專利名稱：一種水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻不僅是重要的糧食作物，而且還是單子葉植物分子生物學(xué)研究的模式植物。水稻的基因組比較小，大約430Mb，而重復(fù)序列的含量相對較低。水稻基因組與其他禾本科作物如小麥、玉米等有很高的共線性和基因間的同源性，在比較基因組研究中有較大的利用價值。另外，水稻中建立了比較良好的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可以比較容易的驗(yàn)證目標(biāo)基因的功能。
圖位克隆技術(shù)(Map-based cloning)已經(jīng)發(fā)展成為克隆植物基因的有效方法，在水稻重要性狀基因克隆中占主導(dǎo)地位。該方法可以在基因產(chǎn)物未知的情況下，根據(jù)突變體的表型和遺傳定位的結(jié)果分離目的基因。從理論上講，可以分離任何基因，因此在植物遺傳與發(fā)育生物學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。圖位克隆方法的應(yīng)用需要具備以下幾個條件具有高密度的分子標(biāo)記圖譜；具有YAC或BAC文庫及物理圖譜；親本間具有較高多態(tài)性的分離群體等。水稻兩亞種基因組測序的完成，將成倍地加快水稻重要農(nóng)藝性狀基因的圖位克隆速度。
水稻的葉是單葉，分葉片(leaf blade)和葉鞘(leaf sheath)兩部分。葉片和葉鞘相接處的外側(cè)有色澤稍淡的帶狀結(jié)構(gòu)，稱為葉枕(collar)。葉枕有彈性和延伸性，借以調(diào)節(jié)葉片的位置和角度。葉片和葉鞘相接處的腹面有一膜質(zhì)向上突出的片狀結(jié)構(gòu)，稱為葉舌(ligule)，可以防止害蟲、水分、病菌孢子等進(jìn)入葉鞘處，也能使葉片向外伸展，多受光照。葉舌兩側(cè)有片狀、爪狀或毛狀的突出物，稱為葉耳(auricle)。葉舌和葉耳的有無、形狀、大小等，可以作為鑒定禾本科植物種類或品種以及識別幼苗或雜草的依據(jù)。
水稻無葉舌和無葉耳突變體有相似的表型，沒有葉舌和葉耳結(jié)構(gòu)，葉枕結(jié)構(gòu)亦消失，葉片和主莖之間的角度變小，葉片向上，水稻植株成緊密型株型，適合密植。水稻無葉舌和無葉耳突變體基因的克隆和功能研究，對于分子設(shè)計水稻的理想株型，從而提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。
另外，禾本科植物的葉舌和葉耳結(jié)構(gòu)多種多樣。例如，水稻的葉舌頂端分歧成狹三角形；玉米的葉舌呈半月形，兩側(cè)對稱；黍的葉舌成條形。無葉舌突變體在玉米、水稻、大麥、小麥、高粱等禾本科作物中均有報道。比較圖譜分析表明，控制禾本科作物無葉舌性狀的基因可能為同一個定向進(jìn)化同源基因(orthologousgene)。利用水稻和玉米的無葉舌突變體材料和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進(jìn)行l(wèi)iguleless基因的互換(swap)實(shí)驗(yàn)，有利于揭示植物形態(tài)多樣性的分子和進(jìn)化機(jī)制，從而為植物株型的分子設(shè)計提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白，名稱為0sLG，來源于稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
其中，序列表中的序列2由416個氨基酸殘基組成。自序列2的氨基端的第170位氨基酸殘基可為Phe或Leu。
上述水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因(OsLG)，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
上述水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白的cDNA基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交并洗膜。
序列表中的序列1由1791個脫氧核苷酸組成，它的編碼序列為自序列1的5′端第281位至1531位脫氧核苷酸。
自序列1的5′端第788位存在SNP單核苷酸多態(tài)性，可為C或T。
含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系和工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因，對于分子設(shè)計水稻的理想株型，培育高產(chǎn)水稻品種、提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。


圖1為野生型(ZF802)和突變體(lg，aur)的照片圖2為SSR RM470檢測ZF802×aur F2分離群體中突變體PCR擴(kuò)增結(jié)果圖3為CAPS marker檢測日本晴×aur F2分離群體結(jié)果圖4為CAPS-5FR marker檢測ZF802×aur F2分離群體結(jié)果圖5為葉耳葉舌基因的精細(xì)定位具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實(shí)施例1、水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白OsLG及其編碼基因的獲得實(shí)驗(yàn)材料及群體配制野生型水稻ZF802有葉耳和葉舌結(jié)構(gòu)(圖1)。中國農(nóng)科院杭州水稻所錢前博士在田間分別發(fā)現(xiàn)了無葉舌(liguleless)和無葉耳(auricleless)兩種突變體lg和aur(圖1)，經(jīng)遺傳分析鑒定兩種突變體均為單隱性核基因控制。兩突變體表型相似，經(jīng)等位基因測試分析發(fā)現(xiàn)無葉舌(lg)和無葉耳基因(aur)是等位基因。因此，命名該基因?yàn)镺sliguleless，縮寫為OsLG。
F2群體ZF802×lg F2 6570株，隱性突變體2523株。
利用已配好的F2群體、現(xiàn)有的水稻基因組信息學(xué)和比較基因組學(xué)對無葉耳葉舌基因進(jìn)行圖位克隆并進(jìn)行相應(yīng)的功能驗(yàn)證。
