專利名稱：肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜牧生產(chǎn)新技術(shù)和獸用疫苗領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
促進(jìn)農(nóng)業(yè)動(dòng)物的肌肉生長(zhǎng)一直是畜牧生產(chǎn)和畜牧研究所追求的目標(biāo)。促進(jìn)畜禽的肌肉生長(zhǎng)或提高瘦肉率，不僅提高動(dòng)物飼養(yǎng)的效率，還可以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和健康的肉類，并且大大提高畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。
目前主要通過常規(guī)的育種工作、調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)素和營(yíng)養(yǎng)水平來促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和提高畜禽肌肉生長(zhǎng)的速度。但到目前為止，畜禽在常規(guī)則生產(chǎn)和飼養(yǎng)技術(shù)下的肌肉生長(zhǎng)性能已經(jīng)發(fā)揮到了極限，利用以上常規(guī)方法促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)的空間已經(jīng)越來越小。要進(jìn)一步促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)，提高畜牧生產(chǎn)效率和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉品，必須尋找更新的技術(shù)方法，調(diào)控和促進(jìn)肌肉的生長(zhǎng)。
可以大幅提高肌肉生長(zhǎng)性能的方法主要為內(nèi)分泌調(diào)控技術(shù)，包括使用①類固醇激素、②β-腎上腺素受體激動(dòng)劑、③生長(zhǎng)激素、④生長(zhǎng)激素釋放激素及其制劑和⑤主動(dòng)免疫生長(zhǎng)抑素等。
以上內(nèi)分泌調(diào)控技術(shù)中，由于類固醇激素、β-腎上腺素受體激動(dòng)劑(即β-興奮劑)和生長(zhǎng)激素由于其藥殘問題和潛在的對(duì)人體生理活動(dòng)的影響，都被明令禁止使用。而主動(dòng)免疫生長(zhǎng)抑素的技術(shù)則因促生長(zhǎng)效應(yīng)僅限于幼齡動(dòng)物且效果很不穩(wěn)定，也不能很好地應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)。
目前發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物的肌肉生長(zhǎng)過程中特別是在肌肉生長(zhǎng)的后期，肌肉細(xì)胞產(chǎn)生一種名為第8生長(zhǎng)分化因子(Growth Differentiation Factor-8，簡(jiǎn)稱GDF-8)的內(nèi)分泌因子，該因子也被稱為肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin，簡(jiǎn)稱MSTN)。肌肉生長(zhǎng)抑制素作用于肌肉細(xì)胞表面的受體，從而抑制肌肉細(xì)胞的肥大或過度生長(zhǎng)。本發(fā)明創(chuàng)造的任務(wù)或要解決的問題，就是在不影響動(dòng)物的遺傳基礎(chǔ)、營(yíng)養(yǎng)和飼養(yǎng)要求或條件下，解除或去除動(dòng)物“肌肉生長(zhǎng)抑制素”對(duì)肌肉生長(zhǎng)的抑制作用，使肌肉細(xì)胞或組織在生長(zhǎng)后期能夠不受限制繼續(xù)生長(zhǎng)或肥大，從而大幅度提高肌肉生長(zhǎng)速度。
目前美國(guó)已經(jīng)生產(chǎn)出專門結(jié)合或中和抑制“肌肉生長(zhǎng)抑制素”的特異性抗體，該抗體使“肌肉生長(zhǎng)抑制素”不能與肌肉細(xì)胞表面的受體結(jié)合，解除其對(duì)肌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)肌肉的“無限制”生長(zhǎng)。目前發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠注射該抗體(稱為“被動(dòng)免疫”)可以把肌肉組織重量提高20～30％。但該“被動(dòng)免疫”技術(shù)目前僅處于實(shí)驗(yàn)階段，同時(shí)“被動(dòng)免疫”的做法還必需每天注射抗體，在生產(chǎn)上因操作繁瑣和國(guó)外受動(dòng)物福利人士的抗議而無生產(chǎn)應(yīng)用前景。因此本發(fā)明的目的或任務(wù)是采用“主動(dòng)免疫”的途徑，制備“肌肉生長(zhǎng)抑制素”的基因工程疫苗并用該疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，然后利用動(dòng)物自身的免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期生產(chǎn)抗“肌肉生長(zhǎng)抑制素”的抗體，該抗體完全具有專門結(jié)合和抑制“肌肉生長(zhǎng)抑制素”的能力，從而也能夠解除“肌肉生長(zhǎng)抑制素”對(duì)肌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，實(shí)現(xiàn)肌肉的“無限制”生長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容包括1)肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備，和2)對(duì)動(dòng)物或畜禽主動(dòng)免疫肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)的兩部分。
一.肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備肌肉生長(zhǎng)抑制素基因在肌肉細(xì)胞中被首先翻譯為一375個(gè)氨基酸殘基的激素肽原，該肽原的263-266氨基酸殘基處有一蛋白裂解位點(diǎn)RSRR，在此處將氨基端的親水性分泌信號(hào)肽切下后產(chǎn)生具生物活性的羧基端109個(gè)氨基酸殘基的肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽。由于肌肉生長(zhǎng)抑制素在不同物種之間(包括畜禽)呈高度保守，其基因核苷酸序列在不同物種之間非常相似，所編碼的成熟肽氨基酸殘基序列在豬、雞和鵝都一樣，因此任何這些動(dòng)物的基因都可以用于制備肌肉生長(zhǎng)抑制素的基因工程疫苗。
肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備，①克隆畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼基因，②利用畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼基因，制備肌肉生長(zhǎng)抑制素的重組融合蛋白，③利用該肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白作為免疫原制備肌肉生長(zhǎng)抑制素的基因工程疫苗。
克隆畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼基因，①利用根據(jù)GenBank中所發(fā)表的雞肌肉生長(zhǎng)抑制素基因序列，設(shè)計(jì)出該基因的特異性上游引物P1(序列為5’-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3’)和下游引物P2(序列為5’-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3’)；②利用異硫氰酸胍-氯仿-異丙醇方法從畜禽肌肉組織中提取總RNA作為模板用引物P2反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；③用該第一鏈cDNA作為模板和引物P1、P2通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出雞、豬或鵝的肌肉生長(zhǎng)抑制素的編碼cDNA序列。
