專(zhuān)利名稱(chēng)：一種5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷的產(chǎn)生菌及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可產(chǎn)生5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的微生物菌株及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(以下簡(jiǎn)稱(chēng)AICAR)的方法。
背景技術(shù)：
目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的鳥(niǎo)苷酸及其鈉鹽鳥(niǎo)苷酸鈉對(duì)人體有促進(jìn)白細(xì)胞的增生、促進(jìn)血管平滑肌舒張和活化肝功能的作用，臨床上用于各種原因引起的白細(xì)胞減少癥，也可用于急慢性肝炎和中毒性肝炎，同時(shí)，鳥(niǎo)苷酸鈉與肌苷酸鈉混合做成的食品增鮮劑的I+G(肌苷酸鈉+鳥(niǎo)苷酸鈉)的市場(chǎng)需求量越來(lái)越大，而鳥(niǎo)苷酸一般是由5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)通過(guò)有機(jī)化學(xué)合成方法制造；同時(shí)，AICAR還可作為合成2-巰基肌苷及異丙肌苷的原料，而2-巰基肌苷及異丙肌苷作為飼料添加劑有增強(qiáng)動(dòng)物免疫的作用，目前用量越來(lái)越大；但現(xiàn)在的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)是由各種有機(jī)材料通過(guò)化學(xué)合成法進(jìn)行生產(chǎn)，該方法存在成本較高、對(duì)環(huán)境污染大及產(chǎn)生的污染物難處理等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷產(chǎn)生菌以及采用該菌株發(fā)酵制備5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的方法，以避免用化學(xué)合成法生產(chǎn)5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)所存在的問(wèn)題。
本發(fā)明所提供的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷產(chǎn)生菌是經(jīng)選育的枯草芽孢桿菌(Bacillussubstilis)XG15，該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號(hào)為CCTCC M205040。該菌株以下簡(jiǎn)稱(chēng)枯草芽孢桿菌XG15 CCTCCM 205040。
本發(fā)明所提供的菌株是以枯草桿菌肌苷產(chǎn)生菌GMI-741為出發(fā)菌株，采用菌體亞硝基胍、硫酸二乙酯、紫外線、氯化鋰等多因子誘變選育出一株的，具有腺嘌呤脫氨酶缺失、非精確嘌呤缺陷型的枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)XG15，該菌株搖瓶發(fā)酵72小時(shí)可產(chǎn)5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)20.3g/L。
本枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040在保藏斜面上28～34℃培養(yǎng)12～18小時(shí)，保藏斜面培養(yǎng)物呈乳白色，其適宜培養(yǎng)條件為1.培養(yǎng)物(肉湯平皿或保藏斜面培養(yǎng)基同)蛋白胨3～6g/l，牛肉膏10～18g/l，酵母膏5～10g/l，瓊脂15～25g/l。2.培養(yǎng)溫度25℃～35℃。培養(yǎng)物pH值6.5～7.5；在液體活化培養(yǎng)基中，28℃～34℃，培養(yǎng)12～18小時(shí)，每毫升菌數(shù)在2.0×109以上，pH值約6-8，培養(yǎng)后的液體靜止一段時(shí)間有乳白色菌體沉淀，其適宜生長(zhǎng)條件為1.培養(yǎng)物葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鳥(niǎo)嘌呤0.010～0.040。2.培養(yǎng)溫度25～35℃。3.培養(yǎng)pH值6.0～8.0。4.培養(yǎng)方法培養(yǎng)18-24小時(shí)的斜面種子接入裝有20ml液體活化培養(yǎng)基的500ml三角瓶(0.07Mpa滅菌10min.)中，32℃于往復(fù)式搖床振動(dòng)培養(yǎng)12-20小時(shí)。
本發(fā)明所提供的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特點(diǎn)是用枯草芽孢桿菌XG15CCTCC M 205040做發(fā)酵菌株，利用糖質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵。所說(shuō)的糖質(zhì)原料可為葡萄糖、淀粉雙酶水解糖(用糖化酶和α-淀粉酶水解)等，搖瓶發(fā)酵50-80小時(shí)，可產(chǎn)5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)10-20g/l。它為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)AICAR核苷提供了一種可行方法。
利用本枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040搖瓶發(fā)酵制備5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷(AICAR)的具體工藝過(guò)程如下(1)斜面菌種活化將培養(yǎng)好的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)XG15 CCTCC M205040斜面種劃線于新配制的活化斜面上進(jìn)行菌種活化。所述的活化斜面組成如下葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鳥(niǎo)嘌呤0.010～0.040，瓊脂20-25g/l，pH6.5-7.5。28-34℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。
培養(yǎng)好的保藏斜面種保藏時(shí)間最長(zhǎng)不要超過(guò)半年。
(2)菌種的液體活化將培養(yǎng)好的活化斜面種接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中，使液體種的菌數(shù)達(dá)2.0×109個(gè)/ml以上。所述的液體活化培養(yǎng)基組成如下葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15，鳥(niǎo)嘌呤0.010～0.040，起始pH6.5-7.5。液體活化培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶中，三角瓶裝量為20ml，于28-34℃往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)12-18小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為80-110r/m，沖程為65-75mm。液體種的菌數(shù)可達(dá)2.0×109個(gè)/ml以上。
