專利名稱:具有dna聚合酶活性的多肽的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及用作基因工程的試劑的、具有高保真性DNA聚合酶活性的多肽、編碼該多肽的基因、生產該多肽的方法,以及使用該多肽擴增核酸的方法。
背景技術:
DNA聚合酶是可用于基因工程的試劑、并廣泛用于DNA測序、標記、定點誘變等等的酶。由于聚合酶鏈反應(PCR)方法的發(fā)展,耐熱的DNA聚合酶近來愈發(fā)受到關注。已經開發(fā)并上市了適于PCR方法的多種DNA聚合酶。
根據(jù)氨基酸序列相似性,通常可將當前已知的DNA聚合酶分成四個家族。其中,家族A(pol I型酶)和家族B(α型酶)占大多數(shù)。屬于每個家族的DNA聚合酶通常具有相似的生化特性。然而,詳細的比較已顯示各自酶在底物特異性、底物類似物的摻入、引物延伸能力的強度和速度、DNA合成的模式、伴隨的外切核酸酶活性、最適反應條件(溫度、pH等)、對抑制劑的敏感性等方面相互之間有不同的性能。因此,已從目前的DNA聚合酶中選出并利用具有最適于實驗方法的特性的DNA聚合酶。
例如,來自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的DNA聚合酶(Pfu)(參見例如,專利文件1-5)是最耐熱的DNA聚合酶之一。其具有被稱作校正活性的3′→5′外切核酸酶活性,并且其在耐熱酶中顯示相對地高保真性。然而,該酶也有尚待解決的問題,即如果用于PCR其需要長的擴增時間,并且因為其延伸速度和持續(xù)合成能力低,其不能用于長鏈的擴增。
最近,可商購的稱作KOD DNA聚合酶的聚合酶,其具有比Pfu來源的DNA聚合酶更高的3′→5′外切核酸酶活性、更高的延伸速度和更高的持續(xù)合成能力(參見例如,專利文件6和7,非專利文件1)??墒褂迷撁冈诙虝r間內進行具有高準確度的PCR。然而,該酶有尚待解決的問題,即由于強的3′→5′外切核酸酶活性降解引物或擴增產物,所以相對難于確定反應條件,并且不適于長鏈的擴增。
此外,通過改良KOD DNA聚合酶已開發(fā)了兩類酶。其中之一,KOD-Plus-DNA聚合酶,能熱啟動PCR而不需要通過向KOD DNA聚合酶添加兩種單克隆抗體以抑制在正常溫度下的聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性的特殊步驟。與KOD DNA聚合酶相比,通過優(yōu)化反應緩沖液組合物提高擴增效率和合成長鏈DNA的能力,同時保留高保真性(例如,專利文件8)。然而,仍存在有待解決的問題,該酶的延伸速度比KOD DNA聚合酶低得多,并且降到與Pfu來源的DNA聚合酶相等的水平。
KOD Dash DNA聚合酶是基于Barnes等方法制備的混合型DNA聚合酶(參見例如,專利文件9,非專利文件2)。通過以最佳比例將KOD DNA聚合酶和已使用基因工程技術從中除去3′→5′外切核酸酶活性的修飾型的KOD DNA聚合酶混合,提高擴增效率和延伸能力(參見例如,專利文件10)。其延伸速度象KOD DNA聚合酶一樣高。然而,還是存在有待解決的問題,由于3′→5′外切核酸酶活性相對降低,所以與KOD DNA聚合酶相比,保真性顯著降低。
專利文件1美國專利No.5489523專利文件2美國專利No.5545552專利文件3美國專利No.5866395專利文件4美國專利No.6489150專利文件5美國專利No.5948663轉錄文件6美國專利No.6054301專利文件7美國專利No.6225065專利文件8美國專利公開No.2002/0076768專利文件9美國專利No.5436149專利文件10美國專利No.6008025非專利文件1Barnes W.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.91,No.6,p.2216-2220(1994)非專利文件2Takagi M.,等,Appl.Environ.Microbiol.,vol.63,No.11,p.4504-4510(1997)發(fā)明的公開本發(fā)明將要解決的問題本發(fā)明的主要目的是提供可用于克隆、測序和核酸擴增的具有高保真性DNA聚合酶活性的多肽,以及編碼該多肽的基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產具有DNA聚合酶活性的多肽的方法以及使用具有DNA聚合酶活性的多肽用于擴增核酸的方法。
解決問題的方法通過深入的研究,本發(fā)明人從熱球菌(Thermococcus)屬的超嗜熱古細菌中發(fā)現(xiàn)了一種具有DNA聚合酶活性的新的多肽,其具有優(yōu)于任何其它常規(guī)DNA聚合酶的性能。此外,本發(fā)明人克隆了編碼具有這種活性的多肽的基因,并且發(fā)現(xiàn)了生產該多肽的方法。因此,已經完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的第一個方面涉及具有DNA聚合酶活性的多肽,其具有選自下列的氨基酸序列、或具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一個或幾個氨基酸的氨基酸序列(a)SEQ ID NO16的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO24的氨基酸序列;和(c)SEQ ID NO32的氨基酸序列。
本發(fā)明的第二個方面涉及一種編碼第一方面的多肽的核酸。
第二個方面的核酸可以是具有SEQ ID NO15、23或31的核苷酸序列,或者其一部分的核酸。其可以是編碼具有DNA聚合酶活性的多肽的核酸,其在嚴格條件下和與上述核酸互補的核苷酸序列構成的核酸雜交。
本發(fā)明的第三個方面涉及一種生產多肽的方法,該方法包括培養(yǎng)能產生多肽的細胞,和從培養(yǎng)物中收集所述多肽,其中所述多肽具有DNA聚合酶活性,并且具有選自下列的氨基酸序列或具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一個或幾個氨基酸的氨基酸序列(a)SEQ ID NO16的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO24的氨基酸序列;和(c)SEQ ID NO32的氨基酸序列。
本發(fā)明的第四個方面涉及一種擴增核酸的方法,該方法包括使用多肽擴增核酸,
其中所述多肽具有DNA聚合酶活性,并且具有選自下列的氨基酸序列或具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一個或幾個氨基酸的氨基酸序列(a)SEQ ID NO16的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO24的氨基酸序列;和(c)SEQ ID NO32的氨基酸序列。
本發(fā)明的第五個方面涉及一種含有第一方面的多肽的組合物。
本發(fā)明的第六個方面涉及一種含有第一方面的多肽的試劑盒。
本發(fā)明的第七個方面涉及一種結合第一方面的多肽的抗體。
發(fā)明的效果本發(fā)明提供一種可用于克隆、測序和核酸擴增的具有高保真性DNA聚合酶活性的多肽,編碼該多肽的基因,以及用于生產具有所述DNA聚合酶活性的多肽的方法。使用具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽,即使將其用于包括許多循環(huán)的PCR也可獲得具有較低錯誤率的擴增產物。因此,其可用于以低拷貝數(shù)量存在的靶核酸的分析或鑒定。
附圖簡述
圖1說明DNA聚合酶活性和反應溫度之間的關系。在圖中,◇、△和○分別代表Tks DNA聚合酶、Tce DNA聚合酶和Tsi DNA聚合酶的結果。
圖2說明DNA聚合酶活性和pH之間的關系。在圖中,◇、△和○分別代表Tks DNA聚合酶、Tce DNA聚合酶和Tsi DNA聚合酶的結果。
完成本發(fā)明的最佳方式如這里所使用的,具有DNA聚合酶活性的多肽指根據(jù)模板DNA的核苷酸序列摻入四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)并且催化與模板DNA互補的DNA鏈聚合的多肽。
如這里所使用的,引物延伸的適合性指擅長使用引物與單鏈模板DNA退火形成的復合物作為底物從引物合成DNA的能力。例如對單鏈DNA的高親和力。預計具有對單鏈DNA高親和力的DNA聚合酶使核酸擴增反應中的高靈敏度。因此,其可用于從以低拷貝數(shù)量存在的模板核酸擴增核酸的反應。DNA聚合酶對單鏈DNA親和力的示例性的指標是對M13噬菌體單鏈DNA的Km值。該Km值優(yōu)選地是2.5μg/ml或更小,更優(yōu)選地2.0μg/ml或更小,更優(yōu)選地1.5μg/ml或更小。
如這里所使用的,高保真性指在用DNA聚合酶的DNA合成反應中高度準確的核苷酸摻入。其測定方法的實例包括Kunkel法(J.Biol.Chem.1985May 10;260(9)5787-96)、測序法以及Cline等的方法(Nucleic Acids Res.1996Sep 15;24(18)3546-51)。在這些方法中,測序法是最可靠的。盡管不作為對本發(fā)明的限制,例如,但是可根據(jù)下列步驟估計保真性使用嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8的基因組DNA作為模板以及DNA聚合酶進行PCR;將擴增產物克隆到載體pUC118中;測定多個克隆中約500-bp擴增片段的核苷酸序列;測定認為是錯誤的核苷酸的數(shù)量;以及測定總的所測核苷酸中錯誤核苷酸的百分率。
在下文中,將詳細描述本發(fā)明。
(1)具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽以及編碼該多肽的基因具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽是比Pfu來源的DNA聚合酶和KOD來源的DNA聚合酶更適于引物延伸,并且在DNA合成上非常準確的多肽。具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽在可使用PCR法擴增的DNA鏈長度和反應的保真性上比Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)(來自典型的高保真性耐熱DNA聚合酶,Pfu來源的DNA聚合酶)、KOD DNA聚合酶、KOD dash DNA聚合酶以及KOD plusDNA聚合酶(所有都來自Toyobo)更優(yōu)秀。
本發(fā)明的DNA聚合酶的理化特性如下(i)分子量根據(jù)通過SDS-PAGE法測定,約85-90千道爾頓(ii)最適溫度75-85℃(iii)最適pH5.5-6.5(75℃)關于具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽沒有特殊限制,只要其具有上述理化特征。例如,其可從熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1(下文稱作Tks)、Thermococcus siculi(下文稱作Tsi)和速生熱球菌(Thermococcus celer)(下文稱作Tce)中獲得。
具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽可由SEQ ID NO16、24或32的氨基酸序列構成,或者其可以是具有基本上相同活性的功能等同物??稍谔烊淮嬖诘亩嚯闹挟a生突變,如氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入、添加或取代。這種突變可能是由于編碼多肽的基因的多態(tài)性或突變,或者由于多肽在體內或在合成后的純化期間的修飾反應所產生的。已知這種突變的多肽可能仍然顯示與無突變的多肽基本上相同的生理或生化活性即可。本發(fā)明也包括這種盡管在結構上有差別,但在功能或活性上沒有發(fā)現(xiàn)顯著差別的功能等同物。關于突變的氨基酸的數(shù)量沒有特殊限制,只要多肽顯示基本上相同的生理或生物活性。例如可以是1個或以上突變(缺失、插入、添加、取代等),例如1到幾個,更具體地1到10個核苷酸。這可用于將這種突變人為地引入到多肽的氨基酸序列中的實例。在這種情況中,可產生更多不同的突變體。
當使用基因工程技術生產多肽時,經常將其表達為融合多肽。例如,為了提高多肽的表達水平,可在目的多肽的N末端添加來自另一個多肽的N末端肽。在另一種情況中,可在目的多肽的N末端或C末端添加適當?shù)碾逆?例如,組氨酸標簽、谷胱甘肽-S-轉移酶),然后表達多肽。由此,通過使用具有對肽鏈有親和力的載體便于目的多肽的純化。具有與本發(fā)明的DNA聚合酶部分不同的氨基酸序列的DNA聚合酶可作為“功能等同物”在本發(fā)明的范圍內,只要其顯示與本發(fā)明的DNA聚合酶基本等同的活性即可。
編碼具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽的DNA包括含有編碼SEQ ID NO16、24或32的氨基酸序列,或其部分的核苷酸序列的DNA(例如,含有SEQ ID NO15、23或31,或其部分的核苷酸序列的DNA)。也包括編碼具有作為DNA聚合酶功能的多肽的DNA,其由在SEQ ID NO16、24或32的氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代1個或多個,例如1到幾個,更具體地1到10個氨基酸的氨基酸序列構成。同樣地,編碼具有DNA聚合酶功能的多肽、能在嚴格條件下和與這種DNA互補的核苷酸序列構成的DNA雜交的核苷酸序列也包含在本發(fā)明的范圍內。例如,“嚴格條件”指在68℃在含有0.5%SDS、5x Denhardt′s和100μg/ml變性的鮭精DNA的6x SSC(1x SSC0.15MNaCl、0.015M檸檬酸鈉,pH 7.0)中與探針孵育12-20小時的條件。例如,可在68℃在含有0.5%SDS的0.1x SSC中洗滌后檢測與探針雜交的DNA。
本發(fā)明的基因可含有編碼稱作內含肽區(qū)的序列,其在翻譯成多肽后從多肽中自動切除。本發(fā)明也包括含有這種序列的DNA,只要其編碼具有DNA聚合酶活性的多肽即可。
盡管不作為對本發(fā)明的限制,但是例如,“具有DNA聚合酶活性的多肽”優(yōu)選地是顯示上述各種理化特性的具有DNA聚合酶活性的多肽。
下面解釋如這里所使用的表述“含有編碼氨基酸序列的核苷酸序列的DNA”。已知每個氨基酸有1-6個密碼子(三個堿基的組合),其中密碼子定義基因中的氨基酸。因此,根據(jù)所編碼的氨基酸序列,編碼一個特定的氨基酸序列的DNA可以有多個。
此外,如果使用各種基因工程技術,那么人工產生編碼同一氨基酸序列的各種基因不困難。例如,如果在編碼目的多肽的原始基因中所使用的密碼子在有待通過基因工程技術生產多肽的宿主中是使用率低的密碼子,那么多肽的表達水平可能很低。在這種情況下,將密碼子人為地轉換成在宿主中經常使用的密碼子,由此不改變所編碼的氨基酸序列,旨在提高目的多肽的表達水平(例如,JP-B 7-102146)。如上所述,能人為地產生編碼一種特定氨基酸序列的各種基因,當然,實際上可以產生。因此,本發(fā)明可包括編碼這里所公開的氨基酸序列,但不具有與這里所公開的核苷酸序列相同的核苷酸序列的基因。
