專利名稱：鑒定黨參品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因組學(xué)、生物技術(shù)以及中藥鑒定領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根據(jù)中國(guó)藥典(2000年版)黨參為桔?？浦参稂h參Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.，川黨參Codonopsis tangshen Oliv.和素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen的干燥根。其性味甘平、無(wú)毒，有補(bǔ)中益氣，健脾益肺功效。主治脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消渴等癥，是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥。但在市場(chǎng)上也常見(jiàn)到管花黨參Codonopsis tubelosa Kom.，新疆黨參Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.Cl.，灰毛黨參Codonopsiscanescens Nannf.和球花黨參Codonopsis subglobosa W.W.Sm作為黨參代用品及同科植物金錢(qián)豹Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong和桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.作為偽品被出售。在香港，黨參通常是以商品名板黨、防黨和紋黨出售。但來(lái)源、規(guī)格不同，價(jià)格差別很大，以劣充優(yōu)常見(jiàn)。另外，一種外表涂有紅色物質(zhì)的黨參首次被發(fā)現(xiàn)在香港市場(chǎng)上，商家用其為止泄目的。為安全用藥，我們通過(guò)5S rDNA基因測(cè)序技術(shù)及配合形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、HPLC-UV、以及X-Ray衍射技術(shù)，對(duì)藥材本身及外表物質(zhì)進(jìn)行了深入、詳細(xì)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種紅色黨參其植物來(lái)源為素花黨參。由于地理環(huán)境，種植方法，生長(zhǎng)狀況及加工工藝等方面的變化對(duì)黨參藥材自身的品質(zhì)、藥物中間體及中成藥的質(zhì)量帶來(lái)了很大影響。黨參藥材傳統(tǒng)的鑒別方法主要以形態(tài)、顯微為主?；瘜W(xué)方面至今沒(méi)有人發(fā)現(xiàn)一個(gè)可以用來(lái)作為鑒定標(biāo)記的化合物。據(jù)現(xiàn)有資料顯示，黨參目前多采用對(duì)照藥材作為對(duì)照進(jìn)行鑒定，至今未得到適當(dāng)?shù)膶?duì)照品。
如何快速、準(zhǔn)確鑒定黨參來(lái)源及各種規(guī)格、真?zhèn)魏推焚|(zhì)，從黨參產(chǎn)品中探測(cè)目標(biāo)黨參成份的存在，對(duì)黨參市場(chǎng)實(shí)行切實(shí)有效的質(zhì)量監(jiān)控和品質(zhì)評(píng)價(jià)是中藥現(xiàn)代化的重要課題之一。開(kāi)發(fā)分子技術(shù)監(jiān)控中藥質(zhì)量雖然剛剛起步，但已展示出它的廣闊應(yīng)用前景。在大多數(shù)真核生物中，核糖體5S rDNA基因是串聯(lián)重復(fù)的多拷貝基因，它們獨(dú)立存在，并不與主體RNA(18S-5.8S-28S rDNA)相連，在生物體內(nèi)含量豐富，廣泛分布，被稱為生物體內(nèi)的活化石。在高等植物中，5S rDNA基因的每個(gè)重復(fù)單位由轉(zhuǎn)錄區(qū)和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Non transcribed spacer，NTS)組成，轉(zhuǎn)錄區(qū)高度保守，而轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)有較大變異，這種高度保守性與變異性的統(tǒng)一，使得5S rDNA基因序列成為研究真核生物中多拷貝基因的分子形成和演化的有用標(biāo)記。本發(fā)明正是利用5S rDNA序列的差異鑒定黨參品種或辨別其真?zhèn)?。為有效控制原料?lái)源及生產(chǎn)過(guò)程中的不穩(wěn)定因素，從基因組學(xué)著手，以鑒定黨參品種藥材的來(lái)源、真?zhèn)?、?yōu)劣及更好地控制中成藥的產(chǎn)品質(zhì)量，從而為制藥行業(yè)提供科學(xué)合理的指導(dǎo)，提高藥品的安全有效性。

發(fā)明內(nèi)容
A提供黨參藥材的5S rDNA序列。
B利用5S rDNA序列鑒定石斛的品種及辨別真?zhèn)蔚姆椒ā?br> 為達(dá)到本發(fā)明的目的，發(fā)明人從全國(guó)不同省份收集了25份樣品，包括7個(gè)市場(chǎng)常見(jiàn)黨參品種、3個(gè)商品黨參、3個(gè)特別商品黨參和2個(gè)偽品品種。所有樣品均經(jīng)過(guò)專家鑒定。所測(cè)得的25個(gè)樣品的5SrDNA序列如下A.黨參7個(gè)種共計(jì)17個(gè)樣品
(1)黨參 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0038-04)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCCGTCAACTCCC CTCCTCTTTA TTCTTTGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACGCTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(2)黨參 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0038-05)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCCGTCAAGTCCC CTCCTCTTTA TTGTTTGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCACAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA TGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACGCTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(3)黨參 Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0038-08)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATCCACCCGTCAACTCCC CTCCTCTTTA TTCTTGGTAC TATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTAT GACTGCTGAC GCGCCCAAAAGCGAGCAAAA CGTGCTTTTC GCGCTCTTAA TTATTGTACGGTGAGCAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(4)黨參 Codonopsis pilsula(Franch.)Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0038-12)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCAG GGAAGTGCTG GTATGCACCGGTCAAGTCCC CTCCTCTTTA TTCTTTGTAA CATCTCTAAACCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAACCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTGT TTAATGCGCG
CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG AAGTTGACGG G(5)素花黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-0093-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTCAGCGTA CATTAAGAAACCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCGTGAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGA AGTTGACGGG(6)素花黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-0093-03)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCAGCCCCCTTTTGC TCTTTTTTTT AATCAGCGTA CATTAACAAACCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT ACGCGCGTCAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA CACATAGTACAAAAGAATAA AGAGGTGGGA AGTTGACGGG(7)素花黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-0093-04)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTT TACTCAGCCT ACTTTAAGAAACCATATAAA AGAAAGAAAA TCCTCGGTTT TGGGCGCGTGAGCAGTCAA AACGACCTTC TCGCGCTCTT TAGAGATAGTTCAAAAGAAT AAAGAGGAGG GAAGTTGACG GG(8)素花黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-0093-05)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TATTTTTTTT ACTCTGCCTA CATTAAGAAACGATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGAGTCA
GCAGTCAAAA GGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATTGTACAAAAGAATAA AGCGGAGGGA AGTTGACGGG(9)川黨參 Codonopsis tanghshen Oliv.樣品(編號(hào)CMED-0101-01)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTCAACTCCCCCCCCTTTTG CTGTTTTGTT TTACTCAGCG TACATTAAGAAACCATATAA ACTGCTCACG CGCTCAAAAC CGGGCATTTTCTTTCTCATA AACGACCTTC TAGTACGCTC TTTAGAGATAGTACAAAAGA ATAAAGAGGA GGGAAGTTGA CGGG(10)川黨參 Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號(hào)CMED-0101-02)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAACCCCTC GTCAAGTCCCCCCCCTTTTG GTGTTTTGTT TTACTCACCG TACATTAAGAAACCTTATAA AGTGCTCACG CGGTCAAAAC CGGCCATTTTCTTTCTCAAA AACGACCTTC TAGTACGGGC TTTAGAGATACTACAAAAGA ATAAAGAGCA GGGAAGTTGA CGGG(11)川黨參 Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號(hào)CMED-0101-05)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGGCCCCCTG GCAAGTCCTC GTCAAGTCCCCCCCCTTTTG GTGTTTTGTT TTTCTCAGCG TACGTTAAGAAACCATATAA AGGGCTCACG CGGTCAAAAC CGGGCGTTTTCTTTCTAATA AACTGCCTTC TAGTAGGCTC TTTAGACATAGTAGAAAAGA ATAAAGAGCA GGGAAGTTGA CGGG(12)管花黨參 Codonopsis tubelosa Kom.樣品(編號(hào)CMED-0102-01)5S rDNA序列CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCGA GCATTTTTCTTTCTTTTATA CTGGTTTCTT AATGTACGGT GAGTAAAAAA
ACAGCAAAAG GGGGGGTGCA ACACGAGGTT CCCAGGGGGTCACCCATCCT AATACTACTC TCGCCCTCAT TTGAGTTCGTACAAAACGAC CATATGGGAG AGGAGTTGAC GGG(13)管花黨參 Codonopsis tubelosa Kom.樣品(編號(hào)CMED-0102-02)5S rDNA序列CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCTA GCATGTTTCTTTCTTTTATA CTGTTTTCTT ACTGTACGGT GACTAAAAAAACAGCTAAAG GGGGGGTGCT ACACGAGGTC GCCAGGGGGACACGCATCCT AATACGACTC TCTCCCTCAT TTTAGTTCGTACAAAACTAC AAAAAGGGAG AGAAGTTGAC GGG(14)新疆黨參 Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.Cl.樣品(編號(hào)CMED-0109-01)5S rDNA序列CTAGGATGGT CGACCATATG GGAAAGCTTC GCGTTTTTCTCCCTTTTTGA GTTTTTTTTA GTGTCACCTA AATAAGGAAACCATTAAAAG AAAGAAACTA CACGAGGTTT TGGGGCCGTTATCCGCTCAC AAACTATTCT GGCATTCGTT TGGGATAGCATAAAAGACTA AAGCCGGGGG GAGTTGACGG G(15)灰毛黨參 Codonopsis canescens Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0110-01)5S rDNA序列CTAGGACGCG GGAATTCGAG AAGAGTGCTG GTATGATCGCACCCGCTGTT TTTTTTCCTC TTTATTCTTT TGTACTATCTCTAAAGAGCG CGAGAAGGTC CGGTTTTGAC TTCTCACGCGCCCAAAACAA AACGAGCTTT TTGCCTTTCG TTTGAGACGGTATAAAAGTA CGCTGAGGAG GGGAGTTGAC GGG(16)球花黨參 Codonopsis subglobosa W.W.Sm樣品(編號(hào)CMED-0107-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTATGCACCC
GTTAACCCCC CCTTTTTTTG TTTTTTTTAC TATCTCTACGTTAAGAAAAT GCTCGGTTTG ACTGCTCATG GGCGCGTGAGCAGTCAAAAC GACCTTCTCG CGCTCTTTAG AGATATGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGG(17)球花黨參 Codonopsis subglobosa W.W.Sm樣品(編號(hào)CMED-0107-02)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGTCCCCCTG GGAAGACCTC GTATGCACCCCCTAACCCCC CCTTTTTTTG TTTTTTTTAC TATCGCAACGTTAAGAAAAT GCTTCCTTTG ACTGCTGATG GGCGCGTCAGCAATCAAAAC GTCCTTCTCG CGCACTTTAG AGATATGGACAAAAGAATAA AGAGGACGGG TGTTGACGGGB.商品黨參3個(gè)樣品(18)板黨 Radix Codonopsis樣品(編號(hào)CMED-DS-8-DFH)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTTTTA GTCAACTATGCCCGCTTTTG CTGTTTTGTT TTCCTCAGCG TTCTTTAAGAATCCATAAAG ACTGCTCACG GGCTCAAAAC CGGGCATTTTCTTTCCCAAA ACCGAGCTTC TAGTTCGCTC TTTAGAGATAGTACAAAAGA ATAAAGAGGA GGGAAGTTGA CGGG(19)防黨Radix Codonopsis樣品(編號(hào)CMED-DS-9-YH)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAATCTTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTAAACGGA CATTAAGAAGCGAATAAAAG AAAGAAAATG CTCGGTTTTG AGCGCGAGAGCAGTCAAAAA GAACTTCTCG CGGTTGTTTG AGATAGTATAAAAGAATAAA GAGGAGGGAA GTTGACGGG(20)紋黨 Radix Codonopsis樣品(編號(hào)CMED-DS-10-YRS)5SrDNA序列CTAGGATGGG TGACTCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT ACTCACCGTA CATTAAGAAACCATATAAAA GAAAGAAAAA TGCTCGGTTT TGGGGCCGTGAGCAGTCAAA ACGACCTTCT GGCGCTCGTT TGAGATAGTACAAAAGAATA AAGAGGAGGG GAGTTGACGG GC.特別商品紅黨參3個(gè)樣品(21)紅黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-DS-7-XH)5S rDNA序列CTAGGATGGA TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACCCCCCCTTTTG GTGTTTTTTT TACTCTGCGT ACATTAAGAAACGATATAAA AGAAAGAAAA TGCTGGGTTT TGGGCGCGTGAGCAGTCAGA ACGACCTTGT CGCGCTCTTT AGAGATAGTACAAAAGAATA AAGAGGAGGG GAGTTGACGG G(22)紅黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-DS-11-WYT)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCGTC GTGTTGCACCCCCCCTTTTG CTGTTTTTTT TACTGAGCGT ACATTAAGAAACCATGTAAA AGAAAGAAAA TGCTCGGTTT TGGGCCCGTGAGCAGTCAAA ACGACGTTCT CGCGCTCTTT GAGATAGTACAAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGG(23)紅黨參 Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-DS-12-YRS)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTACACCCCCCTTTTGC TGTTTTTTTT GCTCAGCGTA CATTAAGAAATCATGTAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCCTGAGCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATAGTAC
AAAAGAATAA AGAGGAGGGG AGTTGACGGGD.黨參偽品金錢(qián)豹和桔梗2個(gè)種(24)金錢(qián)豹 Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong樣品(編號(hào)CMED-0108-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG AGACACCCTG GTAAATCTTC GTGTTGCAATTCCCCTTTTG CTGTTTTTTT TACTAAACGG AGGTCTAGAAGCGAATAAAA GAAAGAAAGA ATAACCATTT TTGAGGCTGAGGTAAGGTCT GAAGAACTTC TGAAGGTTGT TTGAGGCCGTATAAAAATGT TCGAACAAGG GGAGTTGACG GG(25)桔梗 Platycodon grandiflorum (Jacq.)A.DC.樣品(編號(hào)CMED-0111-01)5S rDNA序列CTAGGATGGG TGACCTCCTG GGAAGGCCTC CTGTTGCACCCCCCATTTTT TTTATTTAAT TTTTGATTTA TTTATGTTATCGGTAGGTCG TTTTTTTTGT AGCTGTTGGA ATCATATTGCGTTTTGTGAG TGCGTTTATC CGTAATAATA GGGAGCGTAACGGTAAGGTT TCGGGTGTCG GGTCCGTAAC GGTTGAAACGGGGAATCGTA ATGAGGGAAA ACGGTGGAAT TTCGGTTAAAATGGTAAAAG GATGTTGAAT AAAATGCAAT TTATGGTGAGAGTATATGGG
