專利名稱：硝酸甘油治療急性心絞痛療效檢測方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及乙醛脫氫酶2基因(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphism，SNP)及其與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效之間相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
從1876年的第一次臨床應(yīng)用起，硝酸甘油(Nitroglycerin，NTG)就被廣泛的用來治療急性心絞痛。硝酸甘油的舌下腺給藥治療已經(jīng)成為了急性心絞痛的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。一般硝酸甘油的舌下腺給藥治療可以使急性心絞痛的癥狀在5到10分鐘內(nèi)得到緩解。硝酸甘油的生理學(xué)治療原理主要被解釋為，它具有釋放具有藥理活性的氮氧化合物(NO or NO congener)的能力，從而激活和推動(dòng)下游環(huán)鳥苷酸(cGMP)途徑，達(dá)到舒緩血管平滑肌的作用。
急性心絞痛是一種極為危險(xiǎn)的疾病，如果不能及時(shí)救治將有生命危險(xiǎn)。雖然目前已經(jīng)廣泛使用硝酸甘油治療急性心絞痛，但是臨床上仍發(fā)現(xiàn)有一些急性心絞痛病人在舌下腺給予硝酸甘油治療時(shí)的效果不明顯。這提示，這些人可能由于種種原因而對(duì)硝酸甘油治療不敏感。
人們嘗試提出了可能導(dǎo)致硝酸甘油治療失效的多種原因，包括環(huán)境差異、個(gè)體差異、飲食習(xí)慣等。
乙醛脫氫酶2基因?qū)儆谝粋€(gè)依賴NAD(P)的醛脫氫酶基因家族中的一員。這個(gè)基因家族主要的作用是在生理環(huán)境下的氧化醛類。除了具有脫氫酶的活性外，乙醛脫氫酶2基因還具有相當(dāng)強(qiáng)的酯酶的活性。它可以促使硝酸甘油水解成1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)。
2002年，Chen.ZQ等人發(fā)現(xiàn)無論在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn)，依賴cGMP的硝酸甘油對(duì)血管的擴(kuò)張作用，都可以被乙醛脫氫酶2基因(ALDH2)蛋白的抑制劑所阻斷。這提示，乙醛脫氫酶2基因參與了依賴cGMP的硝酸甘油擴(kuò)張血管的生理作用，并且扮演了重要的角色。
然而，迄今為止，可能導(dǎo)致硝酸甘油治療失效的真正原因尚沒有被證實(shí)。
綜上所述，人們對(duì)于影響硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的原因還了解甚少。為了針對(duì)性地使用硝酸甘油，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)預(yù)測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的方法和試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種預(yù)先判斷硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的方法及試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外檢測樣品是否存在乙醛脫氫酶2基因ALDH2的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用ALDH2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的ALDH2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQ ID NO3和4的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為50-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第1951位。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種預(yù)測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增ALDH2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴(kuò)增出長度為50-3000bp，且含有SEQ ID NO1中第1951位的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第1951位的突變結(jié)合的探針；(b)識(shí)別SEQ ID NO1中第1951位的突變限制性內(nèi)切酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變是以下的單核苷酸多態(tài)性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在另一優(yōu)選例中，所述的引物具有SEQ ID NO3和4的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種對(duì)硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性進(jìn)行預(yù)測的方法，它包括步驟檢測待檢個(gè)體的ALDH2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的ALDH2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，
存在差異就表明對(duì)該個(gè)體而言硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性低于普通的急性心絞痛人群。
在另一優(yōu)選例中，檢測的是ALDH2的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常ALDH2核苷酸序列比較差異。