本發(fā)明的具有DNA聚合酶活性的多肽適于體外引物延伸。例如,當使用引物與單鏈DNA退火的底物(HT引物(SEQ ID NO33)與M13單鏈DNA退火的底物;下文也稱作M13/HT引物底物或引物延伸型底物)測定DNA聚合酶活性時,觀察到核苷酸摻入的活性高于使用通常用作活性測定的活化的DNA(DNA酶I處理的小牛胸腺DNA)時所觀察到的活性。
就使用M13/HT引物底物所測定的DNA聚合酶活性(下文也稱作延伸活性)與使用活化的DNA作為底物所測定的DNA聚合酶活性(下文也稱作摻入活性)的比值(延伸活性/摻入活性)而言,利用具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽所得的比值高于利用來自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu DNA聚合酶;Stratagene)、來自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的Taq DNA聚合酶(TakaRa Taq,Takara Bio)或者來自Thermococcus kodakaraensis的KOD DNA聚合酶(KODDNA聚合酶,Toyobo)的已知DNA聚合酶所得的比值。
當向使用M13/HT引物底物的反應系統(tǒng)中添加作為競爭性底物的活化的DNA時,強烈抑制上述三種DNA聚合酶的引物延伸活性。在另一方面,僅輕微抑制具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽,證明該多肽具有對引物延伸型底物的高親和力。
具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽的M13噬菌體單鏈DNA的Km值為2μg/ml或更低的事實也表明該多肽具有對引物延伸型底物的高親和力。
(2)產生具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽的方法例如,可從Tks、Tsi或Tce株的培養(yǎng)物中,或者從將編碼多肽的基因轉移到其中的轉化體中大量生產具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽。
可使用生產本發(fā)明多肽的微生物的基因組DNA作為起始材料,獲得編碼本發(fā)明多肽的DNA。關于制備基因組DNA的方法沒有特殊限制。在一個示例性的方法中,在85℃厭氧條件下培養(yǎng)熱球(Thermococcus)屬的古細菌、裂解培養(yǎng)的細胞以及提取DNA并純化??墒褂靡阎椒ㄓ糜诨蚩寺〉母鞣N步驟,如用限制酶裂解所獲得的DNA的方法。這些方法詳細描述于J.Sambrook等,MolecularCloning,A Laboratory Manual,3rd ed.,2001,Cold Spring HarborLaboratory。
可在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下(例如,在大腸桿菌宿主的情況中,在LB培養(yǎng)基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl,pH 7.2)),通過培養(yǎng)用整合了編碼具有DNA聚合酶活性的多肽的核酸(例如,非限定性的,具有SEQ ID NO15、23或31的核苷酸序列的核酸)或其部分的重組質粒轉化的轉化體,在細胞中表達具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽。通過進行,例如,超聲處理、加熱,以及使用陽離子交換柱、親和載體柱、凝膠過濾柱、陰離子交換柱等等的層析可從所培養(yǎng)的細胞中獲得多肽。
如通過SDS-PAGE測定,這樣獲得的具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽的分子量是約85-90道爾頓。
具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽在75℃Tris緩沖液中所顯示的最適pH為pH 5.5-6.5。當在各種溫度測定DNA聚合酶的酶促活性時,其顯示在75-85℃具有高度活性。具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽非常耐熱。
具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽伴有3′→5′外切核酸酶活性。外切核酸酶活性相對于DNA聚合酶活性的程度超過Pfu DNA聚合酶的活性比,由于其高度外切核酸酶活性,已知導致在DNA合成上非常高的準確性。對于具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽,在所測定的DNA合成反應期間發(fā)生錯誤的頻率低于來自Pfu的DNA聚合酶。上述各種特性顯示本發(fā)明的DNA聚合酶作為基因工程(例如,對于PCR法)的試劑非常優(yōu)秀。
(3)使用本發(fā)明的DNA聚合酶擴增核酸的方法,以及用于該方法的組合物和試劑盒具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽的特征是,其具有高保真性并且適于引物延伸。由此,本發(fā)明提供使用該多肽用于準確擴增、分析或鑒定靶核酸的方法,以及用于該方法的組合物和試劑盒。
由于上述特點,具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽在PCR方法中顯示非常優(yōu)良的性能。例如,使用用于PCR方法的來自Thermococcus kodakaraensis(KOD DNA聚合酶,Toyobo)的DNA聚合酶很難擴增6k堿基對或更長的DNA片段。只有與其它DNA聚合酶聯(lián)合使用才能擴增15k堿基對或更長的DNA片段。單獨使用本發(fā)明的DNA聚合酶即可擴增15k堿基對的DNA片段,而不需要添加其它酶。
含有本發(fā)明多肽的組合物或試劑盒優(yōu)于含有常規(guī)的DNA聚合酶或含有多個DNA聚合酶的組合物或試劑盒(例如,含有KOD DNA聚合酶的組合物或試劑盒;含有KOD dash DNA聚合酶的組合物或試劑盒;或者含有KOD plus DNA聚合酶的組合物或試劑盒),可用于準確擴增、分析或鑒別靶核酸。
上述組合物或試劑盒,例如可以是含有具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽、優(yōu)化多肽的緩沖液、四種dNTP以及二價陽離子的組合物或試劑盒。其可進一步含有用于擴增和/或檢測靶核酸的一組引物。
本發(fā)明提供結合本發(fā)明的多肽的抗體。關于抗體沒有特別限制,只要其能識別并特異性結合本發(fā)明的多肽即可。其可以是多克隆抗體或單克隆抗體。此外,本發(fā)明也包括具有與上述抗體相同的識別特征的抗體片段(例如,F(xiàn)ab片段)、單鏈抗體等等。
可根據(jù)已知方法,如在Current Protocols in Immunology,1992,John Wiley & Sons,Inc中所描述的方法,可利用作為抗原的本發(fā)明的多肽或其部分免疫小鼠或兔制備本發(fā)明的抗體。此外,可根據(jù)常規(guī)方法通過利用所免疫的動物中所收集的抗體生產細胞中產生雜交瘤,制備單克隆抗體。
可使用抗體用于本發(fā)明多肽進行檢測或純化。另外,其可用于抑制多肽的活性,如DNA聚合酶活性或3′→5′外切核酸酶活性。例如,能抑制DNA聚合酶活性的抗體可在PCR中用于在反應開始前抑制低溫時從非特異性退火的引物開始的DNA延伸。此外,能抑制3′→5′外切核酸酶活性的抗體,例如可在PCR中用于抑制反應開始前的引物的降解。
實施例下列實施例更詳細地舉例說明本發(fā)明,但是不應當被解釋為限制其范圍。
實施例1根據(jù)下列方法制備用于測定實施例中DNA聚合酶活性的活化的DNA。
簡要地,通過用DNA酶I處理以活化鮭精DNA(Sigma)或小牛胸腺DNA(Worthington)。該方法是基于C.C.Richardson在D.R.Davis(編輯),“DNA polymerase from Escherichia coli”,pp.263-276,Harper& Row中所描述的方法。
根據(jù)下列方法測定DNA聚合酶的活性。
簡要地,將進行活性測定的標本在74℃,在50μl用于活性測定的反應混合物(20mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.3)、10mM氯化鉀、6mM硫酸銨、2mM氯化鎂、0.1%Triton X-100、0.001%牛血清白蛋白、dATP、dGTP和dCTP各200μM、100μM dTTP、0.238μM [3H]-甲基TTP、0.4mg/ml活化的鮭精DNA)中反應5分鐘。
反應后,向其中添加500μl含有2%Nappi(Nacalai Tesque)的20%三氯乙酸(TCA)和500μl剪切的DNA。在冰上放置15分鐘或更長時間后,在玻璃濾器(Whatman)上收集混合物。將玻璃濾器用5ml含有2%Nappi的5%TCA洗滌七次,隨后用乙醇洗滌并干燥,使用液體閃爍計數(shù)器測定放射性。根據(jù)上述酶活性測定方法,將在30分鐘內將總共10nmol的核苷酸摻入到不溶于酸的沉淀中的酶活性定義為1U。
實施例2根據(jù)下列方法從熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1(JCM11816)、速生熱球菌(Thermococcus celer)(JCM8558)和Thermococcus siculi(DSMZ12349)中制備基因組DNA。
簡要地,將10ml所購買的培養(yǎng)物以8,000rpm離心10分鐘。將所得的上清液以及在上清液和沉淀之間界面上的深色層進一步以15,000rpm離心10分鐘。將所得的沉淀在0.8ml的20%蔗糖、50mMTris-鹽酸緩沖液(pH 8.0)中懸浮。向其中添加0.16ml 500mM EDTA(pH 8.0)和0.08ml10mg/ml溶菌酶氯化物(Nacalai Tesque)水溶液。將混合物在室溫下反應2小時。
反應后,向反應混合物中添加6.4ml含有150mM NaCl、1mMEDTA和20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)的溶液,0.08ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Bio)以及0.4ml10%月桂基硫酸鈉水溶液。將所得的混合物在37℃孵育1小時。然后向其中添加等體積的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.0)飽和酚/氯仿/異戊醇混合物(25∶24∶1,v/v)。將混合物輕輕混合10分鐘,然后以10,000xg離心10分鐘兩次。離心后,將這樣獲得的上清液進行乙醇沉淀,將沉淀溶于0.1ml TE緩沖液以獲得基因組DNA溶液。
實施例3(1)DNA聚合酶中間部分的克隆根據(jù)各種耐熱DNA聚合酶的氨基酸序列之間的保守部分,使用DNA合成儀合成寡核苷酸TPPolBF4、TPPolBF5、TTPolBR1和TTPolBR4(SEQ ID NOS1-4)。
使用在實施例2中制備的250ng熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1的基因組DNA作為模板,以及引物(每個50pmol)TPPolBF4和TTPolBR1、TPPolBF4和TTPolBR4,或者TPPolBF5和TTPolBR1的組合,在100μl的體積中進行PCR。根據(jù)所附的說明,使用TaKaRa ExTaq(Takara Bio)作為PCR的DNA聚合酶。進行如下的PCR反應94℃,3分鐘;以及40個94℃30秒鐘,50℃30秒鐘和72℃2分鐘的循環(huán)。
反應后,將反應混合物用酚處理并用Microcon-100(Takara Bio)除去引物并濃縮所擴增的DNA片段。
通過直接測序測定濃縮的擴增片段TPPolBF4-TTPolBR1(3kb)、TPPolBF4-TTPolBR4(2kb)和TPPolBF5-TTPolBR1(0.7kb)的核苷酸序列,并且與各種耐熱DNA聚合酶的氨基酸序列進行比較。結果,其顯示熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1DNA聚合酶含有內含肽序列。
(2)DNA聚合酶基因上游部分的克隆根據(jù)在實施例3-(1)中所測定的核苷酸序列,合成用于克隆上游部分的特異性寡核苷酸Tks01(SEQ ID NO5)。另外,合成如在表1中所示的32個引物。表1中的標簽序列如SEQ ID NO6所示。
表1
在50μl反應混合物中進行PCR,每個反應混合物含有在實施例2中制備的1ng熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA作為模板、10pmol Tks01和10pmol表1中所列32個引物之一的組合、20mMTris-乙酸緩沖液(pH 8.5)、50mM乙酸鉀、3mM乙酸鎂、0.01%BSA、dNTP各300μM以及1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(TakaraBio)。進行如下PCR在94℃孵育3分鐘;以及40個98℃10秒鐘,50℃10秒鐘和72℃40秒鐘的循環(huán)。將每個PCR產物的部分進行瓊脂糖凝膠電泳。使用Microcon-100(Takara Bio)從所選的用于產生單一條帶的反應混合物中除去引物并濃縮反應混合物。對濃縮物進行直接測序以篩選含有DNA聚合酶上游部分的片段。結果,顯示約1300-bp PCR擴增的片段Tks012G含有目的DNA聚合酶基因的上游部分。此外,進一步證實該片段含有與實施例3-(1)不同的內含肽序列。
根據(jù)Tks012G的序列,合成用于克隆起始密碼子附近更上游部分的特異性寡核苷酸Tks04(SEQ ID NO7)。使用在實施例2中制備的1ng熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA作為模板,以及10pmol Tks04和10pmol表1中所列32個引物之一的組合在50-μl反應混合物中進行PCR。PCR的條件和純化方法如上所述。將擴增的片段進行直接測序以篩選含有DNA聚合酶上游部分的片段。結果,顯示約1800-bp PCR擴增片段Tks041B含有目的DNA聚合酶基因的起始密碼子附近的部分。
(3)DNA聚合酶下游部分的克隆根據(jù)實施例3-(1)中測定的核苷酸序列,合成用于克隆上游部分的特異性寡核苷酸Tks02(SEQ ID NO8)。使用在實施例2中制備的1ng熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA作為模板,以及10pmolTks02和10pmol表1中所列32個引物之一的組合進行PCR。PCR的條件如上所述。將每個PCR產物的部分進行瓊脂糖凝膠電泳。回收約2500-bp的Tks022D DNA片段,用T4DNA聚合酶(Takara Bio)平末端化并用T4DNA連接酶(Takara Bio)連接到已用HincII(Takara Bio)消化的pUC118(Takara Bio)上。使用該質粒轉化大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109。培養(yǎng)轉化體以獲得具有插入約2500-bp DNA片段的質粒pTks022D,測定所插入的DNA片段的核苷酸序列。
