專(zhuān)利名稱(chēng)：一種雪蓮紫丁香甙的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種雪蓮紫丁香甙的制備方法。
背景技術(shù)：
雪蓮花又名雪蓮，是我國(guó)三類(lèi)珍稀植物，早在《西北域記》和《相園小識(shí)》中，就有關(guān)于雪蓮的記載，并把二者合而為一，統(tǒng)稱(chēng)雪蓮花。作為雪蓮花，原生植物名稱(chēng)隨產(chǎn)地而別，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactylaSch.Bip.；四川、云南等地用綿頭雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肅、青海等地用水母雪蓮S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪蓮(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir，等，但均屬于菊科風(fēng)毛菊屬Saussurea雪兔子亞屬Subgen Eriocorye植物，且一般分布于海拔4,000米以上的高山流石灘上。
雪蓮花是生長(zhǎng)在海拔4000米以上的高山雪線附近的民間常用的一類(lèi)名貴藥用植物，屬多年生草本植物。雪蓮花性溫，味微苦，入肝、脾、腎三經(jīng)。具有散寒除濕，活血通經(jīng)、強(qiáng)筋助陽(yáng)、抗炎、鎮(zhèn)痛、收縮子宮等功能，民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，延緩衰老、動(dòng)脈硬化、終止妊娠，婦女小腹冷痛、閉經(jīng)、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、陽(yáng)萎等癥。雪蓮花原生植物種類(lèi)較多，雖然據(jù)中藥文獻(xiàn)記載均可同等入藥，但其品質(zhì)有優(yōu)劣之分。據(jù)有關(guān)報(bào)道，在以上幾種雪蓮中銷(xiāo)售量最大的是新疆天山雪蓮(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir.和水母雪蓮S.medusa Maxim。而水母雪蓮(Saussurea medusa Maxim.)是藏藥“雪蓮”藥材的原植物，分布在我國(guó)青海、甘肅、西藏等地。水母雪蓮是藏藥中的名貴藥材，具有散寒除濕、活血通絡(luò)、抗癌、抗炎及抗疲勞等功效，可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女月經(jīng)不調(diào)、癰瘡腫毒和高山不適應(yīng)等多種疾病。
雪蓮為多年生草本植物，自然生長(zhǎng)緩慢，采集野生雪蓮入藥對(duì)野生資源具有嚴(yán)重的破壞而且還會(huì)造成對(duì)資源生態(tài)環(huán)境的破壞。為此，我國(guó)早已將雪蓮列為國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物。紫丁香甙(Syringin)為野生雪蓮中有效成分之一，屬于苯丙素類(lèi)化合物。藥理研究表明，紫丁香甙有抗疲勞、促性腺、抗輻射及止血作用。但在野生水母雪蓮中只占干重的0.02％左右。在其他天然藥用植物中不超過(guò)1.0％(其中紫丁香甙含量較高的刺五加原植物中約為0.5％)。為此，迫切需要解決藥用雪蓮資源問(wèn)題?，F(xiàn)代生物技術(shù)的運(yùn)用使大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)植物次生代謝物成為可能?？墒悄壳吧形匆?jiàn)到有關(guān)用雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)高產(chǎn)紫丁香甙這方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種雪蓮紫丁香甙的制備方法，以達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)雪蓮紫丁香甙化合物的目的。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的主要制備步驟是1.雪蓮愈傷組織誘導(dǎo)及細(xì)胞系的建立采集雪蓮?fù)庵搀w，如葉、花、莖或用種子萌發(fā)幼苗，在含有濃度為0.01-3.0mg/L激素的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織在含上述激素的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；獲得雪蓮紫丁香甙的細(xì)胞系。
