專利名稱：一種微生態(tài)制劑及其制備方法與專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物防治領(lǐng)域中一種防治小麥紋枯病的微生態(tài)制劑及其制備方法與專用菌株。
背景技術(shù)：
小麥紋枯病是主要由禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染所致的病害，分布范圍較廣。20世紀(jì)90年代以來，各冬麥區(qū)普遍發(fā)生，并逐年加重，成為制約我國小麥生產(chǎn)的主要因子之一。對于該病的防治，部分化學(xué)農(nóng)藥雖有一定防效，但存在效果不穩(wěn)定、污染環(huán)境、投入成本高等問題。生物防治是近年來被證明很有成效的新途徑，它主要是利用微生物之間的拮抗作用，選擇對農(nóng)產(chǎn)品不造成危害的微生物來抑制病原菌的生長。使用拮抗菌防治農(nóng)作物病害，可以減少化學(xué)農(nóng)藥的用量和在農(nóng)產(chǎn)品上的殘毒，對保護(hù)人體健康和防止環(huán)境污染都極為重要。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供可有效防治小麥紋枯病并具有助長作用的菌株。
可防治小麥紋枯病的菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946，上述二株菌均已于2003年11月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號分別為CGMCC№1031和CGMCC №1032。
蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032，均從小麥紋枯病重病田的健康植株分離得到。蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031，菌體呈桿狀，長4-7微米，寬1.0-1.2微米，革蘭氏反應(yīng)陽性，芽孢中生或近中生，橢圓或柱狀，芽孢囊不膨大，能厭氧生長，V.P反應(yīng)陽性，V.P液pH4.3-5.5；生長溫度10-45℃，7％NaCl中生長；pH5.7生長，從葡萄糖、麥芽糖產(chǎn)酸，不從木糖、乳糖、甘露醇產(chǎn)酸，能水解淀粉，利用檸檬酸鹽；能還原NO3-和NO2-。與同種其它菌株相比菌體較長?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032，菌體呈桿狀，長2-3微米，寬0.8-0.9微米，革蘭氏反映陽性，芽孢橢圓或柱狀，中生或近中生，孢囊不膨大，原生質(zhì)中不含有β-羥基丁酸鹽顆粒；7％NaCl中生長，石芯牛奶不產(chǎn)酸，pH5.7生長，v.p陽性，水解淀粉，還原NO3-和NO2-，不能厭氧生長，接觸酶陽性。與同種其它菌株相比菌體較寬。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種防治小麥紋枯病的微生態(tài)制劑及其制備方法。
本發(fā)明所提供的防治小麥紋枯病的微生態(tài)制劑，是以蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)B932 CGMCC №1031和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032中至少一株的菌體為活性成分，所述菌體為營養(yǎng)體和/或芽孢。
所述微生態(tài)制劑可為固態(tài)或液態(tài)，當(dāng)為固態(tài)時，它還包括吸附添加劑，如碳酸鈣，草炭，高鈣土等，其中碳酸鈣顆粒的直徑優(yōu)選為0.09mm，其含菌量為300-700億個菌體/克微生態(tài)制劑，優(yōu)選為500億個菌體/克微生態(tài)制劑。固態(tài)微生態(tài)制劑每畝的用量為30-70克，可拌種也可在返青期、拔節(jié)期、灌漿期進(jìn)行噴施。
當(dāng)微生態(tài)制劑為液態(tài)時，其含菌量為1.0×106-1.0×1010cfu/ml水，優(yōu)選為1.0×108cfu/ml水。液態(tài)微生態(tài)制劑每畝的用量為0.15-5升，可拌種也可在返青期、拔節(jié)期、灌漿期進(jìn)行噴施。
一種制備上述防治小麥紋枯病的微生態(tài)制劑的方法，是培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031和/或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032，并對發(fā)酵液進(jìn)行后處理得到的。
所述后處理包括濃縮、添加填充料、壓濾、干燥或粉碎等步驟。
