專利名稱：裸胚冷凍技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及胚胎移植冷凍胚胎生產領域，具體的說是將胚胎脫除透明帶后進行超低溫保存的一種冷凍方法。
背景技術：
目前，早期胚胎的性別鑒定技術必須取得部分胚胎細胞，進行基因擴增，從而判定胚胎的性別，達到性別控制的目的。但是胚胎經過切割取樣后，透明帶遭到破壞，若將裸露的細胞團重新放入另外的透明帶中，所需設備投資很大，而且攜帶不方便，不利于產業(yè)化操作。因此，采用獨特的冷凍液和冷凍技術，可大大減少不必要的投資，更方便進行大規(guī)模推廣。
發(fā)明內容
本發(fā)明為了解決胚胎脫除透明帶后，抗低溫的性能降低，同時對冷凍防護液的滲透功能加強，造成冷凍過程中，溶質效應和物理損傷對裸露細胞團的損傷問題，發(fā)明了一種用乙二醇、蔗糖、葡聚糖等為主要原料，來冷凍裸露胚胎的方法。
本發(fā)明為了解決上述技術問題，所采取的技術方案是，一種高保護功能的冷凍液，其配方成分為乙二醇、蔗糖、葡聚糖、血清白蛋白、PBS、超純水。
成分比例10％乙二醇20-30％1M蔗糖20-10％10％葡聚糖10-15％血清白蛋白10-15％PBS 30-10％超純水10-20％冷凍程序室溫平衡5min--6.5℃平衡5min-植冰--6.5℃平衡5min-降溫-平衡后投入液氮。
冷凍操作過程1)平衡室溫下將胚胎洗凈，在冷凍液中平衡5-10分鐘，裝管。
2)植冰前平衡將細管放入冷凍儀，在-6.5℃平衡5分鐘。
3)植冰將鑷子在液氮中放置足夠低溫，于細管上1/3處植冰。
4)植冰后平衡在-6.5℃平衡5分鐘。
5)降溫以0.5℃/min的速率降溫至-35℃。
6)平衡10分鐘后，投入液氮保存。
具體實施例下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步說明。
實施例11、配藥取乙二醇2ml，蔗糖1ml，葡聚糖1ml，血清白蛋白1.5ml，PBS 2.5ml，超純水2ml。
2、打開無菌操作臺的紫外消毒燈，照射30min后，進行操作。將葡聚糖配成10％的水溶液，然后分別取乙二醇2ml，蔗糖1ml，葡聚糖1ml，血清白蛋白1.5ml，PBS 2.5ml，超純水2ml，放入高溫消毒后的小玻璃瓶內，混勻。用細菌濾器過濾后，4℃恒溫保存5-7天。
3、使用該配方冷凍的裸胚，解凍后復蘇率87％，移植成功率42％。
實施例21、配藥取乙二醇3ml，蔗糖1ml，葡聚糖1ml，血清白蛋白1ml，PBS 3ml，超純水1ml。
2、打開無菌操作臺的紫外消毒燈，照射30min后，進行操作。將葡聚糖配成10％的水溶液，然后分別取乙二醇3ml，蔗糖1ml，葡聚糖1ml，血清白蛋白1ml，PBS 3ml，超純水1ml，放入高溫消毒后的小玻璃瓶內，混勻。用細菌濾器過濾后，4℃恒溫保存5-7天。
3、使用該配方冷凍的裸胚，解凍后復蘇率81％，移植成功率40％。
實施例31、配藥取乙二醇2ml，蔗糖2ml，葡聚糖1ml，血清白蛋白1ml，PBS 3ml，超純水1ml。
2、打開無菌操作臺的紫外消毒燈，照射30min后，進行操作。將葡聚糖配成10％的水溶液，然后分別取乙二醇2ml，蔗糖2ml，葡聚糖1ml，血清白蛋白1ml，PBS 3ml，超純水1ml，放入高溫消毒后的小玻璃瓶內，混勻。用細菌濾器過濾后，4℃恒溫保存5-7天。
3、使用該配方冷凍的裸胚，解凍后復蘇率86％，移植成功率40％。
權利要求
1.一種裸露胚胎的冷凍保存方法，其特征是，主要成分為乙二醇、蔗糖、葡聚糖、血清白蛋白、PBS、超純水。
2.根據(jù)權利要求1所述的裸露胚胎的冷凍保存方法，其特征是，成分比例為乙二醇20-30％、蔗糖20-10％、葡聚糖10-15％、血清白蛋白10-15％，PBS30-10％、超純水10-20％。
3.根據(jù)權利要求1所述的裸露胚胎的冷凍保存方法，其特征是，冷凍規(guī)程為室溫平衡5min--6.5℃平衡5min-植冰--6.5℃平衡5min-降溫-平衡后投入液氮。具體冷凍操作過程為1)平衡室溫下將胚胎洗凈，在冷凍液中平衡5-10分鐘，裝管。2)植冰前平衡將細管放入冷凍儀，在-6.5℃平衡5分鐘。3)植冰將鑷子在液氮中放置足夠低溫，于細管上1/3處植冰。4)植冰后平衡在-6.5℃平衡5分鐘。5)降溫以0.5℃/min的速率降溫至-35℃。6)平衡10分鐘后，投入液氮保存。
全文摘要
一種裸胚的冷凍方法，其特征是冷凍液主要成分為乙二醇、蔗糖、葡聚糖、血清白蛋白、PBS、超純水。成分比例為乙二醇20－30％、蔗糖20－10％、葡聚糖10－15％、血清白蛋白10－15％，PBS30－10％、超純水10－20％。它可盡量避免冷凍時的溶質效應和物理損傷對脫除透明帶的裸露細胞團的破壞作用，使胚胎解凍后保持較好的活力，保證獲得與帶有透明帶的胚胎相同的移植成功率。
文檔編號C12N5/06GK1727473SQ200410035488
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月31日 優(yōu)先權日2004年7月31日
發(fā)明者黃河, 李鑫 申請人:青島六和牧業(yè)發(fā)展有限公司