具體實(shí)施例方式上述25樣品的5S rDNA序列的測(cè)定方法包括下列步驟(1)收集植物樣品，進(jìn)行品種鑒定工作；(2)從步驟(1)選出的植物中提取DNA；(3)以步驟(2)提取的DNA為模板，以寡核苷酸作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物，擴(kuò)增5S rDNA區(qū)段，所用的引物分別采自植物5SrDNA兩端的保守區(qū)段；
(4)應(yīng)用克隆測(cè)序技術(shù)對(duì)步驟(3)中所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
每一個(gè)樣品至少重復(fù)測(cè)序3次并樣品的序列也在互聯(lián)網(wǎng)頁(yè)National Center for Biotechnology Information(NCBI)和EuropeanMolecular Biology Laboratory(EMBL)與其它植物序列作比較和驗(yàn)證以保證本發(fā)明的25個(gè)序列準(zhǔn)確。
上述所測(cè)得的同一品種的樣品之間在DNA水平的平均差異為6.2％至9.9％，所述的黨參種間5S rDNA序列的差異為26％至60％。而黨參與大花金錢(qián)豹的5S rDNA序列的差異為37％至57％。黨參與桔梗的5S rDNA序列的差異為63％至72％。
本發(fā)明利用黨參類植物內(nèi)5S rDNA序列的差異進(jìn)行種內(nèi)和種間的比較，借此鑒定不同的黨參品種并辨別其真?zhèn)?。所采用的方法包括下列步驟1.從植物樣品中提取DNA；2.以步驟1提取的DNA為模板，以寡核苷酸作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，擴(kuò)增5S rDNA區(qū)段，所用的引物分別采自植物5S rDNA兩端的保守區(qū)段；3.應(yīng)用克隆測(cè)序技術(shù)對(duì)步驟2所獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；4.將步驟3測(cè)得的DNA序列與上述的18個(gè)黨參及大花金錢(qián)豹的5S rDNA序列比較以鑒定所測(cè)植物的黨參品種及辨別真?zhèn)巍?br> 詳細(xì)描述所述方法(1)DNA的提取植物的DNA提取方法與Draper和Scott(Draper and Scott，1988)所述大致相同，簡(jiǎn)述如下將干燥的植物材料用70％乙醇的蒸餾水溶液沖洗，然后，與液氮混合并研磨成粉末。將所得的粉末樣品與6倍體積的CTAB提取緩沖液混勻，在56℃水浴中保溫30分鐘后，加入等量的氯仿-異戊醇(24∶1)混合液抽提，離心，取上清液。向殘余物中加入0.1體積的10％CTAB溶液，室溫放置10分鐘后再用氯仿-異戊醇萃取一次，離心，取上清液并與前次的上清液混合。向所得上清液中加入等量的CTAB沉淀緩沖液產(chǎn)生沉淀，室溫放置1小時(shí)后以13000g離心15分鐘。將DNA沉淀物用乙醇純化后溶解于TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA)中備用。
(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)5S rDNA區(qū)段的DNA由PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得。反應(yīng)所用的引物為5S2F和5S2R5S2F序列為5’GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA5S2R序列為5’TTA GTG CTG GTA TGA TCG CA反應(yīng)溶液包括10ng植物DNA，1XTag緩沖溶液(10mMTris-HCl，pH8.3，0.001％明膠)，0.2mM dNTPs，1μM引物，以及1個(gè)單位的Taq DNA多聚酶。反應(yīng)條件為于94℃預(yù)處理5分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件是94℃，1分鐘，60℃，1分鐘，72℃，2分鐘；最后72℃，10分鐘。
(3)克隆測(cè)序技術(shù)將步驟(2)得到的PCR產(chǎn)物用DNA純化試劑盒GENCLEAN IIIKit(Bio 101，USA)進(jìn)行純化。取出1μl(約50ng)純化的PCR片段，用克隆試劑盒TA cloning Kit(pGEM-T Easy Vector Systems，Promega，USA)將該P(yáng)CR片段克隆到載體上。經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)后，用質(zhì)粒純化試劑盒Rapid Plasmid Miniprep System(Marligen Bioscience，Germany)純化質(zhì)粒。測(cè)序通過(guò)反應(yīng)試劑盒ABI Prism BigDye Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit(PE Biosystems，USA)和遺傳分析儀Genetic analyzer(ABI Prism 3100，Applied Biosystems，USA)進(jìn)行。最后使用序列分析軟件Sequencing Analysis version 3.0(Perkin Elmer，USA)和DNAsis version 7.00(Hitachi，Japan)分析和確定樣品的DNA序列。
(4)DNA序列比較將序列以Fasta格式儲(chǔ)存，然后使用序列分析軟件BioEdit version7.0.1(Isis Pharmaceuticals，USA)進(jìn)行排序及計(jì)算差異百分比，結(jié)果再輸入Excel 2002(Microsoft Corporation，USA)作統(tǒng)計(jì)分析。
(5)被測(cè)植物樣品的鑒定將所測(cè)樣品的5S rDNA序列與本發(fā)明公開(kāi)的所有黨參品種的DNA標(biāo)準(zhǔn)按上述方法進(jìn)行逐一比較。如發(fā)現(xiàn)該植物樣品的序列與某黨參5S rDNA序列樣準(zhǔn)相匹配，也就是說(shuō)，其序列差異小于9.9％，即可證實(shí)被測(cè)植物樣品與黨參，且與樣準(zhǔn)(黨參)為同一品種。相反，如被測(cè)植物的5S rDNA序列與任何一個(gè)黨參標(biāo)準(zhǔn)DNA序列均不相匹配，則說(shuō)明該被測(cè)植物品種不是黨參。
若想進(jìn)一步了解該被測(cè)植物品是何種偽品或代用品，則可將其序列與本發(fā)明公開(kāi)的幾種偽品和代用品的序列進(jìn)行比較，如發(fā)現(xiàn)匹配，即說(shuō)明該被測(cè)樣品是屬于何種偽品或代用品。
因此，采用本發(fā)明提供的黨參的5S rDNA的DNA序列及鑒定方法，通過(guò)其5S rDNA的DNA序列的比較，使得對(duì)中藥黨參的鑒定更加方便和可靠。
