專利名稱：一株曲霉菌及利用其生產(chǎn)果酸鈣的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物和生化工程領(lǐng)域，尤其涉及一株曲霉菌及利用其發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)果酸鈣的方法。
背景技術(shù)：
鈣是人體含量最多的一種無機(jī)元素，成年人體中鈣約占體重的1.5～2％。人體中的鈣99％的存在于骨骼和牙齒中，1％的存在于血液和細(xì)胞等軟組織中，血液和細(xì)胞中的鈣，擔(dān)負(fù)著維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)，維持機(jī)體酸堿平衡，參與機(jī)體物質(zhì)代謝等重要的生理功能。這部分鈣主要通過與蛋白結(jié)合的形式參與各種生理過程。鈣結(jié)合蛋白具有特異性、高親和力，能夠可逆地與鈣相結(jié)合，廣泛的存在于細(xì)胞內(nèi)外，以其與鈣親和力的不同來感受或調(diào)節(jié)鈣離子濃度，參與肌肉收縮、血液凝固、神經(jīng)肌肉的應(yīng)激性、毛細(xì)血管的滲透性等生理過程；參與酶的激活、激素分泌和代謝過程的催化、啟動(dòng)、運(yùn)輸、分泌等生理功能，維持人體細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。如肌鈣蛋白C，有四個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)，參與肌肉的收縮和舒張。鈣調(diào)蛋白存在于所有真核細(xì)胞漿內(nèi)，有四個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)核酸代謝、細(xì)胞分泌、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖分裂。鈣在機(jī)體內(nèi)有第二信使之稱，是生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)劑。鈣在機(jī)體內(nèi)需要維持一個(gè)正常生理水平，骨骼和牙齒是機(jī)體鈣的儲(chǔ)備庫，在鈣缺乏的情況下，機(jī)體將從骨骼和牙齒中通過骨鈣動(dòng)員，使鈣質(zhì)進(jìn)入血液，維持血鈣平衡，長期缺鈣會(huì)引起骨質(zhì)疏松等疾病。
人體所需的鈣一般通過食物攝取，不同地區(qū)、不同的膳食結(jié)構(gòu)攝取鈣的量會(huì)有很大的差距，一般飲食不能滿足人體對(duì)鈣的需求，特別是正在生長的青少年和機(jī)能退化的中老年人，所以要適當(dāng)食用強(qiáng)化鈣產(chǎn)品來滿足人體對(duì)鈣的需求，保持身體健康。
目前市場(chǎng)上比較常見的補(bǔ)鈣產(chǎn)品按鈣源可以分為三大類一是以碳酸鈣為主要原料的無機(jī)鈣強(qiáng)化劑，優(yōu)點(diǎn)是含鈣量高，價(jià)格便宜，缺點(diǎn)是碳酸鈣可以中和胃酸，長期服用會(huì)引起胃漲、胃痛、食欲不振等不適。二是活性生物鈣，一般以海洋生物牡蠣殼等為原料經(jīng)高溫煅燒而成，含鈣量高，但水溶液是強(qiáng)堿性，對(duì)胃腸刺激性大，也有以動(dòng)物骨骼為原料加工而成的生物鈣，主要成分為羥基磷灰石，溶解度和吸收效果均不好，并且由于原料來源比較復(fù)雜，質(zhì)量不易控制。三是有機(jī)鈣強(qiáng)化劑，如葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、醋酸鈣等，優(yōu)點(diǎn)是溶解度好，但含鈣量低，吸收率低，須大量服用。
一種良好的鈣營養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)該鈣含量高，吸收率和生物利用率好，安全無毒副作用，水溶液呈中性。近年來研制開發(fā)的果酸鈣(檸檬酸-蘋果酸復(fù)合鈣鹽)是一符合上述標(biāo)準(zhǔn)的新一代有機(jī)鈣源。
果酸鈣(檸檬酸-蘋果酸鈣(Calcium citrate malate簡(jiǎn)寫成CCM))是鈣、檸檬酸和蘋果酸按一定比例配合生成的有機(jī)酸鈣復(fù)合物，性質(zhì)既不同于檸檬酸鈣也不同于蘋果酸鈣，溶解度比兩種鈣鹽都高，并且具有高生物學(xué)吸收利用性，能夠減少鐵吸收阻礙，而且風(fēng)味好、安全無毒副作用。日本專利昭和56/097248(1981)介紹了一種生產(chǎn)CCM的方法按一定摩爾比配制檸檬酸、蘋果酸溶液，然后加碳酸鈣50-60℃中和反應(yīng)，分離結(jié)晶，110-120℃干燥。也可以用氯化鈣和檸檬酸鈉和蘋果酸鈉制備。美國專利47722847(1988)公布了一種強(qiáng)化鈣的果汁的制作方法，該發(fā)明首先按照果汁的類型配制不同比例的檸檬酸和蘋果酸溶液，加入一定量的碳酸鈣或氧化鈣、氫氧化鈣，反應(yīng)完全的溶液加入果汁調(diào)配罐調(diào)配強(qiáng)化鈣果汁，這種果汁中的鈣含量與牛奶中鈣含量相當(dāng)，大鼠飼喂實(shí)驗(yàn)證明吸收性和生物利用性都比牛奶好。美國專利5186965(1993)公布的CCM的制備方法是首先配制一定摩爾比的檸檬酸和蘋果酸溶液，然后加入碳酸鈣或氧化鈣、氫氧化鈣至中和完全，反應(yīng)溫度40-60℃最佳，待反應(yīng)充分，采用離心、過濾等方法進(jìn)行固液分離，采用空氣干燥或加熱干燥、冷凍干燥等方法干燥，干燥溫度不高于100℃，然后把干燥鈣鹽磨制成直徑1mm以下的粉末。Patrick，L.(Alter Med Rev 1999Apr；4(2)74-85)研究論文比較CCM和碳酸鈣對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用，表明CCM有較高的生物學(xué)活性，能有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松。Smith，K.T.等人實(shí)驗(yàn)表明CCM中鈣的吸收好于碳酸鈣和牛奶(Calcif Tissue Int 1987 Dec；41(6)351-352)。