本發(fā)明針對小麥紋枯病發(fā)生的嚴(yán)重性和小麥生產(chǎn)上存在的問題，根據(jù)植物微生態(tài)學(xué)原理，由小麥紋枯病重病田的健康植株體內(nèi)分離出2株對小麥紋枯病防治效果明顯的芽孢桿菌，并將其制成微生態(tài)制劑，本發(fā)明微生態(tài)制劑的防效達(dá)70％以上，并且對小麥生長有明顯的促進(jìn)作用，株高、鮮重等指標(biāo)均有提高。
具體實施例方式
實施例1、內(nèi)生芽孢桿菌的分離及鑒定1、內(nèi)生芽孢桿菌的分離(1)分離在小麥紋枯病重病田選擇健康植株，用蒸餾水沖洗干凈，然后整株用1％NaClO表面消毒10分鐘，無菌水沖洗3次，剪碎，加適量無菌水研碎，稀釋到10-1，振蕩均勻，放入80℃的水中處理10分鐘，梯度稀釋到10-4，取0.1ml接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，涂布均勻。置于30℃恒溫箱中暗培養(yǎng)3d，待單菌落長出后，純化，轉(zhuǎn)管，保存。
(2)篩選接種病原菌禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)于PDA平板中央，將待測芽孢桿菌接種于平板四周，每皿在4個方位各接種1株，重復(fù)3次，進(jìn)行初篩；取拮抗性明顯的菌株，再進(jìn)行單株與病原菌對峙培養(yǎng)，采取一邊接芽孢桿菌，一邊接病原菌禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)，或?qū)⒅虚g劃線接芽孢桿菌，兩邊接病原菌的兩種對峙培養(yǎng)法進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果得到32株對禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)具有拮抗作用的菌株。
(3)盆栽防病試驗將具有拮抗性的菌株(32株)進(jìn)行盆栽試驗，菌株活化后接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)30小時，檢測菌液含菌量，無菌水稀釋到1.0×108cfu/ml。
小麥種子經(jīng)1％NaClO表面消毒10分鐘，無菌水反復(fù)沖洗5次，25℃下催芽。將出芽的種子用上述配制好的菌液浸種2小時后，在裝有250克混合土(自然土∶草炭土＝2∶1)的花盆內(nèi)播種，每盆15粒種子，待小麥出苗4-5天后，小麥長1-2片葉子時，用打孔器將長有紋枯病菌平板打孔，取病原菌貼于小麥苗基部，并覆少量混合土，保持25℃左右的溫度和較高濕度，待發(fā)病后統(tǒng)計病情指數(shù)，計算防效。以清水處理為對照。
病情分級標(biāo)準(zhǔn)0級全株無?。?級葉鞘發(fā)病，莖桿無病斑；2級莖桿上病斑寬度小于莖桿的1/2；3級莖桿上病斑寬度大于莖桿的1/2；小于周長3/4，莖桿不軟化；4級莖桿上病斑寬度大于莖桿周長的3/4，莖桿軟化，形成白穗。
將32株對禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)具有拮抗作用的菌株，經(jīng)過三批盆栽測定，結(jié)果如表1所示，表明有2株芽孢桿菌B932和B946表現(xiàn)較高的防治效果，且均在70％以上。
表1芽孢桿菌防治小麥紋枯病盆栽試驗結(jié)果菌株病情指數(shù) 病情指數(shù) 防效I IIIII 平均值 ％B9327.3 7.6 6.7 7.2 71.0B9466.5 6.8 7.4 6.9 72.2對照23.526.7 24.2 24.8 -2、內(nèi)生芽孢桿菌B932和B946的鑒定經(jīng)鑒定，B932為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，B946為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
實施例2、微生態(tài)制劑的制備
1.生產(chǎn)工藝為經(jīng)液體深層發(fā)酵法制成粉劑，工藝主要環(huán)節(jié)為原菌種活化→菌種擴(kuò)大培養(yǎng)→種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐培養(yǎng)→添加填充料→壓濾→干燥→粉碎→粉劑質(zhì)量檢測→包裝→產(chǎn)品檢測。
2.技術(shù)指標(biāo)各種技術(shù)指標(biāo)如表2所示。
表2技術(shù)指標(biāo)