序列表<210>SEQ ID NO1<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 1<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE1CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCC GTCAACTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTTGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO2<211>LENGTH211<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 2<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE2CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATGCACCC GTCAAGTCCC CTCCTCTTTA60TTGTTTGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCACAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA TGACCTTTTC GCGCTCTTTC TTAATGTACG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO3<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 3<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE3CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTGCTG GTATCCACCC GTCAACTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTGGTAC TATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTAT GACTGCTGAC GCGCCCAAAA120GCGAGCAAAA CGTGCTTTTC GCGCTCTTAA TTATTGTACG GTGAGCAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO4<211>LENGTH210<212>TYpEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula (Franch.) Nannf 4<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer
<400>SEQUENCE4CTAGGATGGG TGACCCCCAG GGAAGTGCTG GTATGCACCG GTCAAGTCCC CTCCTCTTTA60TTCTTTGTAA CATCTCTAAA CCATATAAGA AGGTCGTTTT GACTGCTCAC GCGCCCAAAA120CCGAGCAAAA CGACCTTTTC GCGCTCTTGT TTAATGCGCG CTGAGTAAAA AAAAGGAGGG180AAGTTGACGG G191<210>SEQID NO5<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 5<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE5CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCAGCGTA CATTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCGTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGA180AGTTGACGG G190<210>SEQ ID NO6<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 6<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE6CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCAGC CCCCTTTTGC TCTTTTTTTT60AATCAGCGTA CATTAACAAA CCATATAAA GAAAGAAAT GCTCGGTTTT ACGCGCGTCA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA CACATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGTGGGA180AGTTGACGGG190<210>SEQID NO7<211>LENGTH209<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 7<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE7CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCAGCCTA CTTTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAT CCTCGGTTTT GGGCGCGTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGCTCTTTA GAGATAGTTC AAAAGAATAA AGAGGAGGGA
180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO8<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 8<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE8CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TATTTTTTTT60ACTCTGCCTA CATTAAGAAA CGATATAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGAGTCA120GCAGTCAAAA GGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATTGTAC AAAAGAATAA AGCGGAGGGA180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO9<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oliv.9<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE9CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTCAACTCCC CCCCCTTTTG CTGTTTTGTT60TTACTCAGCG TACATTAAGA AACCATATAA ACTGCTCACG CGCTCAAAAC CGGGCATTTT120CTTTCTCATA AACGACCTTC TAGTACGCTC TTTAGAGATA GTACAAAAGA ATAAAGAGGA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO10<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oliv.10<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE10CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAACCCCTC GTCAAGTCCC CCCCCTTTTG GTGTTTTGTT60TTACTCACCG TACATTAAGA AACCTTATAA AGTGCTCACG CGGTCAAAAC CGGCCATTTT120CTTTCTCAAA AACGACCTTC TAGTACGGGC TTTAGAGATA CTACAAAAGA ATAAAGAGCA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO11<211>LENGTH213