(3)搖瓶發(fā)酵按體積百分比為2～10％接種量，接入糖質(zhì)原料發(fā)酵培養(yǎng)基中，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，待殘?zhí)窍陆抵?g/l以下時(shí)，停止發(fā)酵。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(組成同液體活化培養(yǎng)基)可用500ml三角瓶裝，裝量20ml，于32-38℃，沖程65-80mm，轉(zhuǎn)速90-130r/m的往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)60-80小時(shí)，待殘?zhí)窍陆抵?g/l以下時(shí)，停止發(fā)酵。
適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基成份如下(按每升培養(yǎng)基所含克重g/l計(jì)算)糖100～140，玉米漿10～20，酵母粉15～20，硫酸銨8～15，磷酸二氫鉀1～3，碳酸鈣10～30，尿素2～6，硫酸鎂0.5～1.5，pH6.5～7.5，其中碳酸鈣單獨(dú)稱(chēng)入三角瓶中，尿素分開(kāi)滅菌。
(4)將發(fā)酵完畢的搖瓶發(fā)酵醪液離心，取上清液，即得含5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷發(fā)酵醪液。
對(duì)含5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷發(fā)酵醪液，可采用以下紙層析分析AICAR核苷含量發(fā)酵液下?lián)u瓶后，用4000r/m轉(zhuǎn)速的離心機(jī)離心10分鐘，用50ul微量進(jìn)樣器點(diǎn)3號(hào)層析紙，硫酸銨作展開(kāi)劑，展層5～10小時(shí)，烘干，用紫外分析儀照出AICAR核苷斑點(diǎn)，剪下斑點(diǎn)，用0.001mmol/l的HCl浸泡1-4小時(shí)。用752紫外分光光度計(jì)于260nm波長(zhǎng)處測(cè)定紫外光吸收值，計(jì)算發(fā)酵醪液含AICAR核苷量。
本發(fā)明中最大的特點(diǎn)在于用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)AICAR核苷，比以往通常采用的化學(xué)合成法的成本有較大的降低，且對(duì)環(huán)境的污染小，；本發(fā)明在最佳搖瓶發(fā)酵工藝條件下，產(chǎn)AICAR核苷最高可達(dá)20.3g/l。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一將4℃冰箱內(nèi)保藏的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)XG15 CCTCC M 205040斜面種[保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)蛋白胨4，牛肉膏14，酵母膏7，鳥(niǎo)嘌呤0.05，瓊脂20，pH7.0。]，轉(zhuǎn)接到新配置的活化斜面培養(yǎng)基上，活化斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4.0，玉米漿6，蛋白胨10，酵母膏10，鳥(niǎo)嘌呤0.025，瓊脂20，pH7.0。經(jīng)32℃恒溫培養(yǎng)20小時(shí)后，接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖20，尿素4，玉米漿6，蛋白胨10，酵母膏10，鳥(niǎo)嘌呤0.025，pH7.0。液體活化培養(yǎng)基于32℃水浴搖床(沖程70mm、轉(zhuǎn)速96r/m)振蕩培養(yǎng)15小時(shí)，這時(shí)，菌液濃度一般0D(菌液稀釋20倍，用721分光光度計(jì)650nm波長(zhǎng)、1cm比色皿，蒸溜水作參比，測(cè)定光吸收值)達(dá)0.7以上。取1ml菌液(5％接種量)，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖110，玉米漿12，酵母粉18，硫酸銨10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1，尿素5(分開(kāi)滅菌)，CaCO320(先稱(chēng)入空三角瓶中)MgSO4·7H2O 1，pH7.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于76mm沖程、轉(zhuǎn)速120r/m往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，溫度控制方式如下0～12小時(shí)，32℃；12～24小時(shí)，33℃；24～36小時(shí)，34℃；36～48小時(shí)，35℃；48～61小時(shí)，36℃。搖瓶發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液用紙層析法測(cè)定AICAR核苷含量。采用該方法搖瓶發(fā)酵72h產(chǎn)AICAR核苷最高可達(dá)到20.3g/l。
實(shí)施例二將4℃冰箱內(nèi)保藏的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillus substilis)XG15 CCTCC M 205040斜面種[保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)蛋白胨3，牛肉膏10，酵母膏5，鳥(niǎo)嘌呤0.03，瓊脂20，pH6.7。]，轉(zhuǎn)接到新配置的活化斜面培養(yǎng)基上，活化斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖10，尿素3.0，玉米漿4，蛋白胨5，酵母膏5，鳥(niǎo)嘌呤0.001，瓊脂20，pH6.7。經(jīng)32℃恒溫培養(yǎng)14小時(shí)后，接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖10，尿素3，玉米漿4，蛋白胨5，酵母膏5，鳥(niǎo)嘌呤0.001，pH6.7。液體活化培養(yǎng)基于30℃水浴搖床(沖程65mm、轉(zhuǎn)速80r/m)振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，培養(yǎng)后，取1ml菌液(5％接種量)，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖100，玉米漿10，酵母粉15，硫酸銨8，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0.5，尿素2(分開(kāi)滅菌)，CaCO310(先稱(chēng)入空三角瓶中)MgSO4·7H2O 0.5，pH6.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于65mm沖程、轉(zhuǎn)速90r/m往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，溫度控制方式32℃。搖瓶發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液用紙層析法測(cè)定AICAR核苷含量。采用該方法搖瓶發(fā)酵60h產(chǎn)AICAR核苷8.5g/l。