在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有0.01-99wt％的1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)以及藥學(xué)上可接受的載體。或者，該組合物含有(a)安全有效量(0.01-99wt％)的硝酸甘油、(b)有效量的使硝酸甘油水解成1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)的野生型乙醛脫氫酶2(通常，乙醛脫氫酶2與硝酸甘油的摩爾比為1∶10,000至1∶1,000,000)，以及藥學(xué)上可接受的載體。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對(duì)大量候選基因的SNP進(jìn)行了測定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了ALDH2基因的部分SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效密切相關(guān)，ALDH2的改變將導(dǎo)致硝酸甘油治療急性心絞痛的療效下降，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在ALDH2第1951位的SNP(1951位G→A)在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異(P＜0.01)，因此可作為預(yù)測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
ALDH2基因乙醛脫氫酶2基因(acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)的詳細(xì)序列可參見登錄號(hào)為NT_009775的核苷酸序列(可參見網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，如SEQ ID NO1所示。其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
乙醛脫氫酶2基因?qū)儆谝粋€(gè)依賴NAD(P)的醛脫氫酶基因家族中的一員。這個(gè)基因家族主要的作用是在生理環(huán)境下的氧化醛類。除了具有脫氫酶的活性外，乙醛脫氫酶2基因還具有相當(dāng)強(qiáng)的酯酶的活性。它可以促使硝酸甘油水解成1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)。
本發(fā)明的研究表明，當(dāng)乙醛脫氫酶2發(fā)生突變導(dǎo)致活性下降時(shí)，將使硝酸甘油對(duì)血管的擴(kuò)張作用受到影響，甚至被阻斷，從而導(dǎo)致硝酸甘油療效下降。
如本文所用，“ALDH2基因”指編碼乙醛脫氫酶2的多核苷酸分子，包括DNA和RNA。
如本文所用，“ALDH2蛋白”指乙醛脫氫酶2蛋白。
如本文所用，把乙醛脫氫酶2基因分為兩種類型的等位基因，即多態(tài)性位點(diǎn)為G的乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)和多態(tài)性位點(diǎn)為A的乙醛脫氫酶2基因2型(ALDH2*2)。
本發(fā)明人對(duì)大量候選基因的SNP進(jìn)行了測定和分析，其中對(duì)ALDH2基因中的幾乎整個(gè)區(qū)域進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)了許多SNP，其中大部分SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性并不相關(guān)，然而關(guān)聯(lián)研究表明，1951位G→A卻是與硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性關(guān)聯(lián)性非常高的SNP。該SNP使讀碼框從GAA變?yōu)锳AA，從而引起了504位氨基酸從Glu到Lys的改變，進(jìn)而導(dǎo)致影響ALDH2的活性，并最終導(dǎo)致攜帶者的硝酸甘油治療急性心絞痛的療效明顯低于普通的急性心絞痛人群。
基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，ALDH2蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)輔助治療急性心絞痛，例如與硝酸甘油一起用于聯(lián)合治療急性心絞痛。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人ALDH2 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人ALDH2基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人ALDH2基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人ALDH2蛋白的分子，也包括那些并不影響人ALDH2蛋白功能的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人ALDH2基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人ALDH2蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人ALDH2蛋白功能的抗體以及不影響人ALDH2蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人AIDH2基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人ALDH2基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
抗人ALDH2蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的人ALDH2蛋白的多少和/或突變與否。一種優(yōu)選的抗ALDH2抗體是不識(shí)別正常ALDH2但識(shí)別突變ALDH2的抗體，或者識(shí)別正常ALDH2(即野生型)但不識(shí)別突變型ALDH2的抗體。利用這些抗體，可以方便地在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的預(yù)測。
利用本發(fā)明ALDH2蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與ALDH2蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。
本發(fā)明ALDH2蛋白及其激動(dòng)劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)舌下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、或皮下給藥。