制備畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白制備方法之一是利用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株表達(dá)制備重組融合蛋白①根據(jù)肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的cDNA堿基序列和大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pRSET A的多克隆位點(diǎn)堿基序列，合成上游引物P3(序列為5‘-ATTGGATCCGATTTTGGCCTTG ACT-3’，下劃線部分為BamHI限止性酶切位點(diǎn))和下游引物P4(序列為5‘-AATGAGCTCAATGAGCACCCGCAACGA-3’，下劃線部分為SacI限止性酶切位點(diǎn))；②利用該對(duì)引物、上述反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出的肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA序列作為模板，再次通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；③擴(kuò)增出的肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的cDNA克隆片段經(jīng)過BamHI和SacI雙酶切后，克隆入表達(dá)質(zhì)粒pRSET A的BamHI和SacI兩酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pMSTN SCAU；④將重組表達(dá)質(zhì)粒pMSTN SCAU轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株，在培養(yǎng)液中加入0.01mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)使重組細(xì)菌表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白。
制備畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白方法之二是利用畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)此融合蛋白①根據(jù)獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽編碼cDNA的堿基序列和用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母的穿梭質(zhì)粒pPICZαA的多克隆位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)上游引物YP1(序列為5‘-AGGGAATTCGATTTTGGCC TTGACTGC-3’，下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn))和下游引物YP2(5‘-AATGGTACCTTTGAGCACCCGCAACG-3’，下劃線部分為KpnI酶切位點(diǎn))；②利用該對(duì)引物、以上反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出的肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA序列作為模板，再次通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出肌肉生長(zhǎng)抑制素基因成熟肽的cDNA酵母穿梭質(zhì)?？寺∑危揷DNA克隆片段經(jīng)過EcoRI和KpnI雙酶切后，克隆入穿梭質(zhì)粒pPICZαA的EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)之間后，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPICZ-MSTN SCAU；③將重組質(zhì)粒pPICZ-MSTN SCAU線性化并轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母菌X-33，并在ZeocinTM的YPDS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選白色菌落至YPDS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用上游引物AOX1(5‘-GACTG GTTCCAATTGACAAGC-3’)和下游引物AOX2(5‘-GCAAATGGCATTCT GACATCC-3’)通過PCR反應(yīng)來鑒定和挑選Mut+表型重組酵母；④挑取將肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽融合基因正確整合入基因組的單個(gè)重組酵母菌接種于BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)液中添加甲醇至終濃度0.5％誘導(dǎo)表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白，所表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白能被酵母菌分泌至胞外培養(yǎng)液中。
純化所表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白，將用8Mol尿素裂解以上表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，或通過離心分離出含有肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的酵母培養(yǎng)液，將兩種含有肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的溶液通過Ni-NTA凝膠純化樹脂進(jìn)行層析，最后洗脫純化出肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白作為免疫用的抗原。
將以上純化出的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白作為免疫原制備油乳劑疫苗①按2～6mg/mL的濃度將肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白溶于含2～4％Tween80的水溶液中制成水相；②將10號(hào)輕質(zhì)白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向內(nèi)加入2％的硬脂酸鋁，混合均勻制成油相；③將水相和油相按4∶6的比例混合，并于攪拌機(jī)下制成油包水的均質(zhì)乳液作為肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗。
肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的應(yīng)用，主要是通過主動(dòng)免疫的途徑促進(jìn)動(dòng)物的肌肉生長(zhǎng)，對(duì)生長(zhǎng)階段的豬、牛、羊、山羊和鹿，每隔3～4周于肌肉內(nèi)注射肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程油乳劑疫苗，促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗自身肌肉生長(zhǎng)抑制素的抗體，該抗體可以中和抑制動(dòng)物肌肉細(xì)胞分泌的肌肉生長(zhǎng)抑制素，解除肌肉生長(zhǎng)抑制素對(duì)畜禽肌肉生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)。