實(shí)施例三將4℃冰箱內(nèi)保藏的保藏枯草芽孢桿菌(Bacillud substilis)XG15 CCTCC M 205040斜面種[保藏斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)蛋白胨6，牛肉膏18，酵母膏10，瓊脂25，pH7.5。]，轉(zhuǎn)接到新配置的活化斜面培養(yǎng)基上，活化斜面培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖30，尿素6.0，玉米漿10，蛋白胨15，酵母膏15，鳥(niǎo)嘌呤0.04，瓊脂25，pH7.5。經(jīng)34℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后，接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中，液體活化培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖30，尿素6.0，玉米漿10，蛋白胨15，酵母膏15，鳥(niǎo)嘌呤0.04，pH7.5。液體活化培養(yǎng)基于34℃水浴搖床(沖程75mm、轉(zhuǎn)速110r/m)振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，培養(yǎng)后，取1ml菌液(5％接種量)，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下葡萄糖140，玉米漿20，酵母粉20，硫酸銨15，磷酸二氫鉀3，硫酸鎂1.5，尿素6(分開(kāi)滅菌)，CaCO330(先稱(chēng)入空三角瓶中)MgSO4·7H2O 1.5，pH7.5。
發(fā)酵培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，裝量20ml，于80mm沖程、轉(zhuǎn)速130r/m往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，溫度控制方式38℃。搖瓶發(fā)酵完畢后，發(fā)酵液用紙層析法測(cè)定AICAR核苷含量。采用該方法搖瓶發(fā)酵80h產(chǎn)AICAR核苷18.1g/l。
權(quán)利要求
1.一種5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的產(chǎn)生菌，其特征在于該微生物菌株是經(jīng)選育的枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040。
2.一種5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于用枯草芽孢桿菌XG15 CCTCCM 205040做發(fā)酵菌株，利用糖質(zhì)原料進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于所說(shuō)的糖質(zhì)原料為葡萄糖或淀粉雙酶水解糖，搖瓶發(fā)酵50-80小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于所說(shuō)的搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的工藝過(guò)程如下(1)斜面菌種活化將培養(yǎng)好的保藏枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040斜面種劃線于新配制的活化斜面上進(jìn)行菌種活化；(2)菌種的液體活化將培養(yǎng)好的活化斜面種接一環(huán)于液體活化培養(yǎng)基中，使液體種的菌數(shù)達(dá)2.0×109個(gè)/ml以上；(3)搖瓶發(fā)酵按體積百分比為2～10％接種量，接入糖質(zhì)原料發(fā)酵培養(yǎng)基中，在往復(fù)式搖床振蕩培養(yǎng)，待殘?zhí)窍陆抵?g/l以下時(shí)，停止發(fā)酵；(4)將發(fā)酵完畢的搖瓶發(fā)酵醪液離心，取上清液，即得含5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷發(fā)酵醪液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于進(jìn)行斜面菌種活化時(shí)，活化斜面組成為葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15g/l，鳥(niǎo)嘌呤0.010～0.040g/l，瓊脂20-25g/l，pH6.5-7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于進(jìn)行菌種的液體活化時(shí)，液體活化培養(yǎng)基組成為葡萄糖10～30g/l，尿素3～6g/l，玉米漿4～10g/l，蛋白胨5～15g/l，酵母膏5～15g/l，鳥(niǎo)嘌呤0.010～0.040g/l，起始pH6.5-7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的5-氨基-4-氨甲酰咪唑核苷的制備方法，其特征在于進(jìn)行搖瓶發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基成份按每升培養(yǎng)基所含克重g/l計(jì)算，組成如下糖100～140，玉米漿10～20，酵母粉15～20，硫酸銨8～15，磷酸二氫鉀1～3，碳酸鈣10～30，尿素2～6，硫酸鎂0.5～1.5，pH6.5～7.5。
全文摘要
本發(fā)明提供一種5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷的產(chǎn)生菌及生產(chǎn)5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷的方法，所提供的微生物菌株是經(jīng)選育的枯草芽孢桿菌XG15 CCTCC M 205040。用該菌株做發(fā)酵菌株，利用糖質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵，搖瓶發(fā)酵50－80小時(shí)，可產(chǎn)5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷(AICAR)10－20g/l。它為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)5－氨基－4－氨甲酰咪唑核苷(AICAR)提供了一種可行方法。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1710065SQ20051003440
公開(kāi)日2005年12月21日 申請(qǐng)日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月28日
發(fā)明者施慶珊, 林小平, 許虹, 李良秋, 邱玉棠, 陳儀本, 歐陽(yáng)友生, 謝小保, 黃小茉 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所