3.菌種生產(chǎn)操作規(guī)程培養(yǎng)基制備按如下配方制備培養(yǎng)基牛肉膏0.3％，蛋白胨0.5％，NaCl 0.5％，瓊脂2％。將瓊脂加熱溶化后用NaOH或Hcl調(diào)pH值至7.0-7.5，然后分裝克氏瓶或試管，置于滅菌鍋內(nèi)，在0.11MPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面?zhèn)溆谩?br> 菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng)用培養(yǎng)基在無菌條件下從原菌種斜面上挑取少許菌苔，置放試管斜面內(nèi)進(jìn)行劃線，然后置28-30℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，經(jīng)檢查無雜菌、菌體生長整齊，再置28-30℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24-28h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片、染色檢查無雜菌，芽孢大小一致的，可放冰箱中存放備用(4℃左右為宜)。
4.種子罐培養(yǎng)(1)培養(yǎng)基種子罐培養(yǎng)基配方豆餅粉0.5％、魚粉0.3％、玉米粉0.5％、葡萄糖0.3％，豆油0.2％-0.3％(或泡敵0.3％)，pH值7.0-7.5。
(2)空發(fā)酵罐滅菌發(fā)酵罐在應(yīng)用前清洗干凈，排除污物，并在0.14MPa壓力下，滅菌30min。
(3)種子罐裝料參考(1)的配方比例裝料，投料量不得超過罐容積70％。
(4)種子罐滅菌裝好料后，在0.11MPa壓力下滅菌30min，冷卻至30℃后即可接種。
(5)懸浮液制備在無菌條件下將每個克氏瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液，含菌量為10億個菌體/ml，并在80℃恒溫水鍋中處理20min。
(6)接種將制好的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946的菌懸液，按1％的比例接種于冷卻至30℃的種子罐內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
(7)種子罐培養(yǎng)條件控制接種后在溫度為28-30℃，壓力0.05MPa通氣量1∶1.3(每min體積比)和220轉(zhuǎn)/min攪拌條件下，培養(yǎng)8-10h。
5.發(fā)酵罐發(fā)酵(1)發(fā)酵罐培養(yǎng)基豆餅粉2％，魚粉0.5％，玉米漿1.8％，淀粉0.4％，硫酸鎂0.06％，碳酸鈣0.5％，磷酸二氫鉀0.03％，豆油0.1％或泡敵0.05％，用NaOH或HCl調(diào)PH值7.0-7.5左右，裝置為罐容積的70％。
(2)發(fā)酵培養(yǎng)條件攪拌速度180-200轉(zhuǎn)/min，罐壓0.05MPa；通氣量移種后4h內(nèi)通氣量有10.7-0.8(每分鐘進(jìn)出體積之比)，以后逐淅增大至1∶1.3。一般發(fā)酵培養(yǎng)周期為12-18小時，在芽孢70％形成，個別芽孢開始脫落時，即可放罐，這時雜菌污染＜0.3％含菌量＞100億個菌體/ml。
6.后處理(1)設(shè)備攪拌機(jī)、板框、干燥機(jī)(裝置)、超細(xì)度粉碎機(jī)等。
(2)吸附劑一般采用的粒度為0.09mm的輕質(zhì)碳酸鈣為吸附添加劑，加入量按下列公式計算 (3)壓濾按(2)規(guī)定向步驟5得到的發(fā)酵液中加入吸附劑后，機(jī)械攪拌3-6h，使芽孢全部被吸附，然后再用板框壓濾。
(4)干燥將板框壓濾后的濾餅搗碎后。置于烘干機(jī)或烘干裝置內(nèi)進(jìn)行烘干。烘干時的溫度不超過65℃(為了防止菌體死亡)，要不斷翻動，使受熱均勻。當(dāng)含水率≤5％時，即可進(jìn)行粉碎、包裝。
(5)粉碎利用高細(xì)度粉碎機(jī)粉碎，100％通過0.09mm孔徑篩。
7.成品檢驗含水率用干燥失重法(重量法)測定，含水率≤5％為合格，細(xì)度采用濕篩法測定，100％通過0.09mm篩為合格，具體方法按HG2-896標(biāo)準(zhǔn)的濕篩法測定。
8.包裝用編制袋(內(nèi)有塑料袋)25Kg包裝，于干燥通風(fēng)處貯存，保存期3年。
實施例3、微生態(tài)制劑的田間防病效果1、田間防病試驗(1)微生態(tài)制劑的制備按照實施例2的工藝，由蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946按含菌量比為1∶1混合制備含菌量為每克500億個菌體的防治小麥紋枯病微生態(tài)制劑。
(2)小區(qū)設(shè)置選擇往年小麥紋枯病發(fā)病均勻地塊，每處理為一個小區(qū)，重復(fù)四次，小區(qū)面積為67m2，隨機(jī)排列，以清水為對照。
(3)處理方法播種時，微生態(tài)制劑每畝的用量為50克，根據(jù)小區(qū)所需種子量將微生態(tài)制劑加適量水稀釋后進(jìn)行拌種，稍涼干后即可播種。然后在返青期、拔節(jié)期、灌漿期各進(jìn)行1次噴霧，每畝用量50克，根據(jù)小區(qū)所需水量將微生態(tài)制劑溶解后噴灑。
(4)調(diào)查方法及結(jié)果采用五點取樣法，對各處理區(qū)和對照區(qū)進(jìn)行取樣調(diào)查。拔節(jié)期以前按株取樣，每點取50株；拔節(jié)期以后按莖取樣，每點取50個莖桿。分級調(diào)查，病情分級標(biāo)準(zhǔn)同前，計算防效。