現(xiàn)結(jié)合實(shí)例和附圖對(duì)該發(fā)明作進(jìn)一步說明，其中附

圖1為肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。附圖2為含有肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合基因的酵母穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。附圖1所列構(gòu)建步驟為，①?gòu)莫{頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA中擴(kuò)增出其成熟肽cDNA克隆片段，并將該片段經(jīng)BamHI和SacI雙酶切；②另外將用于在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白的質(zhì)粒pRSET A同樣用BamHI和SacI雙酶切；③然后將酶切后的成熟肽cDNA克隆片段和pRSET A載體用T4連接酶連接，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pMSTN SCAU，其中用于表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的核苷酸序列如序列表中序列2所示。附圖2所列構(gòu)建步驟為，①?gòu)莫{頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA中擴(kuò)增出其成熟肽cDNA克隆片段，并將該片段經(jīng)EcoRI和KpnI雙酶切后；②另外將用于向酵母基因組整合外源基因的穿梭質(zhì)粒pPICZαA同樣用EcoRI和KpnI雙酶切；③然后用酶切后的成熟肽cDNA克隆片段和穿梭質(zhì)粒pPICZαA載體用T4連接酶連接，構(gòu)建成重組穿梭質(zhì)粒pPICZ-Mstn SCAU，其中用于表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
具體實(shí)施方案以下是利用從獅頭鵝中克隆出的肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA進(jìn)行制備肌肉生長(zhǎng)抑制素的基因工程疫苗的說明。由于到目前為止所發(fā)現(xiàn)的不同動(dòng)物的肌肉生長(zhǎng)抑制素的成熟肽氨基酸殘基序列極為相似，因此除了利用獅頭鵝的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因外，還可以用雞、豬、牛和羊的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因來制備肌肉生長(zhǎng)抑制素的基因工程疫苗。
具體的做法是(1)獲得或克隆畜禽的肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼基因，(2)利用該基因在大腸桿菌或酵母中表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素的重組融合蛋白作為抗原或免疫原，(3)純化所表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素融合蛋白免疫原并將其與礦物油佐劑混合制成肌肉生長(zhǎng)抑制素疫苗。
1.動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA的克?、俑鶕?jù)GenBank中所發(fā)表的畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素基因序列，設(shè)計(jì)出該基因的特異性引物。上游引物P1(5’-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3’)對(duì)應(yīng)于肌肉生長(zhǎng)抑制素基因編碼區(qū)第1-22位核苷酸；下游引物P2(5’-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3’)對(duì)應(yīng)于肌肉生長(zhǎng)抑制素基因編碼區(qū)第1109-1128位核苷酸。上下游引物之間包含了1128bp的核苷酸序列，覆蓋了畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼區(qū)cDNA的完整序列及之后的TGA終止密碼子。
②取100mg獅頭鵝骨骼肌，置于1ml異硫氰酸胍苯酚溶液(Trizol液，Invitrogen公司)中勻漿，然后用氯仿去除蛋白質(zhì)，離心15分鐘后取出上清液，向上清液中加入異丙醇再離心沉淀總RNA。把總RNA配成1μg/μl的濃度溶于含DEPC的水中，并與下游引物P2和dNTP混合，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶催化下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。
③用引物P1、P2、dNTP和反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA作為模板，在DNA聚合酶的催化下通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出獅頭鵝的肌肉生長(zhǎng)抑制素的編碼cDNA片段。
④將所擴(kuò)增出的獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素cDNA片段與克隆質(zhì)粒pUCm-T載體(購(gòu)于上海生工公司)的連接，并將構(gòu)建成的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α株(Invitrogen公司)進(jìn)行復(fù)制、永久保存、核苷酸序列測(cè)定。序列表中序列1為用此方法反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出的獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素cDNA的核苷酸序列，其中下劃線部分分別對(duì)應(yīng)P1和P2引物，第799～1125位核苷酸為肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的編碼cDNA序列，最后的tga為終止密碼子。該擴(kuò)增的獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素基因核苷酸序列與其它禽類的同源性在90％以上，和家畜的同源性在85％以上；所編碼的成熟肽氨基酸殘基序列與雞、豬的完全一樣，與牛的僅有2個(gè)氨基酸殘基的差異，與羊的僅有3個(gè)氨基酸殘基的差異。因此完全可以用獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA制備肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗。
2.肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的表達(dá)利用獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素cDNA，可以通過原核表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌BL21DE3株(Invitrogen公司)或真核表達(dá)系統(tǒng)如畢赤酵母(Invitrogen公司)進(jìn)行肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的表達(dá)。