(4)表達DNA聚合酶的質粒的構建已證明在熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1DNA聚合酶的序列中含有兩個內含肽序列。
然后,構建除去了內含肽序列的DNA聚合酶基因。
根據(jù)實施例3-(3)中所測定的序列,合成寡核苷酸TksNde、Tks1EndBg、Tks2StaBg、Tks2EndBal、Tks3StaBal和TksBgPs(SEQ IDNOS9-14)。
使用在實施例2中制備的100ng熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA作為模板,以及引物(每種20pmol)TksNde和Tks1EndBg(TksA)、Tks2StaBg和Tks2EndBal(TksB)或者Tks3StaBal和TksBgPs(TksC)的組合,在100μl的體積中進行PCR。根據(jù)所附的說明,使用Pyrobest(Takara Bio)作為PCR的DNA聚合酶。進行如下反應94℃30秒鐘,50℃30秒鐘以及72℃3分鐘,如此40個循環(huán)。然后,獲得下列擴增的DNA片段約1.3-kb TksA;約0.3-kb TksB;以及約0.9-kb TksC。另外,在上述條件下以類似方式使用1μl PCR反應混合物TksB和1μlPCR反應混合物TksC的混合物作為模板,以及20pmol Tks2StaBg和20pmol TksBgPs(TksD)作為引物,在100μl體積中進行PCR。然后,獲得約1.2-kb擴增的DNA片段TksD。
DNA片段TksA用限制酶NdeI和BglII消化。DNA片段TksD用限制酶BglII和PstI消化。根據(jù)常規(guī)方法將它們連接到已用限制酶NdeI和PstI消化的pTV119Nd(pTV119N中的NcoI位點轉化成NdeI位點的質粒)中以構建質粒pTks59。將該質粒稱作并表示為Tks59,并于2004年5月14日(原始保藏日期)保藏在國際專利生物保藏中心,國立高等工業(yè)科學和技術學院,AIST Tsukuba中心6,1-1,Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566,日本,保藏號FERM BP-10312。
(5)含有DNA聚合酶基因的DNA片段的核苷酸序列的測定根據(jù)雙脫氧法測定實施例3-(4)中所獲得的插入到pTks59中的DNA片段的核苷酸序列。
所測定的核苷酸序列的分析顯示,存在可能編碼目的DNA聚合酶的可讀框??勺x框的核苷酸序列如SEQ ID NO15所示。從核苷酸序列中推定的RNA酶HII的氨基酸序列如SEQ ID NO16所示。
(6)熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1DNA聚合酶基因的表達將用pTks59轉化的大腸桿菌(Escherichia coli)JM109接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化鈉)中并在37℃培養(yǎng)6小時。將50μl培養(yǎng)物接種到含有100μg/ml氨芐青霉素和1mM IPTG的5ml LB培養(yǎng)基中,在37℃震蕩過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后,將通過離心收集的細胞懸于36μl超聲處理緩沖液(50mM Tris-鹽酸(pH 8.0)、2mM 2-巰基乙醇、10%甘油)中并進行超聲處理。將超聲處理的懸液通過在12,000rpm離心10分鐘所獲得的上清液在80℃加熱10分鐘,然后再次在12,000rpm離心10分鐘以收集上清液作為加熱過的上清液。
根據(jù)實施例1中所述的方法測定加熱的上清的酶活性。結果,觀察到有DNA聚合酶活性。
(7)純化的DNA聚合酶制劑的制備將用實施例3-(5)中所獲得的質粒pTks59轉化的大腸桿菌JM109接種到400ml含有50μg/ml氨芐青霉素和0.1%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中,并在37℃震蕩過夜培養(yǎng)。將整個培養(yǎng)物加到含有50μg/ml氨芐青霉素的20升LB培養(yǎng)基中并在37℃培養(yǎng)到OD660為1.0。當OD600達到1.0時,添加IPTG至終濃度為0.2mM,繼續(xù)在37℃培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后,將通過離心收集的細胞在732ml緩沖液A(50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.5)、2mM EDTA、2mM二硫蘇糖醇、1mM苯甲基磺酰氟)中懸浮并進行超聲處理。將超聲處理過的懸液在12,000rpm離心30分鐘。向所得的上清液中添加硫酸銨至終濃度為0.2M。將混合物在75℃加熱15分鐘并使其在0℃放置30分鐘。將其再次在12,000rpm離心30分鐘。使用聚乙烯亞胺和硫酸銨沉淀除去上清液中的核酸,并用2升緩沖液B(50mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.5)、1mM EDTA、10%甘油、1mM二硫蘇糖醇、1mM苯甲基磺酰氟)透析2次,每次2小時并過夜透析一次。透析后,將200ml酶溶液加到用緩沖液B平衡的磷酸纖維素P-11柱(Whatman)上。使用FPLC系統(tǒng)(AmershamPharmacia Biotech),用0-500mM磷酸鉀緩沖液(pH 7.5)的線性梯度進行洗脫。
將洗脫的DNA聚合酶級分用1升緩沖液C(20mM Tris鹽酸緩沖液(pH 7.5)、0.1mM EDTA、10%甘油、0.2%Tween 20、1mM二硫蘇糖醇)透析2次,每次2小時并過夜透析一次。透析后,將100ml的酶溶液加到用緩沖液B平衡的肝素-瓊脂糖CL-6B(PharmaciaPharmacia Biotech)上。使用FPLC系統(tǒng),用0-700mM KCl的線性梯度進行洗脫。
將級分用1升緩沖液D(20mM Tris-HCl(pH 9.0)、0.1mM EDTA、10%甘油、0.2%Tween 20、1mM二硫蘇糖醇)透析2次,每次2小時并過夜透析一次。透析后,將50ml酶溶液加到上用緩沖液D平衡的Q-瓊脂糖(Pharmacia Pharmacia Biotech)上。使用FPLC系統(tǒng),用0-300mM NaCl的線性梯度進行洗脫。
將級分用1升貯藏緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 8.2)、0.1mMEDTA、10mM氯化鈉、0.1%Tween 20、0.1%Nonidet P-40、1mM二硫蘇糖醇、50%甘油)透析2次,每次2小時并過夜透析一次。將這樣獲得的DNA聚合酶用作Tks DNA聚合酶制劑。
根據(jù)在實施例1中所描述的方法測定Tks DNA聚合酶制劑的活性。結果,觀察到有DNA聚合酶活性。
實施例4(1)DNA聚合酶基因中間部分的克隆根據(jù)各種耐熱DNA聚合酶的氨基酸序列之間的保守部分,合成寡核苷酸TPPolBF1、TPPolBF5、TTPolBR1和TTPolBR5(SEQ IDNOS17、2、3、18)。
使用在實施例2中制備的250ng速生熱球菌(Thermococcusceler)基因組DNA作為模板,以及引物(每種50pmol)TPPolBF1和TTPolBR1、TPPolBF1和TTPolBR5或者TPPolBF5和TTPolBR1的組合,在100μl體積中進行PCR。PCR的條件和純化方法如實施例3-(1)中所述。通過直接測序確定擴增片段TPPolBF1-TTPolBR1(約2kb)、TPPolBF1-TTPolBR5(約1kb)以及TPPolBF5-TTPolBR1(約0.8kb)的核苷酸序列。
(2)DNA聚合酶基因的上游和下游部分的克隆根據(jù)實施例4-(1)中所測定的核苷酸序列,合成用于克隆上游部分的特異性寡核苷酸Tce01(SEQ ID NO19)和用于克隆下游部分的Tce02(SEQ ID NO20)。
使用在實施例2中制備的1ng速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA作為模板,以及10pmol Tce01或Tce02和10pmol實施例3-(2)表1中所列32個引物之一的組合進行PCR。PCR的條件和純化方法如實施例3-(2)中所述。將擴增產物進行直接測序以篩選含有目的DNA聚合酶上游區(qū)的片段。結果,顯示約650-bp PCR擴增片段Tce013C含有DNA聚合酶基因的上游部分,約650-bp PCR擴增片段Tce022F含有DNA聚合酶基因的下游部分。
(3)用于表達DNA聚合酶的質粒的構建根據(jù)實施例4-(2)中所測定的序列合成寡核苷酸TceNde和TceBgPs(SEQ ID NOS21和22)。
使用在實施例2中所制備的100ng速生熱球菌(Thermococcusceler)基因組DNA作為模板,以及引物(每種20pmol)TceNde和TceBgPs的組合,在100μl體積中進行PCR。根據(jù)所附的說明,使用Pyrobest(Takara Bio)作為PCR的DNA聚合酶。進行如下的反應94℃30秒鐘,50℃30秒鐘以及72℃2分鐘,如此40個循環(huán)。用限制性酶NdeI和BglII(購自Takara Bio)消化約2.3-kb擴增的DNA片段。在質粒載體pTV119Nd(將pTV119N中的NcoI位點轉變成NdeI位點的質粒)的NdeI和BamHI位點之間整合DNA片段以構建質粒pTce19。將該質粒稱作并表示為pTce19,并在2004年5月14日(原始保藏日期)保藏在國際專利微生物保藏中心,國立高等工業(yè)科學和技術學院,AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566,日本,保藏號為FERM BP-10311。
(4)含有DNA聚合酶基因的DNA片段的核苷酸序列的測定根據(jù)雙脫氧法測定插入到pTce19中的DNA片段的核苷酸序列。
所測定的核苷酸序列的分析顯示,存在可能編碼目的DNA聚合酶的可讀框。可讀框的核苷酸序列如SEQ ID NO23所示。從該核苷酸序列所推斷的DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO24所示。
(5)速生熱球菌(Thermococcus celer)DNA聚合酶基因的表達根據(jù)如實施例3-(6)中所述的方法,培養(yǎng)用pTce19轉化的大腸桿菌JM109。將通過離心所收集的細胞懸浮在64μl超聲處理緩沖液中并進行超聲處理。將超聲處理的懸液通過在12,000rpm離心10分鐘所獲得的上清液在80℃加熱10分鐘,然后在12,000rpm再次離心10分鐘以收獲上清液作為加熱的上清液。
根據(jù)如在實施例1中所描述的方法測定加熱的上清液的酶活性。結果,觀察到有DNA聚合酶活性。
(6)純化的DNA聚合酶制劑的制備根據(jù)實施例3-(7)中所描述的方法培養(yǎng)用pTce19轉化的大腸桿菌JM109。根據(jù)如在實施例3-(7)中所描述的方法進行純化直到用0-700mM KCl的線性梯度從肝素-瓊脂糖CL-6B(Pharmacia Biotech)上洗脫的步驟。
將洗脫的DNA聚合酶級分用含有0.3M氯化鈉的1升緩沖液C透析2次,每次2小時并過夜透析一次。透析后,將95ml酶溶液加到用含有0.3M氯化鈉的緩沖液C平衡的Superdex G200(PharmaciaBiotech)上。用含有0.3M氯化鈉的緩沖液C進行洗脫。
將洗脫的DNA聚合酶級分用1升緩沖液D透析2次,每次2小時并過夜透析一次。透析后,將45ml酶溶液加到用緩沖液D平衡的Q-瓊脂糖(Pharmacia Pharmacia Biotech)上。使用FPLC系統(tǒng),用0-300mM NaCl的線性梯度進行洗脫。
將級分用1升貯藏緩沖液透析2次,每次2小時并過夜透析一次。將這樣所得的DNA聚合酶用作Tce DNA聚合酶制劑。
根據(jù)如實施例1中所描述的方法測定Tce DNA聚合酶制劑的酶活性。結果,觀察到Tce DNA聚合酶制劑有DNA聚合酶活性。
實施例5(1)DNA聚合酶基因的中間部分的克隆根據(jù)各種耐熱DNA聚合酶的氨基酸序列之間的保守部分,合成寡核苷酸TPPolBF1、TPPolBF5、TTPolBR1、TTPolBR4和TTPolBR5(SEQID NOS17、2、3、4、18)。
使用在實施例2中制備的250ng Thermococcus siculi基因組DNA作為模板,以及引物(每種50pmol)TPPolBF1和TTPolBR4、TPPolBF1和TTPolBR5或者TPPolBF5和TTPolBR1的組合,在100μl體積中進行PCR。PCR的條件和純化方法如在實施例3-(1)中所述。通過直接測序測定擴增片段TPPolBF1-TTPolBR4(約1.2kb)、TPPolBF1-TTPolBR5(約1kb)和TPPolBF5-TTPolBR1(約2kb)的核苷酸序列。結果,顯示Thermococcus siculi DNA聚合酶含有內含肽序列。
(2)DNA聚合酶基因的上游和下游部分的克隆根據(jù)在實施例5-(1)中所測定的核苷酸序列,合成用于克隆上游部分的特異性寡核苷酸Tsi01(SEQ ID NO25)和用于克隆下游部分的Tsi06(SEQ ID NO26)。
使用在實施例2中制備的1ng Thermococcus siculi基因組DNA作為模板,以及10pmol Tsi01或Tsi06和10pmol表1所列32個引物之一的組合進行PCR。PCR的條件和純化方法如實施例3-(2)所述。將擴增產物進行直接測序以篩選含有目的DNA聚合酶的上游區(qū)的片段。結果,顯示約2900-bp片段Tsi011A含有DNA聚合酶基因的上游部分,約400-bp片段Tsi065B含有DNA聚合酶基因的下游部分。
(3)用于表達DNA聚合酶的質粒的構建證明在Thermococcus siculi DNA聚合酶的序列中含有一個內含肽序列。然后,構建除去內含肽了序列的DNA聚合酶基因。
根據(jù)在實施例5-(2)中所測定的序列,合成寡核苷酸TsiNde、TsiA、TsiB和TsiBamPst(SEQ ID NOS27-30)。
使用在實施例2中制備的100ng的Thermococcus siculi基因組DNA作為模板,以及引物(各20pmol)TksNde和TsiB(TsiI)或者TsiA和TsiBamPst(TsiII)的組合,在100μl體積中進行PCR。如在實施例5-(2)中所述進行PCR以獲得DNA片段TsiI(約1.5kb)和TsiII(約0.9kb)。另外,使用1μlPCR反應混合物TsiI和1μl PCR反應混合物TsiII的混合物作為模板,以及20pmol TsiNde和20pmol TsiBamPst作為引物,在100μl體積中以類似方式進行PCR。獲得約2.4-kb DNA片段。
用限制性酶NdeI和BamHI消化所得的約2.4-kb DNA片段。將DNA片段連于已用NdeI和BamHI消化的pTV119Nd(將pTV119N中的NcoI位點轉變成NdeI位點的質粒)以構建質粒pTsi16。將該質粒稱作并表示為Tsi16,并且在2004年5月4日保藏在國際專利微生物保藏中心,國立高等工業(yè)科學和技術學院,AIST Tsukuba Central 6,1-1,Higashi 1-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken 305-8566,日本,保藏號為FERM BP-10310。