小麥紋枯病在苗期就開始發(fā)病，該微生態(tài)制劑在苗期的防病效果如表3所示，表明該微生態(tài)制劑通過拌種對小麥紋枯病有明顯控制效果，防病效果達(dá)到80％以上，且在a＝0.05水平差異顯著。
表3防治小麥紋枯病微生態(tài)制劑苗期防病效果處理 發(fā)病率(％) 病指 防效(％)
防病微生態(tài)制劑2.401.25 80.4CK9.006.40 -該微生態(tài)制劑在拔節(jié)期的防病效果如表4所示，表明通過拌種+噴霧1次處理，在拔節(jié)期調(diào)查，防效超過70％，達(dá)75.1％，且在a＝0.05水平差異顯著。
表4防治小麥紋枯病微生態(tài)制劑拔節(jié)期防病效果處理 發(fā)病率(％) 病指防效(％)防病微生態(tài)制劑7.152.1075.1CK27.36 8.43-該微生態(tài)制劑在灌漿期的防病效果如表5所示，表明通過拌種+噴霧2次處理，灌漿期調(diào)查，該微生態(tài)制劑對小麥紋枯病均有較高的控制效果，防效超過70％，且在a＝0.05水平差異顯著。
表5防治小麥紋枯病微生態(tài)制劑灌漿期防病效果處理 發(fā)病率(％) 病指 防效(％)防病微生態(tài)制劑30.18 10.38 73.0CK60.70 38.40 -----實施例4、微生態(tài)制劑在防止小麥紋枯病發(fā)生同時的促長增產(chǎn)試驗(1)蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932微生態(tài)制劑和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946微生態(tài)制劑的溫室促長測定將蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946分別活化后分別接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)30小時，檢測菌液含菌量，無菌水稀釋到1.0×108cfu/ml，分別得到蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)B932微生態(tài)制劑和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946微生態(tài)制劑。
小麥種子經(jīng)1％NaClO表面消毒10分鐘，無菌水反復(fù)沖洗5次，25℃下催芽。將出芽的種子分為三組對照組、B932組和B946組，對照組用水、B932組和B946組分別用上述配制好的微生態(tài)制劑浸種2小時后，在裝有250克混合土(自然土∶草炭土＝2∶1)的花盆內(nèi)播種，每盆15粒種子，待小麥出苗4-5天后，小麥長1-2片葉子時，用打孔器將長有紋枯病菌平板打孔，取病原菌貼于小麥苗基部，并覆少量混合土，保持25℃左右的溫度和較高濕度，對蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932微生態(tài)制劑和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946微生態(tài)制劑進(jìn)行促進(jìn)生長效果測定，調(diào)查株高、鮮重等指標(biāo)。
株高、鮮重結(jié)果如表6、表7所示，表明通過浸種處理，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)B932微生態(tài)制劑和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946微生態(tài)制劑具有促進(jìn)生長作用，株高增加17.9-25.6％，鮮重增加27.5-34.1％，且在a＝0.01水平上差異顯著。
表6芽孢桿菌對小麥株高的影響株高(cm) 株高平均值(cm) 增高率(％)菌株I II IIIB932 30.430.026.7 29.0b 17.9B946 32.929.528.8 30.4a 23.6對照 25.423.724.7 24.6c -表7芽孢桿菌對小麥鮮重的影響菌株 鮮重(g/100株) 鮮重平均值(g/100株) 增重率(％)I II IIIB9328.211.816.7 12.2b 34.1B94611.5 11.611.5 11.6a 27.5對照7.09.0 11.2 9.1c-(2)微生態(tài)制劑的增產(chǎn)效果測定本實施例中的微生態(tài)制劑為實施例3中的微生態(tài)制劑。
選擇往年小麥紋枯病發(fā)病均勻地塊，每處理為一個小區(qū)，重復(fù)四次，小區(qū)面積為67m2，隨機(jī)排列，以清水為對照。