(1)大腸桿菌BL21 DE3株(Invitrogen公司)中表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白①根據(jù)測(cè)序所得到的獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素cDNA的核苷酸序列，按其成熟肽的cDNA序列(序列表中序列1)，設(shè)計(jì)一上游引物P3(5‘-ATT GATT TTGGCCTTGACT-3’)對(duì)應(yīng)于肌肉生長(zhǎng)抑制素基因編碼區(qū)的第799～814位核苷酸序列，并含一BamHI酶切位點(diǎn)(雙下劃線部分)和一下游引物P4(5‘-AAT TGAGCACCCGCAACGA-3’)，對(duì)應(yīng)于肌肉生長(zhǎng)抑制素基因編碼區(qū)的第1109～1125位核苷酸序列，含一SacI酶切位點(diǎn)(雙下劃線部分)和該位點(diǎn)之后補(bǔ)充的兩個(gè)腺嘌呤核苷酸(單下劃線部分)以維持?jǐn)U增片段的閱讀框架。②利用引物P3、P4、擴(kuò)增得到的肌肉生長(zhǎng)抑制素cDNA片段作為模板和dNTP在Pfu DNA聚合酶催化下經(jīng)PCR反應(yīng)再次擴(kuò)增出兩端帶有BamHI和SacI酶切位點(diǎn)的肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的cDNA克隆片段，用于插入表達(dá)質(zhì)粒pRSET A(Invitrogen公司)。圖1顯示了含有肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合基因的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程利用引物P3和P4擴(kuò)增得到肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽cDNA克隆片段，將該片段經(jīng)BamHI和SacI雙酶切；將具有多克隆酶切位點(diǎn)、能夠裝載并在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)質(zhì)粒pRSETA用BamHI和SacI雙酶切；然后用T4連接酶連接肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽cDNA克隆片段和表達(dá)質(zhì)粒pRSET A載體，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pMSTNSCAU。其中肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其中下劃線部分分別與引物P3和P4相對(duì)應(yīng)，下劃線之間的部分為肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽cDNA序列，其余部分為來自于質(zhì)粒的核苷酸序列。③將該重組表達(dá)質(zhì)粒pMSTN SCAU轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 DE3株，重組細(xì)菌在培養(yǎng)后0.01mmol/L在IPTG濃度下誘導(dǎo)6小時(shí)表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白。該重組融合蛋白的氨基酸殘基序列如序列表中序列3所示，其中單下劃線部分即為肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽109個(gè)氨基酸殘基序列，其前方和后方分別為來自表達(dá)質(zhì)粒的36位和14位氨基酸殘基序列，雙下劃線部分為6個(gè)組氨酸殘基標(biāo)記(His-Tag)。
(2)在畢赤(Pichia)酵母中表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白①根據(jù)獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽cDNA核苷酸序列和用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母的穿梭質(zhì)粒pPICZαA(Invitrogen公司)的多克隆位點(diǎn)核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。上游引物YP1(5‘-AGG GATTTTGGCCTTGACTGC-3’)，對(duì)應(yīng)于肌肉生長(zhǎng)抑制素基因編碼區(qū)的第799～816位核苷酸序列，含EcoRI酶切位點(diǎn)(雙下劃線部分)；下游引物YP2(5‘-AA TGAGCACCCGCAACG-3’)，對(duì)應(yīng)于肌肉生長(zhǎng)抑制素基因編碼區(qū)的第1110～1125位核苷酸序列，含一KpnI酶切位點(diǎn)(雙下劃線部分)和維持閱讀框架的兩個(gè)堿基TT(單下劃線部分)。②利用引物YP1、YP2、dNTP、反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到的肌肉生長(zhǎng)抑制素cDNA片段作為模板，在Pfu DNA聚合酶催化下經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出兩端帶有EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)的肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的cDNA克隆片段。圖2顯示了含有肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合基因的酵母穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建流程利用引物YP1和YP2擴(kuò)增得到肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽cDNA克隆片段，將該片段用EcoRI和KpnI雙酶切；將具有多克隆酶切位點(diǎn)、能夠裝載并在將外源基因整合到畢赤酵母基因組中的穿梭質(zhì)粒pPICZαA用EcoRI和KpnI雙酶切；然后用T4連接酶連接肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽cDNA克隆片段穿梭質(zhì)粒pPICZαA載體，構(gòu)建成重組穿梭質(zhì)粒pPICZ-Mstn SCAU。該質(zhì)粒中的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合基因的cDNA序列如序列表中序列4所示，其中下劃線部分分別對(duì)應(yīng)于YP1和YP2，中間為肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽編碼cDNA，之前為α因子信號(hào)肽編碼cDNA，之后為來自于穿梭質(zhì)粒的核苷酸所編碼的氨基酸殘基，其中包括一個(gè)6個(gè)組氨酸的標(biāo)記(His-tag)。③將重組穿梭質(zhì)粒pPICZ-Mstn SCAU轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株在其中進(jìn)行復(fù)制，取培養(yǎng)的含有重組穿梭質(zhì)粒的DH5α培養(yǎng)菌液涂布低鹽LB(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，5g/L NaCl)+ZeocinTM(25μg/mL)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落至低鹽LB+ZeocinTM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行PCR和酶切鑒定和測(cè)序鑒定。④將鑒定構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pPICZ-Mstn SCAU線性化，提純后電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母菌X-33，涂布含ZeocinTM的YPDS(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L D-葡萄糖，1mol/L山梨醇，20g/L瓊脂粉)固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至白色菌落出現(xiàn)。