad.SciUSA(1982)79:6777所述來源于勞斯肉瘤病毒的LTR的轉錄調節(jié)元件；如Boshart等，Cell(1985)41:521所述來源于人巨細胞病毒(CMV)的LTR的轉錄調節(jié)元件；hsp70啟動子(Levy-Holtzman,R.和I.Schechter(Biochim.Biophys.Acta(1995)1263:96-98)Presnail,J.K.和M.A.Hoy,(Exp.Appl.Acarol.(1994)18:301-308》等。在具體的實施方案中，調節(jié)元件是誘導型啟動子。誘導型啟動子對熟悉本領域的人員來說是已知的，存在多種可用于驅動轉座酶基因表達的誘導型啟動子。誘導型啟動子包括例如熱激啟動子系統(tǒng)、金屬硫蛋白系統(tǒng)、糖皮質激素系統(tǒng)、組織特異性啟動子等。由熱激調節(jié)的啟動子，例如一般與70kDa熱激蛋白編碼基因相連的啟動子，可在暴露于提升的溫度后使表達增加幾倍。糖皮質激素系統(tǒng)也可很好地起觸發(fā)基因表達的作用。該系統(tǒng)由編碼糖皮質激素受體蛋白(GR)的基因組成，GR在甾類激素(即糖皮質激素或其一種合成等價物，例如地塞米松)存在下與激素形成復合物。該復合物然后結合稱為糖皮質激素效應元件(GRE)的短核苷酸序列(26bp)，此結合活化所連接基因的表達。因此，誘導型啟動子可用作控制所導入基因表達的環(huán)境誘導型啟動子。除了控制基因產(chǎn)物的功能活性的誘導型啟動子之外的其它方法對熟悉本領域的人員來說是已知的。在某些實施方案中，^gg^ac樣轉座酶在種系特異性啟動子控制下表達。在某些實施方案中，種系特異性啟動子是雄性特異性啟動子(例如本文所述的魚精蛋白1(Prm)啟動子)。在其它實施方案中，種系特異性啟動子是雌性特異性啟動子(例如ZP3啟動子，例如鼠ZP3(mZP3)啟動子(Lira等，1990,Proc.Nat，l.Acad.Sci.U.S.A.87(18):7215-9)。為使用家畜作為生物反應器，蛋白可大量地在乳汁、尿、血液或蛋中生產(chǎn)。在乳汁、尿、血液或蛋中啟動表達的啟動子是已知的，這些啟動子分別包括但不限于酪蛋白啟動子、小鼠尿蛋白啟動子、p-球蛋白啟動子和卵清蛋白啟動子。5.12.w'ggyBac樣轉座子誘變和基因發(fā)現(xiàn)轉座子標記是一種藉此將轉基因DNA傳遞至細胞，使得轉基因DNA整合4因中，由此通過插入誘變活化基因的技術。在該方法中，被失活基因由轉座因子標記，然后可使用轉座因子回收突變等位基因。轉座因子的插入可破壞可產(chǎn)生特征表型的基因的功能。由于轉座因子在基因組內和基因組間由一個染色體位置向另一個染色體移動的固有能力，其具有某些生物的進化的遺傳操作，所述生物包括細菌(Gonzales等，1996Vet.Microbiol.48,283-291;Lee和Henk,1996.Vet.Microbiol.50,143-148)、果蠅(Dmso;^7a)(Bamnger和Benzer,1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,9402-9406;Bellen等,1989GenesDev.3,1288-1300;Spradling等，1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92,10824-10830)、秀麗隱桿線蟲(C.degam)(Plasterk,1995.Meth.Cell.Biol.,AcademicPress,Inc.59-80頁)和各種植物物種(O/^ggy^rc-likeorneandBaker,Curr.Opin.CellBiol,7,406-413(1995))。已利用轉座子作為有用的載體進行轉座子-標記、增強子捕獲和基因轉移。但是，即便不是全部也是大部分脊稚動物沒有此強力工具。由于本發(fā)明的^ggvSac樣轉座子系統(tǒng)的簡單性和在不同生物中起作用的能力，其可作為有效載體用于其中DNA轉座子技術在當前不可用的物種。轉座子標記是一種其中轉座子被移動，以"跳，，進基因中，由此通過插入誘變失活所述基因的技術。這些方法論述于Evans等，TIG199713:370-374。在該方法中，被失活基因由轉座因子"標記，，，轉座因子隨后可用于回收突變的等位基因。因此，本發(fā)明提供一種將65/7/gg^GC樣轉座子標記導入細胞基因組中的有效方法。當所述標記被插入到細胞中破壞特定表型相關性蛋白之表達的位置時，在含被轉座子破壞的特定基因相關聯(lián)。//ggy5ac樣轉座子在此起標記的功能。設計用于反向PCR或對本發(fā)明核酸片段側翼的基因組DNA測序的引物可用于獲得有關凈皮破壞基因的序列信息。有幾種分離被標記基因的方法。在所有情況下，通過常規(guī)技術(其隨不同組織和動物而變)由突變動物的一種或多種組織的細胞中分離基因組DNA。所述DNA通過可在轉座子標記中切割或可不切割(多半其的確在已知位點切割)的限制性內切核酸酶剪切。然后將獲得的片段直接克隆入質粒或噬菌體載體中，使用針對轉座子DNA的探針進行鑒別(參見MobileGeneticElements,IRLPress,D.L.Sheratt編輯中Kim等，1995的參考文獻)。備選地，所述DNA可以眾多方法中的任一種進行PCR擴增。可使用Izsvak和Ivies(1993,Biotechniques.15(5):814-8)的LM-PCR法。LM-PCR法可按照Devon等(1995,NucleicAcidsRes.23(9):1644-5)改進的方法實施，并通過其與轉座子探針的雜交鑒別。一種備選方法是反向PCR(例如Allende等，19%,GenesDev.，10:3141-3155)。不考慮克隆的方法，然后對所鑒別的克隆測序。側接轉座子(或其它插入DNA)的序列可通過其與插入因子的不一致性來鑒別。所述序列可組合，然后用于檢索核酸數(shù)據(jù)庫中與其它先前已表征基因的同源性，或與編碼某種功能的基因或序列基序的部分同源性。在某些情況下，所述基因與任意已知蛋白都沒有同源性。其成為其它序列將與其對比的新序列。所編碼蛋白將成為進一步研究其在產(chǎn)生誘導其恢復的表型中作用的中心。因此，；zggy^c樣轉座子可用于使脊推動物基因組誘變，使得可產(chǎn)生喪失功能的突變體，并篩選突變體的目標表型。通常，使用含一個或多個因子元件的樣轉座子，所述元件允許;險測含該轉座子的動物。更經(jīng)常地使用影響可見性狀如毛皮或眼睛顏色的標記基因。但是，任意基因都可用作在轉基因動物中產(chǎn)生可靠的和容易記錄的表型改變的標記。其中插入了戶'gg)^ac樣轉座子的基因可如下鑒別用能夠剪切樣轉座子序列的限制性內切核酸酶消化轉座子插入其中的細胞中的DNA;鑒別轉座子的反向重復序列；對緊鄰反向重復序列的核酸測序，以獲得可讀框的DNA序列；并比較該DNA序列與計算機數(shù)據(jù)庫中的序列信息。在一個實施方案中，限制性內切核酸酶識別4堿基識別序列。在另一個實施方案中，消化步驟還包括克隆消化片段或PCR擴增消化片段。在一個實施方案中，所述基因通過反向PCR鑒別。因此，本發(fā)明的/7/ggySac樣轉座子系統(tǒng)還可用于基因發(fā)現(xiàn)。在一個實施例中，將與p/ggy5ac樣轉座酶蛋白或編碼p/gg)必ac樣轉座酶的核酸組合的/7Zgg)^7C樣轉座子導入細胞中。^ggv6flc樣轉座子優(yōu)選包含一種含標記蛋白(例如GFP)和限制性內切核酸酶識別位點(優(yōu)選為6堿基識別序列)的插入片段。在整合后，分離細胞DNA，并用限制性內切核酸酶消化。在使用運用4石威基識別序列的限制性內切核酸酶的情況下，細胞DNA被切成平均約256-bp的片段。這些片段可被克隆，或者可將接頭加至消化片段的末端，以提供PCR引物的互補序列。在加入接頭的情況下，使用來自接頭的引物和結合核酸片段中的反向重復序列的正向重復序列的引物，使用PCR反應擴增片段。然后對擴增片段測序，側接正向重復序列的DNA用于檢索計算機數(shù)據(jù)庫，例如GenBank。5.12.1.用于突變確i人的表型逆轉用于本發(fā)明方法的戸'gg)^"c樣轉座子在體內轉座時精確切離，在切離時沒有留下任何轉座子序列。可利用p/gg^"c樣轉座子系統(tǒng)的此特征，以證實在非人脊稚動物中觀測到的表型由戸ggySac樣轉座子在基因組中的插入直接引起。5.13.基因治療用于基因治療的基因轉移載體可大致分類為病毒載體或非病毒載體。；/ggy5ac樣轉座子系統(tǒng)的應用是對非病毒DNA介導的基因轉移的精修。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)病毒載體在細胞中導入和表達基因方面更有效。對于新基因療法的開發(fā)而言，非病毒基因轉移優(yōu)于病毒介導的基因轉移有幾個原因。例如，采用病毒作為基因治療劑使遺傳設計限于該病毒基因組在大小、結構和表達調節(jié)方面的約束條件。非病毒載體主要由合成原料產(chǎn)生，因此比病毒載體更容易生產(chǎn)。非病毒因子不大可能比病毒因子更具免疫原性，使得可重復施用。非病毒載體比病毒載體更穩(wěn)定，因此比病毒載體更適合于藥用制劑和應用。目前的非病毒基因轉移系統(tǒng)未被配置而促使核酸整合入細胞的DNA(包括宿主染色體)中。因此，使用非病毒系統(tǒng)的穩(wěn)定基因轉移頻率一直非常低；在組織培養(yǎng)細胞中最好時為0.1%,在原代細胞和組織中要低得多。本發(fā)明的系統(tǒng)是一種有利于整合并顯著改善穩(wěn)定基因轉移之頻率的非病毒基因轉移系統(tǒng)。在本發(fā)明的基因轉移系統(tǒng)中，可將pgg)^ac樣轉座酶作為蛋白或作為編碼蛋白的核酸導入到細胞中。在一個實施方案中，編碼蛋白的核酸是RNA，在另一個實施方案中，所述核酸是DNA。此外，可通過病毒載體、陽離子脂質或其它標準轉染機制，包括用于真核細胞的電穿孔或粒子轟擊，將編碼pzggySflc樣轉座酶的核酸摻入到細胞中。在導入編碼；/gg)^ac樣轉座子的核酸后，可將pz'ggyBac樣轉座酶導入到相同細胞中。同樣，可將^ggV^7C樣轉座酶作為線性片段或環(huán)化片段、優(yōu)選作為質?；蛑亟M病毒DNA,導入到細胞中。優(yōu)選地，所述核酸序列包含至少一部分可讀框，以產(chǎn)生含氨基酸的產(chǎn)物。在優(yōu)選實施方案中，pggy5ac樣轉座子包含編碼至少一種蛋白的插入片段，例如選擇標記、報告體、治療性蛋白或在畜牧業(yè)有價值的蛋白，并包含至少一個選定用于控制插入到//gg)^aC樣轉座子中的可讀框或編碼區(qū)表達的啟動子。包含在本發(fā)明的//ggy^7C樣轉座子中的適宜編碼區(qū)的更詳盡描迷提供于下文的5.14節(jié)。關于基因治療方法的一般性綜述，參見Goldspiel等，1993,ClinicalPharmacy12:488-505;Wu和Wu,1991,Biotherapy3:87-95;Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan,1993,Science260:926-932;以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217;1993年5月，TIBTECH11(5):155-215)。重組DNA
技術領域：
