專利名稱：一種呋喃丹農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種呋喃丹農(nóng)藥殘留降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域，是利用微生物的方法降解化學(xué)農(nóng)藥殘留，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
二、技術(shù)背景自從滴滴涕、六六六等有機(jī)農(nóng)藥使用以來(lái)，化學(xué)農(nóng)藥日益被人們所重視。隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，病蟲害與雜草為害作物生長(zhǎng)的問(wèn)題急需解決，也促使農(nóng)藥生產(chǎn)的品種與數(shù)量不斷增加。目前，國(guó)外農(nóng)藥的總含量，以含百分之百有效成份計(jì)約為二百萬(wàn)噸。生產(chǎn)的農(nóng)藥約1300多種。常見(jiàn)產(chǎn)量較大的約有50種左右。
化學(xué)農(nóng)藥在作物病、蟲、雜草害的綜合防治中占有重要的地位。但是由于長(zhǎng)期和大量地使用農(nóng)藥，尤其在開(kāi)始時(shí)，人們對(duì)農(nóng)藥在自然界、生物體中的運(yùn)動(dòng)規(guī)律，諸如代謝途徑、降解方式、殘留積蓄等方面知識(shí)掌握不夠，同時(shí)也由于開(kāi)始時(shí)對(duì)農(nóng)藥毒性的認(rèn)識(shí)，局限于急性毒性方面，忽略了農(nóng)藥慢性毒害的嚴(yán)重性，致使一些性質(zhì)較為穩(wěn)定、對(duì)人和牲畜又具有積蓄性慢性毒害的化學(xué)農(nóng)藥，象含汞、鉛等金屬元素的農(nóng)藥制劑，以及大多數(shù)有機(jī)氯制劑。污染了自然環(huán)境，并通過(guò)生物富集和食物鏈，造成了它們?cè)趧?dòng)植物體內(nèi)，甚至在人體內(nèi)的積貯，出現(xiàn)了今日農(nóng)藥的公害問(wèn)題。
目前，國(guó)內(nèi)外一些科學(xué)工作者積極開(kāi)展農(nóng)藥殘留、代謝等方面的研究，了解農(nóng)藥在環(huán)境、人畜、作物中的變化規(guī)律，制定了一系列的安全用藥措施，基本上控制了農(nóng)藥的污染問(wèn)題。
對(duì)于已施用的農(nóng)藥，科研工作者一直在農(nóng)藥在自然環(huán)境中的降解方面探索，這其中包括使用物理、化學(xué)、生物等方法。而微生物由于具有分布廣，數(shù)量大，代謝類型多樣性和適應(yīng)突變能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因而倍受青睞。任何存在污染物的地方都會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的降解微生物，并存在著或強(qiáng)或弱的生物降解作用。生物修復(fù)目前已成為一種新的可靠的環(huán)保技術(shù)，已有大量的生物修復(fù)資料，參數(shù)和各種降解模型以供工程技術(shù)人員進(jìn)行工藝路線選擇、實(shí)際設(shè)計(jì)和處理效果評(píng)價(jià)。
呋喃丹(carbofuran)，是一種高效廣譜的氨基甲酸酯類殺蟲劑和殺螨劑，廣泛應(yīng)用于土壤害蟲的防治。其用量大、難降解、毒性高，尤其對(duì)哺乳動(dòng)物的急性毒性就更大。呋喃丹施入土壤后，易被淋溶而直接進(jìn)入環(huán)境，從而廣泛存在于水體、土壤及生物體中，直接威脅人類的生存環(huán)境。聯(lián)合國(guó)已將其列為世界禁用農(nóng)藥之列?？墒菍?duì)于已經(jīng)施用過(guò)呋喃丹的環(huán)境的綜合治理目前一直未見(jiàn)有比較成熟的方法。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問(wèn)題和需求，開(kāi)發(fā)研制出一種新型的農(nóng)藥殘留降解菌劑，使用本菌劑可以使呋喃丹農(nóng)藥的殘留量降低905％以上。同時(shí)生產(chǎn)和使用成本較低。使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)過(guò)程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥呋喃丹進(jìn)行病蟲害防止而保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥呋喃丹殘留含量符合綠色食品要求。
技術(shù)方案 下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容本發(fā)明提供一種消除呋喃丹農(nóng)藥殘留的降解菌，其菌株是一株革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌CDS-1(2003年10月27日已寄存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號(hào)CGMCC NO.1025)，經(jīng)鑒定為Sphingomonas agrestis。主要生物學(xué)特性為G-，菌體為長(zhǎng)桿狀，略帶卷曲，無(wú)芽孢，好氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性；從戊糖、己糖和雙糖能氧化產(chǎn)酸，但不分解多羥基醇和菊糖。能以呋喃丹為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，將其徹底礦化為CO2和水及簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物。在實(shí)驗(yàn)室要瓶條件下呋喃丹的降解率達(dá)95％以上。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。