綜合上述CCM的生產(chǎn)方法，一般是按照一定的比例配制檸檬酸和蘋果酸混合溶液，然后加入碳酸鈣或氧化鈣或氫氧化鈣中和，通過結(jié)晶或直接干燥法生產(chǎn)。所用蘋果酸一般為DL-蘋果酸，如采用L-蘋果酸制造成本還會(huì)增加。經(jīng)檢索，關(guān)于利用微生物菌株發(fā)酵法生產(chǎn)果酸鈣，特別是利用曲霉菌發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)果酸鈣的方法至今未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明首先要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題是分離選育出一種能高產(chǎn)復(fù)合果酸鈣的菌株；同時(shí)本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提出一種利用該選育的微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)和分離純化果酸鈣(檸檬酸-蘋果酸復(fù)合鈣鹽)的方法。
本發(fā)明過程中涉及的技術(shù)方案詳述如下按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，從土壤中分離篩選積累少量的蘋果酸和檸檬酸的原始菌株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵進(jìn)行初、復(fù)篩得到SFA-208菌株，SFA-208菌株經(jīng)紫外線照射、γ射線輻射和化學(xué)誘變劑(硫酸二乙酯、亞硝基胍等)處理獲得一株高產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸的菌株，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為SFAH-4060，該菌株生物學(xué)特性為菌株分生孢子梗較短，頂端膨大呈囊狀，上面生有類似保鈴球瓶狀小梗，小梗多為單層，瓶狀小梗上生有3～5個(gè)分生孢子，孢子球形、梨形。該菌株能夠利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、D-木糖、纖維二糖、棉子糖、D-甘露糖、L-山梨糖、甘露醇、淀粉、糊精等多種碳源。在察氏培養(yǎng)基上所述SFAH-4060菌株的培養(yǎng)特征，放置30℃培養(yǎng)2天有生長，菌落圓形，白色，直徑0.5cm；培養(yǎng)4天，菌落圓形，表面生有淡黃色孢子，直徑2cm左右；培養(yǎng)7天菌落圓形，表面孢子色澤不均勻，呈黃色到黃綠色，菌落直徑約3-4cm；基內(nèi)菌絲不產(chǎn)生色素。放置36℃培養(yǎng)2天有生長，菌落圓形，白色，直徑0.5-1cm；培養(yǎng)四天，菌落直徑3-4cm，孢子呈黃到黃綠色；培養(yǎng)7天，菌落直徑約4cm，表面孢子色澤不均勻，呈黃到黃綠色；基內(nèi)菌絲不產(chǎn)生色素。在麥芽汁培養(yǎng)基上所述SFAH-4060菌株的培養(yǎng)特征，放置30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2天，菌落圓形，直徑約2cm，中間菌絲比較致密，周圍菌絲向四周發(fā)散，表面有少量黃色孢子生成；培養(yǎng)4天菌落圓形，直徑約5～6cm表面孢子呈綠色。培養(yǎng)7天，菌落布滿9cm平板，表面平整長滿綠色孢子，菌落中心約2cm呈絨毛狀突起，菌落表面和背面可見從菌落中心向四周發(fā)散的溝紋。放置36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2天菌落圓形，直徑約2.5-3cm，中間菌絲比較致密，周圍菌絲向四周發(fā)散，表面有少量黃色孢子生成；培養(yǎng)4天菌落圓形，直徑約5-6cm表面孢子呈綠色。培養(yǎng)7天，菌落布滿9cm平板，表面平整長滿暗綠色孢子，菌落中心約2cm呈絨毛狀突起，菌落表面和背面可見從菌落中心向四周發(fā)散的溝紋。
根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)鑒定該菌屬于曲霉菌屬的黃曲霉菌(Aspergillus flavus)，已于2004年8月4日在中國微生物菌種保藏管委會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，保藏中心地址為北京市中關(guān)村中國科學(xué)院微生物所內(nèi)，郵政編碼為100080，保藏號(hào)為CGMCC No.1204。