播種時，微生態(tài)制劑每畝的用量為50克，根據(jù)小區(qū)所需種子量將微生態(tài)制劑加適量水稀釋后進(jìn)行拌種，稍涼干后即可播種。然后在返青期、拔節(jié)期、灌漿期各進(jìn)行1次噴霧，每畝用量50克，根據(jù)小區(qū)所需水量將微生態(tài)制劑溶解后噴灑。
在小麥?zhǔn)斋@期，每小區(qū)五點，每點取1平方米測定畝穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重，計算產(chǎn)量。另外，各小區(qū)進(jìn)行實打?qū)嵤諟y定實際產(chǎn)量，計算增產(chǎn)效果。該微生態(tài)制劑增產(chǎn)效果如表8所示，表明該微生態(tài)制劑具有增產(chǎn)效果，可使小苗畝增產(chǎn)10.86％。
表8防治小麥紋枯病微生態(tài)制劑增產(chǎn)效果測定處理 測定產(chǎn)量 增產(chǎn)率實際產(chǎn)量 增產(chǎn)率(Kg/畝)(％) (Kg/畝)(％)防病微生態(tài)制劑579.85 10.89 539.75 10.86CK522.92 ----- 486.87 -----
權(quán)利要求
1.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032。
2.蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031。
3.一種防治小麥紋枯病的微生態(tài)制劑，是以蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032中至少一株的菌體為活性成分，所述菌體為營養(yǎng)體和/或芽孢。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生態(tài)制劑，其特征在于所述微生態(tài)制劑為固態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微生態(tài)制劑，其特征在于所述微生態(tài)制劑還包括吸附添加劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生態(tài)制劑，其特征在于所述吸附添加劑為碳酸鈣。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生態(tài)制劑，其特征在于所述微生態(tài)制劑的含菌量為300-700億個菌體/克微生態(tài)制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生態(tài)制劑，其特征在于所述微生態(tài)制劑為液態(tài)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生態(tài)制劑，其特征在于所述微生態(tài)制劑的含菌量為1.0×106-1.0×1010cfu/ml水。
10.一種制備權(quán)利要求3所述的防治小麥紋枯病的微生態(tài)制劑的方法，是培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031和/或枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B946 CGMCC №1032，并對發(fā)酵液進(jìn)行后處理得到的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生態(tài)制劑及其制備方法與專用菌株，其目的是提供一種可有效防治小麥紋枯病的菌株，利用該菌株制備的防治小麥紋枯病的微生態(tài)制劑及其制備方法。本發(fā)明所提供的防治小麥紋枯病的菌株是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B946 CGMCC №1032和蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B932 CGMCC №1031。本發(fā)明所提供的防治小麥紋枯病的微生態(tài)制劑，以蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)B932 CGMCC №1031和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B946 CGMCC №1032中至少一株的菌體為活性成分，所述菌體為營養(yǎng)體和/或芽孢。本發(fā)明微生態(tài)制劑的防效達(dá)70％以上，并且對小麥生長有明顯的促進(jìn)作用，施用后作物的株高、鮮重等指標(biāo)均有提高。
文檔編號C12N1/20GK1544617SQ20031011373
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者王 琦, 梅汝鴻, 王 琦 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)