公知的可用方法描述于Ausubel等(編輯)，1993,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork;以及Kriegler,1990，GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NewYork。任意這樣的方法都可用于傳遞本發(fā)明的//gg7&c樣核酸。p/ggy5ac才羊核酸例如為包含p'ggySac纟羊轉座子和/或編碼pzggyBac樣轉座酶的核苷酸序列的核酸，可選地有效連接至啟動子，它們可直接傳遞到患者中，在該情況下患者與所述核酸或攜帶核酸的載體直接接觸，或者可間接傳遞到患者中，在該情況下細胞首先用戶ggy^c樣核酸體外轉化，然后植入患者中。這兩種方法分別^支稱為體內基因治療或離體基因治療。在具體實施方案中，所述核酸在體內直接施用，其在體內表達以產(chǎn)生所編碼產(chǎn)物。這可通過本領域已知的眾多方法中的任一種完成，例如通過將其作為適宜核酸表達載體的一部分構建并施用，使得其變成胞內的；例如通過使用缺陷型或減毒型逆轉錄病毒載體或其它病毒載體感染(參見美國專利第4,980,286號)；或通過直接注射棵DNA;或通過使用微粒轟擊(例如基因4倉；Biolistic,Dupont);或用脂質或細胞表面受體或轉染劑包被；在脂質體、微?；蛭爸邪?；或通過將其連同已知進入細胞核的肽一起施用；通過將其連同經(jīng)受受體介導的胞吞作用的配體一起施用(參見例如Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)(其可用于靶向特異性表達該受體的細胞類型)，等等。在另一個實施方案中，可形成核酸-配體復合物，其中所述配體包含融合病毒肽，以破壞核內體，使核酸得以避免溶酶體降解。在另一個實施方案中，所述核酸可為體內靶向的，以便通過靶向特定受體而被細胞特異性吸收和表達(參見例如1992年4月16日公開的PCT公開說明書WO92/06180(Wu等)；1992年12月23日公開的WO92/22635(Wilson等)；1992年11月26曰公開的WO92/20316(Findeis等)；1993年1月22日公開的WO93/14188(Clarke等)；1993年10月14日公開的WO93/20221(Young))。備選地，所述核酸可通過同源重組胞內導入，并摻入到宿主細胞DNA中用于表達(Koller和Sm他ies,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:8932-8935;Zijlstra等，1989,Nature342:435-438)。在一個具體實施方案中，使用含/7ZggV^7C樣核酸的病毒載體。例如，可使用逆轉錄病毒載體(參見Miller等，1993,Meth.Enzymol.217:581-599)。這些逆轉錄病毒栽體已被修飾，以缺失對包裝病毒基因組和整合入宿主細胞DNA中非必要的逆轉錄病毒序列。待用于基因治療的pggv5ac樣核酸克隆入有利于將基因傳遞入患者中的載體中。關于逆轉錄病毒的更多細節(jié)可見于Boesen等，1994,Biotherapy6:291-302。其它闡述逆轉錄載體在基因治療中應用的參考文獻是Clowes等，1994,J.Clin.Invest93:644-651;Kiem等，1994,Blood83:1467-1473;Salmons和Gunzberg,1993,HumanGeneTherapy4:129畫141;以及Grossman和Wilson,1993,Cu訂.Opin.載于GeneticsandDevel.3:110-114。腺病毒是可用于基因治療的其它病毒載體。腺病毒是用于將基因傳遞至呼吸道上皮的尤其有吸引力的載體。腺病毒天然感染呼吸道上皮，在該處它們引起輕微疾病。基于腺病毒的傳遞系統(tǒng)的其它標靶是肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內皮細月包和肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂纟田月包的4尤勢。Kozarsky牙口Wilson,1993,CurrentOpinioninGeneticsandDevelopment3:499-503提出了基于腺病毒的基因治療的綜述。Bout等，1994，HumanGeneTherapy5:3-10證明了應用腺病毒載體將基因轉移至獼猴的呼吸道上皮。腺病毒在基因治療中的應用的其它實例可見于Rosenfeld等，1991,Science252:431-434;Rosenfeld等，1992,Cell68:143-155;以及Mastrangeli等，1993,J.Clin.Invest.91:225-234。還已提議腺相關病毒(AAV)用于基因治療(Walsh等，1993,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300)。另一種基因治療方法包括通過諸如電穿孔、脂轉染、磷酸鈣介導的轉染或病毒感染的方法將pgg75ac樣核酸轉移至組織培養(yǎng)物中的細胞。通常，轉移方法包括將選擇標記轉移給細胞。然后將細胞置于選擇壓力之下，以分離那些已攝取并表達轉移基因的細胞。然后將這些細胞傳遞給患者。在該實施方案中，將pZgg)必ac樣核酸導入細胞中，然后體內施用所獲重組細胞。這樣的導入可通過本領域已知的任意方法實施，包括但不限于轉染、電穿孔、微注射、用含所述核酸序列的病毒或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體介導的基因轉移、微細胞介導的基因轉移、原生質球融合等。將外源基因導入細胞中的眾多技術是本領域已知的(參見例如Loeffler和Behr,1993,Meth.Enzymol.217:599-618;Cohen等，1993,Meth.Enzymol.217:618-644;Cline,1985,Pharmac.Ther.29:69-92),可按照本發(fā)明使用，只要未破壞受體細胞的必需的發(fā)育和生理功能。該技術應使核酸穩(wěn)定轉移入細胞，使得所述核酸可由所述細胞表達，優(yōu)選地可由其細胞子代遺傳和表達。獲得的重組細胞可通過本領域已知的各種方法傳遞給患者。在一個優(yōu)選實施方案中，例如皮下注射上皮細胞。在另一個實施方案中，重組皮膚細胞可作為皮膚移植物應用于患者。重組血液細胞(例如造血干細胞或祖細胞)優(yōu)選靜脈內施用。預期使用的細胞量耳又決于所需效果、患者狀況等，可由本領域技術人員確定。用于基因治療的可導入pggySac樣核酸的細胞包括任意期望的、可獲得的細胞類型，包括但不限于上皮細胞、內皮細胞、角化細胞、成纖維細胞、肌細胞、肝細胞；血細胞，如T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、粒細胞；各種干細胞或祖細胞，尤其是造血干細胞或祖細胞，例如得自骨髓、臍帶血、外周血、胎肝等的造血干細胞或祖細胞。5.14.由p/ggv必ac樣轉座子編碼的蛋白如本文所述，本發(fā)明的^ggy6ac樣轉座子可用于將所述核酸帶有的各種核酸傳遞給受治療者。另外，在諸如增強子捕獲的某些應用中，轉座子可有益地帶有標記基因。在其它方面，/7/gg》必OC樣轉座子可帶有改變靶細胞或生物的基因組中性狀的核香酸序列、選擇標記等。以下提供了本發(fā)明的p/g幻《ac樣轉座子帶有的此類核酸的實例。用于治療或預防基于遺傳缺陷的病癥的具體治療劑包括編碼以下產(chǎn)物的基因IX因子、P-球蛋白、低密度蛋白受體、腺苷脫氨酶、噤呤核苷^^酸化酶、鞘磷脂酶、葡糖腦苷脂酶、嚢性纖維化跨膜調節(jié)劑、ot-抗胰蛋白酶、CD18、鳥氨酸轉氨曱酰酶、精氨琥珀酸合成酶、苯丙氨酸羥化酶、支鏈oc-酮酸脫氫酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、葡糖6-磷酸酶、a-L-巖藻糖苷酶、p-葡糖醛酸酶、ot-L-艾杜糖苷酸酶、半乳糖1-磷酸尿苷酰轉移酶、胰島素、人生長激素、促紅細胞生成素、凝血因子vi、牛生長激素、血小板衍生生長因子、凝血因子vm、血小板生成素、白介素-1、白介素-2、白介素-lRA、過氧化物歧化酶、過氧化氫酶、成纖維細胞生長因子、軸突生長因子、粒細胞集落刺激因子、L-天冬酰胺酶、尿酸氧化酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、蔗糖酶、降釣素、Ob基因產(chǎn)物、胰高血糖素、干擾素、轉化生長因子、睫狀軸突轉化因子、胰島素樣生長因子-1、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、腦衍生軸突因子、促胰島素、組織纖溶酶原激活物、尿激酶、鏈激酶、腺苷脫酰胺酶、降鈣素、精氨酸酶、苯丙氨酸氨裂解酶、"千擾素、胃蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、乳糖酶、內因子、縮膽嚢肽和促胰島素激素(insulinotrophichormone)等。可經(jīng)題述方法傳遞的癌癥治療基因包括增強淋巴細胞的抗腫瘤活性的基因、其表達產(chǎn)物增強腫瘤細胞的免疫原性的基因、腫瘤抑制基因、毒素基因、自殺基因、多重抗藥性基因、反義序列等。由本發(fā)明的p/ggvSac樣轉座子帶有的標記基因序列可為酶、含表位的蛋白或肽、受體、轉運蛋白、tRNA、rRNA或生物發(fā)光劑、化學發(fā)光劑或熒光分子。在具體的實施方案中，所述標記是綠色熒光蛋白(GFP)或其突變體，例如具有改變的熒光波長、增加的熒光或這二者的突變GFP。在某些具體的實施方案中，突變GFP是藍色GFP。在其它模式的實施方案中，所述熒光分子是紅色熒光蛋白(參見章節(jié)6)或黃色熒光蛋白。在其它實施方案中，所述標記是氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、(3-半乳糖苷酶(lacZ)和螢光素酶(LUC)。在畜牧應用中，戸ggy^/c樣轉座子可帶有生長激素(例如胰島素樣生長因子(IGF))的序列，例如以在轉基因動物中促進生長。在其它畜牧應用中，p/ggy5ac樣轉座子帶有的轉基因可提供對疾病的更大抗性?？蓪⒍喾N標記基因插入到本發(fā)明的p/gg)^"c樣轉座子中，包括但不限于可分別在tk-、hgprt-或aprt-細胞中使用單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等，1977,Cell11:223)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因(Szybalska和Szybalski,1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:2026)和腺苷酸磷酸核糖基轉移酶(Lowy等，1980,Cell22:81"基因。另外，抗代謝物抗性可用作賦予對氨曱蝶呤抗性的dhfr(Wigler等，1980,Natl.Acad.Sci.USA77:3567;O'Hare等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527);賦予對霉酚酸抗性的gpt(Mulligan和Berg,1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072);賦予對氨基糖苷G-418抗性的neo(Colberre-Garapin等，1981,J.Mol.Biol.150:1);賦予對潮霉素抗性的hygro(Santerre等，1984,Gene30:147);允許細胞使用吲哚代替色氨酸的trpB;允許細胞使用組氨醇代*#組氨酸的hisD(Hartman和Mulligan,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8047);以及賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥氨酸即DFMO抗性的ODC(鳥氨酸脫羧酶)(McConlogue,L.,1987,載于CurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratory,Ed.)的選擇基石出。5.15.由^ggyjgflc樣轉座子帶有的非編碼序列另外，或作為備選，0RF—本發(fā)明的戸'ggv5ac樣轉座子還可包含至少一個由結合和/或修飾核酸的蛋白所識別的序列。在具體的實施方案中，所述蛋白是DNA結合蛋白、DNA-修飾蛋白、RNA-結合蛋白或RNA-修飾蛋白。在某些具體的實施方案中，所述序列是由限制性內切核酸酶識別的序列，即限制性位點。各種限制性位點是本領域已知的，可包括例如由以下限制酶識別的位點HmdIII、Pstl、Sall、Accl、HmcII、Xbal、BamHI、Smal、Xmal、Kpnl、Sacl、EcoRI等。在其它具體的實施方案中，所述序列是位點特異性重組酶的靶點，所迷重組酶例如為FLP重組酶(即所述序列是FRT)或CRE重組酶(即所述序列是loxP)。這樣的實施方案可用于產(chǎn)生如5.7節(jié)所述的鑲嵌動物。5.16.本發(fā)明的獸醫(yī)和家畜應用本發(fā)明方法和組合物可在非人動物中用于治療或預防疾病或障礙或提升家畜品質的獸醫(yī)應用。在一個具體的實施方案中，所述非人動物是家庭寵物。在另一個具體實施方案中，所述非人動物是家畜。在一個優(yōu)選實施方案中，所述非人動物是哺乳動物，最優(yōu)選為牛、馬、綿羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、倉鼠、貂或豚鼠。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述非人動物是禽類物種，最優(yōu)選為雞、火雞、鴨、鵝或鵪鶉。