<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tangshen Oiv.11<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE11CTAGGATGGG TGGCCCCCTG GCAAGTCCTC GTCAAGTCCC CCCCCTTTTG GTGTTTTGTT60TTTCTCAGCG TACGTTAAGA AACCATATAA AGGGCTCACG CGGTCAAAAC CGGGCGTTTT120CTTTCTAATA AACTGCCTTC TAGTAGGCTC TTTAGACATA GTAGAAAAGA ATAAAGAGCA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQID NO12<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tubelosa Kom.12<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE12CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCGA GCATTTTTCT TTCTTTTATA CTGGTTTCTT60AATGTACGGT GAGTAAAAAA ACAGCAAAAG GGGGGGTGCA ACACGAGGTT CCCAGGGGGT120CACCCATCCT AATACTACTC TCGCCCTCAT TTGAGTTCGT ACAAAACGAC CATATGGGAG180AGGAGTTGAC GGG193<210>SEQ ID NO13<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis tubelosa Kom.13<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE13CTAGGACTGC TCACGGCCCG AAAAGTCCTA GCATGTTTCT TTCTTTTATA CTGTTTTCTT60ACTGTACGGT GACTAAAAAA ACAGCTAAAG GGGGGGTGCT ACACGAGGTC GCCAGGGGGA120CACGCATCCT AATACGACTC TCTCCCTCAT TTTAGTTCGT ACAAAACTAC AAAAAGGGAG180AGAAGTTGAC GGG193<210>SEQID NO14<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis clematidea (Schyenk) C.B.Cl.14<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE14CTAGGATGGT CGACCATATG GGAAAGCTTC GCGTTTTTCT CCCTTTTTGA GTTTTTTTTA60
GTGTCACCTA AATAAGGAAA CCATTAAAAG AAAGAAACTA CACGAGGTTT TGGGGCCGTT120ATCCGCTCAC AAACTATTCT GGCATTCGTT TGGGATAGCA TAAAAGACTA AAGCCGGGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQID NO15<211>LENGTH212<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis canescens Nannf.15<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE15CTAGGACGCG GGAATTCGAG AAGAGTGCTG GTATGATCGC ACCCGCTGTT TTTTTTCCTC60TTTATTCTTT TGTACTATCT CTAAAGAGCG CGAGAAGGTC CGGTTTTGAC TTCTCACGCG120CCCAAAACAA AACGAGCTTT TTGCCTTTCG TTTGAGACGG TATAAAAGTA CGCTGAGGAG180GGGAGTTGAC GGG193<210>SEQID NO16<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis subglobosa W.W.Sm 16<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE16CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTATGCACCC GTTAACCCCC CCTTTTTTTG60TTTTTTTTAC TATCTCTACG TTAAGAAAAT GCTCGGTTTG ACTGCTCATG GGCGCGTGAG120CAGTCAAAAC GACCTTCTCG CGCTCTTTAG AGATATGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQID NO17<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis subglobosa W.W.Sm 17<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE17CTAGGATGGG TGTCCCCCTG GGAAGACCTC GTATGCACCC CCTAACCCCC CCTTTTTTTG60TTTTTTTTAC TATCGCAACG TTAAGAAAAT GCTTCCTTTG ACTGCTGATG GGCGCGTCAG120CAATCAAAAC GTCCTTCTCG CGCACTTTAG AGATATGGAC AAAAGAATAA AGAGGACGGG180TGTTGACGGG190
<210>SEQID NO18<211>LENGTH213<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 18<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE18CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTTTTA GTCAACTATG CCCGCTTTTG CTGTTTTGTT60TTCCTCAGCG TTCTTTAAGA ATCCATAAAG ACTGCTCACG GGCTCAAAAC CGGGCATTTT120CTTTCCCAAA ACCGAGCTTC TAGTTCGCTC TTTAGAGATA GTACAAAAGA ATAAAGAGGA180GGGAAGTTGA CGGG194<210>SEQ ID NO19<211>LENGTH207<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 19<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE19CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAATCTTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTAAACGGA CATTAAGAAG CGAATAAAAG AAAGAAAATG CTCGGTTTTG AGCGCGAGAG120CAGTCAAAAA GAACTTCTCG CGGTTGTTTG AGATAGTATA AAAGAATAAA