正常的ALDH2可直接用于疾病治療，例如，用于硝酸甘油治療急性心絞痛的療效治療。在使用本發(fā)明ALDH2蛋白抑制劑時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療硝酸甘油治療急性心絞痛的療效的藥劑。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明ALDH2蛋白和硝酸甘油、以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.1微克/千克體重-約10毫克/千克體重。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的ALDH2蛋白或其激動(dòng)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約0.1微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.1微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測人ALDH2蛋白水平的試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括ELISA等。
一種檢測樣品中是否存在ALDH2蛋白的方法是利用ALDH2蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與ALDH2蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在ALDH2蛋白。
ALDH2蛋白的多聚核苷酸可用于預(yù)先判斷硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性。如ALDH2 DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷ALDH2蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因檢測。用ALDH2蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測ALDH2蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測ALDH2基因的突變也可用于預(yù)先判斷硝酸甘油治療急性心絞痛的療效。檢測可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。ALDH2蛋白突變的形式包括與正常野生型ALDH2 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用ALDH2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的ALDH2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性1951位G→A，其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了ALDH2基因的SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可特異性擴(kuò)增出含該SNP位置的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在1951位G→A。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5′端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對(duì)應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對(duì)具有SEQ ID NO3和4的序列。
雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為50-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴(kuò)增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQ ID NO1中第1951位。
由于本發(fā)明的SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此不僅可用于早期較準(zhǔn)確地預(yù)先判斷硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性，而且可以未雨綢繆地使攜帶者在未發(fā)病前或發(fā)病時(shí)就采取合理的預(yù)防措施(如使用其他有效藥物如1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)，或在使用硝酸甘油的同時(shí)使用乙醛脫氫酶2)，從而顯著提高對(duì)急性心絞痛患者的救治效果，因此具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例11.1研究對(duì)象選取了80名中國漢族，并且明確診斷冠心病的病人。他們均以含服硝酸甘油作為心絞痛發(fā)作時(shí)用藥。根據(jù)舌下硝酸甘油給藥的效果，可以將這些病人分為十分鐘內(nèi)顯效的有效組，和十分鐘內(nèi)未顯效的無效組。有效組共有59個(gè)病人，其中男性47人，女性12人。無效組共21個(gè)病人，其中男性13人，女性8人。這些病人，從性別關(guān)系上看，給藥的效果與患者的性別無顯著相關(guān)(p＝0.107)。
1.2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果1.2.1DNA提取用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。
1.2.2PCR及測序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中ALDH2基因的序列，設(shè)計(jì)和合成以下引物。具體引物如下表1所示。
表1引物序列表

1.2.3ALDH2基因的PCR擴(kuò)增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700 PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2分鐘，94℃變性30秒，63℃退火40秒，72℃延伸40秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5℃；以后94℃變性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