6.實施例6.1.過轉座因子已常規(guī)地用作低等生物中的遺傳操作工具，包括產(chǎn)生轉基因動物和插入誘變。相比之下，轉座子在小鼠和其它脊推動物系統(tǒng)中的應用仍然有限，原因是沒有有效的轉座子系統(tǒng)。我們已檢驗了來自4分紋夜蛾(7Vz'c/2o;7/MWam)的一種DNA轉座子p/ggySac在哺乳動物系統(tǒng)中轉座的能力，并已發(fā)現(xiàn)攜帶多個基因的；^gg)^ac因子可在人和小鼠細胞系中以及在小鼠中有效轉座。本文提供的數(shù)據(jù)表明，在種系轉座過程中，pzggy5ac因子精確地由原始插入位點切離，并在不同位點轉座入小鼠基因組中，優(yōu)選轉座入轉錄單位，并允許由所述轉座子攜帶的標記基因表達。這些數(shù)據(jù)才是供了一個對用于各種遺傳操作(包括在小鼠和其它脊推動物中的基因轉移和插入誘變)的高效轉座子系統(tǒng)關鍵的步驟。6.2.材料和方法6.2.1.質粒構建尸BASV40-neol:pSLfal180fa的BamHI-KpnI片段(Horn和Wimmer:2000,DevGenesEvol210,630-637)由pCLXSN(IMGENEX)的BamHI-KpnI片段替代。然后，用Ascl切出新霉素表達盒，并插入到pBac(3xP3-EGFPafm)的Ascl位點中(Hom和Wimmer,2000,Dev.GenesEvol.210:630-637)。CMV-fg鵬:p/gg)^ac轉座酶的編碼序列用引物BacEN-F(5，-GCCACCATGGGATGTTCTTTAG-3，)(SEQIDNO:l)和BacEN-B(5，-GTACTCAGAAACAACTTTGGC-3，)(SEQIDNO:2)經(jīng)PCR由phsp-Bac擴增(Handler和Harrell，2001,InsectBiochemMolBiol31:199-205),并克隆入pSLfall80fa的Spel和Sphl位點中，產(chǎn)生pSL-BacEN。由pSL-BacEN分離含所述轉座酶基因的Hindlll-EcoRI片段，并插入到pcDNA4/HisA(Invitrogen)中，產(chǎn)生最終構建物。PBg/PGK陽neol:將得自pPNT的PGK-neo基因(Tybulewicz等，1991Cell65:1153-1163)克隆入一種改良的p/級vSac構建物pBac-AB的BglII位點中，產(chǎn)生尸S/PGK-neo]。TOAct誦RFPl:pCX-EGFP的0.7kbEcoRI片段(Okabe等，1997,FEBSLett407:313-319)由mRFP的編碼序列(Campbell等，2002,Proc.Nat,l.AcadSci.USA99:7877-7882)替代，制備pCX-RFP。將包含完整RFP表達盒的pCX-RFP的Sall-BamHI片段進一步克隆入pBac-AB的BglII位點，產(chǎn)生尸B/Act-RFP]。加入多接頭，產(chǎn)生具有多個獨特克隆位點的通用pb載體尸s/^"-i^pyas。Prml-尸細g:將pPrml-SMO的Pmr-1啟動子和BamHI-Sall片段(Fischer等，2001，Proc.Nat，l.Acad.Sd.USA98:6759扁6764)分別克隆入pSL-BacEN的HindIII位點和BamHI-XhoI位點，產(chǎn)生此睪丸特異性轉座酶輔助質粒。Act國尸gfl":使用Nhel-Notl接頭，用pSL-BacEN的Spel-Eagl轉座酶片段替換pCX-EGFP的EcoRI片段，產(chǎn)生此遍在表達的轉座酶輔助質粒。PB/K14-Tvrl:將plnKl4-Albino中的K14啟動子的Smal片段(Saitou等，1995,Nature374:159-162)、通過RT陽PCR由129Sv小鼠的皮膚樣品擴增的酪氨酸酶cDNA以及SV40polyA插入到pBac-AB的BglII位點中，產(chǎn)生尸S/K14-Tyr]。/WK14-Tvr,Act誦RFPl:將pCX-RFP的Sall-BamHI片段克隆入尸J5/K14-Tyr]的Asd位點中，產(chǎn)生該構建物。JWAct-RFP,MCK-TSC11:尸S/Act-RFP]的Smal片段由RPP表達盒和左末端(//ggv5acL)組成，用該片羊殳替4灸pBluescript的Sall-EcoRV片段，產(chǎn)生pBS-BLRFP。然后將由右末端(/^A)組成的尸S/Act-RFP〗DS的Smal-EcoRV片段克隆入pBS-BLRFP的Pmel位點中，產(chǎn)生尸5/Act-RFP]，其用作通用//ggy^7c-型(/7/ggy^fobased)轉基因載體。將MCK-TSC1構建物的Bssffll片段(Inoki等，2002，Nat.CellBiol.4:648-657)和hGHpolyA(Nguyen等，1998,Science279:1725-1729)克隆入尸S/Act-RFP]DS的Swal位點中。6.2.2.細胞轉染將細胞在補加10%血清的DMEM(GIBCO/BRL)中于"。C和5%C02下培養(yǎng)。在轉染前1天，將1.5xl()S個細胞接種入24孔板的每個孔中。對于每個孔，按照標準方法(Invitrogen)通過LipofectAMNE2000用測試組中的0.5pg環(huán)狀尸S/"SV40-neo]和0.5環(huán)狀CMV-尸Sa化或對照組中的0.5]Lig環(huán)狀pcDNA4/HisA進行轉染。轉染后1天，用胰蛋白酶處理各孔中的細胞，并接種在1個10-cm平板上的含500mg/mlG-418(GIBCO/BRL)的培養(yǎng)基中。藥物選擇持續(xù)2周。在生產(chǎn)商(Taconic)推薦的方法中描述了W4/129S6小鼠胚胎干(ES)細胞的培養(yǎng)和電穿孔條件。使用測試組中的24pg環(huán)形尸5/PGK-neo]和6jxgAct-尸5me或對照組中的6jig鯡魚精DNA(Promega)電穿孔1><107個細胞。在電穿孔后立即將各組中的細胞接種在3塊含絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)細胞的10-cm平板上。在電穿孔后48小時用含200mg/mlG-418的培養(yǎng)基啟動選擇。藥物選擇持續(xù)2周。在藥物選擇結束時，用含4%多聚甲醛的PBS固定細胞達10分鐘，然后用0.2%亞曱基藍染色1小時。在用去離子水充分洗滌后計數(shù)克隆。6.2.3.PCR和序列分析使基因組DNA的HaeIII或Mspl消化物自連接，以用作反向PCR的沖莫板。用于回收p'g幻Wac轉座子左側側翼序列的引物是LF1(5'-CTTGACCTTGCCACAGAGGACTATTAGAGG-3，)(SEQIDNO:3)和LR1(5，-CAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGC-3，)(SEQIDNO:4)。用于回收p/ggyBac轉座子右側側翼序列的引物是RF1(5，-CCTCGATATACAGACCGATAAAACACATGC-3，)(SEQIDNO:5)和RR1(5，一AGTCAGTCAGAAACAACTTTGGCACATATC-3，)(SEQEDNO:6)。用引物EL1(5，誦CCATATACGCATCGGGTTGA-3，)(SEQIDN0:7)和引物ER1(5，-TTAAAGTTTAGGTCGAGTAAAGCGC畫3，)(SEQIDNO:8)進行切離位點的PCR檢測。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體(Promega),用于隨后的測序。用NCBIBLAST搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov)和Ensembl人或小鼠基因組數(shù)據(jù)庫(www.ensembl.org)分析測序結果。為檢測PB插入事件的附加序列偏好性，對小鼠中的100個pZgg^ac插入分析TTAA靶位點上游和下游的5個磁基對。同時，分析作為對照的100個隨機選擇的TTAA位點。用STATISTICA6.0計算兩部分(proportion)之間的單側概率。6.2.4.轉基因小鼠的產(chǎn)生將環(huán)形p/ggvSac供體構建物與輔助質粒以2:1的比率混合。如所述將混合的DNA樣品(2ng/pl)微注射入受精的FVB/Nj卵母細胞中(Nagy等，2003,Manipulatingthemouseembryo:alaboratorymanual,第3版(ColdSpringHarborLaboratoryPress))。6.2.5.DNA印跡由尾樣品分離基因組DNA,用EcoRV和BglII消化，然后在0.7%瓊脂糖凝膠中分離，之后進行DNA印跡分析。探針為尸S/Act-RFP]的SacII消化物的499bp片段。6.3.鏈6.3.1.p/ggyBflc在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中的轉座活性由供體和輔助質粒這二者組成的二元共轉染測定系統(tǒng)，設計用于檢測組織培養(yǎng)細胞中；/gg)^ac介導的染色體整合事件。供體質粒包含其中盧gg^ac轉座酶(i^aye)被藥物選擇標記替換的pggv^fc因子(圖1A)。輔助質粒攜帶轉座酶片段，但沒有轉座所需的末端序列(圖IB)。在沒有輔助質粒的情況下，供體質?？呻S機整合入基因組中，但如果供體質粒保持環(huán)形形式，則這些隨機整合事件可減到最少。因此，在輔助質粒存在下抗藥性克隆的增加應指示轉座事件。我們首先檢驗了人293細胞中的p'gg3^ac轉座。攜帶SV40啟動子的驅動新霉素抗性(neo)基因的供體i^^SV40-neo]因子和攜帶遍在表達的轉座酶的輔助CMV-尸^we的共轉染(圖l)產(chǎn)生的新霉素抗性克隆高達用單獨的供體質粒轉染的IO倍(圖2A)。為檢驗提升的供體整合是否歸因于轉座，進行反向PCR，以回收鄰接整合的尸S/SV40-neo]的pggy5ac右側反向末端重復(PBR)位點的序列(圖1A)。真實轉座事件的PCR產(chǎn)物應產(chǎn)生PBR之外的基因組序列，而不是質粒序列。由5個抗藥性克隆回收了18個獨立的基因組序列。所有這些序列都在整合位點處包含特征(signature)TTAA序列(表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>(SEQIDNO:24)PBE7T墨1TTAAAGAATGGTTA(SEQIDNO:25)22(J8TC68內含子PBE7T-7TTAAAAGACCTTTA(SEQIDNO:26)重復序列(VERVH)表2.在人293細胞中的PB轉座通過對在轉座子另一末端的幾個接合片段測序證實了TTAA復制(未出示數(shù)據(jù))。相比之下，用單獨的尸S/"SV40-neo]穩(wěn)定轉染的新霉素抗性克隆的反向PCR分析僅檢測出接合質粒序列，這與隨機插入事件一致(未出示數(shù)據(jù))。該實驗表明，在人細胞中發(fā)生的//ggy^c轉座與在昆蟲細胞中具有相同的位點偏好性。在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和(貂源)MvlLu細胞中實施共轉染步驟時獲得了相似的結果(參見圖7)。我們接著檢驗了戸ggyBac在小鼠W4/129S6胚胎干(ES)細胞中轉座的能力。在該檢驗中，供體質粒P5/PGK-neo]因子攜帶PGK啟動子驅動的neo基因，輔助質粒Act-尸SMe提供處于雜種肌動蛋白啟動子控制之下的^ggy^c轉座酶(圖1B)。在3個重復的轉染實驗中，尸S/PGK-neo]和Act-尸5me共轉染產(chǎn)生的抗藥性克隆平均高達單獨的PB[PGK-neo]轉染的50倍(圖2B和2C)。反向PCR分析證實，增強的克隆生產(chǎn)緣于轉座(表3)。插入編號PBES2T1插入位點TTAAGTTGTACCAA(SEQIDNO:27)染色體2基因名稱/EnsembleIDB23033歸5Rik插入位置內含子PBES2T3TTAAAGGAGAGACT(SEQIDNO:28)1GENSCAN00000093186內舍子PBES2T4TTAACTGCCCAGTG(SEQIDNO:29)重復序列(LTRs)PBES4T58TTAACAAAACAAAA(SEQIDNO:30)64833415FllRik外顯子PBES4T59TTAATCAACAAATA(SEQIDNO:31)5基因間的PBES4T63TTAAAGAGTCCCCT(SEQIDNO:32)2NoI5a內含子PBES9T27TTAACAACAGATAA(SEQE)NO:33)5基因間的表3.