(4)含有DNA聚合酶基因的DNA片段的核苷酸序列的測定根據(jù)雙脫氧法測定在實施例5-(3)中所獲得的插入到pTsi16中的DNA片段的核苷酸序列。所測定的核苷酸序列的分析顯示,存在可能編碼目的DNA聚合酶的可讀框??勺x框的核苷酸序列如SEQ ID NO31所示。從該核苷酸序列推斷的DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ IDNO32所示。
(5)Thermococcus siculi DNA聚合酶基因的表達根據(jù)如在實施例3-(6)中所述的方法培養(yǎng)用質粒pTsi16轉化的大腸桿菌JM109。在52μl超聲處理的緩沖液中懸浮通過離心所收集的細胞并進行超聲處理。將超聲處理的懸液通過在12,000rpm離心10分鐘后所獲得的上清液在80℃加熱10分鐘,然后在12,000rpm再次離心10分鐘以收集上清液作為加熱的上清液。
根據(jù)如在實施例1中所述的方法測定加熱的上清液的酶活性。結果,觀察到有DNA聚合酶活性。
(6)純化的DNA聚合酶制劑的制備根據(jù)如實施例3-(7)中所述的方法培養(yǎng)用質粒pTsi16轉化的大腸桿菌JM109。根據(jù)如實施例3-(7)中所述的方法進行純化。
這樣獲得的DNA聚合酶用作Tsi DNA聚合酶制劑。根據(jù)如在實施例1中所述的方法測定Tsi DNA聚合酶制劑的活性。結果,觀察到TsiDNA聚合酶制劑有DNA聚合酶活性。
實施例6(1)各DNA聚合酶的摻入和延伸活性測定Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶的摻入和延伸活性。使用可通過商業(yè)途徑獲得的產品KOD DNA聚合酶(Toyobo)作為對照。
當測定摻入活性時,使用1μg活化的小牛胸腺DNA作為模板。當測定延伸活性時,使用M13/HT引物,其中將1μg M13噬菌體單鏈DNA和與其互補的1pmol HT引物(SEQ ID NO33)退火。使用含有1mM氯化鎂的KOD#1緩沖液作為緩沖液。根據(jù)下列方法測定DNA聚合酶活性。
簡要地說,將含有要進行活性測定的酶標本、上述模板、40μMdNTP、0.238μM[3H]甲基-TTP(Amersham)以及1mM氯化鎂的50μlKOD#1緩沖液在75℃反應5分鐘。將40μl反應混合物點在DE81紙(Whatman)上。用5%Na2PO4洗滌4次后,使用液體閃爍計數(shù)器測定DE81紙上殘留的放射性。根據(jù)上述酶活性測定方法,將導致在30分鐘內將10nmol dNMP摻入到底物DNA中的酶量定義為1U的酶。結果顯示于表2。在表2中,“摻入”代表在作為模板的核酸的缺口位點處摻入的能力,“延伸”代表由于延伸從與作為模板的核酸退火的引物摻入的能力。
表2
如表2所示,進一步證實Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶由引物延伸所顯示出的摻入的活性高于KOD#1緩沖液中向模板DNA中摻入核酸到的活性。此外,進一步證實與用作對照的KOD DNA聚合酶相比,由于引物延伸的摻入活性非常高?;谏鲜鼋Y果,進一步證實本發(fā)明的DNA聚合酶非常適于引物延伸。
(2)對M13單鏈DNA的親和力檢查Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶的摻入和對M13單鏈DNA聚合酶的親和力。使用KOD DNA聚合酶作為對照。
使用各種濃度的M13單鏈DNA作為模板。使用與其互補的1pmolHT引物作為引物。使用含有1mM氯化鎂的KOD#1緩沖液作為緩沖液。根如實施例6-(1)中所述的方法測定DNA聚合酶活性。結果如表3所示。
表3
如表3所示,進一步證實本發(fā)明的Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶顯示對M13單鏈DNA的親和力高于KOD DNA聚合酶。根據(jù)上述結果,就PCR中的檢測靈敏度而言,本發(fā)明的DNA聚合酶優(yōu)于KOD DNA聚合酶。
(3)Tks和Tsi DNA聚合酶的保真性檢查Tks和Tsi DNA聚合酶的保真性。使用KOD DNA聚合酶和KOD plus DNA聚合酶(兩者均來自Toyobo)以及Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)作為對照。
使用嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB8基因組DNA(Takara Bio)作為模板。另外,使用引物c280/RG34-F和-R(SEQ IDNOS34和35)。
根據(jù)下列方法測定保真性。簡要地,在50μl體積中進行PCR,使用10ng嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB8基因組DNA(TakaraBio)作為模板,以及引物c280/RG34-F和-R的組合。由于用引物擴增區(qū)域的GC含量高(70%),因此添加2%濃度的DMSO。當使用Tks、Tsi和KOD plus DNA聚合酶時,根據(jù)所附的說明使用KOD plus緩沖液。當使用KOD DNA聚合酶時,根據(jù)KOD DNA聚合酶所附的說明,使用KOD#1緩沖液。此外,根據(jù)所附的說明,在所附的緩沖液中使用Pyrobest DNA聚合酶。PCR的條件如下在96℃孵育2分鐘,隨后98℃5秒鐘;以及68℃30秒鐘,如此30個循環(huán)。反應后,向其中添加等體積的100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.O)飽和酚/氯仿/異戊醇混合物(25∶24∶1,v/v)。將混合物混合,然后在10,000xg離心10分鐘,兩次。離心后,將上清液與氯仿/異戊醇的混合物(24∶1,v/v)混合,然后在10,000xg離心10分鐘。將這樣獲得的上清液進行乙醇沉淀,將沉淀溶于20μlH2O中以獲得約0.5-bp DNA片段。根據(jù)TaKaRa BKL試劑盒(Takara Bio)的方案,對每8μl約0.5-bp DNA片段進行處理,使用每5μl所得的溶液轉化大腸桿菌JM109。培養(yǎng)所得的轉化體,測定12-24個插入約500-bp DNA片段的克隆的核苷酸序列,并且計算突變的核苷酸數(shù)與所閱讀的總核苷酸數(shù)的比值以確定保真性。結果如表4所示。
表4
如表4所示,進一步證實本發(fā)明的Tks和Tsi DNA聚合酶的突變頻率低于KOD、KOD plus或Pyrobest DNA聚合酶?;谏鲜鼋Y果,證明它們作為用于克隆的酶比KOD、KOD plus或Pyrobest DNA聚合酶更優(yōu)秀。
(4)Tks和Tce DNA聚合酶的保真性檢查Tks和Tce DNA聚合酶的保真性。使用KOD DNA聚合酶和KOD plus DNA聚合酶(來自Toyobo)以及Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)作為對照。
使用嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB8基因組DNA(TakaraBio)作為模板。另外,使用引物c240/RA18-F和-R(SEQ ID NOS36和37)。
為了測定保真性,使用10ng嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8基因組DNA作為模板,以及引物TEMP10-F和-R的組合,在50μl體積中進行PCR。由于引物所擴增的區(qū)域的GC含量高(70%),因此添加2%濃度的DMSO。根據(jù)所附的說明,使用KOD#1緩沖液作為緩沖液。PCR的條件和計算保真性的方法如實施例6-(3)所述。結果顯示于表5。
表5
如表5所示,進一步證明本發(fā)明的Tks和Tce DNA聚合酶的突變頻率低于KOD。也根據(jù)上述結果,證明它們作為用于克隆的酶很優(yōu)秀。
實施例7(1)各自DNA聚合酶的最適溫度測定Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶的最適溫度。使用20μg活化的小牛胸腺DNA作為模板。使用Pyrobest DNA聚合酶所附的緩沖液作為緩沖液。根據(jù)下列方法測定DNA聚合酶活性。
首先,制備含有5mU(根據(jù)如實施例6-(1)所述摻入活性測定方法所計算的)將要進行活性測定的酶標本、上述模板、200μM dATP、200μM dGTP、200μM dCTP、100μM dTTP、0.204μM[3H]甲基-TTP(Amersham)和Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)所附的1x緩沖液的50μl反應混合物。使用各自酶標本,在65℃-85℃范圍的期望溫度反應5分鐘。將每種反應混合物40μl點到DE81紙(Whatman)上。用5%Na2PO4洗滌4次后,使用液體閃爍計數(shù)器測定DE81紙上殘留的放射性。在圖1圖示根據(jù)上述活性測定方法所測定的活性和反應溫度之間的關系。在圖1中,將反應在85℃所觀察到的活性定義為100%。
如圖1所示,當使用活化的小牛胸腺DNA作為模板時,Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶具有75℃-85℃范圍的最適溫度。
(2)各DNA聚合酶的最適pH測定Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶的最適pH。使用10μg活化的小牛胸腺DNA作為模板。使用已在75℃時將pH調至pH 5.0-pH 8.0的期望值的120mM Tris-HCl緩沖液作為緩沖液。根據(jù)下列方法測定DNA聚合酶活性。
首先,制備含有0.05U(根據(jù)如實施例6-(1)所述摻入活性測定方法所計算的)將要進行活性測定的酶標本、上述模板、上述緩沖液、10mM KCl、6mM(NH4)2SO4、0.1%Triton X-100、0.001%BSA、1mMMgCl2、40μM dNTP和0.204μM[3H]甲基-TTP(Amersham)的50μl反應混合物。使用各自酶標本在75℃反應5分鐘。將每個混合物的40μl溶液點在DE81紙(Whatman)上。用5%Na2PO4洗滌4次后,使用液體閃爍計數(shù)器測定DE81紙上殘留的放射性。在圖2圖示根據(jù)上述活性測定方法所測定的活性與pH之間的關系。在圖2中,將在pH 6.0(75℃)時所觀察到的反應的活性定義為100%。
如圖2所示,當使用活化的小牛胸腺DNA作為模板時,Tks、Tce和Tsi DNA聚合酶具有pH 5.5-pH 6.5(75℃)范圍的最適pH。
實施例8為了將本發(fā)明的DNA聚合酶在PCR反應中的性能與KOD DNA聚合酶進行比較,使用λ-DNA作為模板進行PCR反應。用KOD plusDNA聚合酶所附的1x緩沖液、200μM dNTP和1mM(NH4)2SO4(對于Tks、Tce或Tsi DNA聚合酶);或者KOD DNA聚合酶所附的1x緩沖液、200μM dNTP和1mM MgCl2(對于KOD DNA聚合酶)的反應混合物組合物,制備含有1ng/50μlλ-DNA(Takara Shuzo)、10pmol/50μl引物λ-1、10pmol/50μlλ-9B和0.625U/50μl DNA聚合酶的50μl反應混合物。
在SEQ ID NOS38和39中分別示出引物λ-1和λ-9B的核苷酸序列。將反應混合物進行如下反應98℃10秒鐘;以及68℃10分鐘,如此30個循環(huán)。然后,將每個反應混合物的3μl溶液進行瓊脂糖凝膠電泳,并且通過用溴化乙錠染色觀察所擴增的DNA片段。結果,使用KOD DNA聚合酶沒有觀察到DNA片段的擴增。在另一個方面,使用Tks、Tce或Tsi DNA聚合酶觀察到約12k堿基對的DNA片段的擴增。
其次,將引物改變成引物λ-1和引物λ-10D進行實驗。在SEQ IDNO40中引物λ10D的核苷酸序列。用與上述相同的反應混合物組合物制備50μl含有1ng/50μlλ-DNA(Takara Shuzo)、10pmol/50μl引物λ-1、10pmol/50μl引物λ-10d和0.625U/50μlDNA聚合酶的反應混合物。將反應混合物進行下列PCR反應98℃10秒鐘;以及68℃10分鐘,如此30個循環(huán)。然后,將每個反應混合物的3μl溶液進行瓊脂糖凝膠電泳,并通過用溴化乙錠染色觀察所擴增的DNA片段。結果,使用KOD DNA聚合酶沒有觀察到DNA片段的擴增。在另一個方面,使用Tks、Tce或Tsi DNA聚合酶觀察到約15k堿基對的DNA片段的擴增。
實施例8(1)小鼠雜交瘤細胞系的生產向在實施例2中所制備的210μg(100μl)Tks DNA聚合酶制劑、在實施例4中所制備的210μg(100μl)Tce DNA聚合酶制劑,或者在實施例6中所制備的200μg(100μl)Tsi DNA聚合酶制劑添加800μlPBS。將每個混合物用1ml完全弗氏佐劑(Difco Lab.)乳化以獲得抗原制劑。將該抗原制劑分成相等的部分并通過腹膜內施用給4只Balb/c小鼠(10周齡,雌性,CREA日本)。在2和5周后進行下列強化免疫通過向與上述等量的DNA聚合酶制劑中添加900μlPBS和RIBI佐劑(RIBI)制備抗原制劑,向各自小鼠腹膜內施用其相等的部分。此外,初次抗原施用后6周進行下列終免疫通過向與上述等量的DNA聚合酶制劑中添加900μlPBS制備抗原制劑,并向各自組中的小鼠腹膜內施用其相等的部分。
終免疫后3天從所免疫動物中的兩只中除去脾,并且在存在50%聚乙二醇時與P3-X63-Ag8-U1小鼠骨髓瘤細胞進行細胞融合。將細胞分配到10個96孔平板內并培養(yǎng)。
(2)雜交瘤細胞系的篩選使用在實施例8-(1)中用作抗原的各DNA聚合酶制劑的溶液(5μg/ml),制備用DNA聚合酶包被的96孔平板。對于在上述細胞融合中所獲得的細胞,從觀察到細胞生長的孔中收集上清液,在DNA聚合酶包被的平板上進行ELISA法以測定培養(yǎng)物上清液中是否存在抗DNA聚合酶抗體。對使用DNA聚合酶作為抗原所獲得的900個或更多細胞系進行該試驗。根據(jù)該方法選擇鑒定為用于生產抗體的細胞系(TksDNA聚合酶95個細胞系;Tce DNA聚合酶103個細胞系;Tsi DNA聚合酶61個細胞系)。
培養(yǎng)所選的細胞系作為原始細胞系,在42℃使用培養(yǎng)物上清液檢查各自DNA聚合酶的聚合酶活性的抑制。根據(jù)下列方法測定抑制活性。將已與每個雜交瘤的培養(yǎng)物上清液中的IgG結合的抗小鼠IgG磁珠(Dynabeads M-280綿羊抗小鼠IgG,Dynal Biotech)和DNA聚合酶在室溫下孵育10分鐘。然后在42℃測定DNA聚合酶活性并與單獨使用DNA聚合酶得到的DNA聚合酶活性測定的結果進行比較。結果,在下列系的培養(yǎng)物上清液中觀察到DNA聚合酶活性的抑制Tks DNA聚合酶18個細胞系;Tce DNA聚合酶28個細胞系;Tsi DNA聚合酶11個細胞系。通過限制性稀釋分析,對這些細胞系進行克隆。
