專(zhuān)利名稱：：過(guò)量表達(dá)和純化的無(wú)花果曲霉氧化酶及其編碼核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的分離的核酸序列，其包含編碼新的真菌氧化酶的基因，和其核酸片段。還涉及從無(wú)花果曲霉(Aspergillusficuum)分離和純化的所述新的真菌氧化酶，它的氨基酸序列如SEQIDNO40或41所示，和其功能等同物或衍生物。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核酸分子的構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)本發(fā)明的氧化酶的方法。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的氧化酶在工業(yè)過(guò)程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：氧化酶是催化許多種類(lèi)的生物氧化的酶。在這些氧化酶中，例如，漆酶(也稱作多酚氧化酶；EC1.10.3.1.；苯二酚氧氧化還原酶)是含有多個(gè)銅的酶，其催化多種酚類(lèi)化合物的氧化，伴隨將O2還原成H2O。這些多酚氧化酶廣泛分布，并由許多種以下生物生產(chǎn)(1)真菌，包括(a)子囊菌，如曲霉屬，鏈孢霉屬或足孢子菌屬，(b)半知菌，如葡萄孢屬，(c)擔(dān)子菌，如金錢(qián)菌屬，層孔菌屬，香茹屬，灰側(cè)耳菌屬，栓菌屬，射脈菌屬或密孔菌屬，(d)有性形式的絲核菌屬，還有(2)植物，如漆樹(shù)，北美鵝掌楸，煙草或桐葉槭，以及(3)細(xì)菌，如生脂固氮螺菌。它們也廣布于細(xì)菌中(Alexandre和Zhulin，2000，Tibtech1841)?？紤]到它們的生產(chǎn)者的生物多樣性，氧化酶和漆酶表現(xiàn)出廣范圍的底物特異性，具有不同的氧化酚類(lèi)底物的能力。因而，漆酶參與色素形成、子實(shí)體形成、致病性和木素降解及生物合成。因?yàn)樵摰孜锾禺愋?，氧化酶和漆酶表現(xiàn)出在工業(yè)應(yīng)用(紙漿和紙加工，去污劑或酚聚合中的染料轉(zhuǎn)移抑制)、環(huán)境應(yīng)用(環(huán)境污染物解毒或廢水處理)、食品應(yīng)用(烘烤，釀造，預(yù)防酒變色，基于茶的食品的顏色增強(qiáng)，食物的脫氧，或果汁制造)和制藥應(yīng)用(甾族化合物和抗生素的轉(zhuǎn)化)中的潛力(實(shí)例參見(jiàn)Sariaslani，1989，Critic.Rev.Biotechnol.9171；Potusetal.，1999，Industriesdescéréales，1153；Lopezetal.，2002，J.Biotechnol.，99249；Duranetal.，2002，Enz.MicrobialTechnol.，31907；Minussietal.，2002，TrendsFoodSci.Technol.，13205；Biotechnologyinthepulpandpaperindustry，2002，ViikarietLanttoeds，Elsevier)。取決于它們的來(lái)源，真菌漆酶具有不同的溫度和pH最適條件，不同的氧化還原電位和底物特異性(XuF.&al.，1996，BiochimBiophysActa.1292，p.303)。已經(jīng)分離了大量的真菌漆酶，且已經(jīng)克隆了它們的對(duì)應(yīng)基因中的大多數(shù)。在它們的氨基酸序列之間發(fā)現(xiàn)的相似性和強(qiáng)同一性表明，密切相關(guān)的序列屬于作為同一種系發(fā)生群的成員的生物。這些值有時(shí)在來(lái)自相同屬的不同物種的酶之間高于由相同物種生產(chǎn)的不同漆酶之間(Eggertetal.，1998，ApplEnvironMicrobiol.641766)。取決于它們的寬范圍的底物特異性，氧化酶和漆酶具有巨大的商業(yè)潛力，且以非常高的水平表達(dá)這些酶的能力對(duì)于商業(yè)目的是至關(guān)重要的。在異源真菌系統(tǒng)中表達(dá)漆酶基因的嘗試，經(jīng)常產(chǎn)生非常低的產(chǎn)率。因而，輻射射脈菌漆酶在Trichodermareesei中的表達(dá)，僅產(chǎn)生20mg/升的活性酶(Saloheimoetal.，Bio/Technology1991，9987)，而灰蓋鬼傘Lcc1漆酶在米曲霉中的表達(dá)，產(chǎn)生8至135mg/升(Yaveretal.，1999，lcc1.ApplEnvironMicrobiol.，65(11)4943-8.)，Myceliophtorathermophila漆酶在米曲霉中的表達(dá)，產(chǎn)生11至19mg/升(Berkaetal.，1997，ApplEnvironMicrobiol.633151)。朱紅密孔菌的漆酶已經(jīng)在曲霉中以約80mg/升的水平表達(dá)(SigoillotC.etal.，2004，Appl.Microbiol.Biotechnol.64346)?，F(xiàn)在，仍然需要可以在本文所述的不同應(yīng)用中使用的新的氧化酶。而且，它們的對(duì)應(yīng)基因在工業(yè)宿主(如曲霉)中的高水平表達(dá)非常令人感興趣。發(fā)明概述本發(fā)明涉及編碼無(wú)花果曲霉氧化酶的新基因的分離和表征。已經(jīng)從無(wú)花果曲霉分離了編碼根據(jù)本發(fā)明的氧化酶的新基因，其長(zhǎng)為1,923堿基對(duì)，具有2個(gè)內(nèi)含子和與596個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的可讀框。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及核酸分子，其包含編碼無(wú)花果曲霉氧化酶的SEQIDNO1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11，或由其組成。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及選自下述的多核苷酸-核酸分子，其包含與SEQIDNO1至39中任一具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、優(yōu)選地至少85％、更優(yōu)選地至少90％、且更優(yōu)選地至少95％同一性的核苷酸序列，其互補(bǔ)形式和RNA形式，-編碼具有氧化酶活性的蛋白的其任意片段，其互補(bǔ)形式和RNA形式，和-至少15個(gè)核苷酸、優(yōu)選地至少20個(gè)核苷酸、或更優(yōu)選地至少25個(gè)核苷酸的其任意片段，其互補(bǔ)形式和RNA形式。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及具有氧化酶活性的蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯藍(lán)染色顯示其為約85kDa。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及具有氧化酶活性的蛋白，用PNGaseF去糖基化后，分子量為約70kDa。本發(fā)明也涉及分離的氧化酶多肽，它的氨基酸序列包含SEQIDNO40或41或由其組成，和其具有氧化酶活性的任意片段。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及分離的具有氧化酶活性的多肽，其選自與SEQIDNO40或41具有至少70％、有利地至少80％、優(yōu)選地至少85％、更優(yōu)選地至少90％、且更優(yōu)選地至少95％同一性的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，例如構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)2024，其包含在它自己的啟動(dòng)子控制下表達(dá)的根據(jù)本發(fā)明的基因。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，例如構(gòu)巢曲霉或無(wú)花果曲霉，其包含在構(gòu)巢曲霉的gpdA啟動(dòng)子(甘油醛-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子)控制下表達(dá)的根據(jù)本發(fā)明的基因，導(dǎo)致所述基因的表達(dá)的數(shù)倍增加。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及根據(jù)本發(fā)明的氧化酶在需要將酚類(lèi)化合物氧化的食品和非食品工業(yè)應(yīng)用中的用途，例如它在烘烤過(guò)程中的應(yīng)用或它作為增色劑的應(yīng)用，例如在茶中。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及包含本發(fā)明的氧化酶多肽的面包改良組合物。附圖簡(jiǎn)述圖1描繪了來(lái)自無(wú)花果曲霉(保藏在DSMZ，登錄號(hào)DSM932)的具有氧化酶活性的純化的酶的SDS-PAGE和酶譜分析。圖2描繪了隨pH而變的酶活性。圖3描繪了編碼來(lái)自無(wú)花果曲霉(DSM932)的具有氧化酶活性的酶的基因的核苷酸序列，和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。圖4描繪了用或不用根據(jù)本發(fā)明的氧化酶處理的茶溶液的吸收光譜。圖5描繪了增加量的根據(jù)本發(fā)明從無(wú)花果曲霉(DSM932)分離的氧化酶對(duì)面包體積的影響。圖6描繪了增加量的根據(jù)本發(fā)明從無(wú)花果曲霉(DSM932)分離的氧化酶對(duì)面包粘性的影響。圖7描繪了增加量的根據(jù)本發(fā)明從無(wú)花果曲霉(DSM932)分離的氧化酶對(duì)面團(tuán)稠度的影響。圖8至12描繪了本發(fā)明的核苷酸和氨基酸序列。發(fā)明詳述氧化酶編碼基因本發(fā)明提供了分離的編碼氧化酶的核酸分子。已經(jīng)從以登錄號(hào)DSM932保藏在DSMZ的無(wú)花果曲霉(稱作無(wú)花果曲霉DSM932)分離了由SEQIDNO1組成的核酸分子。也預(yù)見(jiàn)到等位基因變體和物種變體，它們稱作同源物或同源序列。在本發(fā)明的上下文中，同源物或同源序列是與SEQIDNO1至50中任一具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、優(yōu)選地至少90％、且更優(yōu)選地至少95％、96％、97％、98％或99％同源性(或同一性)的核苷酸或氨基酸序列?！巴葱浴被颉巴恍浴敝府?dāng)對(duì)比2個(gè)序列時(shí)，給出的百分比值。所述的對(duì)比可以使用任何可得到的軟件進(jìn)行，例如Clustalw程序和默認(rèn)參數(shù)值(例如可從http://www.ebi.ac.uk/clustalw得到)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸分子”指單鏈或雙鏈分子，且包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)，RNA分子(例如mRNA)和類(lèi)似物，其中核苷酸已經(jīng)被替換為核苷酸類(lèi)似物或衍生物?？梢詮纳a(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的氧化酶的不同微生物中，分離由SEQIDNO1至39中任一或任意同源物組成或包含其的核酸，它的互補(bǔ)形式(或互補(bǔ)鏈)，或它的RNA形式。所述微生物可以是細(xì)菌或真菌，包括酵母，且可以更具體地是其它曲霉物種?？梢允褂么_立的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)分離本發(fā)明的同源序列。這樣的方法的實(shí)例包括在合適的載體中從微生物的基因組DNA構(gòu)建基因文庫(kù)，然后通過(guò)直接表達(dá)所述同源序列，篩選該文庫(kù)。另一種方法包括與例如本發(fā)明核酸分子的至少15個(gè)核苷酸、優(yōu)選地至少20個(gè)核苷酸、且更優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸的片段(例如SEQIDNO37，38或39的片段)的雜交步驟。其它方法包括，通過(guò)分子技術(shù)，例如PCR技術(shù)，使用從本發(fā)明的核酸序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，擴(kuò)增所述同源序列。