使用上述呋喃丹農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)菌劑的工藝為斜面種—搖瓶種子液—種子罐—產(chǎn)品(包裝劑型為液體菌劑)。
本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施步驟為1)將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖1％(質(zhì)量比，下文同)，(NH4)2SO40.05％，K2HPO40.15％，MgSO40.01％，蛋白胨0.05％，pH7.2-7.5；
3)將種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
有益效果 本發(fā)明提供了一種消除呋喃丹農(nóng)藥殘留的降解菌，實(shí)驗(yàn)室生物降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)呋喃丹的降解率達(dá)到98.80％以上。
使用該發(fā)明生產(chǎn)的農(nóng)藥殘留降解菌劑具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在全國(guó)糧油蔬菜生產(chǎn)出口基地或有綠色食品商標(biāo)標(biāo)志的地方大面積推廣使用。本發(fā)明對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人民的身體健康，提高農(nóng)產(chǎn)品的附加值具有重要的意義。降解菌CDS-1能使呋喃丹農(nóng)藥的殘留量降低95％以上?？梢源蟠蠼档蜕a(chǎn)和使用過(guò)程中的工作量，降低了生產(chǎn)和使用成本。使用該降解菌劑可以在農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)過(guò)程中正常使用化學(xué)農(nóng)藥呋喃丹進(jìn)行病蟲害防治而保證農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥呋喃丹殘留含量符合綠色食品要求。并且該菌為革蘭氏陰性菌，在田間的存活時(shí)間適當(dāng)，不會(huì)影響以后農(nóng)藥使用效果。
田間試驗(yàn)表明，用本發(fā)明生產(chǎn)的降解菌劑直接施用于農(nóng)作物可使作物中農(nóng)藥呋喃丹殘留量降低95％以上。本發(fā)明成功的解決了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥呋喃丹殘留超標(biāo)問(wèn)題，既充分發(fā)揮化學(xué)農(nóng)藥呋喃丹在植物病蟲害防治中的高效快速的作用，又可以生產(chǎn)出無(wú)毒無(wú)公害的綠色農(nóng)產(chǎn)品。
四

圖1 CDS-1菌落照片圖2接種量對(duì)CDS-1降解的影響圖3初始pH對(duì)CDS-1降解的影響圖4溫度對(duì)CDS-1降解的影響圖5通氣量對(duì)CDS-1降解呋喃丹的影響五具體實(shí)施方式
1菌株的分離和鑒定取實(shí)驗(yàn)室馴化的活性污泥顆粒，將其溶解于無(wú)菌水中，進(jìn)行梯度稀釋。稀釋液涂布于100mg/L的呋喃丹無(wú)機(jī)鹽離子固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)數(shù)天。從中挑取單菌落(見(jiàn)圖1)，鑒定為Sphingomonas agrestis。主要生物學(xué)特性為G-，菌體為長(zhǎng)桿狀，略帶卷曲，無(wú)芽孢，好氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性；從戊糖、己糖和雙糖能氧化產(chǎn)酸，但不分解多羥基醇和菊糖。能以呋喃丹為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，將其徹底礦化為CO2和水及簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物。在實(shí)驗(yàn)室要瓶條件下呋喃丹的降解率達(dá)95％以上。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。
2實(shí)驗(yàn)室生物降解實(shí)驗(yàn)2.1接種量對(duì)CDS-1降解呋喃丹的影響CDS-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，按2％、4％、8％、15％與20％的接種量分別接入富集培養(yǎng)基(含100mg/L的呋喃丹無(wú)機(jī)鹽離子液體培養(yǎng)基，下文同)中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)，每隔1小時(shí)測(cè)定一次呋喃丹的含量，結(jié)果如圖2。8小時(shí)的測(cè)定結(jié)果表明，按接種量從低到高排列，呋喃丹的降解率依次為9.17％、13.31％、25.49％、51.34％、67.79％；14小時(shí)的測(cè)定結(jié)果表明，8％、15％與20％接種量的培養(yǎng)基中，呋喃丹已完全被降解；2％、4％接種量的培養(yǎng)基中，呋喃丹的降解率分別為91.25％、98.80％。由此可見(jiàn)，接種量的大小對(duì)呋喃丹的降解效率有直接的關(guān)系，接種量越大，呋喃丹的降解效率就越高。
2.2初始pH對(duì)CDS-1降解呋喃丹的影響CDS-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，按8％接種至不同初始pH的富集培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)，14h后測(cè)定其中呋喃丹的含量，結(jié)果如圖3所示。在pH5.0～8.0的條件下，CDS-1對(duì)呋喃丹的降解率都大于85％；當(dāng)pH為7.0，降解率幾乎為100％。當(dāng)pH小于5.0時(shí)，呋喃丹的降解率隨著pH的下降呈明顯的下降趨勢(shì)；pH為3.0時(shí)，呋喃丹的降解率僅為33％。