結(jié)果，獲得358bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。
1.2.4SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件(美國華盛頓大學(xué)http//droog.mbt.washington.edu/Polyphred.html)進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在以下SNP1951位G→A。
1.2.5SNP基因分型和分析將這80個(gè)病人，針對(duì)乙醛脫氫酶2基因中的1951G/A位點(diǎn)，利用如上的PCR以及測序的結(jié)果，進(jìn)行了基因分型。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有效組中，乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)純合子個(gè)體(即1951位為G/G)數(shù)為40個(gè)；而在無效組中，乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)純合子個(gè)體數(shù)為7個(gè)。乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)純合子的個(gè)數(shù)，在兩個(gè)不同的組中，具有顯著性差異(x2＝7.59，p＝0.006)。結(jié)果說明，舌下硝酸甘油給藥治療急性心絞痛的效果，對(duì)乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)純合子的個(gè)體，明顯比對(duì)乙醛脫氫酶2基因2型(ALDH2*2)純合子(即1951位為A/A)，或乙醛脫氫酶2基因1型、2型的雜合子的個(gè)體(即1951位為G/A)要更有效，并且兩者具有顯著性差異。
實(shí)施例2野生型和突變型乙醛脫氫酶2的活性測定從乙醛脫氫酶2基因型雜合的個(gè)體中，利用逆轉(zhuǎn)錄的方法得到了野生型和1951位G→A突變型的兩種不同基因型的逆轉(zhuǎn)錄DNA(cDNA)，并通過測序?qū)λ眯蛄羞M(jìn)行了驗(yàn)證。隨后，使用嵌套式PCR(nest-PCR)的方法對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行了擴(kuò)增，并引入了酶切位點(diǎn)。然后，擴(kuò)增后的序列被重組進(jìn)質(zhì)粒中(recombinantplasmid)，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)了昆蟲細(xì)胞sf9(購自Invitrogen公司)中。重組進(jìn)質(zhì)粒的序列也通過測序進(jìn)行了驗(yàn)證，分別為SEQ ID NO5(野生型，第1510位為G)和SEQ ID NO6(突變型，第1510位為A)。使用常規(guī)免疫吸染(immunoblotting)的方法，驗(yàn)證了傳染進(jìn)細(xì)胞中的質(zhì)粒的乙醛脫氫酶2基因的表達(dá)。
重組表達(dá)的乙醛脫氫酶2基因蛋白，經(jīng)過親合層析提純，可以通過12％的丙烯酰胺凝膠電泳，利用托馬斯亮藍(lán)(Coomassie blue)染色，看到大約54kDa的蛋白。
將重組表達(dá)的兩種不同基因型的乙醛脫氫酶2基因蛋白，以及直接從乙醛脫氫酶2基因1型純合個(gè)體和乙醛脫氫酶2基因1型、2型雜合個(gè)體取得的純化后的乙醛脫氫酶2基因蛋白，通過放射化學(xué)的方法，檢測這四種樣本轉(zhuǎn)化硝酸甘油的能力。
結(jié)果見下表兩種等位基因型蛋白的動(dòng)力學(xué)特性

結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶2基因1型(即野生型)的蛋白，明顯比乙醛脫氫酶2基因2型的蛋白，在轉(zhuǎn)化硝酸甘油方面，具有更低的Km，以及更高的Vmax。而乙醛脫氫酶2基因1型的蛋白純合子的蛋白，也比1型、2型雜合子蛋白具有更低的Km，更高的Vmax。
由此可見，乙醛脫氫酶2基因1型的蛋白具有更高的轉(zhuǎn)化硝酸甘油的生理活性。而乙醛脫氫酶2基因2型的蛋白，由于1951G→A的突變，改變了蛋白的氨基酸序列，影響了蛋白的功能和活性。乙醛脫氫酶2基因2型的蛋白無法有效的轉(zhuǎn)化硝酸甘油，也就影響了硝酸甘油對(duì)下游cGMP途徑的作用，無法達(dá)到有效舒張血管平滑肌的效果，從而降低了硝酸甘油對(duì)急性心絞痛的療效。
實(shí)施例3硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性有效性預(yù)測試劑盒如實(shí)施例1所述，SEQ ID NO1中1951位G→A的突變與硝酸甘油治療急性心絞痛的療效密切相關(guān)。因此，可基于這個(gè)突變設(shè)計(jì)ALDH2基因特異性引物在以待測個(gè)體的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行預(yù)測。
制備一試劑盒(100人次)，它含有

抽取待測男性病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將硝酸甘油治療急性心絞痛的療效預(yù)測試劑盒中的PCR引物稀釋到1ìmol/ìl，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377 DNA測序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。
或者，將擴(kuò)增產(chǎn)物與正常對(duì)照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，也可檢測出1951位G→A。
結(jié)果表明，含1951位G→A的測試對(duì)象的硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性(以十分鐘顯效為標(biāo)準(zhǔn))低于普通的急性心絞痛人群。
實(shí)施例4其他乙醛脫氫酶2的SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的相關(guān)性除了1951位G→A之外，還用實(shí)施例1中所述的方法檢測到了ALDH2基因中以下9個(gè)SNP

用實(shí)施例1中相同方法，對(duì)這些SNP進(jìn)行了SNP基因分型和分析。結(jié)果表明，這些SNP與硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有相關(guān)性。