挑單菌落至YPDS(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，20g/L D-葡萄糖)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。同時(shí)合成一對(duì)引物，上游引物AOX1(5‘-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’)和下游引物AOX2(5‘-GCAAAT GGCATTC TGAATCC-3’)。用引物AOX1、AOX2、dNTP、重組酵母培養(yǎng)菌在DNA聚合酶催化下進(jìn)行PCR反應(yīng)，鑒定并挑選Mut+表型重組酵母。⑤挑選構(gòu)建正確的已經(jīng)將肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽基因整合入基因組的單個(gè)重組酵母菌接種于25mLBMGY(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，13.4g/L酵母氮源，4×10-5g/LD-生物素，10mL/L丙三醇，100mmol/L磷酸緩沖液，pH6.0)培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)至OD600＝2.6，收獲重組酵母菌并用BMMY(10g/L酵母提取物，20g/L胰蛋白胨，13.4g/L酵母氮源，4×10-5g/L D-生物素，5mL/L甲醇，100mmol/L磷酸緩沖液，pH6.0)培養(yǎng)基稀釋至OD600＝1，30℃振蕩培養(yǎng)4d，每隔24h添加甲醇至終濃度0.5％，每12h取樣備SDS-PAGE分析所表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白。
以上用畢赤酵母所表達(dá)的重組蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。其中含來自于載體的89個(gè)氨基酸的α因子信號(hào)肽序列，109個(gè)氨基酸殘基的肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽序列(下劃線部分)，來自質(zhì)粒基因序列所編碼的29個(gè)殘基的肽序列和用于純化的6個(gè)氨基酸殘基的組氨酸標(biāo)記。酵母在表達(dá)時(shí)會(huì)將該蛋白分泌至胞外培養(yǎng)液中，此時(shí)會(huì)把氨基端的89個(gè)氨基酸的α因子信號(hào)肽序列裂解開，形成包含一個(gè)144氨基酸殘基的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白，其中109個(gè)氨基酸殘基為肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的氨基酸殘基序列，羧基端的35個(gè)氨基酸殘基為來自質(zhì)粒pPICZαA的基因所編碼，包括位于最后的6個(gè)組氨酸殘基標(biāo)記(His-tag)。
3.肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的純化利用大腸桿菌表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的氨基端具有一6個(gè)連續(xù)組氨酸的標(biāo)記(His-tag)，在酵母表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的羧基端具有一6個(gè)連續(xù)組氨酸的標(biāo)記。此His-Tag標(biāo)記能夠與鎳離子發(fā)生特異親和結(jié)合，因此將表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的細(xì)菌經(jīng)8M尿素溶液裂解、或?qū)⒃诩状颊T導(dǎo)后表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的酵母培養(yǎng)表達(dá)液加載到Ni-NTA凝膠純化樹脂層析柱，使其中的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白被吸附到Ni-NTA凝膠純化樹脂并洗脫不能與鎳離子樹脂結(jié)合的菌體雜蛋白，最后改變洗脫液pH值將目的蛋白肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白洗脫純化。
4.肌肉生長(zhǎng)抑制素油乳劑疫苗的制備將以上所表達(dá)并純化出的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白按2～6mg/mL的濃度溶于含2～4％Tween 80的水溶液中制成水相；再將10號(hào)輕質(zhì)白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向加入2％的硬脂酸鋁混合均勻制成油相；將水相和油相按4∶6的比例混合，并于攪拌機(jī)下制成油包水的均質(zhì)乳液作為肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗。
二.畜禽主動(dòng)免疫“肌肉生長(zhǎng)抑制素”基因工程疫苗促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)的方法對(duì)豬、牛、羊、山羊和鹿每隔3-4周肌肉注射以上制備的“肌肉生長(zhǎng)抑制素”的基因工程油乳劑疫苗，即可以有效促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗自身肌肉生長(zhǎng)抑制素的抗體，該抗體可以中和抑制動(dòng)物肌肉細(xì)胞自身分泌的肌肉生長(zhǎng)抑制素，解除肌肉生長(zhǎng)抑制素對(duì)畜禽肌肉生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)畜禽肌肉的生長(zhǎng)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的優(yōu)點(diǎn)、特點(diǎn)或者積極效果“主動(dòng)免疫肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗促進(jìn)畜禽肌肉生長(zhǎng)的方法”所使用的物質(zhì)是“肌肉生長(zhǎng)抑制素”基因工程疫苗或“肌肉生長(zhǎng)抑制素”的重組融合蛋白，該蛋白無毒性，不對(duì)動(dòng)物造成任何疾??；該蛋白作為基因工程疫苗使用后使動(dòng)物產(chǎn)生本質(zhì)是上免疫球蛋白的抗體，不會(huì)造成其他藥物殘留，對(duì)人畜無害，不會(huì)對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生任何不良影響。與其他任何技術(shù)相比，該技術(shù)促進(jìn)肌肉組織生長(zhǎng)的效力強(qiáng)，特異性高，具有其他任何技術(shù)無法比擬的優(yōu)點(diǎn)和性能。
序列表<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備及其應(yīng)用<140>
<141>
<160>5<210>1<211>1128<212>DNA<213>獅頭鵝(Anser anser)<220>
<222>(1)...(1128)<223>肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼區(qū)cDNA序列<220>
<221>misc_recomb<222>(1)...(12)<223>引物P1對(duì)應(yīng)區(qū)域<220>
<221>misc_recomb<222>(799)...(814)<223>引物P3對(duì)應(yīng)區(qū)域<220>
<221>mat_peptide<222>(799)...(1125)<223>肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽cDNA序列<220>
<221>misc_recomb<222>(1109)...(1128)<223>引物P2對(duì)應(yīng)區(qū)域<220>
<221>misc_recomb<222>(1110)...(1125)<223>引物P4對(duì)應(yīng)區(qū)域<400>1atgcaaaagc tagcagtcta tgtttatatt tacctgttca tgctgatttc agttgatccg 60gtggctcttg atgacggtag tcaccccaca gagaatgctg aaaaagatgg actgtgcaat 120gcttgtacat ggagacagaa tacaaaatct tccagaatag aagccataaa aattcaaatc 180ctcagcaaac tgcgtctgga acaagctcct aacattagca gggatgttat taaacaactt 240ttacccaaag ctcctccact acaggaactg gttgatcaat atgacgtcca gagagatgac 300agtagcgatg gctctttgga agacgatgac tatcatgcca caactgaaac gattatcaca 360atgcctacag agtctgattt tcttgtacaa atggagggaa aaccaaaatg ttgcttcttt 420aagtttagct ctaaaataca atataacaaa gtagtaaagg cacaattgtg gatatacttg 480aggcaagtcc aaaaacctac aacagtgttt gtgcagatcc tgagacttat taagcccatg 540aaagacggta caagatatac tggaattcga tctttgaaac ttgacatgaa cccaggcact 600
ggtatttggc agagtattga tgtgaagaca gtgttgcaaa attggctcaa acagcctgaa 660tccaatttag gcgtcgaaat aaaagctttt gatgagaatg gacgagatct tgctgtaact 720ttcccaggac caggtgaaga tggattgaat ccatttttag aggtcagagt tacagacaca 780ccgaaacgat cccgcaga gcgatg agcactcgac agaatccaga 840tgttgtcgct acccactaac tgtggacttt gaagcttttg gatgggactg gattatcgca 900cctaaaagat acaaagccaa ttactgctct ggagaatgtg aatttgtatt tctacagaaa 960tatccgcaca ctcatcttgt acaccaagca aatcctagag gctcggcagg cccctgctgc 1020acgcccacca agatgtcccc cataaatatg ttgtatttca atggaaaaga acaaataata 1080tacggaaaga taccagccat ggttgtag 1128
<210>2<211>480<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(480)<223>質(zhì)粒pMSTN SCAU中肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合基因序列<220>
<222>(103)...(124)<223>引物P3對(duì)應(yīng)區(qū)域<220>
<222>(419)...(443)<223>引物P4對(duì)應(yīng)區(qū)域<400>2atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa 60atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccga ttttggcctt120gactgcgatg agcactcgac agaatccaga tgttgtcgct acccactaac tgtggatttt 180gaagcttttg gatgggactg gattatcgca cctaaaagat acaaagccaa ttactgctct 240ggagaatgtg aatttgtatt tctacagaaa tatccgcaca ctcatcttgt acaccaagca 300aaccctagag gctcggcagg cccctgctgc acgcccacca agatgtcccc cataaatatg 360ttgtatttca atggaaaaga acaaataata tacggaaaga taccagccat ggttgtagat420cgttgcgggt gctcattgag ctcgagatct gcagctggta ccatggaatt cgaagcttga 480
<210>3<211>159<212>PRT<213>人工序列<220>
<222>(1)...(159)<223>重組大腸桿菌表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白氨基酸殘基序列<220>
<222>(5)...(10)<223>His-tag標(biāo)記氨基酸殘基序列<220>
<222>(27)...(145)<223>肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽氨基酸殘基序列<400>3Met Arg Gly Ser 1 5 10Gly Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln11 15 20Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp21 25 30Lys Asp Arg Trp Gly SerAsp Phe Gly Leu31 35 40Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg
41 45 50Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe51 55 60Glu Ala Phe Gul MMT arp Asp Trp Ile Ile Ala61 65 70Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser71 75 80Gly Glu Cys Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys81 85 90Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala91 95 100Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys101 105 110Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met111 115 120Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile121 125 130Tyr Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp131 135 140Arg Cys Gly Cys SerLeu Ser Ser Arg Ser141 145 150Ala Ala Gly Thr Met Glu Phe Glu Ala151 155 159
<210>4<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>(1)...(702)<223>質(zhì)粒pPICZ-MSTN SCAU中肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合基因序列<220>
<222>(268)...(291)<223>引物YP1對(duì)應(yīng)的區(qū)域<220>