在42℃檢查每個克隆細胞的培養(yǎng)物上清液中DNA聚合酶的聚合酶活性的抑制。選擇下列系作為抑制95%或更高的聚合酶活性的雜交瘤克隆系Tks DNA聚合酶1個細胞系;Tce DNA聚合酶2個細胞系;Tsi DNA聚合酶2個細胞系。檢查由這些雜交瘤克隆系所產生的抗體的同種型。結果,Tks和Tce DNA聚合酶的抗體是IgG2b型,TsiDNA聚合酶的抗體是IgG1和G2b型。當將從雜交瘤的培養(yǎng)物上清液中所制備的抗體在94℃加熱5分鐘時,完全喪失抑制DNA聚合酶的活性。因此,證明這些抗體可以低溫度特異性方式用于抑制耐熱DNA聚合酶的活性。
工業(yè)應用性本發(fā)明提供適于引物延伸的具有高保真性DNA聚合酶活性的多肽,其可用于克隆、測序和核酸擴增,編碼該多肽的基因,以及用于生產具有DNA聚合酶活性的該多肽的方法。使用具有本發(fā)明的DNA聚合酶活性的多肽,可獲得具有較低錯誤率的擴增產物,例如,即使其用于包括多個循環(huán)的PCR。因此,其可用于以低拷貝數(shù)量存在的靶核酸的分析或鑒別。
序列表自由文本SEQ ID No1;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TPPolBF4SEQ ID No2;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TPPolBF5SEQ ID No3;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TTPolBR1SEQ ID No4;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TTPolBR4SEQ ID No5;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks01SEQ ID No6;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸標簽序列區(qū)SEQ ID No7;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks04SEQ ID No8;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks02SEQ ID No9;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物TksNdeSEQ ID No10;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks1EndBgSEQ ID No11;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks2StaBgSEQ ID No12;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks2EndBalSEQ ID No13;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks3StaBalSEQ ID No14;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物TksBgPsSEQ ID No17;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TPPolBF1
SEQ ID No18;設計用于擴增熱球菌屬某種(Thermocoecus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TTPoIBR5SEQ ID No19;設計用于擴增速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA的寡核苷酸引物Tce01SEQ ID No20;設計用于擴增速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA的寡核苷酸引物Tce02SEQ ID No21;設計用于擴增速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA的寡核苷酸引物TceNdeSEQ ID No22;設計用于擴增速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA的寡核苷酸引物TceBgPsSEQ ID No25;設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物Tsi01SEQ ID No26;設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物Tsi06SEQ ID No27;設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物TsiNdeSEQ ID No28;設計用于擴增Thermocoecus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物TsiASEQ ID No29;設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物TsiBSEQ ID No30;設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物TsiBamPstSEQ ID No33;設計用于擴增M13基因組DNA的寡核苷酸引物HT SEQ ID No34;設計用于擴增嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8基因組DNA的寡核苷酸引物c280/RG34-FSEQ ID No35;設計用于擴增嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)HB-8基因組DNA的寡核苷酸引物c280/RG34-RSEQ ID No36;設計用于擴增嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)HB-8基因組DNA的寡核苷酸引物c240/RA18-FSEQ ID No37;設計用于擴增嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)HB-8基因組DNA的寡核苷酸引物c240/RA18-RSEQ ID No38;設計用于擴增噬菌體λ的DNA的寡核苷酸引物λ-1SEQ ID No39;設計用于擴增噬菌體λ的DNA的寡核苷酸引物λ-9BSEQ ID No40;設計用于擴增噬菌體λ的DNA的寡核苷酸引物λ-10D。
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>具有DNA聚合酶活性的多肽<130>665234<150>JP 2004-166541<151>2004-06-04<160>40<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TPPolBF4<220>
<221>特征<222>(35)..(35)<223>n代表任何堿基<400>1ttaatacgac tcactatagg cacaacgtct crccngayac40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TPPolBF5<220>
<221>特征<222>(32)..(32)<223>n代表任何堿基
<220>
<221>特征<222>(35)..(35)<223>n代表任何堿基<400>2ttaatacgac tcactatagg gagagcgtta cngcntgggg40<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TTPolBR1<400>3gctagttatt gctcagcgga cctggttctc katrtarta 39<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TTPolBR4<400>4gctagttatt gctcagcggg taacgctctc kgcrcaytc 39<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks01<400>5cttcatcttc ttctttatct t21
<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸標簽序列區(qū)<400>6ttacgtctga cgtgtg 16<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks04<400>7attcccatac ttttctaact c21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks02<400>8accggtcccc acgttgccgt t21<210>9<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物TksNde<400>9gattatgggg gatgacatat gatcctcgac actgac36<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks1EndBg<400>10ggggtacaga gatctaaaat ctaggtacac tat 33<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks2StaBg<400>11gtacctagat tttagatctc tgtacccctc aatcatcatc40<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks2EndBal<400>12gtagccgtag tagctgttgg ccaggatctt gat 33
<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物Tks3StaBal<400>13atcaagatcc tggccaacag ctactacggt tactacggct40<210>14<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1基因組DNA的寡核苷酸引物TksBgPs<400>14tccgctggaa aacctgcaga gatctcaagt tcccttcgg 39<210>15<211>2325<212>DNA<213>熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1<400>15atgatcctcg acactgacta cataactgag aatggaaaac ccgtcataag gattttcaag 60aaggagaacg gcgagtttaa gattgagtac gataggactt ttgaacccta catttacgcc 120ctcctgaagg acgattctgc cattgaggag gtcaagaaga taaccgccga gaggcacgga 180acggttgtaa cggttaagcg ggctgaaaag gttcagaaga agttcctcgg gagaccagtt 240gaggtctgga aactctactt tactcaccct caggacgtcc cagcgataag ggacaagata 300cgagagcatc cagcagttat tgacatctac gagtacgaca tacccttcgc caagcgctac 360
ctcatagaca agggattagt gccaatggaa ggcgacgagg agctgaaaat gcttgccttt 420gatatcgaga cgctctacca tgagggcgag gagttcgccg aggggccaat ccttatgata 480agctacgccg acgaggaagg ggccagggtg ataacgtgga agaacgcgga tctgccctac 540gttgacgtcg tctcgacgga gagggagatg ataaagcgct tcctaaaggt ggtcaaagag 600aaagatcctg acgtcctaat aacctacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctacctaaaa 660aaacgctgtg aaaagcttgg aataaacttc acgctcggaa gggacggaag cgagccgaag 720attcagagga tgggcgacag gtttgccgtc gaagtgaagg gacggataca cttcgatctc 780tatcctgtga taagacggac gataaacctg cccacataca cgcttgaggc cgtttatgaa 840gccgtcttcg gtcagccgaa ggagaaggtc tacgctgagg agatagctac agcttgggag 900agcggtgaag gccttgagag agtagccaga tactcgatgg aagatgcgaa ggtcacatac 960gagcttggga aggagttttt ccctatggag gcccagcttt ctcgcttaat cggccagtcc 1020ctctgggacg tctcccgctc cagcactggc aacctcgttg agtggttcct cctcaggaag 1080gcctacgaga ggaatgagct ggccccgaac aagcccgatg aaaaggagct ggccagaaga 1140cgacagagct atgaaggagg ctatgtaaaa gagcccgaga gagggttgtg ggagaacata 1200gtgtacctag attttagatc tctgtacccc tcaatcatca tcacccacaa cgtctcgccg 1260gatactctca acagggaagg atgcaaggaa tatgacgttg ccccccaggt cggtcaccgc 1320ttctgcaagg acttcccagg atttatcccg agcctgcttg gagacctcct agaggagagg 1380cagaagataa agaagaagat gaaggccacg attgacccga tcgagaggaa gctcctcgat 1440tacaggcaga gggccatcaa gatcctggcc aacagctact acggttacta cggctatgca 1500agggcgcgct ggtactgcaa ggagtgtgca gagagcgtaa cggcctgggg aagggagtac 1560ataacgatga ccatcagaga gatagaggaa aagtacggct ttaaggtaat ctacagcgac 1620accgacggat tttttgccac aatacctgga gccgatgctg aaaccgtcaa aaagaaggcg 1680