另外，存在在相對(duì)較短的時(shí)間段內(nèi)得到數(shù)千個(gè)突變的序列以及評(píng)估它們的對(duì)應(yīng)多肽序列的酶活性的確立的方法。這些方法包括，例如，隨機(jī)誘變，高流量篩選等，且經(jīng)常用于證明單個(gè)或多個(gè)突變的可能效應(yīng)。這樣的突變(添加、缺失和/或置換)可以是或不是沉默的，可以產(chǎn)生在對(duì)分子的功能至關(guān)重要的區(qū)域之內(nèi)或之外，且仍然產(chǎn)生具有氧化酶活性的活性蛋白(也稱作功能等同物)，該活性或多或少地(即至少70％、有利地至少80％、優(yōu)選地至少90％、或更優(yōu)選地至少95％)類(lèi)似于SEQIDNO40或41的多肽的氧化酶活性?；蛘?，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，合成地制備本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以包括寡核苷酸類(lèi)似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸等)，所以它具有例如改變的堿基配對(duì)能力或提高的對(duì)核酸酶的抗性。本發(fā)明的核酸分子可以包括或不包括間斷編碼序列的內(nèi)含子。本發(fā)明的核酸分子可以是混合的基因組的、合成的和/或cDNA來(lái)源的，通過(guò)本領(lǐng)域已知的包括連接來(lái)自不同來(lái)源的片段的步驟的方法制備。優(yōu)選的本發(fā)明的分離的和純化的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于SEQIDNO1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11或其編碼具有氧化酶活性的肽的片段。所述序列SEQIDNO1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或11的片段優(yōu)選地具有超過(guò)600個(gè)核苷酸、更優(yōu)選地超過(guò)900個(gè)核苷酸或更優(yōu)選地超過(guò)1200個(gè)核苷酸，且編碼特征在于氧化酶活性的蛋白(也稱作功能等同物)，所述氧化酶活性類(lèi)似于SEQIDNO40或41的完整氨基酸序列的氧化酶活性。優(yōu)選地，所述功能等同物具有通過(guò)其SEQIDNO40或41的氨基酸序列定義的完整酶的初始氧化酶活性的超過(guò)70％、或超過(guò)80％的氧化酶活性，且與具有SEQIDNO40或41的氨基酸序列的酶相比，優(yōu)選地具有至少90％的氧化酶活性。本發(fā)明的多核苷酸選自-(a)核酸分子，其包含與SEQIDNO1至39中任一具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、優(yōu)選地至少85％、更優(yōu)選地至少90％、且更優(yōu)選地至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，其互補(bǔ)形式和RNA形式，-(b)(a)組核酸分子的編碼具有氧化酶活性的蛋白的任意片段，其互補(bǔ)形式和RNA形式，和-(c)(a)或(b)組核酸分子的至少15個(gè)核苷酸、優(yōu)選地至少20，25，或30個(gè)核苷酸、或更優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸的任意片段，其互補(bǔ)形式和RNA形式。換而言之，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以包含下述序列或由其組成-SEQIDNO1至39中任一的核苷酸序列，其互補(bǔ)形式或RNA形式，-與SEQIDNO1至39中任一、或與其互補(bǔ)形式或RNA形式具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、優(yōu)選地至少85％、更優(yōu)選地至少90％、且更優(yōu)選地至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，-SEQIDNO1至11中任一的片段，或它們的同源物中任一的片段，或它們的互補(bǔ)形式和RNA形式中任一的片段，其中所述片段編碼具有氧化酶活性的蛋白，或-SEQIDNO1至39中任一、或它們的同源物中任一、或它們的互補(bǔ)形式或RNA形式中任一的至少15個(gè)核苷酸、優(yōu)選地至少20個(gè)核苷酸、更優(yōu)選地至少25個(gè)核苷酸的片段。所述的編碼具有氧化酶活性的蛋白的SEQIDNO1至11中任一的片段、或它們的同源物中任一的片段、或它們的互補(bǔ)形式或RNA形式中任一的片段，優(yōu)選地由至少600個(gè)核苷酸、優(yōu)選地至少900個(gè)核苷酸、或更優(yōu)選地至少1200個(gè)核苷酸組成。包含SEQIDNO1至39中任一、或它們的同源物中任一、或它們的互補(bǔ)形式或RNA形式中任一的至少15個(gè)核苷酸、優(yōu)選地至少20、25或30個(gè)核苷酸、更優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸的片段或由所述片段組成的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，可以用于例如檢測(cè)或鑒別目的，作為引物或探針。氧化酶蛋白還提供了具有氧化酶活性的蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯藍(lán)染色顯示其為約85kDa。具有氧化酶活性的本發(fā)明的蛋白，在用PNGaseF去糖基化后，分子量為約70kDa。有利地，分離的和純化的根據(jù)本發(fā)明的氨基酸序列的非糖基化形式具有介于約60至約70kDa之間、優(yōu)選地約63kDa或約65.5kDa的分子量。本發(fā)明的分離的氧化酶由本發(fā)明的核酸編碼的多肽組成。本發(fā)明的分離的氧化酶多肽可以包含下述序列或由其組成-SEQIDNO40至50中任一的氨基酸序列，-SEQIDNO40、41或45的至少100個(gè)氨基酸的片段，或-呈現(xiàn)與SEQIDNO40至50中任一的氨基酸序列、或與所述SEQIDNO40、41或45的至少100個(gè)氨基酸的任何片段至少60％同一性的氨基酸序列。更具體地，本發(fā)明的分離的氧化酶由多肽組成，所述多肽由包含下述序列或由其組成的核酸分子編碼-SEQIDNO1至39中任一，-與SEQIDNO1至39中任一具有至少60％、有利地至少70％、更有利地至少80％、優(yōu)選地至少85％、更優(yōu)選地至少90％、且更優(yōu)選地至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列(也稱作同源物)，或-SEQIDNO1至11中任一的任何片段，或它們的同源物的任何片段，其編碼具有氧化酶活性的蛋白。本發(fā)明的分離的氧化酶多肽包含下述序列或由其組成SEQIDNO40至50中任一的氨基酸序列，或其保留了氧化酶活性的任意片段。本發(fā)明的分離的氧化酶多肽包含下述序列或由其組成呈現(xiàn)與SEQID40或41的氨基酸序列、或與所述SEQIDNO40或41的具有氧化酶活性的任何片段至少60％、優(yōu)選地至少70％、80％或85％、更優(yōu)選地至少90％、或更優(yōu)選地至少95％、96％、97％、98％或99％同源性(或序列同一性)的氨基酸序列。本發(fā)明的氧化酶多肽的優(yōu)選片段、特別是SEQIDNO40或41的優(yōu)選片段，包含下述序列或由其組成至少100個(gè)氨基酸、優(yōu)選地至少200個(gè)、更優(yōu)選地至少300個(gè)氨基酸、且更優(yōu)選地至少400個(gè)氨基酸的氨基酸序列。本發(fā)明的氧化酶多肽的優(yōu)選片段具有由SEQIDNO40或41的氨基酸序列定義的氧化酶多肽的氧化酶活性的至少70％、有利地至少80％、更有利地至少85％、優(yōu)選地至少90％、或更優(yōu)選地至少95％、96％、97％、98％或99％。本發(fā)明的氧化酶多肽的優(yōu)選片段、特別是SEQIDNO40或41的優(yōu)選片段，包含下述序列或由其組成至少100個(gè)氨基酸、優(yōu)選地至少200個(gè)、更優(yōu)選地至少300個(gè)氨基酸、且更優(yōu)選地至少400個(gè)氨基酸的氨基酸序列，且具有由SEQIDNO40或41的氨基酸序列定義的氧化酶多肽的氧化酶活性的至少70％、有利地至少80％、更有利地至少85％、優(yōu)選地至少90％、或更優(yōu)選地至少95％、96％、97％、98％或99％。實(shí)際上，包含SEQIDNO40至50中任一的氨基酸序列或由其組成的本發(fā)明的分離的氧化酶多肽可以部分地缺失，同時(shí)維持它的酶活性。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法，可以測(cè)量所述酶活性。通過(guò)重組技術(shù)，也可以制備根據(jù)本發(fā)明的蛋白片段。根據(jù)本發(fā)明的分離的氧化酶多肽也可以得自，在SEQIDNO40至50中任一的氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失和/或插入。所述置換可以是保守的，這是指一個(gè)氨基酸被一個(gè)具有類(lèi)似側(cè)鏈的氨基酸替代，與由SEQIDNO40或41的氨基酸序列組成的氧化酶多肽相比，其不顯著影響所述多肽的酶活性。這些家族是本領(lǐng)域已知的，包括具有堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸，精氨酸和組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸，谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)、β分支的側(cè)鏈(蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)的氨基酸。而且，所述置換、缺失或插入可以涉及非必需氨基酸，與由SEQIDNO40或41的氨基酸序列組成的氧化酶多肽相比，也不導(dǎo)致顯著改變所述多肽的氧化酶活性。根據(jù)本發(fā)明的分離的和純化的氧化酶特征還在于約5.5的最適pH。更大體地，最大活性是在pH約5至pH約6.5之間(見(jiàn)圖2)。根據(jù)本發(fā)明的分離的氧化酶多肽特征還在于下述事實(shí)，即除了別的以外，它可以特別使用N，N-二甲基-對(duì)苯二胺和2，2′-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)作為底物。因此，根據(jù)本發(fā)明的分離的氧化酶多肽也可以稱作漆酶。酶的表達(dá)和/或純化本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及重組核苷酸序列，其包含與根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列可操作地連接的一個(gè)或多個(gè)鄰近調(diào)節(jié)序列。所述鄰近調(diào)節(jié)序列優(yōu)選地源自同源微生物。但是，所述鄰近調(diào)節(jié)序列也可以源自異源微生物。所述鄰近調(diào)節(jié)序列是特定的序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、分泌信號(hào)序列和/或終止子。本發(fā)明的優(yōu)選的鄰近調(diào)節(jié)序列能指導(dǎo)本發(fā)明的核苷酸序列在重組宿主細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的鄰近調(diào)節(jié)序列是構(gòu)巢曲霉的組成型gpdA(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動(dòng)子。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及載體，其包含本發(fā)明的核酸分子，后者可能可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)源自同源或異源微生物的鄰近調(diào)節(jié)序列上。在本上下文中，將“載體”定義為可以用于將核苷酸序列導(dǎo)入(通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)化，感染，綴合等)細(xì)胞中的任何生物化學(xué)構(gòu)建體。有利地，根據(jù)本發(fā)明的載體選自質(zhì)粒(包括復(fù)制型和整合型質(zhì)粒)，病毒，噬菌粒，染色體，轉(zhuǎn)座子，脂質(zhì)體，陽(yáng)離子小泡，或其混合物。