專利名稱：：作為抗惡性瘧的潛在疫苗的重組mva株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及重組的MVA株(經(jīng)修飾的牛痘病毒安卡拉(ModifiziertesVacciniaVirusAnkara))牛痘病毒的制備，其用于重組生產(chǎn)瘧疾病原體惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)的完全的瘧疾抗原gp190/MSP-1的重組產(chǎn)物及具體自然存在的功能域及其部分。此外，本發(fā)明還涉及所述重組MVA的用途，其含有將合成的瘧疾抗原DNA序列及其部分整合進入病毒基因組中作為疫苗用于免疫接種抵抗瘧疾。瘧疾是世界上最危險的傳染疾病的一種，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的估計，每年登記有400-900百萬病例。根據(jù)來自抗瘧疾多邊倡議(MIM)的信息，每年死于此病傳染的人數(shù)為70萬至270萬(MIM，2001)。以此觀點，分布在99個國家的約占世界人口的40％的人們處于得瘧疾的危險。該疾病是由來自頂復(fù)亞門(Apicomplexa)的瘧原蟲屬(Plasmodium)的單細胞原生生物導(dǎo)致的。其中四種感染人類三日瘧原蟲(Plasmodiummalariae)，其導(dǎo)致(Malariaquartana)，間日瘧(Plasmodiumvivax)以及卵形瘧原蟲(Plasmodiumovale)，二者均導(dǎo)致間日瘧原蟲(Malariatertiana)，以及最后一個是惡性瘧原蟲，熱帶瘧(Malariatropica)的病原體，其可導(dǎo)致大多數(shù)致命的傳染病?，F(xiàn)在，其又以更甚的程度進行傳播。這主要歸因于用于治療及預(yù)防的藥劑促使瘧疾病原體迅速產(chǎn)生的抗性。除了尋找新的化學(xué)療法，研究集中于疫苗的開發(fā)，這是因為在人類的瘧疾感染進程中，免疫機理是適用的，一個事實是其表達一種對瘧原蟲的提高的抗性，正如在瘧疾流行猖獗的地區(qū)發(fā)展出人類的不同類型免疫性所證明的那樣。MSP-1作為潛在的疫苗MSP-1，裂殖子的主要表面蛋白，瘧疾病原體的血相的侵入型，是一種190-220kDa蛋白。該蛋白在裂殖子形成過程中被處理成較小的蛋白片段，其直到寄生蟲入侵紅細胞時經(jīng)糖基磷脂酰肌醇錨以復(fù)合體錨定在裂殖子表面上而被呈遞并可以被分離。幾種惡性瘧原蟲菌株的MSP-1蛋白的序列分為兩種類型，其根據(jù)兩個具有代表性的分離物K1以及MAD20命名。該蛋白總共由許多高保守區(qū)域、分別歸類于兩種類型之一的二態(tài)區(qū)域和兩個在所述蛋白的N端部分的相對較小的寡態(tài)區(qū)組成(圖1；Tanabeetal.，1987)。使用純化自尤氏瘧原寄生蟲(P.yoelii-Parasiten)的蛋白免疫小鼠，保護其免于否則致命的感染(Holder以及Freeman，1981)。同樣抗來自尤氏瘧原蟲的MSP-1的單克隆抗體的轉(zhuǎn)移在小鼠動物模型中的提供了保護(Majarianetal.，1984)。除了在小鼠上做研究以外，松鼠猴以及夜猴也同樣被使用天然的、免疫親和純化的MSP-1接種免疫。在這些測試中獲自惡性瘧原蟲的蛋白部分(Perrinetal.，1984)或完全(Siddiquietal.，1987)保護抵抗寄生蟲的感染。然而從瘧原蟲提純天然物質(zhì)是昂貴的且不能大規(guī)模生產(chǎn)，因此疫苗的研究主要集中于重組疫苗的開發(fā)。因此使用純化自大腸桿菌或啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的MSP-1-19成功地接種免疫小鼠(DalyandLong，1993；Lingetal.，1994；Tianetal.，1996；Hirunpetcharatetal.，1997)，同樣的是攜有MSP-1-19的牛分枝桿菌(MycobacterIUmbovis)(Matsumotoetal.，1999)。作為一種使用天然或重組的蛋白進行免疫接種的替代，編碼MSP-1-19的DNA同樣被用于疫苗且使免疫小鼠抵抗夏氏瘧原蟲(P.chabaudi)的感染(Wunderlich等；2000)。使用獲自惡性瘧原蟲的重組體MSP-1-19以及MSP-1-42免疫接種的猴子，提供了部分保護(Kumaretal.