1、水稻基因組DNA的提取水稻基因組DNA的提取根據(jù)CTAB方法[Murray，M.G.and W.F.Thompson，Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research，1980.8p.4321-4325.]，并進(jìn)行了一些修改。1.DNA提取緩沖液的準(zhǔn)備，按順序依次加1體積的DNA提取溶液(0.35mol/L sorbitol；0.1mol/L Tris，pH8.2；0.005mol/L EDTA)，1體積的核裂解液(0.2mol/L Tris，pH7.5；0.05mol/L EDTA；2mol/L NaCl；0.055mol/L CTAB)和0.4體積的5％ sarkosyl。用前加入亞硫酸氫鈉，終濃度為0.02mol/L。輕輕混勻，于65℃水浴。2.稱量0.1g的水稻葉片用液氮研磨成粉狀，然后加入700μl的DNA提取緩沖液，65℃水浴30min至60min。3.加700μl的氯仿∶異戊醇(24∶1)，并混勻。4.10000rpm離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加2/3至1倍體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻至DNA沉淀。5.13000rpm離心8min，倒出上清液，用70％的己醇洗滌DNA沉淀。6.將DNA涼干并溶于100μl TE或純水中。每一個dCAPS、SSR和CAPS反應(yīng)用1μl DNA樣品。
2、利用現(xiàn)有的SSR Marker對水稻無葉耳葉舌基因粗定位、利用水稻基因組序列設(shè)計CAPS和dCAPS Marker對水稻無葉耳葉舌基因進(jìn)行精細(xì)定位結(jié)合水稻基因組生物信息學(xué)分析初步認(rèn)為水稻無葉舌突變體基因位于第四染色體OSJNBa0071I13 BAC內(nèi)，預(yù)測的水稻liguleless基因位置在OSJNBa0071I13BAC克隆的99084-102524bp之間，基因全長3440bp，有3個外顯子。選擇6個水稻第四染色體長臂離liguleless位點(diǎn)區(qū)域較近的SSR標(biāo)記，檢測野生型和突變體親本，RM470、RM317和RM303引物在親本之間檢測到多態(tài)性，用RM470引物對236株ZF802×aur F2隱性突變體進(jìn)行PCR檢測驗(yàn)證，結(jié)果有46株單交換個體，RM470與liguleless基因連鎖，交換率為9.746％，遺傳距離9.76cM(圖2)。圖2中，Mmarker；ZFwild ZF802；aurauricleless mutant。
比較已經(jīng)公布的粳稻OSJNBa0071I13 BAC克隆序列和相應(yīng)的秈稻序列，設(shè)計了CAPS引物，用CAPS-1F2R2對日本晴×lg F2群體進(jìn)行作圖，465株隱性突變體，出現(xiàn)8個單交換重組個體，CAPS-1F2R2與lg基因的交換率為0.8602％，遺傳距離0.86cM，約258kb(圖3)。圖3中，Mmarker；NPwild日本晴；aurauriclelessmutant digest with HaeIII。
用CAPS-5FR對ZF802×lg F2群體進(jìn)行作圖，498株隱性突變體，出現(xiàn)8個單交換重組個體，CAPS-5FR與OsLG基因的交換率為0.8048％，遺傳距離0.80cM，約240kb(圖4)。圖4中，Mmarker；ZFwild ZF802；aurauricleless mutant digestwith HaeIII。CAPS-5FR與CAPS-1F2R2標(biāo)記相距58kb，分析作圖結(jié)果表明OsLG基因的位置應(yīng)位于CAPS-5FR標(biāo)記之間。
3、其中SSR反應(yīng)參照文獻(xiàn)(Lee DS，Chen LJ，Suh HS.Geneticcharacterization and fine mapping of a novel thermo-sensitive genicmale-sterile gene tms6 in rice(Oryza sativa L.Theor Appl Genet.2005 Aug25)，其中SSR引物序列為RM470RAGAACCAGTTCTACGTCACGRM470FTCCTCATCGGCTTCTTCTTC
CAPS和dCAPS反應(yīng)參照文獻(xiàn)(Neff MM，Neff JD，Chory J，Pepper AE.dCAPS，a simple technique for the genetic analysis of single nucleotidepolymorphismsexperimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.Plant J.1998 May；14(3)387-92.)dCAPS標(biāo)記dCAPS-1FRwf引物和內(nèi)切酶為Forwardwf5’-AGAGCCAAGGAGCTGTCTCGCG-3’Reversewf5’-GCTGAAGGATGTTGCTGTGTTGGTG-3’HhaI酶切CAPS-1F2R2CAPS-1F2 5’-GGGTGTGTACGTTGTGACATC-3’CAPS-1R2 5’-CGATTAGCGGCTGAGAGTAAC-3’NruI，酶切CAPs5FRCAPS-5F 5’-CAATGCCGCTGAACTGCTAA-3’CAPS-5R 5’-AGACGCTGGGACCTAAACTG-3’HaeIII酶切通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在標(biāo)記CAPs-1F2R2和CAPs5FR(圖5)之間僅存在三個可能的基因，其中OSJNBa0071I13.12恰好是玉米ligulesess基因的同源基因。