所述載體可能已經(jīng)包含一個(gè)或多個(gè)鄰近調(diào)節(jié)序列，允許所述核酸分子的表達(dá)和它向本發(fā)明的多肽的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，所述載體是質(zhì)粒。本發(fā)明也涉及經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或重組的宿主細(xì)胞，其含有(或已摻入了)一個(gè)或多個(gè)根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體。在本上下文中，“經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞”或“重組細(xì)胞”也稱作“轉(zhuǎn)化體”，是已摻入了一個(gè)或多個(gè)根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體的細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以是這樣的細(xì)胞，其中所述載體和/或所述核苷酸序列通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入，優(yōu)選地通過(guò)同源重組的方式，或通過(guò)任何其它熟知的用于得到重組生物的方法導(dǎo)入。所述用于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以已經(jīng)具有或不具有本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體。包括原核生物細(xì)胞和真核生物細(xì)胞，例如細(xì)菌、真菌、酵母等。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是構(gòu)巢曲霉，特別是構(gòu)巢曲霉2024，黑曲霉(A.niger)，更具體地黑曲霉N402，或無(wú)花果曲霉，更特別是無(wú)花果曲霉DSM932。所述宿主細(xì)胞也可以是原始細(xì)胞，例如無(wú)花果曲霉，其已經(jīng)含有本發(fā)明的核苷酸序列，并被遺傳地修飾成過(guò)量表達(dá)或更有效地表達(dá)本發(fā)明的氧化酶多肽(更好的pH或溫度特征，更高的細(xì)胞外表達(dá)等)。本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在它的基因組中已經(jīng)整合入根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子，和/或可以含有包含本發(fā)明的分離的核酸分子的附加型載體。優(yōu)選的本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能過(guò)量表達(dá)(即比在原始或野生型微生物中觀察到的表達(dá)更高的表達(dá))本發(fā)明的核苷酸序列和/或載體，有利地允許大量生產(chǎn)由所述核苷酸序列和/或所述載體編碼的多肽。優(yōu)選地，所述重組宿主細(xì)胞含有鄰近根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的調(diào)節(jié)序列，其能指導(dǎo)所述核酸分子的過(guò)量表達(dá)。本發(fā)明的氧化酶的過(guò)量表達(dá)，也可源自根據(jù)本發(fā)明的核酸序列在所述重組宿主細(xì)胞中的增加的拷貝數(shù)。為了最佳表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的氧化酶，原始生產(chǎn)種，例如無(wú)花果曲霉，和/或合適的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，例如經(jīng)轉(zhuǎn)化的黑曲霉或經(jīng)轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉，是在合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和/或表達(dá)培養(yǎng)基中。在實(shí)施例部分描述了最佳條件的一些實(shí)例，如培養(yǎng)基，溫度和pH條件等。根據(jù)本發(fā)明，可以如下得到本發(fā)明的具有氧化酶活性的多肽首先在適合表達(dá)所述氧化酶的培養(yǎng)基中/上培養(yǎng)菌株，然后可通過(guò)常規(guī)方法，包括但不限于，離心，微濾，超濾，噴霧干燥，蒸發(fā)或沉淀，從培養(yǎng)基回收。使用例如電泳方法、提取或多種色譜方法，如離子交換色譜、凝膠過(guò)濾色譜、親和色譜等，可以進(jìn)一步純化所述根據(jù)本發(fā)明的氧化酶。所有這些技術(shù)都記載在科學(xué)文獻(xiàn)中，且是眾所周知的技術(shù)。所述氧化酶可以在胞外或胞內(nèi)表達(dá)，和/或由生產(chǎn)所述氧化酶的微生物或根據(jù)本發(fā)明的重組宿主分泌。所述本發(fā)明的多肽可以以修飾的形式表達(dá)，如融合蛋白，且可以包括一個(gè)或多個(gè)分泌信號(hào)和/或一個(gè)或多個(gè)附加的異源功能區(qū)域。所述區(qū)域可以由添加到所述多肽的Nt上的帶特定電荷的氨基酸組成，以提高在純化過(guò)程中或在隨后的處理和儲(chǔ)存過(guò)程中在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性和持久性。它們也可以由添加到所述本發(fā)明的多肽上以促進(jìn)純化的短肽組成。本發(fā)明的氧化酶的不同應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的氧化酶可以用于不同種類(lèi)的工業(yè)中。根據(jù)本發(fā)明的具有氧化酶活性的多肽，經(jīng)進(jìn)一步純化或不經(jīng)純化，特別適合用作面包改良劑。面包改良劑或面包改良組合物是能改良和/或增加面團(tuán)和/或最終的烘烤產(chǎn)品的質(zhì)地、風(fēng)味、保鮮作用、柔軟性、儲(chǔ)存后的碎屑(crumb)柔軟性、新鮮度、面團(tuán)加工性和/或體積的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的具有氧化酶活性的多肽優(yōu)選地用于改善面團(tuán)處理和/或增加最終的烘烤產(chǎn)品的比體積。根據(jù)本發(fā)明的具有氧化酶活性的多肽有利地用于面包改良劑配方或面包改良組合物中。本發(fā)明也涉及面包改良組合物，其包含本發(fā)明的氧化酶多肽。術(shù)語(yǔ)“烘烤產(chǎn)品”包括從面團(tuán)制備且在烘烤面團(tuán)后得到的任何產(chǎn)品，更具體地包括酵母發(fā)起的烘烤產(chǎn)品。面團(tuán)從任意類(lèi)型的面粉或粗粉(例如基于小麥、黑麥、大麥、燕麥或玉米)得到。優(yōu)選地，用小麥和/或包括小麥的混合物制備面團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的面包改良組合物也可以包含其它的面包改良劑，例如但不限于，酶，乳化劑，氧化劑，奶粉，脂肪，糖，氨基酸和/或蛋白(谷蛋白，纖維素結(jié)合位點(diǎn))。這樣的酶的實(shí)例包括但不限于，α-淀粉酶，β-淀粉酶，形成麥芽糖的(maltogenic)淀粉酶，木聚糖酶，蛋白酶，葡萄糖氧化酶，氧化還原酶，葡聚糖酶，纖維素酶，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，異構(gòu)酶，脂肪酶，磷脂酶，果膠酶等。優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的面包改良組合物包含本發(fā)明的氧化酶多肽和α-淀粉酶、優(yōu)選來(lái)自米曲霉(Aspergillusoryzae)的α-淀粉酶。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的氧化酶多肽特別適用于改進(jìn)或增強(qiáng)基于茶的食品的顏色。本發(fā)明的氧化酶多肽可以用于食品應(yīng)用，如烘烤、面粉糕餅、蛋糕、釀造、預(yù)防酒變色、食物的脫氧、果汁制造等，或用于飼料應(yīng)用。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明的氧化酶多肽可以用于工業(yè)應(yīng)用，如紙漿和紙加工、去污劑或酚聚合中的染料轉(zhuǎn)移抑制等，環(huán)境應(yīng)用，如環(huán)境污染物解毒、廢水處理等，或制藥應(yīng)用(甾族化合物和抗生素的轉(zhuǎn)化等)。通過(guò)添加其它酶，可以進(jìn)一步改進(jìn)本發(fā)明的氧化酶多肽的作用。這樣的酶可以屬于，但不限于，水解酶家族，如葡聚糖酶，蛋白酶，纖維素酶，半纖維素酶，和果膠酶。其它酶是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，氧化還原酶，異構(gòu)酶等。根據(jù)應(yīng)用，可以以幾種形式使用本發(fā)明的氧化酶多肽。表達(dá)本發(fā)明的氧化酶多肽的微生物(重組或非重組)，如酵母、真菌、古細(xì)菌或細(xì)菌，可以直接用于工藝過(guò)程中。本發(fā)明的氧化酶多肽可以作為細(xì)胞提取物、無(wú)細(xì)胞的提取物(即已經(jīng)經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)破碎、離心和/或提取步驟的宿主細(xì)胞的部分)和/或作為純化的蛋白使用。一種或多種所述形式可以與任何上述形式的一種或多種酶聯(lián)合使用?？梢詫⑺鋈?xì)胞、細(xì)胞提取物、無(wú)細(xì)胞的提取物、或所述純化的本發(fā)明的氧化酶多肽通過(guò)任何常規(guī)方法固定化到固體支持物上，例如以允許保護(hù)本發(fā)明的氧化酶多肽，或允許連續(xù)水解底物，和/或允許酶制品的再循環(huán)。所述細(xì)胞、細(xì)胞提取物(包括粗提取物和部分純化的提取物)、無(wú)細(xì)胞的提取物和/或所述純化的本發(fā)明的氧化酶多肽可以與不同的成分相混合，例如以干燥粉末或顆粒(特別是無(wú)粉塵顆粒)形式，或以液體形式，例如與根據(jù)確立的方法的穩(wěn)定劑(如多元醇、糖、有機(jī)酸、糖醇)相混合。在下面的實(shí)施例中，進(jìn)一步詳述了本發(fā)明，所述實(shí)施例僅用于解釋目的，不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例A)材料和方法實(shí)施例1菌株和培養(yǎng)基.使用的細(xì)菌菌株是大腸桿菌菌株RR1ΔM15(F′lacIQlacZΔM15hsdS20supE44ara-14proA2rspL20(strR)lacY1galK2xyl-5mtl-1)和MC1061(hsdRmcrBaraD139Δ(araABC-leu)7697ΔlacX74galUgalKrpsLthi)。真菌菌株是無(wú)花果曲霉DSM932，構(gòu)巢曲霉2024(biA1argB3)和黑曲霉N402(ATCC菌株9029的cspA1衍生物)。細(xì)菌在37℃生長(zhǎng)在LB(0.5％酵母提取物，1％Bacto蛋白胨，1％NaCl)或TB培養(yǎng)基(TerrificBroth，GibcoBRLLifeTechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)中，真菌在28℃以250rpm生長(zhǎng)在曲霉基本培養(yǎng)基(Ponteverco&al，1953，Adv.Genet.，5.141)中。實(shí)施例2發(fā)酵在151BiostatE發(fā)酵罐(B.BraunBiotech-工作體積10升)中培養(yǎng)曲霉菌株。培養(yǎng)基組成如下Maldex1540g/l；鹽溶液50ml/l；微量元素溶液1ml/l；CuSO4溶液(1.6g/l)1ml/l。鹽溶液含有120g/lNaNO3，10.40g/lKCl，10.40g/lMgSO4·7H2O和30.40g/lKH2PO4。微量元素溶液(pH6.5)含有22g/lZnSO4·7H2O，11g/lH3BO3，4.1g/lMnCl2·2H2O，5g/lFeSO4·7H2O，1.7g/lCoCl2·6H2O，1.6g/lCuSO4·5H2O，1.5g/lNa2MoO4·2H2O和50g/l乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物。滅菌后加入1mg/l維生素H(biotine)。發(fā)酵的起始pH是6.0，溫度固定在30℃。發(fā)酵持續(xù)時(shí)間是約60至70小時(shí)。實(shí)施例3基因組DNA的分離基于Blin和Stafford的方案(Nucl.Ac.Res.