討論乙醛脫氫酶2基因?qū)儆谝粋€(gè)依賴NAD(P)的醛脫氫酶基因家族中的一員。這個(gè)基因家族主要的作用是在生理環(huán)境下的氧化醛類。除了具有脫氫酶的活性外，乙醛脫氫酶2基因還具有相當(dāng)強(qiáng)的酯酶的活性。它可以促使硝酸甘油水解成1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)。
在乙醛脫氫酶2基因(ALDH2)的第十二號(hào)外顯子中，有一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)，即SEQ ID NO1中第1951位的鳥苷酸和腺苷酸(G/A)的多態(tài)。這個(gè)SNP位點(diǎn)把乙醛脫氫酶2蛋白的第504號(hào)氨基酸從谷氨酸(Glu)改變成了賴氨酸(Lys)(見SEQ ID NO2)。由這個(gè)SNP，把乙醛脫氫酶2基因分為兩種類型的等位基因，即多態(tài)性位點(diǎn)為G的乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)和多態(tài)性位點(diǎn)為A的乙醛脫氫酶2基因2型(ALDH2*2)。
這個(gè)SNP在包括中國人在內(nèi)的亞洲人群中，具有比較高的頻率，約為30％左右。由于它改變了乙醛脫氫酶2基因蛋白的氨基酸序列，導(dǎo)致了這個(gè)SNP具有功能上的作用。乙醛脫氫酶2基因1型具有正常的酶活性，而乙醛脫氫酶2基因2型產(chǎn)出的是具有活性缺陷的酶。乙醛脫氫酶2基因1型(ALDH2*1)生成的有正?；钚缘拿福梢源侔l(fā)下游反應(yīng)，使硝酸甘油發(fā)揮舒張血管的作用。而乙醛脫氫酶2基因2型(ALDH2*2)所生成的沒有正?；钚缘拿福瑹o法正常促發(fā)下游反應(yīng)，使得硝酸甘油的舒張血管作用減弱，甚至消失。
本發(fā)明提示，可以將乙醛脫氫酶2基因1型與硝酸甘油聯(lián)合給藥，或者對(duì)于具有1951位G→A突變的急性心絞痛患者，可以在硝酸甘油之外使用1，2-二硝基甘油(1，2-GDN)和亞硝酸離子(NO2-)等藥物。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海人類基因組研究中心復(fù)旦大學(xué)上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院<120>硝酸甘油治療急性心絞痛療效檢測方法和試劑盒<130>045937<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2445<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1acctcgttca tctccttcac ctccgaaatg atctcgcttt tgggtttacg gccggtctct 60tcacctggag catcagccgg gaaggtcagg gtcgccctgg ctcgggcctg ttcacattgg120ggtcaaaggc acacattggg ggctcaacca aggcgagctg cgttcgcggg gccgggtctt180tccgcacagg cggagggcgg tggcgggcgc ggaggcgtcg cgcgagccag ggggcagcca240cgggccgggg gtacctagcg ccacccgctt cgcttgcatc agctgcgcgc cccatcccga300ggaatggtag aggcagcccc gcccccggcc cgcccccgcc tttccattgg ctgccgcgcg360gggcggggag cggggtcggc tcagtggccc tgagacccta gctctgctct cggtccgctc420gctgtccgct agcccgctgc gatgttgcgc gctgccgccc gcttcgggcc ccgcctgggc480cgccgcctct tgtcagccgc cgccacccag gccgtgcctg cccccaacca gcagcccgag540gtcttctgca accagatttt cataaacaat gaatggcacg atgccgtcag caggaaaaca600ttccccaccg tcaatccgtc cactggagag gtcatctgtc aggtagctga aggggacaag660gaagatgtgg acaaggcagt gaaggccgcc cgggccgcct tccagctggg ctcaccttgg720cgccgcatgg acgcatcaca caggggccgg ctgctgaacc gcctggccga tctgatcgag780cgggaccgga cctacctggc ggccttggag accctggaca atggcaagcc ctatgtcatc840tcctacctgg tggatttgga catggtcctc aaatgtctcc ggtattatgc cggctgggct900gataagtacc acgggaaaac catccccatt gacggagact tcttcagcta cacacgccat960gaacctgtgg gggtgtgcgg gcagatcatt ccgtggaatt tcccgctcct gatgcaagca 1020tggaagctgg gcccagcctt ggcaactgga aacgtggttg tgatgaaggt agctgagcag 1080acacccctca ccgccctcta tgtggccaac ctgatcaagg aggctggctt tccccctggt 1140gtggtcaaca ttgtgcctgg atttggcccc acggctgggg ccgccattgc ctcccatgag 1200gatgtggaca aagtggcatt cacaggctcc actgagattg gccgcgtaat ccaggttgct 1260gctgggagca gcaacctcaa gagagtgacc ttggagctgg gggggaagag ccccaacatc 1320atcatgtcag atgccgatat ggattgggcc gtggaacagg cccacttcgc cctgttcttc 1380aaccagggcc agtgctgctg tgccggctcc cggaccttcg tgcaggagga catctatgat 1440gagtttgtgg agcggagcgt tgcccgggcc aagtctcggg tggtcgggaa cccctttgat 1500agcaagaccg agcaggggcc gcaggtggat gaaactcagt ttaagaagat cctcggctac 1560atcaacacgg ggaagcaaga gggggcgaag ctgctgtgtg gtgggggcat tgctgctgac 1620cgtggttact tcatccagcc cactgtgttt ggagatgtgc aggatggcat gaccatcgcc 1680aaggaggaga tcttcgggcc agtgatgcag atcctgaagt tcaagaccat agaggaggtt 1740