4、克隆水稻無葉耳葉舌基因并尋找無葉耳葉舌基因在突變體中的缺陷利用位于OSJNBa0071I13.12 3’端的dCAPS標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與水稻無葉舌突變體基因共分離，初步確定OSJNBa0071I13.12即為無葉舌突變體基因，然后對包含OSJNBa0071I13.12基因上下有序列共8kb反復(fù)測序發(fā)現(xiàn)該基因cDNA序列只有一個SNP，即一個C轉(zhuǎn)換成T導(dǎo)致氨基酸由L變?yōu)镕。OsLG的cDNA基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，它的編碼序列為自序列1的5′端第281位至1531位脫氧核苷酸，編碼序列表中序列2的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白。
5.構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行水稻無葉耳葉舌基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)正常野生OsLG基因組DNA已經(jīng)被亞克隆到pBluescript_SK vector中，然后分別克隆到表達(dá)載體pCAMBIA2300和pCAMBIA1391Z中，電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中對無葉耳葉舌突變體植株進(jìn)行相應(yīng)功能互補(bǔ)驗(yàn)證。
序列表<160>2<210>1<211>1791<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<220>
<221>misc-feature<222>(788)<223>y＝c或t<220>
<221>CDS<222>(281)..(1531)<400>1ggccctcctg ctcgatccat ccatccatcc acccgaaccc tagatagatg aaaaagggca 60aaaccatggc atatgccgcg cgatccatct ctgcgcgctg ctgatataag agatccatcg120agtagtagcc ctgttagcta gagcgagctc gatcgatgga gaggatgatg gtggtgtcct180tgccgcgtcc tctcttccat tcctagtcct ttccgtgtgt gtgcgactgc gtgagtagtg240agggatagat aaaggaggga ggaggagaca ggccgcgagg atgatgaacg ttccatccgc300cgctgccgcg agctcctgcg atgatttcgg ctacaacgcc accccgccgc cgccgccgtc360gcttctccca atcatggacc aggacggcgg cggcggtagc atccagaggg atcaccacca420ccaccacaac caccagcagc tcggctacaa cctggagccg agctccctag ctctgcttcc480cccttccaac gccgccgccg ccgcagcaca ccacgccacc atcgcccacg cctccccaca540tgacctcctc cagttctacc cgacctcgca ctacctcgcc gctgccggcg gcgccggtgg600cggaggcaac ccctacagcc acttcacggc ggcggcggcg gccgggagca ccttccagtc660gtactaccag cagccgccgc aggccgcgcc ggagtactac ttcccgacgc tggtcagctc720cgccgaggag aacatggcca gcttcgccgc cacccagctc ggcctcaacc tcggctaccg780
gacctacytc ccgccgagag gcggctacac ctacggccac cacccgccgc ggtgccaggc 840cgagggctgc aaggccgacc tctccagcgc caagcgctac caccgccgcc acaaggtgtg 900cgagcaccac tccaaggcgc ccgtcgtcgt caccgccggc ggcctccacc agagattctg 960ccagcagtgc agcagattcc atcttcttga tgagttcgac gatgccaaga agagctgcag1020gaagcgactc gccgaccaca accgccggcg gaggaagtcg aagccgtccg acggcgagca1080ttctggtgaa aagagaaggg cgcaggcgaa taaatcggca gctactaaag acaaagcagg1140aagtagcagc aagaacgcag gcattggaga cggtttcgag acacagctac tggggggtgc1200acacatgtcc aaagatcaag accaagccat ggatctggga gaggtggtga aagaagctgt1260agatcccaaa ggtaaggcat cgatgcagca gcagcagcag caagcacatc atgggattca1320tcagcagagc caccagcagc atggcttccc tttcccttcg tcgtctggct cgtgcttatt1380ccctcagagc caaggagctg tctcgagcac tgacacatca aatatagctc aagtgcaaga1440accaagctta gccttccatc agcagcatca ccaacacagc aacatccttc agcttggaca1500ggcgatgttt gatctcgact tcgatcacta gtataattaa tatttatcaa tcatctcgat1560ctctccttct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct1620ctctctctcc ctcgtacgtg tgtgtacgtc cagacatctc ttttcatctt gtctctatta1680attactgtaa tttggatata ataatgatag cttatgcgtt attgtcatgt gtactggcag1740ttttcctcgt tggagaagct ggttaattag ccggtacatc aaatttagtg c 1791<210>2<211>416<212>PRT<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<220>