在小鼠W4/129S6胚胎干細胞中的PB轉座當在各種不同來源(包括貂、倉鼠、大鼠、猴、人和雞)的細胞系中實施共轉染步驟時，獲得了相似的轉座結果(參見圖8)。6.3.2.ff/ggWflC在小鼠種系中有效轉座在小鼠ES細胞中的有效轉座鼓勵我們檢驗pgg^ac轉座在小鼠種系中的可行性。進行原核共注射轉座子供體和轉座酶輔助質粒，產(chǎn)生轉基因小鼠。為有利于轉基因小鼠中的轉座分析，我們使用可見標記(紅色熒光蛋白，RFP)代替供體質粒中的抗藥性標記。將供體/^/Act-RFP]因子和輔助質粒Act-尸Sa^以環(huán)形形式共注射入FVB/Nj小鼠胚胎的原核中。PCR分片斤表明，34.8%(62/184)的創(chuàng)始鼠是尸萬/Act-RFP]單陽性，0.5。/。(1/184)是Act-尸^^e單陽性，2.7%(5/184)是雙陽性。相比之下，當用單獨的尸S/Act-RFP]進行注射時僅10.4%(10/96)的幼崽是陽性。當將具有不同的標記基因酪氨酸酶(其影響皮膚色素形成)的較長PB因子尸5/K14-Tyr]與相同輔助構建物一起共注射時，獲得相似的結果(圖1和圖3A)。為分析RFP陽性創(chuàng)始鼠中整合的轉基因的結構，與轉座子特異性探針進行DNA雜交(圖1A)。大部分創(chuàng)始鼠具有多個整合事件(圖3B)。然后我們進行反向PCR,以回收轉座子末端側翼的基因組序列。由42個RFP陽性創(chuàng)始鼠回收了總共85個轉座事件(表4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>表4.小鼠中的PB轉座。1.A,B:PB[Act-RFP];C:PB[K14-Tyr,Act-RFP];D:PB[Act-RFP,MCK-TSC1];2.少于10kb的已知或預測基因的下游序列；3.少于10kb的已知或預測基因的上游序列；4.來自種系轉座的插入。依據(jù)側接整合轉座子的右末端重復序列的基因組序列將這些轉座的大部分作圖至小鼠基因組。我們隨機選擇了9個轉座事件，擴增了轉座子對側上的基因組接合序列。在每種情況下均發(fā)現(xiàn)轉座子插入產(chǎn)生精確的整合位點的TTAA復制(未出示數(shù)據(jù))。這些結果表明，由共注射產(chǎn)生的大部分轉基因整合歸因于轉座。為檢驗整合的轉座子通過種系傳遞的能力，使兒只尸B/Act-RFP]陽性但輔助質粒陰性的創(chuàng)始鼠與野生型FVB/Nj小鼠交配，以產(chǎn)生轉基因系。詳細分析了其中1只具有8個尸6/Act-RFP]整合的創(chuàng)始鼠(AF0-61)?；赑CR的基因分型表明，該創(chuàng)始鼠的16只子代中有15只保有轉座子DNA。PCR陽性個體的DNA印跡分析表明，全部這些個體遺傳了至少1個拷貝的轉座/^/Act-RFP](圖3C和未出示的數(shù)據(jù))。這些轉基因的隨機分離提示初始轉座事件在創(chuàng)始鼠中的不同染色體分布。具有單個轉座子的笫二只創(chuàng)始鼠(AF0-47)的子代分析表明，在一群同窩幼崽的8個F1中有2個遺傳了轉座子(圖3C和未出示的數(shù)據(jù))。采用靶向幾個個別轉座子整合位點的引物進行的基于PCR的基因表型分析也證實整合的轉座子由創(chuàng)始鼠穩(wěn)定遺傳給Fl代(未出示數(shù)據(jù))?？傊?，轉座介導的基因整合的高頻率和整合的轉基因通過種系傳遞的能力表明了使用pggy5ac因子作為小鼠中的基因轉移工具的可行性。6.3.3.在小鼠種系中p/ggygflc的精確切離和轉座我們采用"起跳林(jumpstarter)"和"增變株(mutator)"原種的經(jīng)典育種策略(Cooley等，1988,Science239:1121-1128;Horn等，2003,Genetics163:647-661)進一步檢驗了//ggy^rc在小鼠種系中的轉座行為。在該方法中，攜帶非自主轉座子的增變系與在雄性種系中表達轉座酶的起跳系雜交。預期僅在同時攜帶轉座子與轉座酶DNA的雄性的生殖細胞中才發(fā)生活性轉座。這些雄性隨后與野生型雌性交配，產(chǎn)出具有新轉座子插入的品系。我們修正了該方法，用共注射法直接生產(chǎn)出非自主轉座子和輔助轉座酶基因雙陽性的小鼠。轉基因動物通過常規(guī)的線性質粒原核注射產(chǎn)生，這確保了供體與輔助質粒共整合在相同基因座中。產(chǎn)生若干同時攜帶尸5fAct-RFP]和魚精蛋白1(prml)啟動子驅動的//ggV^c轉座酶轉基因(尸w^-尸^we)的轉基因小鼠品系。預期prml啟動子在精子形成過程中有活性(O'Gorman等，1997,Proc.Nat，l.Acad.Sci.USA94:14602-14607)。因此，在這樣的雙陽性轉基因系中，預期雄性小鼠將產(chǎn)生新轉座事件，而雌性小鼠可用作種畜(breeder)。這些雙轉基因系的其中一個品系稱為BF0-33，檢驗其子代中的轉座。用轉座子特異性引物進行的DNA印跡雜交(圖1A)揭示，在67.8%(19/28)的轉座子陽性子代中有新的轉座子整合(圖4A和未出示的數(shù)據(jù))。平均每個配子產(chǎn)生了l.l個新插入。新插入似乎不是區(qū)域性的，因為對其中三個新插入測序，發(fā)現(xiàn)它們位于三個不同染色體(表4中的BF1-29T6、BF1-30T43和BF1-44T10)。應用把向轉座子側翼的尸S/Act-RFP]質粒序列的引物來研究種系中內gS^"c的轉座行為(圖4B)。如果/7/gg^ac通過切割和粘貼方式進行，則應檢測到一種273bp的PCR產(chǎn)物。實際上，該PCR產(chǎn)物在BF0-33系的17個后代中的IO個中檢出(圖4C)。對這些樣品中的七個進行測序，揭示存在單個TTAA靶點(未出示數(shù)據(jù))，說明p/ggvSac在,J、鼠雄性種系中通過精確的切割和粘貼方式轉座。因為該創(chuàng)始鼠攜帶轉基因串聯(lián)子(transgenearray),故預期某些轉座事件(圖4B-C中的子代BF1-30和BFl-32)沒有與此273bp產(chǎn)物的檢出聯(lián)系在一起。6.3.4.作為獨特的轉基因工具的p/ggygac轉座子系統(tǒng)先前已表明，隨著一些轉座子長度的增加轉座效率顯著降低，這妨礙其作為遺傳工具的效力。例如在HeLa細胞中，已表明SS轉座子在其2.2kb原長度之外長度每增加1kb，轉座效率降低約30%(Izsvak等，2000,J.Mol.Biol.302:93-102)。為測定小鼠中PB轉座的尺度限制，使用4.8-14.3kb的幾個PB因子制備轉基因小鼠(圖1A)。這些轉座子攜帶i^P報告體表達盒和/或獨立的轉錄單位。在沒有或有y4"-i^me輔助質粒的情況下檢驗環(huán)形質粒中這些PB元件的整合比率(圖3A)。結果表明，PB因子可攜帶9.1kb的外源序列，而不顯著降低整合效率。pcr分析證實，在具有攜帶兩個標記基因的尸s/r/4-:r,，^"-i^/V因子的創(chuàng)始鼠中有83.9%(26/31)存在轉座事件。應用14.3kb的尸萬/^"-iF尸，A/CA:-reci/因子時，輔助質粒輔助的整合降低。通過DNA印跡雜交和反向PCR分析11只尸S/^c"尺F尸,A/d-7^C〃陽性創(chuàng)始鼠，發(fā)現(xiàn)四只具有轉座整合(表4和未出示了數(shù)據(jù))。因此，PB能使達14kb的序列轉座。接著，我們評價了整合PB因子的轉基因表達行為。在攜帶尸S/"A:"i^P7的小鼠中，98y。(39/40)表達RFP標記。在我們的實驗中，甚至單拷貝的i^/^"-i^P/轉座子在UV照射下也產(chǎn)生可見的紅色信號(圖5A)。這些創(chuàng)始鼠中有一些表現(xiàn)出鑲嵌RPP信號，該信號是一種最有可能起因于單細胞期之后的胚胎發(fā)育中的轉座的現(xiàn)象(圖5B)。在29%(9/31)的攜帶尸5/"04-7>，爿cf-RFP/的創(chuàng)始鼠中觀察到^^和酪氨酸酶標記這二者的共表達，所述/^/r/^r,，^"-i^77是一種既含〖W啟動子驅動的酪氨酸酶基因、又含iF尸表達盒的轉座子(圖1A、5C和5D)。因此，含獨特的克隆位點和RFP標記的i^/^"-i^7V構建物用作通用轉基因PB載體。兩個獨立轉錄單位能同時表達和高頻率整合事件提示，PB轉座可用作產(chǎn)生轉基因小鼠的有效方法。6.3.5.作為插入誘變工具的^ggy^ic轉座子系統(tǒng)為了測試PB在脊推動物中作為插入誘變工具的可行性，我們評價了小鼠中產(chǎn)生的104例轉座事件(表3)。首先，TTAA序列存在于除一個以外的所有PB整合位點處。其次，我們比較了整合的TTAA位點側翼的基因組序列和在小鼠基因組中隨機采樣的TTAA位點，發(fā)現(xiàn)核心TTAA序列周圍富含T和A(圖6A)。這和昆蟲中存在的整合位點相似(Li等，2005,InsectMolBiol.14(1):17-30)。最后，對Ensembl'J、鼠基因組數(shù)據(jù)庫分析了這些轉座位點的基因組定位。盡管由于數(shù)據(jù)庫中存在重復序列與序列間隙而使一些位點不能坤皮作圖，但仍確定了93個轉座子整合位點的精確位置(表4;圖6E)。在這些轉座位點中觀察到廣泛的染色體分布。除了兩個染色體(19號染色體與Y染色體)以外的所有小鼠染色體均被PB轉座命中(圖6E)。所有轉座位點的67%(70/104)被作圖到已知的或預測的轉錄單位。在這些整合中，約97%(68/70)命中內含子，而3%(2/70)命中外顯子(圖6B)。即使分析中排除了未經(jīng)證實的(即預測的)基因和EST(48%(50/104)),轉錄單位內的整合優(yōu)先性仍保持很高。而且，超過40%的"基因間的"轉座被作圖在50Kb的已知基因或EST內(圖6C和6D)。在轉錄單位的5'和3'末端設置10Kb的間隔作為調節(jié)區(qū)的任意閾值時，對于已知或預測的轉錄單位而言，BP轉座命中基因的頻率為約80%(83/104)(圖6B)。轉座的廣泛染色體分布和在轉錄單位中的偏好性表明，PB因子可用作全基因組遺傳篩選的高效誘變劑。針對多達共128個新插入的另外的研究表明，112個位于轉錄單位中，覆蓋所有染色體。轉座子中有5個作圖至外顯子，63個作圖至內含子。6.4.iiii我們已表明，BP因子可在人和小鼠中活躍地轉座。相比于其它轉座子，PB轉座被認為基本不依賴于宿主因子，因為它是已知能在超過12種不同昆蟲物種中轉座的唯一轉座子(Handler,2002,InsectBiochemistry&MolecularBiology32:1211-1220;Sumitani等，2003,InsectBiochem.Mol.Biol.33:449-458)。PB在昆蟲與哺乳動物中均可有效轉座的事實表明，該轉座系統(tǒng)可廣泛應用于無脊稚動物與脊推動物中的遺傳研究。進一步提示PB因子的轉座機制可能與其它自然存在的、僅在高度有限的物種中起作用的轉座子顯著不同。6.4.1.作為基因轉移工具的WggyBflc我們的研究表明，PB是一種產(chǎn)生轉基因小鼠的實用工具，并且可能是產(chǎn)生其它轉基因脊稚動物的實用工具。首先，PB可被高效導入到小鼠種系中。輔助質粒和供體質粒的原核共注射導致在其種系中超過30%的供體攜帶整合的供體質粒(圖3A)。其次，該方法產(chǎn)生了單拷貝的整合轉基因。在大部分情況下，小鼠中線性DNA的經(jīng)典原核注射導致形成轉基因串聯(lián)體(Nagy等，2003,Manipulatingthemouseembryo:alaboratorymanual,第3版(ColdSpringHarborLaboratoryPress))。我們表明，各個轉座整合位點可通過反向PCR快速確定。由此，可估計染色質環(huán)境對所整合轉基因的影響。第三，PB因子允許其攜帶的轉基因表達。顯示預期的轉基因表達譜的小鼠的總頻率與傳統(tǒng)轉基因實驗相當。最后，我們的結果表明，PB可攜帶多達9.1kb的轉基因，而不顯著降低轉座頻率。觀察到大至14.3kb的轉基因的轉座，這比逆轉錄病毒可攜帶的插入片段要大得多。因此，單個PB因子可攜帶多個基因，使人們可進行復雜的轉基因實驗，例如在可見標記的幫助下鑒別陽性轉基因動物。6.4.2.作為破譯基因功能的基因組工具的"/ggv丑flc在后基因組時代，系統(tǒng)性基因失活是最強有力的基因組功能破譯方法之一。