gttgggagag ccaacaattc cacgtacggg ctggccgcag ctgtcttcac aaaggatttg 1800gacaaggcca attacctgtc ccaggccctc caggcgggca ctgtgtgggt caactgctat 1860gatgtgtttg gagcccagtc accctttggt ggctacaaga tgtcggggag tggccgggag 1920ttgggcgagt acgggctgca ggcatacact gaagtgaaaa ctgtcacagt caaagtgcct 1980cagaagaact cataagaatc atgcaagctt cctccctcag ccattgatgg aaagttcagc 2040aagatcagca acaaaaccaa gaaaaatgat ccttgcgtgc tgaatatctg aaaagagaaa 2100tttttcctac aaaatctctt gggtcaagaa agttctagaa tttgaattga taaacatggt 2160gggttggctg agggtaagag tatatgagga accttttaaa cgacaacaat actgctagct 2220ttcaggatga tttttaaaaa atagattcaa atgtgttatc ctctctctga aacgcttcct 2280ataactcgag tttatagggg aagaaaaagc tattgtttac aattatatca ccattaaggc 2340aactgctaca ccctgctttg tattctgggc taagattcat taaaaactag ctgctcttaa 2400aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2445<210>2<211>517<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Leu Arg Ala Ala Ala Arg Phe Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Leu1 5 10 15Leu Ser Ala Ala Ala Thr Gln Ala Val Pro Ala Pro Asn Gln Gln Pro20 25 30Glu Val Phe Cys Asn Gln Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Asp Ala35 40 45Val Ser Arg Lys Thr Phe Pro Thr Val Asn Pro Ser Thr Gly Glu Val50 55 60Ile Cys Gln Val Ala Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys Ala Val65 70 75 80Lys Ala Ala Arg Ala Ala Phe Gln Leu Gly Ser Pro Trp Arg Arg Met85 90 95Asp Ala Ser His Arg Gly Arg Leu Leu Asn Arg Leu Ala Asp Leu Ile100 105 110Glu Arg Asp Arg Thr Tyr Leu Ala Ala Leu Glu Thr Leu Asp Asn Gly115 120 125Lys Pro Tyr Val Ile Ser Tyr Leu Val Asp Leu Asp Met Val Leu Lys130 135 140Cys Leu Arg Tyr Tyr Ala Gly Trp Ala Asp Lys Tyr His Gly Lys Thr145 150 155 160Ile Pro Ile Asp Gly Asp Phe Phe Ser Tyr Thr Arg His Glu Pro Val165 170 175Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Leu Met Gln180 185 190Ala Trp Lys Leu Gly Pro Ala Leu Ala Thr Gly Asn Val Val Val Met195 200 205Lys Val Ala Glu Gln Thr Pro Leu Thr Ala Leu Tyr Val Ala Asn Leu210 215 220Ile Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly
225 230 235 240Phe Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ala Ser His Glu Asp Val Asp245 250 255Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Ile Gly Arg Val Ile Gln Val260 265 270Ala Ala Gly Ser Ser Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly275 280 285Lys Ser Pro Asn Ile Ile Met Ser Asp Ala Asp Met Asp Trp Ala Val290 295 300Glu Gln Ala His Phe Ala Leu Phe Phe Asn Gln Gly Gln Cys Cys Cys305 310 315 320Ala Gly Ser Arg Thr Phe Val Gln Glu Asp Ile Tyr Asp Glu Phe Val325 330 335Glu Arg Ser Val Ala Arg Ala Lys Ser Arg Val Val Gly Asn Pro Phe340 345 350Asp Ser Lys Thr Glu Gln Gly Pro Gln Val Asp Glu Thr Gln Phe Lys355 360 365Lys Ile Leu Gly Tyr Ile Asn Thr Gly Lys Gln Glu Gly Ala Lys Leu370 375 380Leu Cys Gly Gly Gly Ile Ala Ala Asp Arg Gly Tyr Phe Ile Gln Pro385 390 395 400Thr Val Phe Gly Asp Val Gln Asp Gly Met Thr Ile Ala Lys Glu Glu405 