上述的黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204在含如下配比的種子培養(yǎng)基上，能較穩(wěn)定的保持高產(chǎn)蘋果酸和檸檬酸的特性并產(chǎn)生足夠量的菌種孢子用于接種，培養(yǎng)基為9-11°BX麥芽汁，pH5～8，加20g/L的瓊脂配制成固體培養(yǎng)基，0.08MPa滅菌20～30分鐘，放置成斜面，用接種環(huán)劃線接種該菌種，30℃～36℃培養(yǎng)60～72小時(shí)，培養(yǎng)完畢后可直接用于接種或置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 上述的黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204在含如下配比的發(fā)酵培養(yǎng)基上，能夠直接發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉100～130g/L，玉米漿5～10g/L，硫酸銨2～4g/L，硫酸亞鐵0.04g/L，碳酸鈣60～80g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L。其中淀粉可以用葡萄糖100～120g/L、全糖粉100～120g/L、結(jié)晶葡萄糖母液100～120g/L、蔗糖100～120g/L之一替代，不影響發(fā)酵最終結(jié)果。
上述的黃曲霉菌種(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204經(jīng)50L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的工藝流程是斜面菌種→麩曲菌種→深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽→過濾→脫色→濃縮→結(jié)晶→干燥→成品；其中種子及深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的控制條件是麩曲種子培養(yǎng)溫度為32℃～36℃，培養(yǎng)時(shí)間為60～72小時(shí)；所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉含量為100～120g/L；罐壓1kg/cm2，溫度34℃～36℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.5～1.0，攪拌轉(zhuǎn)速200～300r/min；發(fā)酵時(shí)間100～120小時(shí)。2m3發(fā)酵采用三級(jí)發(fā)酵，發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸-蘋果酸復(fù)合鈣鹽工藝流程為斜面菌種→麩曲菌種→一級(jí)種子→二級(jí)種子→深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽過濾→脫色→濃縮→結(jié)晶→干燥→成品。其中種子及深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的控制條件是麩曲種子培養(yǎng)溫度為32℃～36℃，時(shí)間為60～72小時(shí)；一級(jí)種子培養(yǎng)溫度34℃～36℃，時(shí)間是20～28小時(shí)，二級(jí)種子培養(yǎng)溫度為34℃～36℃，時(shí)間為12～16小時(shí)，所采用的液體種子培養(yǎng)基為淀粉40-80g/L，玉米漿10-20g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L；所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉含量為100～120g/L；罐壓1kg/cm2，溫度34℃～36℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.2～0.5，攪拌轉(zhuǎn)速100～150r/min，發(fā)酵時(shí)間為80～100小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束的放罐標(biāo)準(zhǔn)殘?zhí)?g/L以下。發(fā)酵液脫色、濃縮、結(jié)晶等采用常規(guī)方法。
上述種子及深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的優(yōu)選控制條件是麩曲種子培養(yǎng)溫度為34℃～36℃，時(shí)間為65～70小時(shí)，一級(jí)種子培養(yǎng)溫度34℃～36℃，時(shí)間是24～28小時(shí)，二級(jí)種子培養(yǎng)溫度為35℃～36℃，時(shí)間為12～16小時(shí)，所采用的液體種子培養(yǎng)基為淀粉50g/L，玉米漿15g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L；所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉含量為110-120g/L，玉米漿5-7g/L，硫酸銨2g/L，硫酸亞鐵0.04g/L，碳酸鈣78g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L；罐壓1kg/cm2，溫度35℃～36℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.5，攪拌轉(zhuǎn)速130r/min；發(fā)酵時(shí)間為80～90小時(shí)。