，1976，3.2303)，從無(wú)花果曲霉的菌絲體制備基因組DNA。用100％乙醇洗滌菌絲體，在真空干燥器中干燥，在液氮下磨碎成粉末。將粉末重懸于提取緩沖液(50mMTris-HClpH7.4，10mMMgCl2，50mMNaCl，1％SDS)，并在55℃溫育15min。加入苯酚/氯仿(1/1v/v)，將溶液在室溫在搖動(dòng)平臺(tái)上放置30min。以3,000rpm離心混合物15min。用苯酚/氯仿再次提取DNA相，然后用氯仿提取。在室溫加入0.1體積的3MNaAc和0.5體積的異丙醇，沉淀DNA。離心后，用70％乙醇洗滌沉淀，簡(jiǎn)短地干燥，并溶于TE-緩沖液(10mMTris-HClpH8.0，1mMEDTA)。為了去除殘余的RNA，加入100μg無(wú)DNA酶的RNA酶A，將溶液在37℃溫育30min。在50℃，向DNA溶液加入SDS至終濃度0.5％和預(yù)消化的蛋白酶K至終濃度50μg/ml1小時(shí)。用等體積的苯酚/氯仿提取一次，用氯仿提取一次。再次沉淀DNA，離心，用70％乙醇洗滌，并重新溶于TE-緩沖液。實(shí)施例4對(duì)基因組DNA的PCR擴(kuò)增基于氨基末端序列(SEQIDNO46)和內(nèi)部肽(1)的序列(SEQIDNO47)，合成了一組簡(jiǎn)并的寡核苷酸引物。NH2-末端序列(SEQIDNO46)AVVQFQLDLT正向PCR-引物(SEQIDNO37)5′GTIGTICAGTTTCAGYTIGATYTIAC3′內(nèi)部序列1(SEQIDNO47)SEDQAGDYTIR反向PCR-引物(SEQIDNO38)3′CTYCTRGTYCGICCICTGATGTGITA5′這兩種引物用于PCR擴(kuò)增。對(duì)100ng無(wú)花果曲霉DSM932的基因組DNA進(jìn)行PCR。將DNA懸浮于100μl耐熱緩沖液(50mMKCl，10mMTris-HClpH9.0，0.1％TritonX-100；PromegaCorporation，Madison，WI)，其中添加了0.2mMdNTP，3mMMgCl2，50pmol每種引物和1.5單位TaqDNA聚合酶(PromegaCorporation)。擴(kuò)增的溫度方案如下在95℃變性10min，TaqDNA聚合酶在80℃熱啟動(dòng)，降落2個(gè)循環(huán)，始于95℃30sec，和67℃2min。重復(fù)這一方案，逐漸下降至65、63和61℃代替67℃。最后的循環(huán)參數(shù)是95℃30sec，60℃30sec和72℃1min(35個(gè)循環(huán))。在Biometra″Trio-Thermoblock″循環(huán)變溫器(Biometra，G_ttingen，Germany)中進(jìn)行反應(yīng)。實(shí)施例5PCR產(chǎn)物的序列分析將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pUC18載體(Yanisch-Perron&al，1985，Gene，33103)。用SmaI(NewEnglandBiolabsInc.，Beverly，MA)消化該質(zhì)粒(在Qiagen柱(QiagenInc.，Chatsworth，CA)上純化)，產(chǎn)生平端。用苯酚/氯仿提取后，在37℃，用在50mMTris-HCl-0.1mMEDTA-緩沖液(pH8.5)中的小牛腸堿性磷酸酶(Boehringer)將平端去磷酸化30分鐘。通過(guò)1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過(guò)Geneclean方法(Bio101，LaJolla，CA)洗脫和純化去磷酸化的載體條帶。在Qiagen柱上初步純化PCR反應(yīng)混合物。在37℃，使用在Pfu-緩沖液(20mMTris-HClpH8.75，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％TritonX-100，0.1mg/ml牛血清白蛋白；Stratagene)中的Pfu-DNA-聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)和T4-DNA-聚合酶(Boehringer)，用0.2mMdNTP補(bǔ)充PCRDNA片段的末端45min。新的Qiagen純化后，使用在添加了6％聚乙二醇8,000和8mMMgCl2的激酶緩沖液(20mMTris-HClpH7.5，10mMMgCl2，10mMβ-巰基乙醇)中的T4-多核苷酸激酶(Amersham，Buckinghamshire，England)，在37℃，用0.2mMrATP磷酸化PCR片段的平端30min。經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，通過(guò)Geneclean方法洗脫和純化1,150bpDNA片段。使用在連接酶緩沖液(66mMTris-HClpH7.5，5mMMgCl2，1mMDTE，1mMATP；Boehringer)中的T4-DNA-連接酶(Boehringer)，在18℃，將洗脫的DNA片段連接進(jìn)pUC18載體16小時(shí)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株RR1ΔM15。遵循Birnboim方法(Birhboim&al，1979，Nucl.Ac.Res，71513)，將得到的菌落進(jìn)行DNA提取。通過(guò)EcoRI-HindIII消化和經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，分析DNA。遵循ABITaqDyeDeoxyTerminator循環(huán)測(cè)序方案(ABI，F(xiàn)osterCity，CA)，對(duì)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA(Qiagen純化的)測(cè)序。將樣品在自動(dòng)化的ABI373A測(cè)序系統(tǒng)(ABI)上運(yùn)行。將得到的DNA序列轉(zhuǎn)化成ASCII格式，并轉(zhuǎn)移到HIBIODNASIS軟件包(PharmaciaLKBBiotechnology，Uppsala，Sweden)進(jìn)行匯編。實(shí)施例6構(gòu)建無(wú)花果曲霉DSM932的基因組DNA文庫(kù)用限制酶AluI(7.5單位)部分地消化無(wú)花果曲霉DSM932的基因組DNA(5μg)15min。在37℃，用T4-DNA-聚合酶(1單位)和dNTP核苷酸(各自的終濃度為100μM)進(jìn)一步補(bǔ)齊所得到的DNA末端5min。然后用苯酚/氯仿提取部分消化物，并在0.7％瓊脂糖凝膠上按大小分級(jí)分離。通過(guò)離心過(guò)濾(Zhu&al，1985，Bio/Technology，91014；膜類(lèi)型GV，0.22μm，MilliporeIntertech，Bedford，MA)，從凝膠洗脫長(zhǎng)度為9,000至23,000bp的基因組DNA片段，用苯酚/氯仿提取，并通過(guò)乙醇沉淀濃縮。將SfiI銜接頭(5′-GTTGGCCTTTT)(SEQIDNO52)連接到DNA末端。在含有24單位T4DNA連接酶和250pmol磷酸化的SfiI銜接頭，體積為50μl的PEG緩沖液(25mMTris-HClpH7.5，5mMMgCl2，2.5％(w/v)PEG8,000，0.5mMDTT，0.4mMATP)中，在12℃，進(jìn)行連接反應(yīng)過(guò)夜。用苯酚/氯仿提取后，再次在0.7％瓊脂糖凝膠上純化和分離SfiI-SfiI基因組DNA片段。切出含有10至20kb長(zhǎng)度的片段的凝膠部分，膜洗脫，并通過(guò)乙醇沉淀濃縮。將這些片段(100ng)最終克隆進(jìn)SfiI-消化的YCp50SfiI-SfiI載體(源自攜帶EcoRI-HindIII片段的質(zhì)粒YCp50(Trash&al，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，824374)的大腸桿菌/釀酒酵母穿梭載體，其含有反向的側(cè)接2個(gè)SfiI位點(diǎn)的hIFNβ基因)。用8單位T4DNA連接酶(PharmaciaLKBBiotechnology，Uppsala，Sweden)，在12℃，在20μl體積中進(jìn)行連接4小時(shí)，用苯酚/氯仿進(jìn)一步提取，最后在新鮮制備的MC1061細(xì)胞中電穿孔。將細(xì)菌涂布到LB瓊脂糖上，以1,000個(gè)克隆的組，將得到的菌落刮離平板。文庫(kù)大小是約100,000個(gè)克隆，平均插入物大小是±16kb。實(shí)施例7通過(guò)菌落雜交篩選基因組DNA文庫(kù)通過(guò)EcoRI-HindIII消化、瓊脂糖凝膠電泳、通過(guò)Geneclean方法的洗脫和純化，從pUC18載體分離1,150bp片段。使用Feinberg和Vogelstein的方法(Anal.Biochem，1984，137.266)，用α32P-dCTP隨機(jī)地標(biāo)記片段。將75ng1,150bp片段煮沸10分鐘，立即在冰上冷卻。使用6單位克列諾聚合酶，dGTP、dATP和dTTP(各25μM)，六核苷酸混合物(來(lái)自Boehringer的RandomPrimedDNA標(biāo)記試劑盒)和45pmolα32P-dCTP(Amersham，Buckinghamshire，England)，在37℃，在60μl總體積中，進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)30分鐘。然后，使用膜濾器(型號(hào)VS，0.025mm；MilliporeIntertech，Bedford，MA)，在雙蒸水中透析反應(yīng)混合物90分鐘。將無(wú)花果曲霉DSM932的基因組DNA文庫(kù)的克隆組涂布到LB平板上，在37℃溫育過(guò)夜，每個(gè)平板產(chǎn)生2,000至6,000個(gè)菌落。將這些菌落進(jìn)行菌落轉(zhuǎn)移到尼龍膜(HybondN，Amersham)上，并紫外交聯(lián)(來(lái)自Stratagene的UVStratalinkerTM1800)，然后與放射性標(biāo)記的探針雜交。在62℃，在7％SDS-磷酸鹽緩沖液(1mMEDTA，0.5MNaHPO4pH7.2和7％SDS)中，進(jìn)行預(yù)雜交和雜交步驟，在62℃，在5％SDS-磷酸鹽緩沖液(1mMEDTA，40mMNaHPO4pH7.2，5％SDS)中進(jìn)行洗滌步驟。將濾器最后曝光于X-射線片。實(shí)施例8基因組DNA的亞克隆在冰上，在超聲處理緩沖液(1M氯化四甲基銨，2mMEDTA，50mMTris-HClpH7.6)中，超聲處理(VibraCellVC500；Sonics&Materials，Danbury，CT)篩選基因組DNA文庫(kù)后得到的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA(±10μg；Qiagen純化的)30秒(50％工作循環(huán))。用異丙醇沉淀后，使用在添加了1mMdNTP的T4DNA聚合酶緩沖液(50mMTris-HClpH8.5，15mM(NH4)2SO4，7mMMgCl2，0.1mMEDTA，10mMβ-巰基乙醇；Boehringer)中的T4-和克列諾-DNA聚合酶(Boehringer)各5單位，在37℃使DNA平端化30min。通過(guò)在1％瓊脂糖凝膠上電泳，將片段按大小分級(jí)分離，使用Geneclean方法，洗脫和純化包含800至1,200bp的片段的凝膠部分的DNA。將平端化的片段導(dǎo)入pUC18的去磷酸化的SmaI位點(diǎn)。使用在平端緩沖液(25mMTris-HClpH7.5，5mMMgCl2，2.5％(w/v)PEG8,000，0.5mMDTT，0.4mMATP)中的T4DNA連接酶(PharmaciaLKBBiotechnology)，在23℃，進(jìn)行連接(載體/插入物的摩爾比是1/3)4小時(shí)。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌MC1061，建立2個(gè)亞克隆文庫(kù)。實(shí)施例9用于曲霉轉(zhuǎn)化的DNA制備通過(guò)基于Kahn&al.(Meth.Enzymol.，1979，68268)的“澄清裂解液”方法的改進(jìn)方案，分離質(zhì)粒，并通過(guò)在氯化銫-溴化乙錠梯度中平衡離心，進(jìn)行純化。以5,000rpm，在GSASorvall轉(zhuǎn)子中離心1升培養(yǎng)物(TB培養(yǎng)基)10分鐘。將沉淀重懸于15ml裂解緩沖液(25％蔗糖，50mMTris-HClpH8，20mMEDTA)，并加入0.6ml溶菌酶懸浮液(10mg溶菌酶/mlH2O；Boehringer)。在冰上溫育30min后，將15ml2％TritonX-100與懸浮液相混合，再在冰上溫育30min。