410 415Ile Phe Gly Pro Val Met Gln Ile Leu Lys Phe Lys Thr Ile Glu Glu420 425 430Val Val Gly Arg Ala Asn Asn Ser Thr Tyr Gly Leu Ala Ala Ala Val435 440 445Phe Thr Lys Asp Leu Asp Lys Ala Asn Tyr Leu Ser Gln Ala Leu Gln450 455 460Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Asp Val Phe Gly Ala Gln Ser465 470 475 480Pro Phe Gly Gly Tyr Lys Met Ser Gly Ser Gly Arg Glu Leu Gly Glu485 490 495Tyr Gly Leu Gln Ala Tyr Thr Glu Val Lys Thr Val Thr Val Lys Val500 505 510Pro Gln Lys Asn Ser515<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3cctgggcaac agagaaagat t 21
<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4cccaacagac cccaatcc 18<210>5<211>1551<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>5atgttgcgcg ctgccgcccg cttcgggccc cgcctgggcc gccgcctctt gtcagccgcc 60gccacccagg ccgtgcctgc ccccaaccag cagcccgagg tcttctgcaa ccagattttc120ataaacaatg aatggcacga tgccgtcagc aggaaaacat tccccaccgt caatccgtcc180actggagagg tcatctgtca ggtagctgaa ggggacaagg aagatgtgga caaggcagtg240aaggccgccc gggccgcctt ccagctgggc tcaccttggc gccgcatgga cgcatcacac300aggggccggc tgctgaaccg cctggccgat ctgatcgagc gggaccggac ctacctggcg360gccttggaga ccctggacaa tggcaagccc tatgtcatct cctacctggt ggatttggac420atggtcctca aatgtctccg gtattatgcc ggctgggctg ataagtacca cgggaaaacc480atccccattg acggagactt cttcagctac acacgccatg aacctgtggg ggtgtgcggg540cagatcattc cgtggaattt cccgctcctg atgcaagcat ggaagctggg cccagccttg600gcaactggaa acgtggttgt gatgaaggta gctgagcaga cacccctcac cgccctctat660gtggccaacc tgatcaagga ggctggcttt ccccctggtg tggtcaacat tgtgcctgga720tttggcccca cggctggggc cgccattgcc tcccatgagg atgtggacaa agtggcattc780acaggctcca ctgagattgg ccgcgtaatc caggttgctg ctgggagcag caacctcaag840agagtgacct tggagctggg ggggaagagc cccaacatca tcatgtcaga tgccgatatg900gattgggccg tggaacaggc ccacttcgcc ctgttcttca accagggcca gtgctgctgt960gccggctccc ggaccttcgt gcaggaggac atctatgatg agtttgtgga gcggagcgtt 1020gcccgggcca agtctcgggt ggtcgggaac ccctttgata gcaagaccga gcaggggccg 1080caggtggatg aaactcagtt taagaagatc ctcggctaca tcaacacggg gaagcaagag 1140ggggcgaagc tgctgtgtgg tgggggcatt gctgctgacc gtggttactt catccagccc 1200actgtgtttg gagatgtgca ggatggcatg accatcgcca aggaggagat cttcgggcca 1260gtgatgcaga tcctgaagtt caagaccata gaggaggttg ttgggagagc caacaattcc 1320acgtacgggc tggccgcagc tgtcttcaca aaggatttgg acaaggccaa ttacctgtcc 1380caggccctcc aggcgggcac tgtgtgggtc aactgctatg atgtgtttgg agcccagtca 1440ccctttggtg gctacaagat gtcggggagt ggccgggagt tgggcgagta cgggctgcag 1500gcatacactg aagtgaaaac tgtcacagtc aaagtgcctc agaagaactc a1551<210>6<211>1551<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)<400>6atgttgcgcg ctgccgcccg cttcgggccc cgcctgggcc gccgcctctt gtcagccgcc 60gccacccagg ccgtgcctgc ccccaaccag cagcccgagg tcttctgcaa ccagattttc120ataaacaatg aatggcacga tgccgtcagc aggaaaacat tccccaccgt caatccgtcc180actggagagg tcatctgtca ggtagctgaa ggggacaagg aagatgtgga caaggcagtg240aaggccgccc gggccgcctt ccagctgggc tcaccttggc gccgcatgga cgcatcacac300aggggccggc tgctgaaccg cctggccgat ctgatcgagc gggaccggac ctacctggcg360gccttggaga ccctggacaa tggcaagccc tatgtcatct cctacctggt ggatttggac420atggtcctca