利用篩選分離的黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204可以充分地以淀粉和碳酸鈣為原料發(fā)酵，直接生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽，明顯降低了生產(chǎn)成本，發(fā)酵果酸產(chǎn)率達(dá)到90～100g/L(以蘋果酸計(jì))，轉(zhuǎn)化率90％以上。發(fā)酵結(jié)束殘?zhí)墙抵?.1％以下。通過本發(fā)明的方法制得的果酸鈣(檸檬酸-蘋果酸鈣)為白色粉末狀結(jié)晶，25℃溶解度為0.9～1.1，檸檬酸和蘋果酸的摩爾比約2∶3～4。發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸為生理活性物質(zhì)，能夠被人體直接吸收利用，產(chǎn)品的安全性能高。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204菌株形態(tài)觀察。察氏培養(yǎng)基組成蔗糖30.0g，硝酸鈉2.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，水1000ml，pH7.0～7.2，固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0g。麥芽汁培養(yǎng)基的制備啤酒用大麥芽粉碎后加入3倍水混合均勻，60℃水浴保溫糖化至無淀粉反應(yīng)為止(檢查方法是取糖化液0.5ml加碘液2滴，無藍(lán)紫色出現(xiàn)，即停止糖化)，糖化液加熱煮沸過濾，取濾清液稀釋至11°BX麥芽汁，加入20g/L的瓊脂配制固體培養(yǎng)基。上述兩種培養(yǎng)基0.08MPa蒸汽滅菌25-30分鐘，傾倒無菌培養(yǎng)皿(9cm)，冷卻凝固后點(diǎn)種黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204菌株成熟孢子，分別放置30℃和36℃培養(yǎng)，觀察菌落培養(yǎng)特征。
在察氏培養(yǎng)基上所述黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204菌株的培養(yǎng)特征如下，放置30℃培養(yǎng)2天有生長，菌落圓形，白色，直徑0.5cm；培養(yǎng)4天，菌落圓形，表面生有淡黃色孢子，直徑2cm左右；培養(yǎng)7天菌落圓形，表面孢子色澤不均勻，呈黃色到黃綠色，菌落直徑約3-4cm；基內(nèi)菌絲不產(chǎn)生色素。放置36℃培養(yǎng)2天有生長，菌落圓形，白色，直徑0.5-1cm；培養(yǎng)四天，菌落直徑3-4cm，孢子呈黃到黃綠色；培養(yǎng)7天，菌落直徑約4cm，表面孢子色澤不均勻，呈黃到黃綠色；基內(nèi)菌絲不產(chǎn)生色素。
在麥芽汁培養(yǎng)基上所述黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204菌株的培養(yǎng)特征如下，放置30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2天，菌落圓形，直徑約2cm，中間菌絲比較致密，周圍菌絲向四周發(fā)散，表面有少量黃色孢子生成；培養(yǎng)4天菌落圓形，直徑約5～6cm表面孢子呈綠色。培養(yǎng)7天，菌落布滿9cm平板，表面平整長滿綠色孢子，菌落中心約2cm呈絨毛狀突起，菌落表面和背面可見從中心向四周發(fā)散的溝紋。放置36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2天菌落圓形，直徑約2.5-3cm，中間菌絲比較致密，周圍菌絲向四周發(fā)散，表面有少量黃色孢子生成；培養(yǎng)4天菌落圓形，直徑約5-6cm表面孢子呈綠色。培養(yǎng)7天，菌落布滿9cm平板，表面平整長滿暗綠色孢子，菌落中心約2cm呈絨毛狀突起，菌落表面和背面可見從中心向四周發(fā)散的溝紋。
實(shí)施例2斜面菌種的培養(yǎng)。麥芽汁培養(yǎng)基按照實(shí)施例1所述的方法配制，灌制試管斜面，0.08MPa蒸汽滅菌25-30分鐘，趁熱擺制成斜面，冷卻成型后備用。用上述方法配制的斜面用于黃曲霉菌種(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204日常保存和傳接菌種。接種后斜面菌種放置36℃培養(yǎng)60-72小時(shí)，表面長滿綠色孢子，取出備用。
實(shí)施例3黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204麩曲菌種的制備小麥麩皮按不同的比例加水配制，料水混合均勻后分裝500ml三角瓶，每瓶干料15g左右，0.1MPa蒸汽滅菌30分鐘以上，取出趁熱打散，冷卻后接種1～2環(huán)斜面孢子，混合均勻，置28～36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中經(jīng)過堆積、打散、扣瓶等常規(guī)步驟，待孢子成熟后取出作為發(fā)酵種子，培養(yǎng)過程一般為48～72小時(shí)，成熟麩曲種子呈黃綠色。比較了不同的料水比配方和不同的培養(yǎng)溫度對(duì)菌株SFAH4060生孢子數(shù)的影響，結(jié)果見表1，表2。