然后，以20,000rpm，在SS34Sorvall轉(zhuǎn)子中離心懸浮液30分鐘。加入氯化銫(1.1g氯化銫/ml上清液)以及1500μl溴化乙錠(5mg/ml)。在25℃和55,000rpm，超速離心該懸浮液16小時(shí)。分離質(zhì)粒DNA條帶后，通過(guò)用1/1體積的異丁醇提取幾次(以10,000rpm離心10min)，去除剩余的溴化乙錠，用0.6體積的異丙醇進(jìn)一步沉淀DNA(幾次)，用70％乙醇洗滌，最后重懸于200μlH2O中。實(shí)施例10構(gòu)巢曲霉的轉(zhuǎn)化構(gòu)巢曲霉的轉(zhuǎn)化是基于Yelton等的方法(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1984，81.1470)，且包括，首先用水解酶(20mg/g菌絲體；SigmaChemical，St.Louis，MO)使菌絲體原生質(zhì)體化，其次使用聚乙二醇處理，進(jìn)行轉(zhuǎn)化本身。用1μgpSa123選擇質(zhì)粒的DNA和19μg目標(biāo)質(zhì)粒的DNA，轉(zhuǎn)化107個(gè)原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體涂布到包含在頂層瓊脂(與平板的組成相同，但是含有0.8％瓊脂)中的曲霉基本培養(yǎng)基平板[含有1.2M山梨醇，1.5％純凈瓊脂(DifcoLaboratories，Detroit，MI)和維生素H(1μg/ml)，但是不含精氨酸]上。在37℃溫育平板，直到出現(xiàn)形成孢子的菌落(±3天)。將這些轉(zhuǎn)化體的孢子在相同的選擇培養(yǎng)基上重劃線數(shù)次，以得到單個(gè)菌落。實(shí)施例11小規(guī)?；蚪MDNA制備將108個(gè)孢子接種到20ml添加了維生素H(1μg/ml)的曲霉基本培養(yǎng)基中，并在37℃和240rpm溫育過(guò)夜。使用基于Raeder和Broda的方法(Lett.Appl.Microbiol.，1985，1.17)的改進(jìn)方案，分離基因組DNA。使用折疊過(guò)濾器(Schleicher&Schuell，Dassel，Germany)，通過(guò)過(guò)濾收獲菌絲體，并用H2O、用0.5MEDTApH8、最后用100％乙醇洗滌。在真空下干燥菌絲體沉淀數(shù)小時(shí)，然后在液氮下磨成粉末。將100mg菌絲體重懸于500μl裂解緩沖液(200mMTris-HClpH8.5，250mMNaCl，25mMEDTA，0.5％SDS)，并用1體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25/24/1-v/v/v)提取2次，用氯仿/異戊醇(24/1-v/v)提取1次。用0.6體積的異丙醇沉淀DNA(加入0.1體積的3M醋酸鉀pH4.8后)，用70％乙醇洗滌，重懸于含有RNA酶A(50μg/ml；SigmaChemical)的H2O中。在37℃溫育30min后，將DNA貯存在-20℃。實(shí)施例12DNA印跡分析在37℃，在適當(dāng)?shù)腅coRI緩沖液(總體積的200μl)中，用120單位EcoRI(NewEnglandBiolabsInc.，Beverly，MA)過(guò)夜消化10μg曲霉基因組DNA。上0.8％瓊脂糖凝膠電泳，并用溴化乙錠染色。電泳后，將凝膠在0.25MHCl中溫育15min。使用Amersham的“堿印跡”方案，進(jìn)行DNA片段到HybondN+濾膜上的轉(zhuǎn)移。將濾膜與用α32P-dCTP標(biāo)記的上述1,150bpDNA片段雜交。在68℃，在7％SDS-磷酸鹽緩沖液(1mMEDTA，0.5MNaHPO4pH7.2和7％SDS)中，進(jìn)行預(yù)雜交和雜交步驟。在68℃，用5％SDS-磷酸鹽緩沖液(1mMEDTA，40mMNaHPO4pH7.2，5％SDS)洗滌濾膜2次，用1％SDS-磷酸鹽緩沖液(1mMEDTA，40mMNaHPO4pH7.2，1％SDS)洗滌1次，最后曝光于X-射線片。實(shí)施例13酶測(cè)定使用N，N-二甲基-對(duì)苯二胺作為底物，在微量滴定平板中進(jìn)行酶測(cè)定。將100μl底物溶液(0.4mgN，N-二甲基-對(duì)苯二胺/ml40mM醋酸鈉pH5.3)加入25μl適當(dāng)稀釋度的樣品，在室溫避光溫育。在550nm測(cè)量光密度。將活性任意地表達(dá)為ΔAbs/sec。關(guān)于茶顏色改變研究，用2，2′-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS-Sigma-AldrichChemie，Germany)作為底物，測(cè)定漆酶活性。氧化后，在415nm，用光度計(jì)測(cè)量它的綠藍(lán)顏色。使用在100mM檸檬酸鹽緩沖液pH4中的75μl1.66mMABTS，其與25μl上清液相混合，并在50℃溫育10min，在微量滴定平板中進(jìn)行酶測(cè)定。1漆酶單位(LACU)是在這些條件下，每分鐘催化1μmolABTS轉(zhuǎn)化的酶量。實(shí)施例14用PNGaseF去糖基化向濃縮的蛋白懸浮液(終體積90μl)中，加入10μl變性緩沖液(5％SDS，10％β-巰基乙醇)，并在100℃煮沸混合物10min。加入12μlNP40(10％)和12μl0.5M磷酸鈉pH7.5后，將樣品分成2等分試樣。將3000單位PNGaseF(肽N-糖苷酶F；NewEnglandBiolabsInc.)加入第一份樣品。另一份用作陰性對(duì)照。在37℃溫育過(guò)夜。加入2xLaemmli緩沖液(Nature，227680(1970))并煮沸5min后，將樣品上樣于12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過(guò)考馬斯藍(lán)染色，觀察蛋白條帶。實(shí)施例15用構(gòu)巢曲霉的gpdA啟動(dòng)子調(diào)換無(wú)花果曲霉DSM932氧化酶基因啟動(dòng)子通過(guò)BamHI-SspI消化，從YCp50SfiI/SfiI載體分離編碼氧化酶蛋白的基因，并連接到以下述方式制備的質(zhì)粒pMa58(Stanssens&al，1989，Nucl.Ac.Res.，174411)用HindIII消化pMa58質(zhì)粒，通過(guò)T4DNA聚合酶用dNTP補(bǔ)齊粘性末端，并用BamHI和PvuI進(jìn)一步消化。得到的質(zhì)粒稱作pMa58Afic。然后，基于Deng和Nickoloff的方法(Anal.Biochem，20081(1992)；ClontechInc.，CA，USA的TransformerTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?，通過(guò)定點(diǎn)誘變，在氧化酶基因的ATG密碼子的位置創(chuàng)建BspHI位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pMac58Aficm。通過(guò)XbaI對(duì)pMac58Aficm的消化，然后通過(guò)T4DNA聚合酶用dNTP使粘性末端變成平端，和BspHI消化，分離氧化酶基因并連接進(jìn)pFGPDGLAT2載體。pFGPDLAT2質(zhì)粒含有構(gòu)巢曲霉的甘油醛-3-P脫氫酶啟動(dòng)子，其允許位于它下游的基因的強(qiáng)組成型轉(zhuǎn)錄(Punt&al，1990，Gene，93.101；Punt&al，1991，J.Biotechnol.17.19)。首先用HindIII消化pFGPDGLAT2，用T4DNA聚合酶處理，最后用NcoI消化。然后，將pMac58Aficm的BspHI-XbaI片段連接到該載體以生成質(zhì)粒pFGPDAfic。實(shí)施例16曲霉轉(zhuǎn)化體的PCR分析如所述，從轉(zhuǎn)化體分離基因組DNA。用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸如下5′GAAGTGGAAAGGCTGGTGTGC(SEQIDNO51)，其對(duì)應(yīng)于gpdA啟動(dòng)子的部分序列，和5′CAACCCAGGTACCGTACTCC(SEQIDNO39)，其對(duì)應(yīng)于氧化酶基因的部分序列。將50ng基因組DNA懸浮于50μl耐熱緩沖液(50mMKCl，10mMTris-HClpH9.0，0.1％TritonX-100；PromegaCorporation)，后者中添加了0.2mMdNTP，3mMMgCl2，25pmol每種引物和1.5單位TaqDNA聚合酶(PromegaCorporation)。擴(kuò)增的溫度方案如下在95℃變性10min后，將80℃熱啟動(dòng)用于TaqDNA聚合酶。進(jìn)行30個(gè)循環(huán)[95℃30sec，65℃30sec，72℃2min]。在Biometra″Trio-Thermoblock″循環(huán)變溫器(Biometra)中進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)在0.8％瓊脂糖凝膠上的電泳，分析PCR產(chǎn)物。實(shí)施例17從無(wú)花果曲霉DSM932純化具有氧化酶活性的酶1.脫鹽的無(wú)細(xì)胞的上清液的獲得如實(shí)施例2所述，將101無(wú)花果曲霉DSM932菌株發(fā)酵68小時(shí)。通過(guò)離心，將培養(yǎng)上清液與菌絲體分離。使它通過(guò)在10mMTris-HCl，pH7.0緩沖液(緩沖液A)中平衡的6升SephadexG-25柱(AmershamBiosciences)而脫鹽。使用相同的緩沖液從柱中洗脫蛋白。含有氧化酶的樣品的終體積是25升。2.在DEAEMacroPrep上的色譜將步驟1的樣品應(yīng)用到用緩沖液A平衡的11DEAEMacroPrep(Bio-Rad)柱上。流速是145ml/min。用相同的緩沖液洗滌后，通過(guò)逐步增加緩沖液A中的NaCl濃度，洗脫結(jié)合的蛋白，得到下述級(jí)分用1.51緩沖液A+50mMNaCl洗脫的級(jí)分1，用1.51緩沖液+60mMNaCl洗脫的級(jí)分2，用1.51緩沖液A+110mMNaCl洗脫的級(jí)分3，用1.51緩沖液1+200mMNaCl洗脫的級(jí)分4，和用1.81緩沖液A+500mMNaCl洗脫的級(jí)分5。在級(jí)分5中檢測(cè)到氧化酶活性。3.在S-Sepharose上的色譜將200ml來(lái)自步驟2的級(jí)分5的緩沖液交換成緩沖液B(15mM醋酸銨，pH4.0)，這是通過(guò)使其通過(guò)在相同緩沖液中平衡的SepharoseG-25(AmershamBiosciences)柱實(shí)現(xiàn)的。將260mlG-25柱洗脫液應(yīng)用到在緩沖液B中平衡的20mlHiloadS-SepharoseHP16/10柱(AmershamBiosciences)上。用緩沖液B洗滌后，用在緩沖液B中的NaCl線性梯度(250ml從0至250mMNaCl，以5ml/min)洗脫蛋白。收集5ml級(jí)分，并測(cè)試氧化酶活性。合并活性級(jí)分(10ml)，用CentriprepYM-30離心式過(guò)濾器單元(Millipore)濃縮。將緩沖液交換成緩沖液C(50mMMES-用NaOH調(diào)成pH5.5)。終體積是400μl。4.在ResourceQ上的色譜將來(lái)自步驟3的200μl應(yīng)用到在緩沖液C中平衡的1mlResourceQ柱(AmershamBiosciences)上。用緩沖液C洗滌后，用在緩沖液C中的NaCl線性梯度(15ml從0至175mMNaCl，以1ml/min)洗脫蛋白。5.在TSKG3000SW和TSKG2000SW上的色譜通過(guò)在CentriprepYM-30離心式過(guò)濾器單元(Millipore)上離心至400μl，濃縮來(lái)自步驟4的具有氧化酶活性的級(jí)分(3.5ml)。此后，將100μl應(yīng)用到連續(xù)設(shè)置的且在緩沖液D(20磷酸鈉，200mMNaCl，pH6.5)中平衡的TSKG3000SW和TSKG2000SW柱(Tosohaas)上。以0.5ml/min，用緩沖液D洗脫蛋白。合并活性級(jí)分(1.5ml)。使用MicroconYM-10離心式過(guò)濾器單元，將1ml脫鹽，并濃縮至200μl的體積。6.SDS-PAGE電泳將來(lái)自步驟5的純化的樣品上樣到10-15％SDS聚丙烯酰胺凝膠(PhastGelGradient-10-15；AmershamBiosciences)上，并根據(jù)生產(chǎn)商的推薦跑膠。使用PhastGe1Silver染色試劑盒(AmershamBiosciences)將一半凝膠染色，將另一半進(jìn)行酶譜分析。為此目的，在室溫，在N，N-二甲基-對(duì)苯二胺溶液(SigmaChemicals；0.4mg/ml40mM醋酸鈉pH5.3)中溫育凝膠。具有氧化酶活性的蛋白表現(xiàn)為黑色。