<222>(585)...(608)<223>引物YP2對(duì)應(yīng)的區(qū)域<400>4atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttcgattttg gccttgactg cgatgagcac300tcgacagaat ccagatgttg tcgctaccca ctaactgtgg actttgaagc ttttggatgg 360gactggatta tcgcacctaa aagatacaaa gccaattact gctctggaga atgtgaattt 420gtatttctac agaaatatcc gcacactcat cttgtacacc aagcaaatcc tagaggctcg 480gcaggcccct gctgcacgcc caccaagatg tcccccataa atatgttgta tttcaatgga 540aaagaacaaa taatatacgg aaagatacca gccatggttg tagatcgttg cgggtgctca600aaggtacctc gagccgcggc ggccgccagc tttctagaac aaaaactcat ctcagaagag 660gatctgaata gcgccgtcga ccatcatcat catcatcatt ga 702
<210>5<211>233<212>PRT<213>人工序列<220>
<222>(1)...(233)<223>重組酵母表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白氨基酸殘基序列<220>
<222>(1)...(89)<223>α因子信號(hào)肽氨基酸殘基序列<220>
<222>(92)...(200)<223>肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽氨基酸殘基序列<400>5Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val1 5 10Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala11 15 20Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr21 25 30Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly31 35 40
Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val41 45 50Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn51 55 60Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile61 65 70Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val71 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu81 85 90PheAsp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His91 95 100Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro101 105 110Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp111 115 120Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys121 125 130Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu Phe131 135 140Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His141 145 150Leu Val His Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser151 155 160Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met161 165 170
Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly171 175 180Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro181 185 190Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser191 195 200Lys Val Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser201 205 210Phe Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu211 215 220Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His221 225 230His His His231 23權(quán)利要求
1.肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備，其特征在于①克隆畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼基因，②利用畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼基因，制備肌肉生長(zhǎng)抑制素的重組融合蛋白，③利用該肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白作為免疫原制備肌肉生長(zhǎng)抑制素的基因工程疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備，其特征在于克隆畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼基因，①利用根據(jù)GenBank中所發(fā)表的雞肌肉生長(zhǎng)抑制素基因序列，設(shè)計(jì)出該基因的特異性上游引物P1(序列為5’-ATGCAAAAGCTAGCAGTCTATG-3’)和下游引物P2(序列為5’-TCATGAGCACCCGCAACGAT-3’)；②利用異硫氰酸胍-氯仿-異丙醇方法從畜禽肌肉組織中提取總RNA作為模板用引物P2反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA；③用該第一鏈cDNA作為模板和引物P1、P2通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出雞、豬或鵝的肌肉生長(zhǎng)抑制素的編碼cDNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所說的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備，其特征在于制備畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白，制備方法之一是利用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株表達(dá)制備重組融合蛋白①根據(jù)肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的cDNA堿基序列和大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pRSET A的多克隆位點(diǎn)堿基序列，合成上游引物P3(序列為5‘-ATTGGATCCGATTTTGGCCTTG ACT-3’，下劃線部分為BamH I限止性酶切位點(diǎn))和下游引物P4(序列為5‘-AATGAGCTCAATGAGCACCCGCAACGA-3’，下劃線部分為Sac I限止性酶切位點(diǎn))；②利用該對(duì)引物、上述反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出的肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA序列作為模板，再次通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的cDNA克隆片段；③擴(kuò)增出的肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽的cDNA克隆片段經(jīng)過BamH