atggagttcc tcaagtatat caacgccaaa ctcccgggcg cgcttgagct cgagtacgag 1740ggcttctaca aacgcggctt cttcgtcacg aagaagaagt acgcggtgat agacgaggaa 1800ggcaagataa caacgcgcgg acttgagatt gtgaggcgcg actggagcga gatagcgaaa 1860gagacgcagg cgagggttct tgaagctttg ctaaaggacg gtgacgtcga gaaggccgtg 1920aggatagtca aagaagttac cgaaaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaagctg 1980gtgatccacg agcagataac gagggattta aaggactaca aggcaaccgg tccccacgtt 2040gccgttgcca agaggttggc cgcgagagga gtcaaaatac gccctggaac ggtgataagc 2100tacatcgtgc tcaagggctc tgggaggata ggcgacaggg cgataccgtt cgacgagttc 2160gacccgacga agcacaagta cgacgccgag tactacattg agaaccaggt tctcccagcc 2220gttgagagaa ttctgagagc cttcggttac cgcaaggaag acctgcgcta ccagaagacg 2280agacaggttg gtctgggagc ctggctgaag ccgaagggaa cttga 2325<210>16<211>774<212>PRT<213>熱球菌屬(Thermococcus sp.)KS-1<400>16Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile1 5 10 15Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg20 25 30Thr Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile35 40 45Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Thr50 55 60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val65 70 75 80Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile85 90 95Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr100 105 110Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro115 120 125Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr130 135 140Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile145 150 155 160Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Asn Ala165 170 175Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Lys180 185 190Arg Phe Leu Lys Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr195 200 205Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu210 215 220Lys Leu Gly Ile Asn Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile245 250 255His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr260 265 270Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu275 280 285Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly290 295 300Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr305 310 315 320Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu325 330 335Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu340 345 350Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala355 360 365Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gln Ser Tyr370 375 380Glu Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile385 390 395 400Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp420 425 430Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe435 440 445Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys450 455 460Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp465 470 475 480Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr485 490 495Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser500 505 510Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Arg Glu Ile515 520 525Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe530 535 540Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala545 550 555 560Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu565 570 575Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu595 600 605Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala610 615 620Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val625 630 635 640Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro645 650 655Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp660 665 670Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala675 680 685Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu690 695 700Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe705 710 715 720Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln725 730 735Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys740 745 750Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp755 760 765
Leu Lys Pro Lys Gly Thr770<210>17<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TPPolBF1<400>17ttaatacgac tcactatagg cgctacctca tmgayaargg40<210>18<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增熱球菌屬(Thermococcus sp.)基因組DNA的寡核苷酸引物TTPolBR5<400>18gctagttatt gctcagcggg tatctggyga gacrttrtg 39<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA的寡核苷酸引物Tce01<400>19cgtggtaaga gggtctcgaa t21<210>20<211>21
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA的寡核苷酸引物Tce02<400>20ctcaagggct ccggaaggat a21<210>21<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA的寡核苷酸引物TceNde<400>21aatccaacgg gtggtcatat gatcctcgac gctgac36<210>22<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增速生熱球菌(Thermococcus celer)基因組DNA的寡核苷酸引物TceBgPs<400>22cagagaggag catgcagatc ttcacccctt ccccgcgtt 39<210>23<211>2325<212>DNA<213>速生熱球菌(Thermococcus celer)<400>23atgatcctcg acgctgacta catcaccgaa gatgggaagc ccgtcgtgag gatattcagg 60aaggagaagg gcgagttcag aatcgactac gacagggact tcgagcccta catctacgcc 120
ctcctgaagg acgattcggc catcgaggag gtgaagagga taaccgttga gcgccacggg 180aaggccgtca gggttaagcg ggtggagaag gtcgaaaaga agttcctcaa caggccgata 240gaggtctgga agctctactt caatcacccg caggacgttc cggcgataag ggacgagata 300aggaagcatc cggccgtcgt tgatatctac gagtacgaca tccccttcgc caagcgctac 360ctcatcgata aggggctcgt cccgatggag ggggaggagg agctcaaact gatggccttc 420gacatcgaga ccctctacca cgagggagac gagttcgggg aggggccgat cctgatgata 480agctacgccg acggggacgg ggcgagggtc ataacctgga agaagatcga cctcccctac 540gtcgacgtcg tctcgaccga gaaggagatg ataaagcgct tcctccaggt ggtgaaggag 600aaggacccgg acgtgctcgt aacttacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctacctgaag 660agacgctccg aggagcttgg attgaagttc atcctcggga gggacgggag cgagcccaag 720atccagcgca tgggcgaccg cttcgccgtc gaggtgaagg ggaggataca cttcgacctc 780tacccggtga taaggcgcac cgtgaacctg ccgacctaca cgctcgaggc ggtctacgag 840gccatcttcg ggaggccaaa ggagaaggtc tacgccgggg agatagtgga ggcctgggaa 900accggcgagg gtcttgagag ggttgcccgc tactccatgg aggacgcaaa ggttaccttc 960gagctcggga gggagttctt cccgatggag gcccagctct cgaggctcat cggccagggt 1020ctctgggacg tctcccgctc gagcaccggc aacctggtcg agtggttcct cctgaggaag 1080gcctacgaga ggaacgaact ggccccgaac aagccgagcg gccgggaagt ggagatcagg 1140aggcgtggct acgccggtgg ttacgttaag gagccggaga ggggtttatg ggagaacatc 1200gtgtacctcg actttcgctc tctttacccc tccatcatca taacccacaa cgtctcgccc 1260gataccctaa acagggaggg ctgtgagaac tacgacgtcg ccccccaggt ggggcataag 1320ttctgcaaag attttccggg cttcatcccg agcctgctcg gaggcctgct tgaggagagg 1380cagaagataa agcggaggat gaaggcctct gtggatcccg ttgagcggaa gctcctcgat 1440