表1

表2

實(shí)施例450L發(fā)酵罐裝32L發(fā)酵培養(yǎng)基(淀粉110g/L，玉米漿5g/L，硫酸銨2g/L，硫酸亞鐵0.04g/L，碳酸鈣70g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L)滅菌后接種黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204麩曲種子15g(干重，加無菌水制備成菌懸液)，攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，通氣比1∶1，罐壓1kg/cm2，36℃培養(yǎng)112小時(shí)殘?zhí)墙抵?g/L以下，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液濾除菌絲體，過濾清液加入1％的活性碳70℃保溫30分鐘脫色過濾，清液80℃減壓濃縮至16-17Be°，冷卻結(jié)晶。固液分離后母液可再結(jié)晶一次。共計(jì)得果酸鈣2.71kg。
實(shí)施例550L發(fā)酵罐裝32L發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉108g/L，預(yù)先液化，玉米漿7g/L，硫酸銨3g/L，硫酸亞鐵0.04g/L，碳酸鈣75g/L)，滅菌后按10％(質(zhì)量體積百分比)接種SFAH-4060液體種子。液體培養(yǎng)基為淀粉60g/L，玉米漿10g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L，0.08MPa蒸汽滅菌后接種麩曲種子，36℃搖床培養(yǎng)24小時(shí)；發(fā)酵罐控制工藝條件為攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣比1∶1，罐壓1kg/cm2，36℃培養(yǎng)100小時(shí)殘?zhí)墙抵?g/L以下，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液濾除菌絲體，過濾清液經(jīng)脫色、減壓濃縮后結(jié)晶。固液分離后的母液可以再結(jié)晶一次，共計(jì)的果酸鈣2.85kg。
實(shí)施例650L發(fā)酵罐裝32L發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖110g/L，玉米漿8g/L，硫酸銨4g/L，硫酸亞鐵0.04g/L，碳酸鈣80g/L)，滅菌后按10％(體積百分比)接種黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204液體種子。液體種子培養(yǎng)基為葡萄糖60g/L，玉米漿10g/L，硫酸銨3g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L，0.08MPa蒸汽滅菌后接種麩曲種子，34℃搖床培養(yǎng)24小時(shí)；發(fā)酵罐控制工藝條件為攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣比1∶1，罐壓1kg/cm2，35℃發(fā)酵120小時(shí)殘?zhí)墙抵?g/L以下，結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液濾除菌絲體，過濾清液經(jīng)脫色、減壓濃縮后結(jié)晶。固液分離后的母液可以再結(jié)晶一次，共計(jì)的果酸鈣2.82kg。
實(shí)施例72m3發(fā)酵罐裝料1.3M3，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉110g/L，玉米漿5g/L，硫酸銨2g/L，硫酸亞鐵0.04g/L，碳酸鈣78g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L，按10％(體積百分比)的接種量采用三級(jí)發(fā)酵進(jìn)行果酸鈣發(fā)酵。麩曲種子培養(yǎng)溫度為34℃，時(shí)間為68小時(shí)，一級(jí)種子培養(yǎng)溫度36℃，時(shí)間是28小時(shí)，二級(jí)種子培養(yǎng)溫度為36℃，時(shí)間為14小時(shí)，液體種子培養(yǎng)基配方為淀粉50g/L，玉米漿15g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L。發(fā)酵工藝條件為罐壓1kg/cm2，溫度36℃，通氣量比1∶0.5，攪拌轉(zhuǎn)速130r/min；發(fā)酵88小時(shí)殘?zhí)墙抵?g/L，結(jié)束發(fā)酵。經(jīng)測(cè)定產(chǎn)酸為95.8g/L(以蘋果酸計(jì))，轉(zhuǎn)化率為94％。
權(quán)利要求