I和SacI雙酶切后，克隆入表達(dá)質(zhì)粒pRSET A的BamH I和Sac I兩酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pMSTN SCAU；④將重組表達(dá)質(zhì)粒pMSTN SCAU轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)株，在培養(yǎng)液中加入0.01mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6小時(shí)使重組細(xì)菌表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備，其特征在于制備畜禽肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白，制備方法之二是利用畢赤酵母在甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)此融合蛋白①根據(jù)獅頭鵝肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽編碼cDNA的堿基序列和用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母的穿梭質(zhì)粒pPICZαA的多克隆位點(diǎn)的堿基序列，設(shè)計(jì)上游引物YP1(序列為5‘-AGGGAATTCGATTTTGGCC TTGACTGC-3’，下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))和下游引物YP2(5‘-AATGGTACCTTTGAGCACCCGCAACG-3’，下劃線部分為Kpn I酶切位點(diǎn))；②利用該對(duì)引物、以上反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增出的肌肉生長(zhǎng)抑制素編碼cDNA序列作為模板，再次通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增出肌肉生長(zhǎng)抑制素基因成熟肽的cDNA酵母穿梭質(zhì)粒克隆片段，該cDNA克隆片段經(jīng)過EcoR I和KpnI雙酶切后，克隆入穿梭質(zhì)粒pPICZαA的EcoRI和KpnI酶切位點(diǎn)之間后，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pPICZ-MSTN SCAU；③將重組質(zhì)粒pPICZ-MSTN SCAU線性化并轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母菌X-33，并在ZeocinTM的YPDS固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑選白色菌落至YPDS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，并用上游引物AOX1(5‘-GACTG GTTCCAATTGACAAGC-3’)和下游引物AOX2(5‘-GCAAATGGCATTCT GACATCC-3’)通過PCR反應(yīng)來鑒定和挑選Mut+表型重組酵母；④挑取將肌肉生長(zhǎng)抑制素成熟肽融合基因正確整合入基因組的單個(gè)重組酵母菌接種于BMGY培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)液中添加甲醇至終濃度0.5％誘導(dǎo)表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白，所表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白能被酵母菌分泌至胞外培養(yǎng)液中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的制備，其特征在于純化所表達(dá)的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白，將用8Mol尿素裂解以上表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，或通過離心分離出含有肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的酵母培養(yǎng)液，將兩種含有肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白的溶液通過Ni-NTA凝膠純化樹脂進(jìn)行層析，最后洗脫純化出肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白作為免疫用的抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所說的肌肉生長(zhǎng)抑制素基因基因工程疫苗的制備，其特征在于將以上純化出的肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白作為免疫原制備油乳劑疫苗①按2～6mg/mL的濃度將肌肉生長(zhǎng)抑制素重組融合蛋白溶于含2～4％Tween 80的水溶液中制成水相；②將10號(hào)輕質(zhì)白油和司本80按94％和6％的比例混合，再向內(nèi)加入2％的硬脂酸鋁，混合均勻制成油相；③將水相和油相按4∶6的比例混合，并于攪拌機(jī)下制成油包水的均質(zhì)乳液作為肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗。
7.肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗的應(yīng)用，主要是通過主動(dòng)免疫的途徑，用于促進(jìn)動(dòng)物的肌肉生長(zhǎng)，其特征在于對(duì)生長(zhǎng)階段的豬、牛、羊、山羊和鹿，每隔3～4周于肌肉內(nèi)注射肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程油乳劑疫苗，促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗自身肌肉生長(zhǎng)抑制素的抗體，該抗體可以中和抑制動(dòng)物肌肉細(xì)胞分泌的肌肉生長(zhǎng)抑制素，解除肌肉生長(zhǎng)抑制素對(duì)畜禽肌肉生長(zhǎng)的抑制作用，促進(jìn)動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于獸用疫苗制備領(lǐng)域，通過基因工程的方法，克隆肌肉生長(zhǎng)抑制素的基因，在大腸桿菌或酵母中表達(dá)肌肉生長(zhǎng)抑制素的重組融合蛋白作為免疫原或基因工程疫苗。對(duì)生長(zhǎng)畜禽主動(dòng)免疫此肌肉生長(zhǎng)抑制素基因工程疫苗，可以促進(jìn)動(dòng)物產(chǎn)生抗肌肉生長(zhǎng)抑制素的抗體，該抗體可以中和抑制畜禽體內(nèi)肌肉自身產(chǎn)生的肌肉生長(zhǎng)抑制素，解除肌肉生長(zhǎng)抑制素的抑制肌肉生長(zhǎng)作用，從而促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)。該技術(shù)促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)效力強(qiáng)，特異性高，并且無毒性，無致病性，無藥物殘留，不對(duì)消費(fèi)者產(chǎn)生任何不良影響。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1569230SQ20031011202
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月5日
發(fā)明者施振旦, 劉穎, 郭文軍 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)