GAGGAGGGAA180GTTGACGGG189<210>SEQID NO20<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMRadix Codonopsis 20<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE20CTAGGATGGG TGACTCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60ACTCACCGTA CATTAAGAAA CCATATAAAA GAAAGAAAAA TGCTCGGTTT TGGGGCCGTG120AGCAGTCAAA ACGACCTTCT GGCGCTCGTT TGAGATAGTA CAAAAGAATA AAGAGGAGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO21<211>LENGTH210<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 21<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE21
CTAGGATGGA TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTGCACC CCCCCTTTTG GTGTTTTTTT60TACTCTGCGT ACATTAAGAA ACGATATAAA AGAAAGAAAA TGCTGGGTTT TGGGCGCGTG120AGCAGTCAGA ACGACCTTGT CGCGCTCTTT AGAGATAGTA CAAAAGAATA AAGAGGAGGG180GAGTTGACGG G191<210>SEQ ID NO22<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 22<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE22CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCGTC GTGTTGCACC CCCCCTTTTG CTGTTTTTTT60TACTGAGCGT ACATTAAGAA ACCATGTAAA AGAAAGAAAA TGCTCGGTTT TGGGCCCGTG120AGCAGTCAAA ACGACGTTCT CGCGCTCTTT GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO23<211>LENGTH208<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCodonopsis pilosula var. Modesta (Nannf.) L.T.Shen 23<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE23CTAGGATGGG TGACCCCCTG GGAAGTCCTC GTGTTACACC CCCCTTTTGC TGTTTTTTTT60GCTCAGCGTA CATTAAGAAA TCATGTAAAA GAAAGAAAAT GCTCGGTTTT GGGCGCCTGA120GCAGTCAAAA CGACCTTCTC GCGGTCTTTA GAGATAGTAC AAAAGAATAA AGAGGAGGGG180AGTTGACGGG190<210>SEQ ID NO24<211>LENGTH211<212>TYPEDNA<213>ORGANISMCampanumoea javanica Blume ssp. japonica (Makino) Hong 24<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE24CTAGGATGGG AGACACCCTG GTAAATCTTC GTGTTGCAAT TCCCCTTTTG CTGTTTTTTT60TACTAAACGG AGGTCTAGAA GCGAATAAAA GAAAGAAAGA ATAACCATTT TTGAGGCTGA120GGTAAGGTCT GAAGAACTTC TGAAGGTTGT TTGAGGCCGT ATAAAAATGT TCGAACAAGG180
GGAGTTGACG GG192<210>SEQ ID NO25<211>LENGTH319<212>TYPEDNA<213>ORGANISMPlatycodon grandiflorum (Jacq.) A.DC.25<223>OTHER INFORMATION5S rDNA Spacer<400>SEQUENCE25CTAGGATGGG TGACCTCCTG GGAAGGCCTC CTGTTGCACC CCCCATTTTT TTTATTTAAT60TTTTGATTTA TTTATGTTAT CGGTAGGTCG TTTTTTTTGT AGCTGTTGGA ATCATATTGC120GTTTTGTGAG TGCGTTTATC CGTAATAATA GGGAGCGTAA CGGTAAGGTT TCGGGTGTCG180GGTCCGTAAC GGTTGAAACG GGGAATCGTA ATGAGGGAAA ACGGTGGAAT TTCGGTTAAA240ATGGTAAAAG GATGTTGAAT AAAATGCAAT TTATGGTGAG AGTATATGGG290
權(quán)利要求
1.一種鑒定黨參品種的方法，其特征在于，應(yīng)用一種或多種選自樣準(zhǔn)組的DNA序列作為樣準(zhǔn)，對(duì)待鑒定樣品的5S rDNA進(jìn)行比較，從而獲得該樣品與樣準(zhǔn)之序列差異百分比，所用樣準(zhǔn)組包括以下DNA序列(1)黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0038-04)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.1所示；(2)黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0038-05)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.2所示；(3)黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0038-08)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.3所示；(4)黨參Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0038-12)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.4所示；(5)素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-0093-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.5所示；(6)素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-0093-03)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.6所示；(7)素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-0093-04)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.7所示；(8)素花黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-0093-05)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.8所示；(9)川黨參Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號(hào)CMED-0101-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.9所示；(10)川黨參Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號(hào)CMED-0101-02)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.10所示；(11)川黨參Codonopsis tangshen Oliv.