該方法已被證實在細菌和酵母之類的單細胞生物以及諸如秀麗隱桿線蟲(C.e/ega"力、果蠅(Dmyo//^/")、斑馬魚和擬南芥G4ra^fo戸^)之類的多細胞生物的研究中得到成功應用。不幸的是，用于哺乳動物中基因組范圍的基因失活的有效方法仍然有限。ENU誘變是少數(shù)可用于小鼠中的基因組范圍基因失活的方法之一；然而，對ENU誘導的突變作圖以及克隆由突變限定的基因通常耗力耗時(Herron等，2002,Nat.Genet.30:185-189)。反轉錄病毒介導的插入誘變也已廣泛用于在整個小鼠基因組中產(chǎn)生誘變。雖然該方法確實產(chǎn)生了大量突變，但這些突變大部分產(chǎn)生于小鼠ES細胞，需要大量額外的工作將這些基因特異性突變傳遞到活體動物中。最近，已檢驗了SB在小鼠中的插入誘變。但是，局部跳^^和轉座到轉錄單位內的效率相對低，使其不能被廣泛應用。相比之下，PB為篩選小鼠中的隱性突變提供了一個新的有吸引力的選擇。小鼠種系中有效PB轉座的成功提示該轉座子對插入誘變的適用性。PB的若干獨特特性可大大推動小鼠中的插入誘變研究。插入誘變實驗的一個重要考慮因素是誘變劑是否能以無偏方式命中基因組中的每個基因。我們的實驗已表明，PB整合在小鼠基因組中有多樣分布，這與最近在果蠅中的一項研究相一致，該研究表明PB以比廣泛應用的P因子低偏倚方式命中基因(Thibault等，2004,Nat.Genet.36:283-287)。有趣的是，我們的研究揭示了PB轉座對轉錄單位的高度偏好。67%的轉座子整合存在于已知的或推測的轉錄單位中。若包括在與轉錄起始位點和終止位點鄰接的調節(jié)區(qū)域中的插入，基因中的PB轉座頻率甚至更高。鑒于僅有約15%的小鼠常染色質序列編碼基因，PB轉座對編碼序列是高度選擇性的。還不清楚這種整合特性是否受到基因組或PB因子攜帶的外源序列的轉錄活性影響。不過，這種整合偏好性使PB成為基因組范圍插入i秀變的潛在理想工具。由隨機誘變獲得的突變分析的一個重要方面是確認突變與其產(chǎn)生的表型之間的關聯(lián)。這在新基因的分析中尤其重要?；蛐?表型關聯(lián)的確認通常通過將野生型基因導入突變背景中并尋找表型"拯救"(理想地，誘導的突變回復為野生型)來進行。確定基因型/表型關聯(lián)的另一種方法是切離插入突變并尋找表型回復。因此，轉座子切離的能力一直被認為是超越逆轉錄病毒載體的一個重要優(yōu)勢。但是，多數(shù)轉座子從原始位點被切離后都留下小的缺失或插入。有趣的是，PB在切離后一般不留下痕跡，這使其對產(chǎn)生回復體很理想。該特征還使PB不太可能在其中于單個基因組中發(fā)生多個轉座事件的誘變過程中引起基因組損傷。我們的研究表明，通過在種系表達轉座酶，可輕易實現(xiàn)PB切離。在轉座過程中PB可攜帶多個基因的事實使包括插入誘變和表型表征在內的眾多遺傳操作得到巨大優(yōu)勢。它使人們可借助于RFP和酪氨酸酶之類的可見標記跟蹤插入/突變和突變狀態(tài)，例如雜合子與純合子以及單突變與雙突變。鑒于與小鼠育種相關的長世代時間和高動物飼養(yǎng)費用，這將急劇削減很多類型實驗的開支，并將使一些不切實際的實驗變得可行。而且，用于插入誘變的PB轉座子還可搆帶用于增強子/啟動子檢測或"基因捕獲"的報告基因，這可大大地推動小鼠基因組的功能注釋工作，并為多種類型的生物分析提供試劑。例如，基因捕獲技術可使用PB系統(tǒng)。微注射或雜交可用于誘導攜帶基因捕獲載體的PB轉座子轉座入小鼠基因組中。當所迷轉座子以正確的方向插入到基因的內含子中時，其中的標記基因(例如LacZ)將被活化，內源基因將被破壞。這使得可以檢測報告基因表達，以及在某些情況下可檢測在某些捕獲系中由基因破壞引起的可見表型?？傊覀兊膶嶒灋樾∈笾械母咝Щ蜣D移和插入誘變系統(tǒng)提供了基礎，提示PB系統(tǒng)還可在其它脊推動物生物體中用作遺傳操作的強力工具(Thibault等，2004,Nat.Genet.36:283-287)。7.引證的參考文獻本文引證的所有參考文獻都就其所有目的整體在此引入作為參考，其程度如同每個單獨的出版物或專利或專利申請被明確和單獨地指出就其所有目的整體引入作為參考?？蓪Ρ景l(fā)明實施眾多修改和變更，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍，這些修改和變更對本領域技術人員是顯而易見的。本文描述的具體實施方案僅作為實例提供，本發(fā)明僅由所附權利要求的術語連同這些權利要求授予的等同方案的完整范圍限制。權利要求1.一種產(chǎn)生轉基因非人脊椎動物的方法，所述轉基因非人脊椎動物在其一種或多種細胞的基因組中包含攜帶至少1.5kb的插入片段的piggyBac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)將含攜帶至少1.5kb的插入片段的piggyBac樣轉座子的核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的、編碼piggyBac樣轉座酶的核苷酸序列，離體導入非人脊椎動物胚胎或受精卵中；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊椎動物的條件下，將所得的非人脊椎動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊椎動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊椎動物；由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中包含攜帶至少1.5kb的插入片段的piggyBac樣轉座子的轉基因非人脊椎動物。2.權利要求1的方法，其中所述p'gg)^ac樣轉座子包含編碼蛋白的核苦酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊堆動物中的性狀。3.權利要求1的方法，其中所述含p/ggj^ac樣轉座子的核酸被線性化，使得一種或多種所述細胞的基因組包含位于串聯(lián)體內的所述p/ggyBac樣轉座子，所述串聯(lián)體包含多個戸'ggy5ac樣轉座子。4.權利要求2的方法，其中所述含//gg)必ac樣轉座子的核酸被線性化，使得一種或多種所述細胞的基因組包含位于串聯(lián)體內的所述;/ggy5ac樣轉座子，所述串聯(lián)體包含多個戸'ggy5ac樣轉座子。5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述p/gg^ac樣轉座子包含由結合和/或修飾核酸的蛋白識別的序列。6.權利要求5的方法，其中所述修飾核酸的蛋白是DNA結合蛋白、DNA-修飾蛋白、RNA結合蛋白或RNA-修飾蛋白。7.權利要求5的任一項的方法，其中所述p'g幻必ac樣轉座子包含位點特異性重組酶的耙位點。8.權利要求7的方法，其中所述靶位點是FRT靶位點或lox耙位點。9.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述；/gg)必ac樣轉座子包M擇標記。10.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述^ggvSac樣轉座子包含報告基因。11.權利要求10的方法，其中所述報告基因對所述物種的物種是內源的。12.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述^ggvSac樣轉座子既包*擇標記，也包含報告基因。13.權利要求1-4中任一項的方法，其中所迷；/g幻必ac樣轉座子和編碼p'ggvSac樣轉座酶的核苷酸序列處于同一核酸中。14.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述/Zgg)^ac樣轉座子和編碼pgg)^ac樣轉座酶的核苷酸序列在獨立的核酸上。15.權利要求14的方法，其中所述包含pggy5ac樣轉座子的核酸是DNA，而包含p/ggy5ac樣轉座酶的核酸是RNA。16.權利要求15的方法，其中所述AggySac樣轉座子被固定在所述非人脊稚動物中。17.權利要求14的方法，其中所述包含pggv5ac樣轉座子和pgg)^ac樣轉座酶的核酸都是DNA。18.權利要求17的方法，其中所述轉基因非人脊推動物還在其一種或多種細胞的基因組中包含編碼；/ggv5ac樣轉座酶的核苷酸序列。19.權利要求18的方法，其中所述編碼/zg幻;^7c樣轉座酶的核苷酸序列有效連接至啟動子。20.權利要求19的方法，其中所述啟動子指導轉座酶在種系中表達。21.權利要求20的方法，其中所述啟動子是種系特異性啟動子。22.權利要求18的方法，其中一種或多種所述細胞的基因組包含位于串聯(lián)體內的編碼AggySac樣轉座酶的所述核苷酸序列，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核苷酸序列都編碼/^ggy5ac樣轉座酶。23.權利要求1的方法，其中所述非人脊推動物是非人哺乳動物。24.權利要求l的方法，其中所述非人脊推動物是家畜。25.—種產(chǎn)生轉基因非人脊^f,動物的方法，所述轉基因非人脊堆動物在其一種或多種細胞的基因組中包含jwggy5ac樣轉座子，所述戸g幻W"c樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀，所述方法包括以下步驟(a)將含/7/ggyS"c樣轉座子的核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的、編碼pzggy萬ac樣轉座酶的核苷酸序列，離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中，所述戸ggy5ac樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊椎動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精印植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物；由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中包含樣轉座子的轉基因非人脊推動物，所迷p'ggy5ac樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀。26.權利要求25的方法，其中所述含^ggySac樣轉座子的核酸被線性化，使得一種或多種所述細胞的基因組包含位于串聯(lián)體內的所述//ggv^c樣轉座子，所述串耳關體包含多個p/gg)必ac樣轉座子。27.權利要求25或26的方法，其中所述pgg^ac樣轉座子包含由結合和/或修飾核酸的蛋白識別的序列。28.權利要求27的方法，其中所述修飾核酸的蛋白是DNA結合蛋白、DNA-修飾蛋白、RNA結合蛋白或RNA-修飾蛋白。29.權利要求27的方法，其中所述//ggy5ac樣轉座子包含位點特異性重組酶的靶位點。30.權利要求29的方法，其中所述靶位點是FRT把位點或lox耙位點。31.權利要求25或26的方法，其中所述p/g幻必ac樣轉座子包含選擇標記。32.權利要求25或26的方法，其中所述p/g幻必ac樣轉座子包含報告基因。33.權利要求32的方法，其中所述報告基因對所述物種的物種是內源的。34.權利要求25或26的方法，其中所述^;gg^ac樣轉座子既包^ii擇標記，又包含報告基因。35.權利要求25或26的方法，其中所述；/ggy^7c樣轉座子和編碼jw'gg)必ac樣轉座酶的核苷酸序列處于同一核酸中。36.權利要求25或26的方法，其中所述p'ggy^fc樣轉座子和編碼wggy5ac樣轉座酶的核苷酸序列在獨立的核酸上。37.權利要求36的方法，其中所述包含WggvSac樣轉座子的核酸是DNA,而包含p/ggy^c樣轉座酶的核酸是RNA。38.權利要求37的方法，其中所述p/ggy5ac樣轉座子被固定在所述非人脊推動物中。39.權利要求36的方法，其中所述包含^ggvSac樣轉座子和p/gg)^ac樣轉座酶的核酸都是DNA。40.權利要求39的方法，其中所述轉基因非人脊推動物還在其一種或多種細胞的基因組中包含編碼//ggv^/c樣轉座酶的核苷酸序列。41.權利要求40的方法，其中所述編碼戸'ggv6ac樣轉座酶的核香酸序列有效連接至啟動子。42.權利要求41的方法，其中所述啟動子指導轉座酶在種系中表達。43.權利要求42的方法，其中所述啟動子是種系特異性啟動子。44.