本發(fā)明采用的激素包括NAAα-奈乙酸；IAA吲哚乙酸；BA6-芐基嘌呤；KT激動(dòng)素；2，4-D2，4-二氯苯氧乙酸。上述激素優(yōu)選0.05-0.1mg/L的BA與0.5-1mg/L的NAA組合。
每次細(xì)胞繼代用目測(cè)法挑選顏色最鮮艷的細(xì)胞接種。
2.雪蓮紫丁香甙細(xì)胞系的細(xì)胞固體或懸浮液體培養(yǎng)生產(chǎn)紫丁香甙化合物固體培養(yǎng)雪蓮細(xì)胞接種于含有濃度為0.01-3.0mg/L激素(NAA、IAA、2，4-D、KT或/和BA)的MS培養(yǎng)基中，加入0.6-0.8重量％的瓊脂，pH值在5.8(滅菌前)，接種量為50(±1)g·FW/L；接種后放入光培養(yǎng)室(光強(qiáng)60μmolm-2s-1)中培養(yǎng)10-11天，溫度為25(±2)℃進(jìn)行培養(yǎng)。
懸浮培養(yǎng)于不加瓊脂的MS培養(yǎng)基中，接種量為50(±1)g·FW/L，其他條件同固體培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速80-110r/min。
3.雪蓮紫丁香甙化合物的分離提取及高效液相色譜(HPLC)測(cè)定
收集步驟2得到的雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物，置于干燥器中，室溫至40℃溫和烘干至恒重后，用粉碎機(jī)粉碎成16-24目的粉狀，用乙醇或正丁醇(較佳的是70％乙醇)浸泡16-24小時(shí)，離心、沉淀，上清液過(guò)濾，得到含紫丁香甙的提取液。
高效液相色譜(HPLC)測(cè)定紫丁香甙含量以反相C18為分離柱子，磷酸(pH2)緩沖液和甲醇(分析醇)為分離相。分離梯度甲醇比例3min(0％)，5min(10％)，15min(20％)，25min(20％)。流速為1mL/min，光電二極管陣列檢測(cè)器(DVD)檢測(cè)紫丁香甙在270nm處有強(qiáng)吸收，且其他物質(zhì)的吸收干擾極小。
本發(fā)明提供的細(xì)胞系和培養(yǎng)基，其細(xì)胞生長(zhǎng)速率可達(dá)15-22g·DW/L，紫丁香甙含量達(dá)到水母雪蓮細(xì)胞干重的3-4％，400-900mg/L。比野生水母雪蓮高150-200倍。
本發(fā)明較已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及積極效果1)雪蓮為國(guó)家保護(hù)植物，利用植物細(xì)胞大量培養(yǎng)生產(chǎn)雪蓮紫丁香甙，走工業(yè)化生產(chǎn)的途徑，可有限地保護(hù)野生資源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
2)應(yīng)用細(xì)胞大量培養(yǎng)生產(chǎn)紫丁香甙，與栽培和野生的植物相比，可獲得穩(wěn)定的質(zhì)量和產(chǎn)量，不受自然條件的限制的影響。
3)不占用耕地面積，只需要占用有限的廠房和培養(yǎng)室。
4)通過(guò)人工調(diào)節(jié)與控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物的合成；可極大地提高紫丁香甙化合物的產(chǎn)量5)該項(xiàng)技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)周期短，生長(zhǎng)迅速，紫丁香甙產(chǎn)率高。


圖1為本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞與野生水母雪蓮紫丁香甙含量比較。
圖2為本發(fā)明培養(yǎng)的水母雪蓮紫丁香甙懸浮細(xì)胞系。
圖3為本發(fā)明培養(yǎng)的水母雪蓮紫丁香甙固體細(xì)胞系。
圖4為紫丁香甙標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜(0.0625mg/mL)。
圖5為本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞系紫丁香甙HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式
為了更好理解本發(fā)明，通過(guò)如下實(shí)施例予以進(jìn)一步說(shuō)明，但并非是對(duì)本發(fā)明的限定。