，1995；Eganetal.，2000；Changetal.，1996；Stowersetal.，2001)。在猴子上進行免疫接種試驗的解釋然而卻僅僅是在某種條件下才可能的，因為實驗中的動物數(shù)量太少而不能獲得結(jié)果的統(tǒng)計評估。使用MSP-1片段作為疫苗進行研究的第1及第II相，其免疫原性也顯示于人類中。在此涉及來自惡性瘧原蟲的p19融合在一個破傷風(fēng)毒素T輔助細胞表位(Keiteletal.，1999)上，且MSP-1的3及4區(qū)(Sauletal.，1999；Gentonetal；2000)。在特定地區(qū)的成人流行病研究顯示在抗MSP-1的抗體滴度以及抗瘧疾的免疫性之間有一定的關(guān)系(Tolleetal.，1993；Rileyetal.，1992；Rileyetal.，1993)。這些調(diào)查以及在動物上的免疫接種研究證明MSP-1是開發(fā)瘧疾疫苗的一個有希望的候選者。一般而言，這些研究可被分化成兩種途徑，或者使用從寄生蟲中純化的物質(zhì)或者使用在雜合系統(tǒng)中獲自的物質(zhì)。不管是用作功能性研究還是用作疫苗，蛋白質(zhì)必須以高產(chǎn)率、高質(zhì)量且可重復(fù)地制備。雖然MSP-1可從寄生蟲中純化產(chǎn)生，但是其僅可能在高代價的情形下小量獲取。因此以此途徑獲取符合上述標(biāo)準(zhǔn)的MSP-1是不可行的。牛痘病毒屬于脊髓動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)下的正痘病毒屬(Orthopoxvirus)。其痘病毒的情形下涉及到復(fù)合病毒，其具有大約200Kb以及尺寸250×350nm的雙鏈DNA基因組，屬于最大的已知病毒。其由一個被膜殼包覆的立方體形狀的病毒體組成。在寄主細胞中，痘病毒的復(fù)制和增殖僅在細胞質(zhì)中進行(參見Mossetal.，1996)。在此牛痘病毒疫苗的寄主細胞范圍很廣泛，其感染源自人及動物的近乎所有的細胞。1953年AntonMayr分離并純化了皮膚痘苗病毒株絨毛膜尿囊牛痘安卡拉(ChorioallantoisVacciniaAnkara(CVA))。該病毒在雞胚纖維細胞上連續(xù)傳代增殖且獲得減毒病毒株，其在人類及動物上并未顯示進一步的毒性(Stickletal.，1974)。該病毒可以進一步用于免疫預(yù)防對抗由正痘病毒引起的人和動物的疾病(Stickletal.，1974)。該病毒按其起源地被命名為經(jīng)修飾的牛痘苗病毒安卡拉(MVA)。考慮到分子遺傳水平，在雞胚纖維細胞的超過570次傳代過程中病毒損失了其基因組的31kb的DNA序列，主要是以6個大的缺失形式，其中至少包括決定寄主范圍的并由此確定病毒的復(fù)制能力的兩個基因(Meyeretal.，1991)。在MVA感染包括人類的哺乳動物的大多數(shù)細胞的過程中，感染性病毒顆粒的形成僅在感染周期的晚期于病毒體組合階段被阻斷，即病毒基因在啟動子的控制下，無論是早期、中期或者晚期的轉(zhuǎn)錄甚至可在不允許的細胞中表達。這區(qū)別于來自其他的減毒及復(fù)制缺陷的痘病毒的MVA，例如，牛痘病毒NYVAC或者金絲雀痘病毒ALVAC，其在哺乳動物的大多數(shù)細胞中的感染在病毒DNA復(fù)制之前已被阻斷(Tartagliaetal.，1992；Sutter及Moss，1992)。在瘧疾疫苗的開發(fā)過程之中使用到了不同的重組牛痘病毒株，其中使用了有復(fù)制能力的病毒類型WesternReserve及Copenhagen及減毒病毒類型NYVAC、ALVAC或COPAC(Kaslow，etal.，1991；EtlingerandAltenburger，1991；Aidooetal.，1997；Allsoppetal.，1996)。與減毒的牛痘病毒MVA相關(guān)的僅僅描述了攜有來自嚙齒類寄生物伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)的CSP作為瘧疾抗原的重組病毒(Schneideretal.，1998；Plebanskietal.，1998；Deganoetal.，1999；Gilbertetal.，1999)。另外描述有含有MSP-1編碼序列的重組牛痘病毒。出版物的作者聲稱其已經(jīng)將天然的MSP-1編碼序列整合進入WesternReserve病毒型的基因組，但是并沒有支持此觀點的實驗(沒有限制性分析、PCR、RNA印跡以及蛋白質(zhì)印跡等)。