權利要求40的方法，其中一種或多種所述細胞的基因組包含位于串聯(lián)體內的編碼戶'ggy^c轉座酶的所述核香酸序列，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個都編碼p/ggySac樣轉座酶。45.權利要求25的方法，其中所述非人脊推動物是非人哺乳動物。46.權利要求25的方法，其中所述非人脊推動物是家畜。47.—種產(chǎn)生轉基因非人脊推動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含p/ggv6ac樣轉座子，其中所述/7&gvSac樣轉座子位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個；&gv5ac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)將含pggy5flc樣轉座子的線性化核酸和在同一核酸中或在獨立核酸上的編碼WggySac樣轉座酶的核苷酸序列離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卯植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物；由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中含位于串聯(lián)體內的/7,ggy^7C樣轉座子的轉基因非人脊推動物，所述串聯(lián)體含多個;^'gg3^^一羊轉座子。48.權利要求47的方法，其中所述/^ggy^ac樣轉座子包含由結合和/或修飾核酸的蛋白識別的序列。49.權利要求48的方法，其中所述修飾核酸的蛋白是DNA結合蛋白、DNA-修飾蛋白、RNA結合蛋白或RNA-修飾蛋白。50.權利要求48的方法，其中所述p&gy5ac樣轉座子包含位點特異性重組酶的靶位點。51.權利要求50的方法，其中所述靶位點是FRT耙位點或lox靶位點。52.權利要求47的方法，其中所述戶ggy5ac樣轉座子包含選擇標記。53.權利要求47的方法，其中所述//gg^ac樣轉座子包含報告基因。54.權利要求53的方法，其中所述報告基因對所述物種的物種是內源的。55.權利要求47的方法，其中所述；/gg)^ac樣轉座子既包M擇標記，又包含報告基因。56.權利要求47的方法，其中所述p/ggy^7c樣轉座子和編碼p/ggvSac樣轉座酶的核苷酸序列處于同一核酸中。57.權利要求47的方法，其中所述p'ggv5ac樣轉座子和編碼p/ggv5ac樣轉座酶的核苷酸序列在獨立的核酸上。58.權利要求57的方法，其中所述包含戸'gg)^ac樣轉座子的核酸是DNA,而包含pggv5ac樣轉座酶的核酸是RNA。59.權利要求58的方法，其中所述pZgg^flc樣轉座子被固定在所述非人脊推動物中。60.權利要求57的方法，其中所述包含pzggySac樣轉座子和p/ggySac樣轉座酶的核酸都是DNA。61.權利要求60的方法，其中所述轉基因非人脊推動物還在其一種或多種細胞的基因組中包含編碼p/ggvBac樣轉座酶的核苷酸序列。62.權利要求61的方法，其中所述編碼/!'ggySac樣轉座酶的核苷酸序列有效連接至啟動子。63.權利要求62的方法，其中所述啟動子指導轉座酶在種系中表達。64.權利要求63的方法，其中所述啟動子是種系特異性啟動子。65.權利要求61的方法，其中一種或多種所述細胞的基因組包含位于串聯(lián)體內的編碼p/ggv萬ac樣轉座酶的所述核苷酸序列，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核苷酸序列都編碼//g^萬"C樣轉座酶。66.權利要求47的方法，其中所述非人脊推動物是非人哺乳動物。67.權利要求47的方法，其中所述非人脊推動物是家畜。68.—種產(chǎn)生轉基因非人脊稚動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含編碼p/ggyS"c樣轉座酶的核苷酸序列，其中所迷編碼尸'ggv萬ac樣轉座酶的核普酸序列在串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核苷酸序列都編碼//ggy^c樣轉座酶，所述方法包括以下步驟(a)將含編碼p/ggv萬"c樣轉座酶的核苷酸序列的線性化核酸序列離體導入非人脊推動物胚胎或受精印中；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊稚動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊堆動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物；由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中含編碼^gg)^"c樣轉座酶的核苷酸序列的轉基因非人脊推動物，其中所述編碼p/ggySac樣轉座酶的核普酸序列在串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核苦酸序列都編碼p/ggy^/c樣轉座酶。69.權利要求68的方法，其中所述編碼pZg幻必ac樣轉座酶的核苷酸序列有效連接至啟動子。70.權利要求69的方法，其中所述啟動子指導轉座酶在種系中表達。71.權利要求70的方法，其中所述啟動子是種系特異性啟動子。72.權利要求68的方法，其中所述非人脊推動物是非人哺乳動物。73.權利要求68的方法，其中所述非人脊推動物是家畜。74.—種產(chǎn)生轉基因非人脊沖食動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因紐中包含固定的戶ggy^7C樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)分別將(i)含;/gg)^ac樣轉座子的核酸；和(ii)AggyBac樣轉座酶多肽離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中，其導入量有效誘導所述p/gg^ac樣轉座子整合入所逸胚胎的一種或多種細胞的基因組中，或整合入所述受精卵或胚胎所來源的一種或多種細胞的基因組中；(b)在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和(c)在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物；由此產(chǎn)生在其一種或多種細胞的基因組中含固定的WggvSac樣轉座子的轉基因非人脊推動物。75.權利要求74的方法，其中所述p/ggySac樣轉座子攜帶至少1.5kb的插入片段。76.權利要求74的方法，其中所述p/ggyS"c樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀。77.權利要求74的方法，其中所述核酸被線性化，使得^ggv^rc樣轉座子處于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個戸'ggvS"c樣轉座子。78.權利要求74的方法，其中所述非人脊椎動物是非人哺乳動物。79.權利要求74的方法，其中所述非人脊推動物是家畜。80.—種產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞的方法，所述細胞的基因組包含攜帶至少1.5kb的插入片段的/z'g幻必ac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)將含攜帶至少1.5kb的插入片段的/7《g^"c樣轉座子的核酸和在同一核酸中或在獨立的核酸上的、編碼樣轉座酶的核苷酸序列導入到培養(yǎng)的脊推動物細胞中；和(b)在其中表達p'ggy5flc樣轉座酶的條件下培養(yǎng)所述細胞，這樣Wgg^ac樣轉座子被整合入所述培養(yǎng)的脊推動物的基因組中，由此產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞，其基因組包含攜帶至少1.5kb的插入片段的p/ggy5ac樣轉座子。81.—種產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊稚動物細胞的方法，所述細胞的基因組包含//ggy^c樣轉座子，所述；/gg^acc樣轉座子包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核普酸序列，所述方法包括以下步驟(a)將含pgg)^ac樣轉座子的核酸和在同一核酸中或在獨立的核酸上的、編碼；^gg)^ac樣轉座酶的核苷酸序列導入到培養(yǎng)的脊推動物細胞中，所述p/ggy^7cc樣轉座子包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列；(b)在其中表達//gg)^"c樣轉座酶的條件下培養(yǎng)所述細胞，這樣p/ggy5ac樣轉座子被整合入所述培養(yǎng)的脊推動物細胞基因組中，由此產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞，其基因組含Wggy5ac樣轉座子，所述//ggyBacc樣轉座子包含編碼在脊稚動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列。82.—種產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞的方法，所述細胞的基因組包含pgg)^ac樣轉座子，其中所述pg幻必ac樣轉座子位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個戸ggy^c樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)將含pgg)^ac樣轉座子的線性化核酸和在同一核酸中或在獨立的核酸上的、編碼pz'gg)^ac樣轉座酶的核苷酸序列導入到培養(yǎng)的脊推動物細胞中；(b)在其中表達//ggv^c樣轉座酶的條件下培養(yǎng)所述細胞，這樣//ggvBac樣轉座子被整合入所述培養(yǎng)的脊椎動物細胞基因組中，由此產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊稚動物細胞，所述細胞的基因組含;,'ggy^7c樣轉座子，其中所述戸ggy5ac樣轉座子位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個/^ggy5ac樣轉座子。83.—種產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊稚動物細胞的方法，所述細胞的基因組包含編碼p/ggySac樣轉座酶的核香酸序列，其中所述編碼；zggyBac樣轉座酶的核苷酸序列在串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個核香酸序列，其中每個核苷酸序列都編碼p&g^ac樣轉座酶，所述方法包括以下步驟(a)將含編碼/7/ggy6ac樣轉座酶的核苷酸序列的線性化核酸導入到培養(yǎng)的脊推動物細胞中；(b)在其中編碼p'gg3^ac樣轉座酶的核苷酸序列被整合入所述培養(yǎng)的脊推動物的基因組中的條件下培養(yǎng)所述細胞，由此產(chǎn)生培養(yǎng)的重組脊推動物細胞，所述細胞的基因組含編碼p'ggySac樣轉座酶的核苷酸序列，其中編碼所述戸'ggy5ac樣轉座酶的所述核苷酸序列在串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個核苷酸序列，其中每個核苷酸序列都編碼p/ggyBac樣轉座酶。84.權利要求80-83中任一項的方法，其中所述脊推動物細胞是哺乳動物細月包。85.權利要求84的方法，其中所述哺乳動物細胞是人細胞D86.—種在非人脊推動物中移動^ggyBac樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊稚動物與第二種轉基因非人脊推動物交配，產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含Wg幻必ac樣轉座子，其中所述p,'gg)^ac樣轉座子攜帶至少1.5kb的插入片段，所述第二種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含編碼廬'ggW"c樣轉座酶的核苦酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其一種或多種細胞的基因組中既包含所述戶'ggy6ac樣轉座子又包含所述編碼pzggy萬"c樣轉座酶的核苷酸序列的子代，使得^ggy^rc樣轉座酶被表達，所述轉座子被移動；由此在非人脊推動物中移動；/ggySac樣轉座子。