該分析的結(jié)果表現(xiàn)在圖1中。它表明，具有氧化酶活性的酶是純的，且它表現(xiàn)出氧化酶活性。純化的氧化酶的表觀分子量是約90kDa。實(shí)施例18確定具有漆酶活性的酶的氨基酸序列按照一般方法，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并在PVDFImmobilon-P膜(Millipore)上電印跡后，進(jìn)行蛋白的N-末端測(cè)序。使用與HPLC120A分析儀(AppliedBiosystem)相偶聯(lián)的自動(dòng)化477A蛋白測(cè)序儀。為了確定內(nèi)部片段的序列，首先用胰蛋白酶在膜上消化蛋白。通過(guò)HPLC上的反相色譜，分離所得到的肽，并如上進(jìn)行N-末端測(cè)序。已經(jīng)得到了下面的序列-N-末端AVVQFQLDLTYEDVSVAGXVXKAIVLNGXI(SEQIDNO48)-內(nèi)部肽1SEDQAGDYTIR(SEQIDNO47)-內(nèi)部肽2ASQYXSYIYHSHTR(SEQIDNO50)實(shí)施例19從無(wú)花果曲霉DSM932克隆氧化酶編碼基因從無(wú)花果曲霉DSM932部分克隆氧化酶基因基于已知的由氧化酶基因編碼的部分蛋白序列，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來(lái)分離DNA片段，其然后用作篩選無(wú)花果曲霉DSM932的基因組DNA文庫(kù)的探針。基于純化的蛋白的氨基-末端序列和內(nèi)部肽的序列，合成一組簡(jiǎn)并的引物(寡核苷酸)。這些核苷酸引物是-正向PCR-引物5′GTIGTICAGTTTCAGYTIGATYTIAC3′(SEQIDNO37)；-反向PCR-引物3′CTYCTRGTYCGICCICTGATGTGITA5′(SEQIDNO38)。這2種引物用于在無(wú)花果曲霉DSM932的基因組DNA上進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。通過(guò)1.3％瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行溴化乙錠染色，直接分析PCR反應(yīng)混合物。產(chǎn)生±550和700bp的2個(gè)弱DNA條帶和1,150bp的1個(gè)強(qiáng)DNA條帶。核苷酸序列分析揭示了1,150bpPCR產(chǎn)物和純化的具有氧化酶活性的酶之間的關(guān)系。為此，將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)如實(shí)施例5所述的pUC18載體。用“通用的”正向和反向寡核苷酸引物(與載體的插入物側(cè)翼區(qū)相容)進(jìn)行測(cè)序，導(dǎo)致插入物兩側(cè)約400個(gè)核苷酸的序列確定。將這些核苷酸序列翻譯成肽序列。這些肽序列包括與實(shí)施例18中確定的氨基末端序列的一部分(氨基酸11至28，SEQIDNO48)相對(duì)應(yīng)的序列YEDVSVAGKVXXAIVLNG(SEQIDNO49)，和與實(shí)施例18所述的內(nèi)部肽2的序列相對(duì)應(yīng)的序列ASQYXSYIYHSHTR(SEQIDNO50)?？寺o(wú)花果曲霉DSM932的整個(gè)氧化酶編碼基因使用PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)了含有具有氧化酶基因的質(zhì)粒的基因組DNA文庫(kù)的克隆組。對(duì)通過(guò)Birnboim方法從文庫(kù)的20個(gè)庫(kù)集(pool)(每個(gè)庫(kù)集約1,000個(gè)克隆)提取的質(zhì)粒DNA(80ng)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過(guò)1.2％瓊脂糖凝膠電泳，分析得到的PCR產(chǎn)物。6組克隆產(chǎn)生了預(yù)期大小1,150bp的PCR產(chǎn)物，該長(zhǎng)度與從對(duì)無(wú)花果曲霉DSM932的基因組DNA進(jìn)行的原始PCR擴(kuò)增得到的長(zhǎng)度相同。使用放射性標(biāo)記的1,150bpDNA片段作為探針，通過(guò)菌落雜交，進(jìn)一步篩選這些陽(yáng)性庫(kù)集中的3個(gè)。放射自顯影檢測(cè)后，得到5個(gè)陽(yáng)性信號(hào)。通過(guò)新一個(gè)循環(huán)的菌落雜交，并通過(guò)從純化的質(zhì)粒PCR擴(kuò)增該1150bp片段，進(jìn)一步純化陽(yáng)性克隆。這最終導(dǎo)致2個(gè)單獨(dú)的陽(yáng)性克隆的分離。通過(guò)SfiI消化，導(dǎo)致從YCp50載體釋放基因組插入物，分析陽(yáng)性克隆的DNA。在0.8％瓊脂糖凝膠上電泳后，一個(gè)克隆表現(xiàn)出長(zhǎng)度為11,000bp的基因組插入物，另一個(gè)表現(xiàn)出超過(guò)12,000bp的插入物。2個(gè)插入物都含有內(nèi)部SfiI切割位點(diǎn)。具有12,000bp插入物的質(zhì)粒稱作pAFLAC，且已經(jīng)作為大腸桿菌MC1061轉(zhuǎn)化體保藏在LMBP中心，參考號(hào)為L(zhǎng)MBP4366。BELDEMS.A.，其注冊(cè)營(yíng)業(yè)地在B-5300Andenne(Belgium)RueBourrie，12，已經(jīng)于2001年5月11日(undertheexpertsolution)將根據(jù)本發(fā)明的微生物大腸桿菌MC1061(pAFLAC)保藏在BCCM/LMBP培養(yǎng)物保藏中心(LaboratoriumvoorMoleculaireBiologie，UniversiteitGent，F(xiàn)iers-Schell-VanMontagu′building，Technologiepark927，B-9052Gent-Zwijnaarde，Belgium)。該保藏已經(jīng)收到登錄號(hào)LMBP4366。無(wú)花果曲霉DSM932氧化酶基因的序列分析剪切來(lái)自pAFLAC的基因組DNA插入物，并亞克隆進(jìn)pUC18質(zhì)粒載體。將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌MC1061，得到2個(gè)亞克隆文庫(kù)。使用放射性標(biāo)記的1,150bpPCR片段作為探針進(jìn)行菌落雜交后，選擇含有部分目標(biāo)基因的亞克隆。將12個(gè)陽(yáng)性亞克隆的純化(Qiagen)的質(zhì)粒DNA進(jìn)一步測(cè)序，并分析得到的DNA序列。該隨機(jī)測(cè)序得到該基因的前1,100bp以及啟動(dòng)子區(qū)域的500bp的核苷酸序列。為了得到整個(gè)基因序列，進(jìn)行引物步移，以對(duì)基因的3′末端測(cè)序。使用定制引物，分辨剩余的模糊處。2個(gè)陽(yáng)性基因組克隆中僅一個(gè)(具有超過(guò)12,000bp的基因組DNA插入物的那個(gè))看起來(lái)含有整個(gè)基因。圖3顯示了核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(SEQIDNO1和SEQIDNO40)。該基因是1,923個(gè)堿基對(duì)。它含有分別為85個(gè)(始于堿基對(duì)245)和49個(gè)(始于堿基對(duì)808)堿基對(duì)的2個(gè)內(nèi)含子，并編碼計(jì)算分子量為65,476Da的596個(gè)氨基酸的可讀框。使用BLAST程序(BasicLocalAlignmentSearchTool；Altschul&al，1990，J.Mol.Biol.，215，p.403)，進(jìn)行對(duì)得到的序列和數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列之間的相似性的搜索。最接近的同源基因產(chǎn)物是來(lái)自構(gòu)巢曲霉FGSCA4的一種假定蛋白(AN0878.2-登錄號(hào)EAA65907)。使用默認(rèn)參數(shù)用Clustalw程序分析(http://www.ebi.ac.uk.clustalw)發(fā)現(xiàn)，總體同源性是56.7％。實(shí)施例20氧化酶基因的異源表達(dá)選擇對(duì)維生素H和精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的真菌菌株構(gòu)巢曲霉2024作為表達(dá)分離的無(wú)花果曲霉氧化酶基因的宿主菌株。進(jìn)行陽(yáng)性克隆(具有超過(guò)12,000bp的基因組DNA插入物的YCp50載體)與含有argB-基因的選擇質(zhì)粒pSa123(John&al，1984，EnzymeMicrobiol.Technol.，6.386)的共轉(zhuǎn)化。使用PCR擴(kuò)增和DNA印跡分析，檢查得到的轉(zhuǎn)化體(在沒(méi)有精氨酸的平板上得到)是否也整合了陽(yáng)性克隆。從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物，分離基因組DNA。對(duì)該基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。分別使用無(wú)花果曲霉DSM932的DNA和未轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉2024的DNA作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。通過(guò)在1.2％瓊脂糖凝膠上電泳，用溴化乙錠染色，分析PCR產(chǎn)物。用無(wú)花果曲霉DSM932的DNA或來(lái)自有些轉(zhuǎn)化體的DNA進(jìn)行的PCR反應(yīng)，如預(yù)期的那樣產(chǎn)生了1,150bpDNA片段，指示著無(wú)花果曲霉基因整合在這些轉(zhuǎn)化體的基因組中。對(duì)未轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉的PCR反應(yīng)沒(méi)有產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)。DNA印跡分析證實(shí)了這些結(jié)果。共轉(zhuǎn)化體在印跡上表現(xiàn)出一個(gè)或多個(gè)信號(hào)，指示著一個(gè)或多個(gè)整合的無(wú)花果曲霉基因拷貝。得到了60％的共轉(zhuǎn)化效率。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體觀察到的另一個(gè)現(xiàn)象是孢子顏色的變化。未轉(zhuǎn)化的和pSa123-轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉菌落表現(xiàn)出墨綠色孢子，而整合了氧化酶基因的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生黃色孢子。對(duì)構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體的分析檢查轉(zhuǎn)化體是否建立了整合的無(wú)花果曲霉基因的表達(dá)，和合成的蛋白是否有酶活性。轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)在曲霉基本培養(yǎng)基中。使用無(wú)花果曲霉作為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化的和pSa123-轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉作為陰性對(duì)照。通過(guò)在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，分析分泌在培養(yǎng)基中的蛋白。通過(guò)脫氧膽酸鹽-三氯醋酸沉淀，預(yù)先濃縮培養(yǎng)基樣品。在凝膠上用考馬斯藍(lán)對(duì)蛋白染色。非常大的85kDa蛋白條帶(其大小與無(wú)花果曲霉氧化酶的大小接近)僅僅出現(xiàn)在構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體的樣品中。構(gòu)巢曲霉分泌的蛋白比無(wú)花果曲霉分泌的蛋白小約5kDa。這是由于糖基化模式的差異，如下所示。這些結(jié)果表明，分離的無(wú)花果曲霉氧化酶基因在構(gòu)巢曲霉中在它自己的啟動(dòng)子控制下表達(dá)。