2.3溫度對(duì)CDS-1降解呋喃丹的影響CDS-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)后期，按8％的接種量接到富集培養(yǎng)基中，分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、37℃的溫度下，150r/min搖床培養(yǎng)，14h后測(cè)定其中呋喃丹的含量，結(jié)果如圖4所示。在15℃時(shí)，CDS-1對(duì)呋喃丹的降解率為14％；在20℃～30℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高降解菌降解呋喃丹性能明顯上升，在30℃時(shí)，降解率接近100％。而當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，CDS-1對(duì)呋喃丹的降解率急劇下降，僅為2％，幾乎不降解呋喃丹。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，CDS-1的最適降解溫度為30℃；在較低的溫度下仍具有一定的降解能力；而過(guò)低或過(guò)高的環(huán)境溫度會(huì)嚴(yán)重抑制呋喃丹的生物降解。
2.4通氣量對(duì)CDS-1降解呋喃丹的影響在5個(gè)250mL的三角瓶中分別裝入30mL、50mL、70mL、100mL和150mL富集培養(yǎng)基，以裝液百分比來(lái)指示通氣量。CDS-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)后期，按8％的接種量接種到上述各培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)，10小時(shí)后測(cè)定呋喃丹的降解率，結(jié)果如圖5。10小時(shí)的測(cè)定結(jié)果表明裝有30mL、50mL、70mL、100mL和150mL培養(yǎng)液的三角瓶中呋喃丹的降解率分別為98％、92％、78％、69％和42％，CDS-1降解呋喃丹的過(guò)程是個(gè)好氧過(guò)程，大通氣量有助于呋喃丹的降解。
2.5呋喃丹的起始濃度對(duì)CDS-1降解的影響CDS-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，按8％接種至不含碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度的呋喃丹(50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L)作為碳源，每隔一定時(shí)間測(cè)定呋喃丹的含量，結(jié)果如表1。300mg/L高濃度呋喃丹的添加未對(duì)CDS-1降解性能產(chǎn)生明顯抑制，完全降解200mg/L呋喃丹僅需要72h。這與大多數(shù)降解細(xì)菌的降解性能會(huì)受高濃度異源化合物的抑制這一現(xiàn)象不同。
表1呋喃丹起始濃度對(duì)CDS-1降解的影響呋喃丹的起始 呋喃丹的含量(mg/L)濃度(mg/L)14h 24h 48h72h50 0 00 0100 0 00 0200 143.73 96.6127.75 0300 264.8 206.13 104.41 43.62.6添加低濃度營(yíng)養(yǎng)物對(duì)CDS-1降解呋喃丹的影響在富集培養(yǎng)基中分別添加等濃度的其它碳源，包括牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖和LB。CDS-1在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，按2％的接種量接入上述各培養(yǎng)基中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)。設(shè)置一個(gè)不添加營(yíng)養(yǎng)物的作為對(duì)照。分別在10h、24h、36h測(cè)定各培養(yǎng)基中呋喃丹的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。24h的測(cè)定結(jié)果表明與對(duì)照相比除酵母膏外，添加其他碳源物質(zhì)均會(huì)使呋喃丹的降解率略微減?。坏?6h的測(cè)定數(shù)據(jù)顯示這對(duì)于呋喃丹的徹底降解無(wú)影響。這說(shuō)明外界低濃度營(yíng)養(yǎng)物的添加僅在降解的前半程起輕微的延滯作用，對(duì)于CDS-1的總體降解性能并無(wú)明顯影響。
表2添加低濃度營(yíng)養(yǎng)物對(duì)CDS-1降解的影響培養(yǎng)條件 培養(yǎng)后測(cè)定呋喃丹的含量(mg/L)(濃度單位為mg/L)10h 24h 36h100FND 94.32 30.84 0100FND+100牛肉膏 92.52 38.06 0100FND+100酵母膏 90.29 27.41 0100FND+100蛋白胨 94.73 35.96 0100FND+100G 94.10 32.07 0100FND+100LB 96.47 36.52 03 田間實(shí)際應(yīng)用實(shí)驗(yàn)將本發(fā)明的微生物呋喃丹農(nóng)藥殘留的降解菌CDS-1的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測(cè)定降解性能，接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml發(fā)酵培養(yǎng)基1000ml搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，準(zhǔn)備接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為葡萄糖1％，(NH4)2SO40.05％，K2HPO40.15％，MgSO40.01％，蛋白胨0.05％，pH7.2-7.5。