87.權利要求86的方法，其中所述第一種轉基因非人脊堆動物通過權利要求14的方法產(chǎn)生。88.權利要求86的方法，其中所述第一種轉基因非人脊推動物通過權利要求74的方法產(chǎn)生。89.權利要求86的方法，其中所述第二種轉基因非人脊推動物通過權利要求68的方法產(chǎn)生。90.—種在非人脊稚動物中移動戶/gg)^ac樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊稚動物與第二種轉基因非人脊推動物交配，產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含;^ggy5ac樣轉座子，所述p/ggy^fc樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀，所述第二種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含編碼p/ggy^c樣轉座酶的核苷酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其一種或多種細胞的基因組中既包含所述/^'ggySac樣轉座子又包含所述編碼pgg)^ac樣轉座酶的核苷酸序列的子代，使得戸ggySac樣轉座酶被表達，所述轉座子^支移動；由此在非人脊推動物中移動p'gg^ac樣轉座子。91.權利要求90的方法，其中所述第一種轉基因非人脊推動物通過權利要求36的方法產(chǎn)生。92.權利要求90的方法，其中所述第一種轉基因非人脊推動物通過權利要求74的方法產(chǎn)生。93.權利要求90的方法，其中所述第二種轉基因非人脊推動物通過權利要求68的方法產(chǎn)生。94.一種在非人脊推動物中移動/&gy5ac樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊推動物與第二種轉基因非人脊稚動物交配，產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含p/ggyBac樣轉座子，其中所述戸'gg^ac樣轉座子位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個pz'gg^ac樣轉座子，所述第二種轉基因非人脊稚動物在其一種或多種生殖細胞的基因組中包含編碼^'ggy5ac樣轉座酶的核苷酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其一種或多種細胞的基因組中既包含所述p/gg)必ac樣轉座子又包含所述編碼;/ggV^ifc樣轉座酶的核苷酸序列的子代，使得p/ggvBac樣轉座酶被表達，所述轉座子被移動；由此在非人脊推動物中移動；/ggy5ac樣轉座子。95.權利要求94的方法，其中所述第一種轉基因非人脊推動物通過權利要求57的方法產(chǎn)生。96.權利要求94的方法，其中所述第一種轉基因非人脊椎動物通過權利要求74的方法產(chǎn)生。97.權利要求94的方法，其中所述第二種轉基因非人脊推動物通過權利要求68的方法產(chǎn)生。98.—種在非人脊推動物中固定；&g)^ac樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊稚動物與第二種成年脊推動物交配，產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中既包含(i)含至少1.5kb的插入片段的/^ggySflc樣轉座子，又包含(ii)編碼pgg)^ac樣轉座酶的核苷酸序列；(b)鑒別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其基因組中不包含編碼^gg〗必ac樣轉座酶的核苷酸序列、而在其一種或多種細胞的基因組中包含p/ggvS"c樣轉座子的子代，使得p/ggySac樣轉座子-波固定在所述子代中，由此在非人脊推動物中固定p'ggySac樣轉座子。99.權利要求98的方法，其中所述第一種轉基因非人脊推動物通過權利要求18的方法產(chǎn)生。100.—種在非人脊推動物中固定/^ggv5"c樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊推動物與第二種成年脊推動物交配，產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中既包含(i)包含編碼蛋白的核苷酸序列的戸'g^^/c樣轉座子，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊推動物中的性狀，又包含(ii)編碼戸ggySac樣轉座酶的核苷酸序列；(b)筌別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其基因組中不包含編碼/7,'gg)必ac樣轉座酶的核苷酸序列、而在其一種或多種細胞的基因組中包含戸ggy5ac樣轉座子的子代，使得pz'ggv^rc樣轉座子被固定在所述子代中，由此在非人脊推動物中固定戶ggF萬"c樣轉座子。101.權利要求100的方法，其中所述第一種轉基因非人脊推動物通過權利要求40的方法產(chǎn)生。102.—種在非人脊推動物中固定p/gg)^oc樣轉座子的方法，所述方法包括以下步驟(a)使第一種轉基因非人脊稚動物與第二種成年脊推動物交配，產(chǎn)生一個或多個子代，所述第一種轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中既包含(i)//ggv^fc樣轉座子，其中所述；z'gg)^ac樣轉座子位于串聯(lián)體中，所述串聯(lián)體包含多個p&g)^ac樣轉座子，又包含(ii)編碼Agw萬oc樣轉座酶的核苷酸序列；(b)筌別步驟(a)的所述一個或多個子代中至少一個在其基因組中不包含編碼//gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列、而在其一種或多種細胞的基因組中包含//g^^ac樣轉座子的子代，使得；/ggy5ac樣轉座子-陂固定在所述子代中，由此在非人脊推動物中固定^ggvBac樣轉座子。103.權利要求102的方法，其中所述第一種轉基因非人脊推動物通過權利要求61的方法產(chǎn)生。104.—種產(chǎn)生轉基因非人脊椎動物的方法，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中含固定的；/ggy^7c樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生一種轉基因非人脊推動物，所述轉基因非人脊推動物在其多種種系細胞的基因組中既包含(i)p'ggvSac樣轉座子，又包含(ii)編碼戸gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苦酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述；/g幻必ac樣轉座子和所述編碼p《gvSac樣轉座酶的核苷酸序列中的至少一個在包含多個^gg)^ac樣轉座子的串聯(lián)體中，或在包含多個每個都編碼//g幻必ac樣轉座酶的核苷酸序列的串聯(lián)體中，所述產(chǎn)生一種轉基因非人脊推動物包括以下步驟將一種或多種核酸離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中，所述一種或多種核酸包含(i)/7/ggyS"c樣轉座子和(ii)編碼p/gg>^"c樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述一種或多種核酸中的至少一種被線性化；在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精卵植入到相同物種的養(yǎng)母中；和在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊稚動物，該動物在其多種種系細胞的基因組中既包含(i)/^ggyB"c樣轉座子，又包含(ii)編碼^ggyBac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述^ggy6ac樣轉座子和所述編碼F'ggyBac樣轉座酶的核苷酸序列中的至少一個在包含多個戸ggy5flc樣轉座子的串聯(lián)體中，或在包含多個每個都編碼戸ggy^/c樣轉座酶的核苷酸序列的串聯(lián)體中；(b)使步驟(a)的回收的轉基因非人脊推動物生長至成年；(C)使步驟(b)的成年轉基因非人脊推動物與第二個成年脊推動物交配，產(chǎn)生一個或多個子代；(d)鑒別步驟(c)的所迷一個或多個子代中至少一個在其基因組中不包含編碼piggyBac樣轉座酶的核苷酸序列、但在其一種或多種細胞的基因組中包含piggyBac樣轉座子的子代，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述一個或多個子代均為轉基因非人脊推動物，所述動物在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的^ggv6ac才羊轉座子；由此產(chǎn)生轉基因非人脊推動物，所述動物在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的pgg^ac樣轉座子。105.—種產(chǎn)生轉基因非人脊推動物文庫的方法，所述轉基因非人脊稚動物文庫的每個在其一種或多種細胞的基因組中均含固定的piggyBac樣轉座子，所述方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生一種轉基因非人脊椎動物，所述轉基因非人脊推動物在其多種種系細胞的基因組中既包舍(piggyBac樣轉座子，又包含(ii)編碼piggyBac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述piggyBac樣轉座子和所述編碼piggyBac樣轉座酶的核苷酸序列中的至少一個在包含多個piggyBac樣轉座子的串聯(lián)體中，或在包含多個每個都編碼piggyBac樣轉座酶的核苷酸序列的串聯(lián)體中，所述產(chǎn)生一種轉基因非人脊推動物包括以下步驟將一種或多種核酸離體導入非人脊推動物胚胎或受精卵中，所述一種或多種核酸包含(i)piggyBac樣轉座子和(ii)編碼piggyBac樣轉座酶的核苦酸序列，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述一種或多種核酸中的至少一種被線性化；在有利于所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的條件下，將所得的非人脊推動物胚胎或受精印植入到相同物種的養(yǎng)母中；和在足以允許所述胚胎發(fā)育成轉基因非人脊推動物的一段時間后，由該養(yǎng)母回收轉基因非人脊推動物，該動物在其多種種系細胞的基因組中既包含(i)p/gg^"c樣轉座子，又包含(ii)編碼p/gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述戸'gg)^ac樣轉座子和所述編碼p/ggv5ac樣轉座酶的核苷酸序列中的至少一個在包含多個p'ggy5ac樣轉座子的串聯(lián)體中，或在包含多個每個都編碼p/ggV^c樣轉座酶的核苷酸序列的串聯(lián)體中；(b)使步驟(a)的回收的轉基因非人脊堆動物生長至成年；(c)使步驟(b)的成年轉基因非人脊推動物與第二個成年脊椎動物交配，產(chǎn)生一個或多個子代；(d)鑒別步驟(c)的所述兩個或多個子代，其中每個均在其基因組中不包含編碼p/ggv5ac樣轉座酶的核香酸序列，但在其一種或多種細胞的基因組中包含p/ggyBac樣轉座子，所述核苷酸序列有效連接至在種系中表達的啟動子，其中所述兩個或多個子代均為轉基因非人脊推動物，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的//gg)^ac樣轉座子；由此產(chǎn)生轉基因非人脊推動物的文庫，其中每個均在其一種或多種細胞的基因組中包含固定的pz'ggy5ac樣轉座子。