aatgtctccg gtattatgcc ggctgggctg ataagtacca cgggaaaacc480atccccattg acggagactt cttcagctac acacgccatg aacctgtggg ggtgtgcggg540cagatcattc cgtggaattt cccgctcctg atgcaagcat ggaagctggg cccagccttg600gcaactggaa acgtggttgt gatgaaggta gctgagcaga cacccctcac cgccctctat660gtggccaacc tgatcaagga ggctggcttt ccccctggtg tggtcaacat tgtgcctgga720tttggcccca cggctggggc cgccattgcc tcccatgagg atgtggacaa agtggcattc780acaggctcca ctgagattgg ccgcgtaatc caggttgctg ctgggagcag caacctcaag840agagtgacct tggagctggg ggggaagagc cccaacatca tcatgtcaga tgccgatatg900gattgggccg tggaacaggc ccacttcgcc ctgttcttca accagggcca gtgctgctgt960gccggctccc ggaccttcgt gcaggaggac atctatgatg agtttgtgga gcggagcgtt 1020gcccgggcca agtctcgggt ggtcgggaac ccctttgata gcaagaccga gcaggggccg 1080caggtggatg aaactcagtt taagaagatc ctcggctaca tcaacacggg gaagcaagag 1140ggggcgaagc tgctgtgtgg tgggggcatt gctgctgacc gtggttactt catccagccc 1200actgtgtttg gagatgtgca ggatggcatg accatcgcca aggaggagat cttcgggcca 1260gtgatgcaga tcctgaagtt caagaccata gaggaggttg ttgggagagc caacaattcc 1320acgtacgggc tggccgcagc tgtcttcaca aaggatttgg acaaggccaa ttacctgtcc 1380caggccctcc aggcgggcac tgtgtgggtc aactgctatg atgtgtttgg agcccagtca 1440ccctttggtg gctacaagat gtcggggagt ggccgggagt tgggcgagta cgggctgcag 1500gcatacacta aagtgaaaac tgtcacagtc aaagtgcctc agaagaactc a155權(quán)利要求
1.一種體外檢測樣品是否存在乙醛脫氫酶2基因ALDH2的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用ALDH2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的ALDH2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物具有SEQID NO3和4的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為50-3000bp，且含有SEQ ID N01中第1951位。
4.一種預(yù)測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增ALDH2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴(kuò)增出長度為50-3000bp，且含有SEQID NO1中第1951位的擴(kuò)增產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQ ID NO1中第1951位的突變結(jié)合的探針；(b)識(shí)別SEQ ID NO1中第1951位的突變限制性內(nèi)切酶。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是以下的單核苷酸多態(tài)性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物具有SEQ ID NO3和4的序列。
8.一種對(duì)硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性進(jìn)行預(yù)測的方法，其特征在于，它包括步驟檢測待檢個(gè)體的ALDH2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的ALDH2基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明對(duì)該個(gè)體而言硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性低于普通的急性心絞痛人群。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，檢測的是ALDH2的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常ALDH2核苷酸序列比較差異。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性1951位G→A；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性有效性的方法，它包括檢測個(gè)體的乙醛脫氫酶2基因ALDH2、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明對(duì)該個(gè)體而言用硝酸甘油治療急性心絞痛的有效性低于普通的急性心絞痛人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1749415SQ20041006637
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2004年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月15日
發(fā)明者黃薇, 金力, 李一峰, 金瑋 申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心, 復(fù)旦大學(xué), 上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院