tacaggcaga gggccatcaa gatactggcc aacagcttct acggatacta cggctacgcg 1500agggcgaggt ggtactgcag ggagtgcgcg gagagcgtta ccgcctgggg cagggagtac 1560atcgataggg tcatcaggga gctcgaggag aagttcggct tcaaggtgct ctacgcggac 1620acggacggac tgcacgccac gatccccggg gcggacgccg ggaccgtcaa ggagagggcg 1680agggggttcc tgagatacat caaccccaag ctccccggcc tcctggagct cgagtacgag 1740gggttctacc tgaggggttt cttcgtgacg aagaagaagt acgcggtcat agacgaggag 1800ggcaagataa ccacgcgcgg cctcgagata gtcaggcggg actggagcga ggtggccaag 1860gagacgcagg cgagggtcct ggaggcgata ctgaggcacg gtgacgtcga ggaggccgtt 1920agaatcgtca gggaggtaac cgaaaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaaactg 1980gtgatccacg agcagataac gagggatttg agggactaca aagccacggg accgcacgtg 2040gcggtggcga agcgcctggc cgggaggggg gtaaggatac gccccgggac ggtgataagc 2100tacatcgtcc tcaagggctc cggaaggata ggggacaggg cgattccctt cgacgagttc 2160gacccgacta agcacaggta cgacgccgac tactacatcg agaaccaggt tctgccagcc 2220gtcgagagga tcctgaaggc cttcggctac cgcaaggagg acctgaaata ccagaagacg 2280aggcaggtgg gcctgggtgc gtggctcaac gcggggaagg ggtga 2325<210>24<211>774<212>PRT<213>速生熱球菌(Thermococcus celer)<400>24Met Ile Leu Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Val1 5 10 15Arg Ile Phe Arg Lys Glu Lys Gly Glu Phe Arg Ile Asp Tyr Asp Arg20 25 30
Asp Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile35 40 45Glu Glu Val Lys Arg Ile Thr Val Glu Arg His Gly Lys Ala Val Arg50 55 60Val Lys Arg Val Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Asn Arg Pro Ile65 70 75 80Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile85 90 95Arg Asp Glu Ile Arg Lys His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr100 105 110Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro115 120 125Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Leu Met Ala Phe Asp Ile Glu Thr130 135 140Leu Tyr His Glu Gly Asp Glu Phe Gly Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile145 150 155 160Ser Tyr Ala Asp Gly Asp Gly Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile165 170 175Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys180 185 190Arg Phe Leu Gln Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Val Thr195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Arg Arg Ser Glu210 215 220Glu Leu Gly Leu Lys Phe Ile Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys225 230 235 240Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile245 250 255His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Val Asn Leu Pro Thr260 265 270Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Arg Pro Lys Glu275 280 285Lys Val Tyr Ala Gly Glu Ile Val Glu Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly290 295 300Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Phe305 310 315 320Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu325 330 335Ile Gly Gln Gly Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu340 345 350Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala355 360 365Pro Asn Lys Pro Ser Gly Arg Glu Val Glu Ile Arg Arg Arg Gly Tyr370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile385 390 395 400Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His405 410 415Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Glu Asn Tyr Asp420 425 430Val Ala Pro Gln Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe435 440 445Ile Pro Ser Leu Leu Gly Gly Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys450 455 460Arg Arg Met Lys Ala Ser Val Asp Pro Val Glu Arg Lys Leu Leu Asp465 470 475 480Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr485 490 495Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Arg Glu Cys Ala Glu Ser500 505 510Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Asp Arg Val Ile Arg Glu Leu515 520 525Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Leu530 535 540His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Gly Thr Val Lys Glu Arg Ala545 550 555 560
Arg Gly Phe Leu Arg Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu565 570 575Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Leu Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys580 585 590Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu595 600 605Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Val Ala Lys Glu Thr Gln Ala610 615 620Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Arg His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val625 630 635 640Arg Ile Val Arg Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro645 650 655Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Arg Asp660 665 670Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Gly675 680 685Arg Gly Val Arg Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu690 695 700Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe705 710 715 720Asp Pro Thr Lys His Arg Tyr Asp Ala Asp Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys740 745 750Glu Asp Leu Lys Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp755 760 765Leu Asn Ala Gly Lys Gly770<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物Tsi01<400>25ctcatggtag agcgtctcaa t21<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物Tsi06<400>26catcagctac atcgtgctca a 21<210>27<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物TsiNde
<400>27tacccggtgt cccatatgat cctcgacacg gactac36<210>28<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物TsiA<400>28ctttatgcgg acactgacgg cttcttcgcg acg 33<210>29<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物TsiB<400>29gaagccgtca gtgtccgcat aaagtacttt aaagcc36<210>30<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增Thermococcus siculi基因組DNA的寡核苷酸引物TsiBamPst<400>30gttcacttgc tgcagggatc ctcacccctt ccccttcgg 39<210>31<211>2328<212>DNA
<213>Thermococcus siculi<400>31atgatcctcg acacggacta catcacggaa gatgggaaac ccgtcataag gatattcaag 60aaagagaacg gcgagttcaa gatcgagtac gacaggactt ttgaacccta catctacgcc 120ctcctgaagg acgactccgc gattgaggat gttaaaaaga taaccgccga gaggcacgga 180acggtggtga aggtcaagcg cgccgaaaag gtgcagaaga agttcctagg caggccggtt 240gaagtctgga agctctactt cacccacccc caagatgtcc cggcgataag ggacaagatt 300aggaagcatc cagctgtaat tgacatctac gagtacgaca taccattcgc caagcgctac 360ctcatcgaca agggcctgat tccgatggag ggtgaagaag agcttaagat gctcgccttc 420gacattgaga cgctctacca tgagggtgag gagttcgccg aggggcctat tctgatgata 480agctacgccg acgagagcga ggcacgcgtc atcacctgga agaaaatcga cctcccctac 540gttgacgtcg tctcaacgga gaaggagatg ataaagcgct tcctccgcgt tgtgaaggag 600aaagatcccg atgtcctcat aacctacaac ggcgacaact tcgacttcgc ctacctgaag 660aagcgctgtg aaaagcttgg aataaacttc ctccttggaa gggacgggag cgagccgaag 720atccagagaa tgggtgaccg cttcgccgtt gaggtgaagg ggaggataca cttcgacctc 780tatcctgtaa taaggcgcac gataaacctg ccgacctaca tgcttgaggc agtctacgag 840gccatctttg ggaagccaaa ggagaaggtt tacgccgagg agatagccac cgcttgggaa 900accggagagg gccttgagag ggtggctcgc tactctatgg aggacgcgaa ggtcacgttt 960gagcttggaa aggagttctt cccgatggag gcccaacttt cgaggttggt cggccagagc 1020ttctgggatg tcgcgcgctc aagcacgggc aatctggtcg agtggttcct cctcaggaag 1080gcctacgaga ggaacgagct ggctccaaac aagccctctg gaagggaata tgacgagagg 1140cgcggtggat acgccggcgg ctacgtcaag gaaccggaaa agggcctgtg ggagaacata 1200gtctacctcg actataaatc tctctacccc tcaatcatca tcacccacaa cgtctcgccc 1260