本實(shí)施例是優(yōu)選水母雪蓮(Saussurea medusa)為例對(duì)本發(fā)明予以說(shuō)明，同時(shí)，本實(shí)施例的技術(shù)方案也適用于其他雪蓮的細(xì)胞培養(yǎng)。
雪蓮愈傷組織誘導(dǎo)及細(xì)胞系的建立采集雪蓮?fù)庵搀w，如葉、花、莖或用種子萌發(fā)幼苗誘導(dǎo)愈傷組織。外植體先用自來(lái)水沖洗數(shù)1hr，然后用殺菌劑浸泡殺菌，用無(wú)菌水洗5-6次，每次2-3分鐘，消毒后接種于如表1所示的含激素的MS培養(yǎng)基上，置于25(±2)℃光照培養(yǎng)。經(jīng)兩周培養(yǎng)后，即可在外植體的切口部位形成愈傷組織。愈傷組織在于如表1所示的含激素的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25(±2)℃，在有光照條件下可以獲得雪蓮高產(chǎn)紫丁香甙細(xì)胞系。繼代培養(yǎng)為11天轉(zhuǎn)代一次，繼代培養(yǎng)用目測(cè)法選擇顏色最鮮艷的細(xì)胞接種；選取紅色愈傷組織細(xì)胞系為高產(chǎn)雪蓮紫丁香甙的細(xì)胞系，結(jié)果如表2。
雪蓮高產(chǎn)紫丁香甙細(xì)胞系的細(xì)胞固體或懸浮液體培養(yǎng)物紫丁香甙化合物的分離、提取、制備工藝雪蓮細(xì)胞接種于如表1所示的含有激素的MS培養(yǎng)基中，pH值在5.8(滅菌前)，固體培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中加入0.6-0.8％瓊脂。培養(yǎng)基高壓消毒后，接種，接種量為50(±1)g·FW/L；接種后放入光培養(yǎng)室中培養(yǎng)11天，溫度為25±2℃；進(jìn)行培養(yǎng)。圖2和圖3所示分別為本發(fā)明水母雪蓮紫丁香甙懸浮細(xì)胞系和固體細(xì)胞系。
收集雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物，置于干燥器中，40℃溫和烘干至恒重后，用粉碎機(jī)粉碎成20目粉狀。用70％乙醇混勻浸泡提取24個(gè)小時(shí)后，12000G，10min高速離心，上清液過(guò)濾后即為含紫丁香甙提取液。
用HPLC測(cè)定紫丁香甙含量以反相C18為分離柱子，磷酸(pH2)緩沖液和甲醇(分析醇)為分離相。分離梯度甲醇比例3min(0％)，5min(10％)，15min(20％)，25min(20％)。流速1mL/min。光電二極管陣列檢測(cè)器(DVD)檢測(cè)270nm有強(qiáng)吸收。330nm無(wú)吸收，此峰即為紫丁香甙。檢測(cè)所用的標(biāo)準(zhǔn)圖譜和樣品圖譜如4和圖5所示本發(fā)明使用的MS培養(yǎng)基，蔗糖濃度為10～40g/L(最佳30g/L)，調(diào)pH值為5.2-6(最佳5.8)，瓊脂濃度為0.6-0.8％(最佳0.7％)。用100ml三角瓶，每瓶裝培養(yǎng)液30ml。高壓消毒，壓力為1.0kg/CM2，20min。接入高產(chǎn)紫丁香甙細(xì)胞系，接種量為50(±1)g·FW/L，放入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)，溫度為25±20℃。培養(yǎng)11天后每瓶鮮重可達(dá)12g(懸浮培養(yǎng)11天，每瓶鮮重可達(dá)10g)。細(xì)胞培養(yǎng)物中的紫丁香甙經(jīng)分離提取后，并與天然植株中提取的紫丁香甙化合物進(jìn)行對(duì)照結(jié)果如圖1。
表1.MS培養(yǎng)基成分組成

本發(fā)明用來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織的1/2MS培養(yǎng)基上添加的激素濃度沒(méi)有特別嚴(yán)格的限定，可以在0.01-3.0mg/L范圍內(nèi)以不同濃度分別組合，實(shí)驗(yàn)證明0.05-0.1mg/L的BA與0.5-1mg/L的NAA的組合為最佳。
本發(fā)明用來(lái)固體培養(yǎng)愈傷組織的MS培養(yǎng)基上添加的瓊脂粉為0.7重量％；激素的濃度沒(méi)有特別嚴(yán)格的限定，可以在0.01-3.0mg/L范圍內(nèi)以不同濃度分別組合，實(shí)驗(yàn)證明0.5mg/L的BA與2mg/L的NAA的組合為最佳。
本發(fā)明用來(lái)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的MS培養(yǎng)基上添加的激素，其濃度沒(méi)有嚴(yán)格限定，可以在0.01-3.0mg/L范圍內(nèi)以不同濃度分別組合，實(shí)驗(yàn)證明0.5mg/L的BA與2mg/L的NAA的組合為最佳。