<221>misc-feature<222>(170)<223>Xaa＝Phe或Leu<400>2Met Met Asn Val Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ser Cys Asp Asp Phe1 5 10 15
Gly Tyr Asn Ala Thr Pro Pro Pro Pro Pro Ser Leu Leu Pro Ile Met20 25 30Asp Gln Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Arg Asp His His His His35 40 45His Asn His Gln Gln Leu Gly Tyr Asn Leu Glu Pro Ser Ser Leu Ala50 55 60Leu Leu Pro Pro Ser Asn Ala Ala Ala Ala Ala Ala His His Ala Thr65 70 75 80Ile Ala His Ala Ser Pro His Asp Leu Leu Gln Phe Tyr Pro Thr Ser85 90 95His Tyr Leu Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Asn Pro Tyr100 105 110Ser His Phe Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Thr Phe Gln Ser Tyr115 120 125Tyr Gln Gln Pro Pro Gln Ala Ala Pro Glu Tyr Tyr Phe Pro Thr Leu130 135 140Val Ser Ser Ala Glu Glu Asn Met Ala Ser Phe Ala Ala Thr Gln Leu145 150 155 160Gly Leu Asn Leu Gly Tyr Arg Thr Tyr Xaa Pro Pro Arg Gly Gly Tyr165 170 175Thr Tyr Gly His His Pro Pro Arg Cys Gln Ala Glu Gly Cys Lys Ala180 185 190Asp Leu Ser Ser Ala Lys Arg Tyr His Arg Arg His Lys Val Cys Glu195 200 205His His Ser Lys Ala Pro Val Val Val Thr Ala Gly Gly Leu His Gln210 215 220Arg Phe Cys Gln Gln Cys Ser Arg Phe His Leu Leu Asp Glu Phe Asp225 230 235 240Asp Ala Lys Lys Ser Cys Arg Lys Arg Leu Ala Asp His Asn Arg Arg245 250 255Arg Arg Lys Ser Lys Pro Ser Asp Gly Glu His Ser Gly Glu Lys Arg
260 265 270Arg Ala Gln Ala Asn Lys Ser Ala Ala Thr Lys Asp Lys Ala Gly Ser275 280 285Ser Ser Lys Asn Ala Gly Ile Gly Asp Gly Phe Glu Thr Gln Leu Leu290 295 300Gly Gly Ala His Met Ser Lys Asp Gln Asp Gln Ala Met Asp Leu Gly305 310 315 320Glu Val Val Lys Glu Ala Val Asp Pro Lys Gly Lys Ala Ser Met Gln325 330 335Gln Gln Gln Gln Gln Ala His His Gly Ile His Gln Gln Ser His Gln340 345 350Gln His Gly Phe Pro Phe Pro Ser Ser Ser Gly Ser Cys Leu Phe Pro355 360 365Gln Ser Gln Gly Ala Val Ser Ser Thr Asp Thr Ser Asn Ile Ala Gln370 375 380Val Gln Glu Pro Ser Leu Ala Phe His Gln Gln His His Gln His Ser385 390 395 400Asn Ile Leu Gln Leu Gly Gln Ala Met Phe Asp Leu Asp Phe Asp His405 410 41權(quán)利要求
1.水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
3.權(quán)利要求1或2所述的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白的cDNA基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白的cDNA基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
6.含有權(quán)利要求3或4或5所述的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求3或4或5所述的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因的細(xì)胞系。
8.含有權(quán)利要求3或4或5所述的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白的編碼基因的工程菌。
9.權(quán)利要求1或2所述的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因在水稻育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的水稻葉舌葉耳發(fā)育相關(guān)蛋白及其編碼基因，對于分子設(shè)計水稻的理想株型，培育高產(chǎn)水稻品種、提高水稻產(chǎn)量具有重要意義。
文檔編號C12N15/82GK1948336SQ20051010833
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者陳明生 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所