gataccctca accgcgaggg ctgtaaggag tatgacgtag ctccacaggt cggccaccgc 1320ttctgcaagg actttccagg cttcatcccg agcctgctcg gggatctcct ggaggagagg 1380cagaagataa agaggaagat gaaggcaaca attgacccga tcgagagaaa gctccttgat 1440tacaggcaac gggccatcaa gatccttcta aatagttttt acggctacta cggctacgca 1500agggctcgct ggtactgcaa ggagtgtgcc gagagcgtta cggcatgggg aagggaatat 1560atcaccatga caatcaggga aatagaagag aagtatggct ttaaagtact ttatgcggac 1620actgacggct tcttcgcgac gattcccggg gaagatgccg agaccatcaa aaagagggcg 1680atggagttcc tcaagtacat aaacgccaaa ctccccggtg cgctcgaact tgagtacgag 1740gacttctaca ggcgcggctt cttcgtcacc aagaagaaat acgcggttat cgacgaggag 1800ggcaagataa caacgcgcgg gctggagatc gtcaggcgcg actggagcga gatagccaag 1860gagacgcagg cgcgggttct ggaggccctt ctgaaggacg gtgacgtcga agaggccgtg 1920agcatagtca aagaagtgac cgagaagctg agcaagtacg aggttccgcc ggagaagctc 1980gttatccacg agcagataac gcgcgagctg aaggactaca aggcaacggg accacacgtg 2040gcgatagcga agaggttagc cgcgagaggc gtcaaaatcc gccccgggac agtcatcagc 2100tacatcgtgc tcaagggctc cgggaggata ggcgacaggg cgattccctt cgacgagttc 2160gaccccacga agcacaagta cgatgcagag tactacatcg agaaccaggt tctacctgcc 2220gtcgagagga ttctgaaggc cttcggctat cgcggtgagg agctcagata ccagaagacg 2280aggcaggttg gacttggggc gtggctgaag ccgaagggga aggggtga 2328<210>32<211>775<212>PRT<213>Thermococcus siculi<400>32
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile1 5 10 15Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg20 25 30Thr Phe Glu Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile35 40 45Glu Asp Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Thr Val Val Lys50 55 60Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Val65 70 75 80Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile85 90 95Arg Asp Lys Ile Arg Lys His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr100 105 110Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro115 120 125Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr130 135 140Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile145 150 155 160Ser Tyr Ala Asp Glu Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys180 185 190Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr195 200 205Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu210 215 220Lys Leu Gly Ile Asn Phe Leu Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys225 230 235 240Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile245 250 255His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr260 265 270Tyr Met Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu275 280 285Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Gly290 295 300Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Phe305 310 315 320Glu Leu Gly Lys Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu325 330 335Val Gly Gln Ser Phe Trp Asp Val Ala Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala355 360 365Pro Asn Lys Pro Ser Gly Arg Glu Tyr Asp Glu Arg Arg Gly Gly Tyr370 375 380Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn Ile385 390 395 400Val Tyr Leu Asp Tyr Lys Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His405 410 415Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp420 425 430Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe435 440 445Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys450 455 460Arg Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp465 470 475 480Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Leu Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr485 490 495Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser500 505 510Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Arg Glu Ile515 520 525
Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe530 535 540Phe Ala Thr Ile Pro Gly Glu Asp Ala Glu Thr Ile Lys Lys Arg Ala545 550 555 560Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu565 570 575Leu Glu Tyr Glu Asp Phe Tyr Arg Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys580 585 590Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu595 600 605Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala610 615 620Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Glu Ala Val625 630 635 640Ser Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro645 650 655Pro Glu Lys Leu Val lle His Glu Gln Ile Thr Arg Glu Leu Lys Asp660 665 670Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Ile Ala Lys Arg Leu Ala Ala675 680 685Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu690 695 700
Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe705 710 715 720Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln725 730 735Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Gly740 745 750Glu Glu Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp755 760 765Leu Lys Pro Lys Gly Lys Gly770 775<210>33<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增M13基因組DNA的寡核苷酸引物HT<400>33ccggaaccgc ctccctcaga gccgccaccc tcagaaccgc caccc 45<210>34<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8基因組DNA的寡核苷酸引物c280/RG34-F<400>34atatcatatg aaagaggcct tcaaggaggc cctcgccc 38
<210>35<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8基因組DNA的寡核苷酸引物c280/RG34-R<400>35atatagatct ttattacgat ggccatacca acctcctgta40<210>36<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8基因組DNA的寡核苷酸引物c240/RA18-F<400>36atatcatatg aaagtagagg aagtggttct tcccggcg 38<210>37<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)HB-8基因組DNA的寡核苷酸引物c240/RA18-R<400>37atatagatct ttattagaag ctccccttca gggcctccac40<210>38<211>35<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>設計用于擴增λDNA的寡核苷酸引物λ-1B<400>38gatgagttcg tgtccgtaca actggcgtaa tcatg 35<210>39<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增λDNA的寡核苷酸引物λ-9B<400>39tgtccgtcag ctcataacgg tacttcacg29<210>40<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>設計用于擴增λDNA的寡核苷酸引物λ-10D<400>40atatctggcg gtgcaatatc ggtactgt 282權利要求
1.一種具有DNA聚合酶活性的多肽,其具有選自下列的氨基酸序列或具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一個或幾個氨基酸的氨基酸序列(a)SEQ ID NO16的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO24的氨基酸序列;和(c)SEQ ID NO32的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所定義多肽的核酸。
3.根據(jù)權利要求2的核酸,其具有SEQ ID NO15、23或31,或其部分的核苷酸序列。
4.一種編碼具有DNA聚合酶活性的多肽的核酸,其在嚴格條件下與和權利要求3定義的核酸互補的核苷酸序列構成的核酸雜交。
5.一種生產多肽的方法,該方法包括培養(yǎng)能生產多肽的細胞,和從培養(yǎng)物中收集所述的多肽,其中所述多肽具有DNA聚合酶活性,并且具有選自下列的氨基酸序列或者具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一個或幾個氨基酸的氨基酸序列(a)SEQ ID NO16的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO24的氨基酸序列;和(c)SEQ ID NO32的氨基酸序列。
6.一種擴增核酸的方法,該方法包括使用多肽擴增核酸,其中所述多肽具有DNA聚合酶活性,并且具有選自下列的氨基酸序列或者具有在所述氨基酸序列中缺失、插入、添加或取代一個或幾個氨基酸的氨基酸序列(a)SEQ ID NO16的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO24的氨基酸序列;和(c)SEQ ID NO32的氨基酸序列。
7.用于擴增核酸的組合物,其含有權利要求1所定義的多肽。
8.含有權利要求1所定義的多肽的試劑盒。
9.結合權利要求1所定義的多肽的抗體。
全文摘要
一種具有高保真性DNA聚合酶活性并可用作基因工程試劑的多肽;編碼該多肽的基因;生產該多肽的方法;以及通過使用該多肽擴增核酸的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1993468SQ20058002651
公開日2007年7月4日 申請日期2005年5月12日 優(yōu)先權日2004年6月4日
發(fā)明者佐藤好美, 西脅一惠, 島田奈奈, 外園成和, 上森隆司, 向井博之, 加藤郁之進 申請人:寶生物工程株式會社