表2 水母雪蓮細(xì)胞黃色系與紅色系含量及特征性的比較

權(quán)利要求
1.一種雪蓮紫丁香甙的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)方法，主要步驟是a)采用雪蓮?fù)庵搀w或用種子萌發(fā)幼苗，在含有濃度為0.01-3.0mg/L激素的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；b)愈傷組織在含上述濃度激素的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，獲得雪蓮紫丁香甙細(xì)胞系；c)雪蓮紫丁香甙細(xì)胞接種于含有濃度為0.01-3.0mg/L激素的MS培養(yǎng)基中，加入0.6-0.8重量％的瓊脂，滅菌前pH值為5.8，接種量為50±1g·FW/L；接種后放入光培養(yǎng)室中，溫度為25±2℃進(jìn)行固體培養(yǎng)；或雪蓮細(xì)胞接種于含有濃度為0.01-3.0mg/L激素的MS培養(yǎng)基中，滅菌前pH值為5.8，接種量為50±1g·FW/L，接種后放入光培養(yǎng)室中，溫度為25±2℃，搖床轉(zhuǎn)速80-110r/min進(jìn)行懸浮液體培養(yǎng)；d)收集步驟c得到的雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物，置于干燥器中，室溫至40℃烘干至恒重，粉碎成16-24目的粉狀，用乙醇或正丁醇浸泡16-24小時(shí)，沉淀取上清液，得到含紫丁香甙的提取液；所述的激素為α-奈乙酸、吲哚乙酸、6-芐基嘌呤、激動(dòng)素或/和2，4-二氯苯氧乙酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟a的雪蓮?fù)庵搀w為雪蓮的葉、花或/和莖。
3.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟a的激素和濃度為0.05-0.1mg/L的6-芐基嘌呤與0.5-1mg/L的α-奈乙酸的組合。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟b的激素和濃度為0.5mg/L的6-芐基嘌呤與2mg/L的α-奈乙酸的組合。
5.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟b的繼代培養(yǎng)用目測(cè)法選擇顏色最鮮艷的細(xì)胞接種。
6.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟c的光培養(yǎng)室培養(yǎng)周期懸浮培養(yǎng)為10-12天，固體培養(yǎng)為13-15天。
7.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟d的浸泡是用70％乙醇。
8.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟d的沉淀是用離心沉淀。
9.權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟d的上清液再進(jìn)一步過(guò)濾。
全文摘要
一種雪蓮紫丁香甙的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)方法，該方法步驟涉及采用雪蓮?fù)庵搀w或用種子萌發(fā)幼苗在1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，該愈傷組織細(xì)胞用于生產(chǎn)雪蓮紫丁香甙；產(chǎn)雪蓮紫丁香甙細(xì)胞的固體或懸浮培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基；用70％乙醇或正丁醇進(jìn)行雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物紫丁香甙的分離、提取和制備；用HPLC測(cè)定紫丁香甙含量。本方法的細(xì)胞培養(yǎng)物中總紫丁香甙化合物的含量為細(xì)胞干重的3－4％，紫丁香甙生產(chǎn)率為400－900mg/L。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1814748SQ20051001129
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日
發(fā)明者趙德修, 虞珍珍, 付春祥 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所