1.一株曲霉菌菌株，該菌為曲霉菌屬的黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060，已于2004年8月4日在中國微生物菌種保藏管委會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.1204。
2.如權(quán)利要求1所述的曲霉菌菌株，其特征在于，所述黃曲霉菌(Aspergillusflavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204生物學(xué)特性為菌株分生孢子梗較短，頂端膨大呈囊狀，上面生有類似保鈴球瓶狀小梗，小梗多為單層，瓶狀小梗上生有3～5個(gè)分生孢子，孢子球形、梨形；該菌株能夠利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、D-木糖、纖維二糖、棉子糖、D-甘露糖、L-山梨糖、甘露醇、淀粉、糊精多種碳源。
3.如權(quán)利要求1或2所述的曲霉菌菌株，其特征在于，所述黃曲霉菌(Aspergillusflavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204在察氏培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征為，放置30℃培養(yǎng)2天有生長，菌落圓形，白色，直徑0.5cm；培養(yǎng)4天，菌落圓形，表面生有淡黃色孢子，直徑2cm左右；培養(yǎng)7天菌落圓形，表面孢子色澤不均勻，呈黃色到黃綠色，菌落直徑約3～4cm；基內(nèi)菌絲不產(chǎn)生色素；放置36℃培養(yǎng)2天有生長，菌落圓形，白色，直徑0.5～1cm；培養(yǎng)四天，菌落直徑3～4cm，孢子呈黃到黃綠色；培養(yǎng)7天，菌落直徑約4cm，表面孢子色澤不均勻，呈黃到黃綠色；基內(nèi)菌絲不產(chǎn)生色素。
4.如權(quán)利要求1或2所述的曲霉菌菌株，其特征在于，所述黃曲霉菌(Aspergiilusflavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204在麥芽汁培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征為，放置30℃培養(yǎng)2天，菌落圓形，直徑約2cm，中間菌絲比較致密，周圍菌絲向四周發(fā)散，表面有少量黃色孢子生成；培養(yǎng)4天菌落圓形，直徑約5～6cm表面孢子呈綠色；培養(yǎng)7天，菌落布滿9cm平板，表面平整長滿綠色孢子，菌落中心約2cm呈絨毛狀突起，菌落表面和背面可見從中心向四周發(fā)散的溝紋；放置36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)2天菌落圓形，直徑約2.5～3cm，中間菌絲比較致密，周圍菌絲向四周發(fā)散，表面有少量黃色孢子生成；培養(yǎng)4天菌落圓形，直徑約5～6cm表面孢子呈綠色；培養(yǎng)7天，菌落布滿9cm平板，表面平整長滿暗綠色孢子，菌落中心約2cm呈絨毛狀突起，菌落表面和背面可見從中心向四周發(fā)散的溝紋。
5.如權(quán)利要求1或2所述的曲霉菌菌株，其特征在于，所述黃曲霉菌(Aspergillusflavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204培養(yǎng)和保存?zhèn)溆玫臈l件是培養(yǎng)基為9～11°BX麥芽汁，pH5～8；加20g/L的瓊脂可制成固體培養(yǎng)基；0.08MPa滅菌20～30分鐘；培養(yǎng)溫度30℃～36℃；培養(yǎng)時(shí)間60～72小時(shí)；培養(yǎng)完畢后可直接用于接種或置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 6.如權(quán)利要求1或2所述的曲霉菌菌株，其特征在于，所述黃曲霉菌(Aspergillusflavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204在含如下配比的發(fā)酵培養(yǎng)基上，能夠發(fā)酵直接生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉100～130g/L，玉米漿5～10g/L，硫酸銨2～4g/L，硫酸亞鐵0.04g/L，碳酸鈣60～80g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L。
7.如權(quán)利要求6所述的曲霉菌菌株，其特征在于，所述淀粉可以用葡萄糖100～120g/L、全糖粉100～120g/L、結(jié)晶葡萄糖母液100～120g/L、蔗糖100～120g/L之一替代。