投料完畢后115℃高壓濕熱滅菌，冷卻至30℃后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10％的接種量接入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無(wú)菌空氣通入量為1∶0.8。將達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容量5噸，投料量4.5噸。投料后生產(chǎn)罐1.1kg/cm2的壓力下，115℃高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至30℃以下，通無(wú)菌空氣保持無(wú)菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30℃，生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為1∶0.8-1.0，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，整個(gè)工藝流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上。
發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。
用上述方法所得的產(chǎn)品進(jìn)行田間農(nóng)藥呋喃丹殘留降解試驗(yàn)示范。河北滄州30萬(wàn)畝棗園土壤中呋喃丹農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)，大大影響了金絲小棗的出口，2003年在1300畝金絲小棗上應(yīng)用農(nóng)藥殘留生物修復(fù)技術(shù)，有效的去除了土壤與小棗中呋喃丹的農(nóng)藥殘留，是林園小棗獲得了國(guó)家綠色食品證書，形成“超健”品牌，基地與北方國(guó)際集團(tuán)有限公司達(dá)成合作協(xié)議，每年向北方國(guó)際集團(tuán)提供年產(chǎn)300噸小棗供其出口，凈增效益20多萬(wàn)元。提供年產(chǎn)900噸小棗供其出口，充分體現(xiàn)了優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)，為農(nóng)民增收做出了重要貢獻(xiàn)。
表3是使用呋喃丹農(nóng)藥后，將上述菌劑按使用方法要求施用于土壤中，20天時(shí)間后，利用氣相色譜測(cè)定該土壤中呋喃丹的含量(由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)綠色食品測(cè)試中心和農(nóng)業(yè)部環(huán)境監(jiān)測(cè)總站測(cè)定)，從結(jié)果看出，經(jīng)降解菌處理后能大大降低土壤中殘留農(nóng)藥。
表3土壤中呋喃丹的含量Ck1Ck2T1T2T3呋喃丹的含1.21.4NDNDND量(mg/kg)
權(quán)利要求
1.一種呋喃丹農(nóng)藥殘留降解菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陰性的Sphingomonas agrestis的菌株CDS-1，2003年10月27日寄存于中國(guó)微生物菌種保存管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.1025，經(jīng)鑒定為Sphingomonas agrestis，主要生物學(xué)特性為G-，菌體為長(zhǎng)桿狀，略帶卷曲，無(wú)芽孢，好氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性；從戊糖、己糖和雙糖能氧化產(chǎn)酸，但不分解多羥基醇和菊糖。能以呋喃丹為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，將其徹底礦化為CO2和水及簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)化合物，在實(shí)驗(yàn)室要瓶條件下呋喃丹的降解率達(dá)95％以上。
2.一種用權(quán)利要求1所述的呋喃丹農(nóng)藥殘留降解菌生產(chǎn)的降解菌劑，是通過(guò)以下方法生產(chǎn)而成1)將試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10％的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖1％(質(zhì)量比，下文同)，(NH4)2SO40.05％，K2HPO40.15％，MgSO40.01％，蛋白胨0.05％，pH7.2-7.5；3)將種子液按10％的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)菌空氣的通氣量為1∶0.6-1.2，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30℃，全流程培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個(gè)/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種消除呋喃丹農(nóng)藥殘留的降解菌及降解菌劑，所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陰性菌CDS－1，經(jīng)鑒定為Sphingomonas agrestis。主要生物學(xué)特性為G
文檔編號(hào)C12P3/00GK1556196SQ20041001383
公開(kāi)日2004年12月22日 申請(qǐng)日期2004年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月8日
發(fā)明者李順鵬, 武俊, 何健, 崔中利 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)