更令人驚奇地，構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)水平甚至高于在野生型無(wú)花果曲霉DSM932菌株中的水平。進(jìn)行酶譜來(lái)研究表達(dá)的蛋白的酶活性。濃縮培養(yǎng)基中的蛋白，并在半變性條件下(沒(méi)有β-巰基乙醇；在上樣前不煮沸樣品)上樣到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。電泳后，在N，N-二甲基-對(duì)苯二胺底物溶液中溫育凝膠。觀察到的無(wú)花果曲霉DSM932的蛋白條帶和構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體的蛋白條帶首先為粉紅色，在更長(zhǎng)的溫育時(shí)間后變成黑色，證實(shí)該蛋白能氧化底物，且有酶活性。在用相同底物N，N-二甲基-對(duì)苯二胺進(jìn)行的氧化測(cè)定中，在溶液中也得到了相同的結(jié)果。未轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉的培養(yǎng)基完全沒(méi)有表現(xiàn)出活性。上面得到的結(jié)果證實(shí)，構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體中整合的無(wú)花果曲霉基因編碼有酶活性的氧化酶。有些轉(zhuǎn)化體由于更高的基因表達(dá)，表現(xiàn)出比原始無(wú)花果曲霉菌株更高的活性。實(shí)施例21具有氧化酶活性的酶的糖基化無(wú)花果曲霉DSM932和一種構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)在曲霉基本培養(yǎng)基中。濃縮培養(yǎng)基中的分泌蛋白，進(jìn)一步進(jìn)行PNGaseF處理。然后，將去糖基化的樣品上樣到聚丙烯酰胺凝膠上，并進(jìn)行考馬斯藍(lán)染色。可看到清楚的蛋白帶型移位。用PNGaseF去糖基化，將2種氧化酶的分子量降低至約70kDa。該實(shí)驗(yàn)顯示，觀察到的無(wú)花果曲霉和構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體的非去糖基化氧化酶的5kDa大小差異，確實(shí)是由于糖基化的差異，因?yàn)槿ヌ腔a(chǎn)生相同大小的蛋白。實(shí)施例22在gpdA啟動(dòng)子控制下在多種不同曲霉物種中表達(dá)具有氧化酶活性的酶將分離的無(wú)花果曲霉氧化酶基因的啟動(dòng)子替換為構(gòu)巢曲霉的組成型gpdA(甘油醛-3-磷酸脫氫酶A)啟動(dòng)子，已知后者為強(qiáng)真菌啟動(dòng)子(Deng&al，1992，Anal.Biochem.，200p.81)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)構(gòu)巢曲霉2024，黑曲霉N402和無(wú)花果曲霉DSM932。轉(zhuǎn)化方法是基于與pSa123(精氨酸選擇)的共轉(zhuǎn)化。為了轉(zhuǎn)化黑曲霉和無(wú)花果曲霉，使用了另一種基于乙酰胺酶編碼基因的選擇方法(Kelly&al，1985，EMBOJ.，4475)。在這些情況中，使用含有構(gòu)巢曲霉的amdS基因(編碼乙酰胺酶)的質(zhì)粒p3SR2進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生可以以乙酰胺作為唯一氮源生長(zhǎng)的菌落。使用一組2種引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，分析得到的轉(zhuǎn)化體(對(duì)于構(gòu)巢曲霉是146個(gè)，黑曲霉是89個(gè)，且無(wú)花果曲霉是326個(gè))。上游引物與gpdA啟動(dòng)子中的序列雜交，下游引物與氧化酶基因中的序列雜交。在有些轉(zhuǎn)化體的PCR混合物中，檢測(cè)到2281bp的DNA條帶(與gpdA啟動(dòng)子和氧化酶基因的序列中的寡核苷酸引物序列之間的預(yù)期大小相對(duì)應(yīng))。這證實(shí)了，這些轉(zhuǎn)化體被共轉(zhuǎn)化，且從而不但整合了選擇質(zhì)粒，而且還整合了質(zhì)粒pFGPDAfic。黑曲霉和無(wú)花果曲霉的這些共轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出相同的孢子顏色變化，如上面關(guān)于構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體所提到的(灰色至淺棕色孢子，而不是黑色-實(shí)施例4)。通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和用底物N，N-二甲基-對(duì)苯二胺進(jìn)行的酶測(cè)定，進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體在曲霉基本培養(yǎng)基(5ml，在50ml塑料管中)中生長(zhǎng)3天，將培養(yǎng)上清液進(jìn)行酶測(cè)定和電泳。最好的構(gòu)巢曲霉轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出比用原始氧化酶啟動(dòng)子在構(gòu)巢曲霉中得到的表達(dá)高5.5倍的表達(dá)水平。該觀察結(jié)果顯示，啟動(dòng)子交換導(dǎo)致構(gòu)巢曲霉中氧化酶的更高的表達(dá)水平。與由它自己的啟動(dòng)子控制的氧化酶轉(zhuǎn)化的構(gòu)巢曲霉相比，最好的無(wú)花果曲霉轉(zhuǎn)化體也表現(xiàn)出4倍增加。黑曲霉轉(zhuǎn)化體分泌出大約相同的量。實(shí)施例23氧化酶的表征氧化酶樣品的獲得選擇在實(shí)施例22中得到的一種無(wú)花果曲霉轉(zhuǎn)化體用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。如實(shí)施例2所述，進(jìn)行101發(fā)酵。以與實(shí)施例17所述相同的條件，將發(fā)酵上清液脫鹽，并通過(guò)超濾濃縮。2.最適pH的確定使用磷酸鈉-檸檬酸鹽緩沖液，通過(guò)測(cè)定氧化酶在不同pH的活性，確定它的最適pH。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。最適pH在pH5.5附近。實(shí)施例24漆酶引起的茶顏色改變通過(guò)將商品茶(PickwickGreenTea，DouweEgbertsN.V.，Belgium)在溫水(1g/100ml)中預(yù)溫育15min，制備30ml綠茶溶液，在40℃，將其與不同量的無(wú)花果曲霉氧化酶(0，1和10U/ml綠茶)攪拌。1小時(shí)后，與氧化酶一起溫育的茶溶液變成紅褐色，在350至680nm記錄它們的吸收光譜，并與沒(méi)有酶的對(duì)照品相比較。圖4中的結(jié)果清楚地表明，使用無(wú)花果曲霉的氧化酶，與未處理的樣品相比，增強(qiáng)茶溶液的顏色。實(shí)施例25氧化酶在烘烤中的作用進(jìn)行烘烤試驗(yàn)來(lái)證實(shí)本發(fā)明的氧化酶在烘烤中的積極作用。通過(guò)與不含有該酶的參照相比面包體積的增加，評(píng)價(jià)積極作用。在用100g面粉制備面團(tuán)的小烘烤實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)來(lái)自實(shí)施例23的氧化酶。所述方法已經(jīng)充分確立，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)容易地明白，使用其它方案或來(lái)自其它供應(yīng)商的裝置，可以得到相同的結(jié)果。下面的表1中列出了使用的成分表1在松下(National)混合器中，將成分混合3.5min。稱量150g面團(tuán)塊，在25℃在塑料盒中放置20min。重新揉和面團(tuán)，再放置20min。最后檢驗(yàn)(proofing)時(shí)間是在36℃60min。然后將面團(tuán)塊在220℃烘烤24min。使用常用的油菜籽置換方法，測(cè)量面包的體積。在下面的表2和圖5中，呈現(xiàn)了用氧化酶進(jìn)行的烘烤試驗(yàn)的結(jié)果。表2(*)酶測(cè)定見(jiàn)實(shí)施例13上面的結(jié)果表明，本發(fā)明的氧化酶對(duì)面包體積有積極作用。實(shí)施例26氧化酶對(duì)黑麥面粉面團(tuán)粘性的影響通過(guò)在30℃，在Farinograph混合器中混合下述成分2min，制備一系列的面團(tuán)。表3*基本面包改良劑RB14120含有α-淀粉酶，木聚糖酶，抗壞血酸和檸檬酸.混合后5分鐘，使用配備Chen-Hoseney面團(tuán)粘性cel的StableMicroSystemsTA-XT2i質(zhì)地分析器，測(cè)量面團(tuán)粘性。在表4和圖6中呈現(xiàn)了結(jié)果。表4從這些數(shù)據(jù)可以看出，通過(guò)添加根據(jù)本發(fā)明的氧化酶，顯著降低了面團(tuán)粘性。實(shí)施例27氧化酶對(duì)黑麥面粉面團(tuán)稠度的影響制備與實(shí)施例10所述相同的面團(tuán)。使用PhysicaUDS200流變儀，以下述參數(shù)，測(cè)量面團(tuán)稠度●振動(dòng)模式●溫度＝30℃●板-板系統(tǒng)_＝30mm，d＝2mm●掃頻γ＝0.02％、F從1線性增加至50Hz。在表5和圖7中呈現(xiàn)了在10Hz得到的結(jié)果。表5這些數(shù)據(jù)表明，通過(guò)添加本發(fā)明的氧化酶，顯著增加了面團(tuán)稠度。另外，面團(tuán)變得更硬，且允許對(duì)面團(tuán)更好的處理和成形。序列表<110>PURATOSN.V.<120>過(guò)量表達(dá)和純化的無(wú)花果曲霉氧化酶及其編碼核酸<130>BP.PURA.030B/WO<160>52<170>PatentInversion3.3<210>1<211>2487<212>DNA<213>無(wú)花果曲霉(Aspergillusficuum)<400>1taattgaagcttgcggtgagcaagacagtctgcaccctgctagaaatgttcgtatgccgg60taggccctgcatatgacggatccagtatcttggccatcggacggcattatgacaagccct120agtcatgaacctttcgctatacgtctcgggtcctccatcccttgccttgaccttcgggca180tcaatggcatcaggtcaatgtgcctcttgagttctgtcattataaaagcctcaaacttct240cgcaggatgaagggaactcaaccacgacaaaccagtccgcgactcggccctgttcgactg300tatatattctgtggaactaggtagttggttccttgtatatttctttatttggttttttga360gccccagcatgagtatatctcaaagcaggctggccctgttggccctttgcttcgtgcaat420gggtgtccggccgtgttgtgcagttcc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nIleLeuGlyAsrLeuThrLeuThrAspMetGlyCysLeuProPro210215220ThrProGlyValValGlyProTyrProTyrAspLeuSerLysIlePro225230235240LysGlyPheTyrGluGlyCysThrProSerGluGlyProThrGluVal245250255PheLysValAsnSerSerSerArgTyrAlaSerPheAspPheIleSer260265270MetAlaGlySerThrSerLeuValPheSerIleAspGluHisProMet275280285TyrValTyrAlaValAspGlyArgTyrValGluProLeuLeuValGlu290295300AlaValThrValProValAlaSerArgTyrSerValMetValProLeu305310315320LysSerGluAspGlnAlaGlyAspTyrThrIleArgValAlaAsnAsn325330335TyrAlaAsnGlnLeuIleAsnGlyThrAlaValLeuSerTyrAspThr340345350AlaThrProLysGlnIleGlyThrSerGlnProTyrIleAsnGluAla355360365GlyAlaAsrAlaThrAlaSerThrValIleLeuAsnGluThrAspVal370375380IleProPheProValValAlaProAlaLysLysAlaAspArgThrTyr385390395400IleLeuAsnValGluAsrAlaAsnSerSerTyrThrTrpThrLeuGly405410415AsnGlnTyrProValSerAsnGluGluLeuArgProProValLeuPhe420425430AsnLeuSerSerIleSerGlnAlaTyrSerAlaMetThrGluTyrGly435440445ThrTrpValAspLeuIleIleAsnIleThrThrSerGlyGlnProGln450455460HisProIleHisLysHisSerAsnLysTyrPheValIleGlyThrGly465470475480AsnGlnProPheIleTrpSerSerValGluGluAlaMetLysAspIle485490495ProGluAsnPheAsnPheGluAsnProGlnMetArgAspThrPheTyr500505510SerProSerSerSerThrGlyProSerTrpLeuAlaMetArgTyrHis515520525IleValAsnProGlyProPheLeuLeuHisCysHisLeuGlnMetHis530535540HisValGlyGlyLeuAlaLeuAlaLeuLeuAspGlyValAspAlaTrp545550555560ProThrAspIleProGluGlyTyrArgLeuProValMetProIle565570575<210>42<211>21<212>PRT<213>無(wú)花果曲霉<400>42MetSerIleSerGlnSerArgLeuAlaLeuLeuAlaLeuCysPheVal151015GlnTrpValSerGly20<210>43<211>81<212>PRT<213>無(wú)花果曲霉<400>43MetSerIleSerGlnSerArgLeuAlaLeuLeuAlaLeuCysPheVal151015GlnTrpValSerGlyArgValValGlnPheGlnLeuAspLeuThrTyr202530GluAspValSerValAlaGlyAspValHisLysAlaIleValSerAsn354045GlyGlnIleProGlyProThrLeuTrpLeuLysGlnGlyAspAspVal505560GluPheLeuValAsnAsnSerMetSerIleAsnThrThrValHisPhe65707580His<210>44<211>160<212>PRT<213>無(wú)花果曲霉<400>44GlyIleGluGlnLeuGlyThrProTrpSerAspGlyValProGlyLeu151015SerGlnGluGlnIleLysProGlyGluGlnPheLeuTyrLysTrpLys202530AlaSerGlnTyrGlySerTyrIleTyrHisSerHisThrArgAlaGln354045IleAspAspGlyLeuTyrGlyAlaIleTyrIleGluProAlaAspSer505560ValGluArgProPheHisLeuIleAlaGlySerAspAlaAspGluGln65707580GlnAlaMetLeuAlaAlaGluLysAsnThrArgProValLeuIleSer859095AspTrpArgAlaPheSerSerHisAspIleLeuGlnIleGlnThrGlu100105110SerGlyValGluAlaTyrCysAlaAsnSerValLeuIleAsnGlyLys115120125GlySerValIleCysProSerGlnGluHisIleAsnAlaAlaThrThr130135140ProGlnGlnLysGlnIleLeuGlyAsnLeuThrLeuThrAspMetGly145150155160<210>45<211>355<212>PRT<213>無(wú)花果曲霉<400>45CysLeuProProThrProGlyValValGlyProTyrProTyrAspLeu151015SerLysIleProLysGlyPheTyrGluGlyCysThrProSerGluGly202530ProThrGluValPheLysValAsnSerSerSerArgTyrAlaSerPhe354045AspPheIleSerMetAlaGlySerThrSerLeuValPheSerIleAsp505560GluHisProMetTyrValTyrAlaValAspGlyArgTyrValGluPro65707580LeuLeuValGluAlaValThrValProValAlaSerArgTyrSerVal809095MetValProLeuLysSerGluAspGlnAlaGlyAspTyrThrIleArg100105110ValAlaAsnAsnTyrAlaAsnGlnLeuIleAsnGlyThrAlaValLeu115120125SerTyrAspThrAlaThrProLysGlnIleGlyThrSerGlnProTyr130135140IleAsnGluAlaGlyAlaAsnAlaThrAlaSerThrValIleLeuAsn145150155160GluThrAspValIleProPheProValValAlaProAlaLysLysAla165170175AspArgThrTyrIleLeuAsnValGluAsnAlaAsnSerSerTyrThr180185190TrpThrLeuGlyAsnGlnTyrProValserAsnGluGluLeuArgPro195200205ProValLeuPheAsnLeuSerSerIleSerGlnAlaTyrSerAlaMet210215220ThrGluTyrGlyThrTrpValAspLeuIleIleAsnIleThrThrSer225230235240GlyGlnProGlnHisProIleHisLysHisSerAsnLysTyrPheVal245250255IleGlyThrGlyAsnGlnProPheIleTrpSerSerValGluGluAla260265270MetLysAspIleProGluAsnPheAsnPheGluAsnProGlnMetArg275280285AspThrPheTyrSerProSerSerSerThrGlyProSerTrpLeuAla290295300MetArgTyrHisIleValAsnProGlyProPheLeuLeuHisCysHis305310315LeuGlnMetHisHisValGlyGlyLeuAlaLeuAlaLeuLeuAspGly325330335ValAspAlaTrpProThrAspIleProGluGlyTyrArgLeuProVal340345350MetProIle355<210>46<211>10<212>PRT<213>曲霉屬<400>46AlaValValGlnPheGlnLeuAspLeuThr1510<210>47<211>11<212>PRT<213>曲霉屬<400>47SerGluAspGlnAlaGlyAspTyrThrIleArg1510<210>48<211>30<212>PRT<213>曲霉屬<220><221>misc_feature<222>(19)..(19)<223>Xaa可為任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>Xaa可為任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(29)..(29)<223>Xaa可為任何天然存在的氨基酸<400>48AlaValValGlnPheGlnLeuAspLeuThrTyrGluAspValSerVal151015AlaGlyXaaValXaaLysAlaIleValLeuAsnGlyXaaIle202530<210>49<211>18<212>PRT<213>曲霉屬<220><221>misc_feature<222>(11)..(12)<223>Xaa可為任何天然存在的氨基酸<400>49TyrGluAspValSerValAlaGlyLysValXaaXaaAlaIleValLeu151015AsnGly<210>50<211>14<212>PRT<213>曲霉屬<220><221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa可為任何天然存在的氨基酸<400>50AlaSerGlnTyrXaaSerTyrIleTyrHisSerHisThrArg1510<210>51<211>21<212>DNA<213>構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)<400>51gaagtggaaaggctggtgtgc21<210>52<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>sfiI銜接序列<400>52gttggcctttt1權(quán)利要求1.分離的氧化酶多肽，其包含-SEQIDNO40至50中任一的氨基酸序列，或-SEQIDNO40、41或45的至少100個(gè)氨基酸的片段，或-呈現(xiàn)與SEQID40、41或45中任一的氨基酸序列至少60％同一性的氨基酸序列，或-呈現(xiàn)與SEQID40、41或45的至少100個(gè)氨基酸的任何片段至少70％同一性的氨基酸序列。2.分離的核酸分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽。3.分離的核酸分子，其包含-SEQIDNO1至36中任一的核苷酸序列，其互補(bǔ)形式或RNA形式，或-與SEQIDNO1至36中任一、或與其互補(bǔ)形式或RNA形式具有至少70％同一性的核苷酸序列，或-SEQIDNO1至11中任一的至少600個(gè)核苷酸的片段，或它們的互補(bǔ)形式或RNA形式中任一的片段，其中所述片段編碼具有氧化酶活性的蛋白，或-SEQIDNO1至36中任一的至少20個(gè)核苷酸的片段，或它們的互補(bǔ)形式或RNA形式中任一的片段。4.根據(jù)權(quán)利要求3的分離的核酸分子，其中所述SEQIDNO1至11中任一或它們的互補(bǔ)形式或RNA形式中任一的編碼具有氧化酶活性的蛋白的片段，由至少900個(gè)核苷酸組成。5.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)的核酸分子。6.根據(jù)權(quán)利要求5的載體，其中所述根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)的核酸分子有效地連接到一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列上。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的載體，其中所述調(diào)節(jié)序列是構(gòu)巢曲霉的gpdA啟動(dòng)子。8.經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其摻入了根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)的核酸分子。9.經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)權(quán)利要求5至7中的任一項(xiàng)的載體。10.融合蛋白，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的氧化酶多肽。11.面包改良組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的氧化酶多肽。12.根據(jù)權(quán)利要求1的氧化酶多肽在烘烤過(guò)程中或作為增色劑的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及新的分離的核酸序列，其包含編碼新的真菌氧化酶的基因，和其核酸片段。還涉及從無(wú)花果曲霉分離和純化的所述新的真菌氧化酶，它的氨基酸序列如SEQIDNO40或41所示，和其功能等同物或衍生物。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核酸分子的構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)本發(fā)明的氧化酶的方法。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的氧化酶在工業(yè)過(guò)程中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/53GK101084306SQ200580035327公開(kāi)日2007年12月5日申請(qǐng)日期2005年9月15日優(yōu)先權(quán)日2004年9月16日發(fā)明者F·阿爾瑙特,R·孔特雷拉斯,T·多弗林,G·萬(wàn)內(nèi)斯泰,J·維亞內(nèi),J·C·E·若里申請(qǐng)人:普瑞圖斯股份有限公司