樣品(編號(hào)CMED-0101-05)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.11所示；(12)管花黨參Codonopsis tubelosa Kom.樣品(編號(hào)CMED-0102-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.12所示；(13)管花黨參Codonopsis tubelosa Kom.樣品(編號(hào)CMED-0102-02)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.13所示；(14)新疆黨參Codonopsis clematidea(Schyenk)C.B.C1.樣品(編號(hào)CMED-0109-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.14所示；(15)灰毛黨參Codonopsis canescens Nannf.樣品(編號(hào)CMED-0110-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.15所示；(16)球花黨參Codonopsis subglobosa W.W.Sm樣品(編號(hào)CMED-0107-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.16所示；(17)球花黨參Codonopsis subglobosa W.W.Sm樣品(編號(hào)CMED-0107-02)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.17所示；(18)板黨Radix Codonopsis樣品(編號(hào)CMED-DS-8-DFH)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.18所示；(19)防黨Radix Codonopsis樣品(編號(hào)CMED-DS-9-YH)之5SrDNA序列，該序列如SEQ ID NO.19所示；(20)紋黨Radix Codonopsis樣品(編號(hào)CMED-DS-10-YRS)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.20所示；(21)紅黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-DS-7-XH)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.21所示；(22)紅黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-DS-11-WYT)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.22所示；(23)紅黨參Codonopsis pilosula var.Modesta(Nannf.)L.T.Shen樣品(編號(hào)CMED-DS-12-YRS)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.23所示；(24)金錢(qián)豹Campanumoea javanica Blume ssp.japonica(Makino)Hong樣品(編號(hào)CMED-0108-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ IDNO.24所示；和(25)桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.樣品(編號(hào)CMED-0111-01)之5S rDNA序列，該序列如SEQ ID NO.25所示。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包括一個(gè)判斷步驟，該判斷步驟是根據(jù)一個(gè)差異域值(threshold)，當(dāng)樣品與樣準(zhǔn)之間序列差異百分比小于該域值，則可初步判斷該樣品與樣準(zhǔn)是同一品種。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述差異域值在8％至12％之間。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述差異域值為9.9％。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法包括以下具體步驟(a)從待鑒定樣品中提取DNA；(b)以上述DNA為模板，并以適當(dāng)?shù)墓押塑账釣橐?，?yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增5S rDNA區(qū)段；(c)對(duì)上述擴(kuò)增的5S rDNA區(qū)段進(jìn)行序列測(cè)定；(d)將上述所測(cè)樣品序列與一種或多種選自樣準(zhǔn)組的DNA序列進(jìn)行比較，并計(jì)算其之間的差異百分比；和(e)根據(jù)上述差異百分比判斷該被鑒定樣品是否和所比樣準(zhǔn)是同一樣品。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物為5S2F，其序列為5’GTG CTT GGG CGA GAG TAG TA和5S2R，其序列為5’TTA GTG CTG GTA TGA TCG CA。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(e)的判斷是根據(jù)一個(gè)差異域值實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)樣品與樣準(zhǔn)之間序列差異百分比小于該域值，則可初步判斷該樣品與樣準(zhǔn)是同一品種。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述差異域值在8％至12％之間。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述差異域值為9.9％。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了黨參的5S rDNA序列及利用該序列區(qū)分黨參、素花黨參、川黨參、管花黨參、新疆黨參、灰毛黨參、球花黨參品種及偽品金錢(qián)豹和桔梗。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1982469SQ20051002287
公開(kāi)日2007年6月20日 申請(qǐng)日期2005年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日
發(fā)明者邵鵬柱, 徐宏喜, 畢培曦, 張艷波 申請(qǐng)人:香港賽馬會(huì)中藥研究院有限公司