106.—種轉基因非人脊推動物，所述動物在其一種或多種細胞的基因組中包含攜帶至少1.5kb的插入片段的；^gg)必ac樣轉座子。107.—種轉基因非人脊推動物，所述動物在其一種或多種細胞的基因組中包含円'ggy5ac樣轉座子，所述p!ggv6ac樣轉座子包含編碼蛋白的核香酸序列，其中所述蛋白改變所述轉基因非人脊堆動物中的性狀。108.—種轉基因非人脊推動物，所述動物在其一種或多種細胞的基因組中包含^ggySac樣轉座子，其中所述jwgg^Bac樣轉座子在包含多個pz'ggy^c樣轉座子的串聯(lián)體中。109.—種培養(yǎng)的脊稚動物細胞，所述細胞在其基因組中包含攜帶至少1.5kb的插入片段的pggy萬ac樣轉座子。110.—種培養(yǎng)的脊推動物細胞，所述細胞在其基因組中包含戸ggy^^樣轉座子，所述//ggy5acc樣轉座子包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核香酸序列。111.一種培養(yǎng)的脊推動物細胞，所述細胞在其基因組中包含p/gg3必ac樣轉座子，所述//g幻必ac樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變轉基因非人脊堆動物中的性狀。112.—種培養(yǎng)的脊推動物細胞，所述細胞在其基因組中包含p/ggy5ac樣轉座子，其中所述p'ggv^c樣轉座子在包含多個Wggy5ac樣轉座子的串聯(lián)體中。113.—種轉基因非人脊推動物的文庫，所述文庫通過權利要求105的方法生產(chǎn)。114.一種轉基因非人脊稚動物的文庫，所述文庫包含多個不同的轉基因非人脊推動物，其中每個都在其一種或多種細胞的基因組中包含攜帶至少1.5kb的插入片段的；/gg^ac樣轉座子。115.—種轉基因非人脊推動物的文庫，所述文庫包含多個不同的轉基因非人脊推動物，其中每個都在其一種或多種細胞的基因組中包含//gg^Sac樣轉座子，所述//ggv^(cc樣轉座子包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列。116.—種轉基因非人脊推動物的文庫，所述文庫包含多個不同的轉基因非人脊推動物，其中每個都在其一種或多種細胞的基因組中包含/^gg^ac樣轉座子，所述pggv5acc樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變轉基因非人脊椎動物中的性狀。117.—種轉基因非人脊推動物的文庫，所述文庫包含多個不同的轉基因非人脊推動物，其中每個都在其一種或多種細胞的基因組中包含"/ggyBac樣轉座子，其中所述p/ggySac樣轉座子在包含多個pggy5"c樣轉座子的串聯(lián)體中。118.權利要求113、114、115、116或117的轉基因非人動物的文庫，所述文庫包含至少IO只轉基因非人動物。119.權利要求118的轉基因非人動物的文庫，所述文庫包含至少20只轉基因非人動物。120.—種培養(yǎng)的脊推動物細胞的文庫，所述文庫包含多種不同的細胞，其中每種細胞都在其基因組中包含攜帶至少1.5kb插入片段的/,'gg^c樣轉座子。121.—種培養(yǎng)的脊推動物細胞的文庫，所述文庫包含多種不同的細胞，其中每種細胞都在其基因組中包含p/ggy5ac樣轉座子，所述有價值的蛋白的核苷酸序列。122.—種培養(yǎng)的脊推動物細胞的文庫，所述文庫包含多種不同的細胞，其中每種細胞都在其基因組中包含p&gySac樣轉座子，所述/7&gy^cc樣轉座子包含編碼蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改變轉基因非人脊推動物中的性狀。123.—種培養(yǎng)的脊推動物細胞的文庫，所述文庫包含多種不同的細胞，其中每種細胞都在其基因組中包含^gg)^ac樣轉座子，其中所述pggv5ac樣轉座子在包含多個p/gg^萬ac樣轉座子的串聯(lián)體中。124.—種治療或預防疾病或障礙的方法，所述方法包含將重組脊推動物細胞施用給需要此治療或預防的受治療者的步驟，其中所述細胞的基因組包含p/ggySac樣轉座子，所述戶/ggy^cc樣轉座子包含編碼在所述脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列。125.權利要求124的方法，其中所述重組脊推動物細胞按照權利要求81的方法產(chǎn)生。126.—種將核酸傳遞給需要治療或預防的受治療者的一種或多種細胞的方法，其中所述核酸編碼的蛋白在所述脊推動物疾病的治療或預防中有價值，所述方法包括施用重組病毒的步驟，所述病毒的基因組包含(i)含編碼所述蛋白的核苷酸序列的p&g^ac樣轉座子；和(ii)編碼pggvSac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至引導戸ggy6ac樣轉座酶在所述受治療者的所述一種或多種細胞中表達的啟動子；使得/7/ggy5"c樣凈爭座子在所述施用后被整合入所述受治療者的所述一種或多種細胞的基因組中，由此將編碼在脊推動物疾病的治療或預防中有價值的蛋白的核酸傳遞給需要此治療或預防的受治療者。127.權利要求126的方法，其中所述病毒是逆轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒。128.—種重組病毒，其基因組包含(i)p/ggv5ac樣轉座子，其包含編碼所述蛋白的核苷酸序列；和(ii)編碼；/gg^ac樣轉座酶的核苷酸序列，所述核苦酸序列有效連接至啟動子。129.權利要求128的重組病毒，所述病毒是逆轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒。130.—種確定由轉基因非人脊推動物展示出的表型是否由/7,ggv6ac樣轉座子引起的方法，其中所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含所述樣轉座子，所迷方法包括(a)產(chǎn)生所述轉基因非人脊4食動物的一個或多個子代，在所述子代中所述p/ggySac樣轉座子被切離；(b)確定所述子代中的所述pggy^c樣轉座子的切離和表型逆轉之間是否存在關聯(lián)，其中關聯(lián)表示所述表型由pggvSac樣轉座子引起，由此確定由轉基因非人脊稚動物展示出的表型是否由pgg^ac樣轉座子引起，所述轉基因非人脊推動物在其一種或多種細胞的基因組中包含所述戸ggySac樣轉座子。131.—種由非人脊推動物分離增強子的方法，所述方法包括以下步驟(a)在其一種或多種細胞或組織的基因組中包含p/ggv^c樣轉座子的轉基因非人脊推動物中，評價在所述轉基因非人脊稚動物或由其獲得的子代的所述一種或多種細胞或組織中的報告基因的表達，其中所述轉座子含處于最小啟動子控制下的報告基因；和(b)分離所述p/gg^"c樣轉座子側翼的、負責報告基因在所述一種或多種細胞或組織中表達的核酸；由此由非人脊推動物分離增強子。132.—種由培養(yǎng)的重組脊推動物細胞分離增強子的方法，其中所述重組細胞包含pz'ggv^7c樣轉座子，所述p/ggySoc樣轉座子含處于最小啟動子控制下的報告基因，所述方法包括以下步驟(a)在所述重組脊推動物細胞或其子代中評價報告基因的表達；和(b)分離所述pz'ggvSac樣轉座子側翼的、負責凈艮告基因在重組脊推動物細胞中表達的核酸；由此由培養(yǎng)的重組脊推動物分離增強子。133.—種產(chǎn)生非人脊椎動物的方法，所述非人脊椎動物是戸'gg)必ac樣轉座子鑲嵌體，所迷方法包括以下步驟(a)產(chǎn)生一種轉基因非人胚胎，所述胚胎在其基因組中包含(i)對p/'gg>^ac樣轉座子為純合的遺傳基因座，其中所述p/ggv6ac樣轉座子包含位點特異性重組酶識別序列，和(ii)編碼所述位點特異性重組酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效連接至啟動子；(b)在其中表達位點特異性重組酶和發(fā)生增殖的條件下培養(yǎng)轉基因非人胚胎；由此產(chǎn)生為pggv5ac樣轉座子鑲嵌體的非人脊推動物。134.—種試劑盒，所述試劑盒包含(a)在一個或多個容器中的一種或多種核酸，所述核酸包含(i)攜帶至少1.5kb插入片段的WggvSac樣轉座子，和(ii)編碼pzggySflc樣轉座酶的核苷酸序列；和(b)在第二個容器中的(i)培養(yǎng)的脊推動物細胞或(ii)非人脊推動物卵母細胞。135.—種試劑盒，所述試劑盒包含(a)在一個或多個容器中的一種或多種核酸，所述核酸包含①p/ggWac樣轉座子，其包含編碼在脊推動物疾病或障礙的治療或預防中有價值的蛋白的核苷酸序列，和(ii)編碼pggySac樣轉座酶的核香酸序列；和(b)在第二個容器中的(i)培養(yǎng)的脊推動物細胞或(ii)非人脊推動物卵母細胞。136.—種試劑盒，所述試劑盒包含(a)在一個或多個容器中的一種或多種核酸，所述核酸包含(i)p/ggySac樣轉座子，和(ii)編碼pggy6ac樣轉座酶的核苷酸序列，其中所述一種或多種核酸中的至少一種一皮線性化；和(b)在第二個容器中的(i)培養(yǎng)的脊推動物細胞或(ii)非人脊推動物卵母細胞。137.權利要求l、25、47、68、80、81、82、83、86、90、94、98、100、102、104、105、124、126、128、130、131、132或133中的任一項的方法，其中所述p/ggy^"c樣轉座子是p/ggy^rc轉座子，和/或；zgg)^ac才羊轉座酶是/^'ggyBac專爭座酶。138.權利要求106-108中任一項的轉基因非人脊推動物，其中所述；/ggy^ac才羊4爭座子是p/gg3^Sac4爭座子，和/或p/ggy5ac才羊4爭座酶是;/ggyte轉座酶。139.權利要求113-117和120-123中任一項的文庫，其中所述pzggyBac樣轉座子是pz'gg)^3rc轉座子，和/或/H'ggvSac樣轉座酶是pz'ggyto轉座酶。140.權利要求109-112中任一項的脊推動物細胞，其中所述p/ggvfiac才羊轉座子是p/ggy^c轉座子，和/或p/ggySac才羊轉座酶是p/ggy&c轉座酶。141.權利要求128的重組病毒，其中所述；&g);5ac樣轉座子是戸'ggy萬fifc轉座子，和/或/,'ggy5ac樣轉座酶是p/gg^Gfc轉座酶。142.權利要求134-136中任一項的試劑盒，其中所述；/gg)^ac樣轉座子是p'ggyBcrc轉座子，和/或p'ggyBac樣轉座酶是/^ggy6ac轉座酶。143.權利要求l、80和86中任一項的方法，其中所述p,'ggv^ac樣轉座子攜帶至少2.5kb的插入片段。144.權利要求106的轉基因非人脊推動物，其中所述pggy^c樣轉座子攜帶至少2.5kb的插入片段。145.權利要求114和120中任一項的文庫，其中所述//g幻Wflc樣轉座子攜帶至少2.5kb的插入片段。146.權利要求109的脊堆動物細胞，其中所述//ggySac樣轉座子攜帶至少2.5kb的插入片段。147.權利要求134中任一項的試劑盒，其中所述//gg)必ac樣轉座子攜帶至少2.5kb的插入片段。148.權利要求105的方法，其中所述步驟(d)的鑒別包括進行反向聚合酶鏈反應。149.權利要求21、43、64或71的方法，其中所述種系特異性啟動子是雄性特異性啟動子。150.權利要求149的方法，其中所述雄性特異性啟動子是魚精蛋白(Prm)啟動子。151.權利要求21、43、64或71的方法，其中所述種系特異性啟動子是雌性特異性啟動子。152.權利要求151的方法，其中所述雌性特異性啟動子是ZP3啟動子。全文摘要本發(fā)明涉及其基因組包含piggyBac家族轉座子系統(tǒng)的一種或多種因子的轉基因脊椎動物(包括哺乳動物)細胞。還提供其基因組包含piggyBac家族轉座子系統(tǒng)的一種或多種因子的轉基因非人脊椎動物，包括轉基因非人哺乳動物。另外提供制備和使用本發(fā)明的細胞和動物的方法，包括在醫(yī)學、獸醫(yī)學和農(nóng)學領域中的應用。本發(fā)明還涉及可用于實施這些方法的試劑盒。文檔編號C12N15/09GK101297031SQ200580051073公開日2008年10月29日申請日期2005年5月14日優(yōu)先權日2005年5月14日發(fā)明者G·李,M·韓,S·丁,T·徐,X·吳,Y·莊申請人:復旦大學