8.一種利用權(quán)利要求1或2所述的曲霉菌菌株生產(chǎn)果酸鈣的方法，其特征在于，所述黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204在50L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的工藝條件是①工藝流程是斜面菌種→麩曲菌種→深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽→過濾→脫色→濃縮→結(jié)晶→干燥→成品；②種子及深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的控制條件是麩曲種子培養(yǎng)溫度為32℃～36℃，培養(yǎng)時(shí)間為60～72小時(shí)；所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉含量為100～120g/L；罐壓1kg/cm2，溫度34℃～36℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.5～1.0，攪拌轉(zhuǎn)速200～300r/min；發(fā)酵時(shí)間100～120小時(shí)；③發(fā)酵結(jié)束的放罐標(biāo)準(zhǔn)，殘?zhí)?g/L以下；④采用常規(guī)方法脫色、濃縮、結(jié)晶、干燥。
9.一種利用權(quán)利要求1或2所述的曲霉菌菌株生產(chǎn)果酸鈣的方法，其特征在于，所述黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH-4060 CGMCC NO.1204在2m3發(fā)酵罐采用三級(jí)發(fā)酵，發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的工藝條件是①工藝流程是斜面菌種→麩曲菌種→一級(jí)種子→二級(jí)種子→深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽過濾→脫色→濃縮→結(jié)晶→干燥→成品；②種子及深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的控制條件是麩曲種子培養(yǎng)溫度為32℃～36℃，時(shí)間為60～72小時(shí)，一級(jí)種子培養(yǎng)溫度34℃～36℃，時(shí)間是20～28小時(shí)，二級(jí)種子培養(yǎng)溫度為34℃～36℃，時(shí)間為12～16小時(shí)，所采用的液體種子培養(yǎng)基為淀粉40-60g/L，玉米漿10-20g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L；所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉含量為100～130g/L；罐壓1kg/cm2，溫度34℃～36℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.2～0.5，攪拌轉(zhuǎn)速100～150r/min；發(fā)酵時(shí)間為80～100小時(shí)；③發(fā)酵結(jié)束的放罐標(biāo)準(zhǔn)，殘?zhí)?g/L以下；④采用常規(guī)方法脫色、濃縮、結(jié)晶、干燥。
10.如權(quán)利要求9所述的曲霉菌菌株生產(chǎn)果酸鈣的方法，其特征在于，所述種子及深層通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽的控制條件是麩曲種子培養(yǎng)溫度為34℃～36℃，時(shí)間為65～70小時(shí)，一級(jí)種子培養(yǎng)溫度34℃～36℃，時(shí)間是24～28小時(shí)，二級(jí)種子培養(yǎng)溫度為35℃～36℃，時(shí)間為12～16小時(shí)，所采用的液體種子培養(yǎng)基為淀粉50g/L，玉米漿15g/L，硫酸銨2g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L；所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉含量為110-120g/L，玉米漿5-7g/L，硫酸銨2g/L，硫酸亞鐵0.04g/L，碳酸鈣78g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸鎂0.2g/L；罐壓1kg/cm2，溫度35℃～36℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.5，攪拌轉(zhuǎn)速130r/min；發(fā)酵時(shí)間為80～90小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開一株曲霉菌菌株，該菌為曲霉菌屬的黃曲霉菌(Aspergillus flavus)SFAH－4060，已于2004年8月4日在中國微生物菌種保藏管委會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.1204。本發(fā)明還公開了利用該曲霉菌菌株生產(chǎn)果酸鈣的方法，該方法以淀粉和碳酸鈣為原料發(fā)酵，能直接生產(chǎn)檸檬酸和蘋果酸復(fù)合果酸鈣鹽，明顯降低了生產(chǎn)成本，發(fā)酵果酸產(chǎn)率達(dá)到90～100g/L(以蘋果酸計(jì))，轉(zhuǎn)化率90％以上。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1597923SQ20041002455
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月13日
發(fā)明者劉建軍, 趙祥穎, 田延軍, 李丕武, 劉麗萍, 張家祥, 韓延雷 申請(qǐng)人:山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院