使用這些重組病毒接種免疫松鼠猴并未導(dǎo)致MSP-1特異性抗體的形成，而且在惡性瘧原蟲感染以后并未發(fā)現(xiàn)其對于抗MSP-1的體液免疫應(yīng)答有明顯的影響(Pyeetal.，1991)。在另一篇出版物中描述了載體NYVAC-Pf7，其在其他情況下表達惡性瘧原蟲的MSP-1。在該出版物中，六個免疫接種的恒河猴的兩個的血清通過蛋白質(zhì)印跡沒有顯示可檢測的抗天然MSP-1的信號。另外三個動物的信號檢測僅顯示部分蛋白質(zhì)復(fù)合體，而僅僅在一個經(jīng)免疫的動物的血清中檢測到一個寬的圖譜。然而總體上，這些信號也表現(xiàn)得很微弱。沒有列舉通過ELISA對MSP-1特異性抗體進行的定量分析(Tineetal.，1996)。在使用NYVAC-Pf7進行的人體試驗的第I/IIa階段既沒有證實抗MSP-1的細胞免疫應(yīng)答，也沒有通過ELISA證實可檢測到得體液免疫應(yīng)答(Ockenhouseetal.，1998)。相反，Tineetal.(1996)在蛋白質(zhì)印跡分析中證實了完整的MSP-1，在此其顯示與惡性瘧原蟲的信號序列將MSP-1運輸出細胞外的觀點相矛盾(參照PublikationenvonMoranandCaras，1994，Yangetal.，1997)。本發(fā)明的目的因此是提供一種重組的牛痘病毒，其能夠-含有穩(wěn)定的整合進入的DNA序列，其編碼惡性瘧原蟲的MSP-1或其一部分-所述序列有效地和可重復(fù)地表達和由此-MSP-1蛋白以分泌的或者以表面錨定的形式產(chǎn)生-免疫接種寄主并因此-導(dǎo)致細胞以及體液免疫應(yīng)答本發(fā)明的目的是通過提供一個重組的MVA病毒來實現(xiàn)，該病毒能夠在寄主體內(nèi)感染、復(fù)制和表達MSP-1。更進一步，其提供一種該重組病毒的生產(chǎn)方法及其用途。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“基于MVA的病毒”表示衍生自MVA的病毒，其在病毒基因組的非必需區(qū)具有一個或多個突變。MVA病毒的必需區(qū)在此意旨MVA病毒的所有基因組片段，其對于獲得病毒基因表達以及MVA病毒的增殖能力是必需的。其包括，例如編碼病毒RNA聚合酶亞單元或者病毒的DNA聚合酶的基因序列?；贛VA的病毒優(yōu)選為MVA病毒?，F(xiàn)有技術(shù)已知的牛痘疫苗體系NYVAC-Pf7是由基礎(chǔ)病毒NYVAC產(chǎn)生的，該基礎(chǔ)病毒最初來源于Copenhagen牛痘病毒株并通過針對性刪除18個開放閱讀框進行減毒。然而在哺乳動物細胞中NYVAC的DNA復(fù)制被阻斷(Tartagliaetal.，1992)，而MVA的病毒裝配被抑制。MVA相比較NYVAC有這樣的優(yōu)勢，發(fā)生晚期基因表達，其可被用于表達重組基因。因此MVA既可以在轉(zhuǎn)錄的早期階段優(yōu)先誘導(dǎo)產(chǎn)生毒性T細胞應(yīng)答也可以在晚期階段通過高蛋白表達刺激免疫應(yīng)答的體液反應(yīng)分支。MVA，其在痘病毒保護免疫運動中已被廣泛應(yīng)用，其被認為是對于人體非常安全的接種病毒(Stickletal.，1974)。根據(jù)本發(fā)明，提供一種基于MVA的重組病毒，其含有至少一種編碼惡性瘧原蟲MSP-1蛋白、其片段或其突變蛋白的核酸。MSP-1氨基酸序列通過公開供使用的數(shù)據(jù)庫獲取，例如3D7(MAD20-隔離群)CAA84556；FCB-1(K1-隔離群)CAB36903。二者均來自NIH數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。特別優(yōu)選的所述編碼MSP-1蛋白的核酸是其中AT含量減少的核酸，如同描述于DE19640817A1，其揭示的內(nèi)容在此作為引用，特別優(yōu)選的核酸是衍生自惡性瘧原蟲MSP-1序列的，并且其中瘧原蟲密碼子的大部分已被如此置換，以至于符合人類的合成基因的密碼子頻率，而不改變氨基酸序列。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，MSP-1蛋白是隔離群3D7的MSP-1，該MSP-1蛋白如下被稱為“MSP-1D”。可替代地，可以是FCB1株的MSP-1蛋白，其如下被稱為“MSP-1F”。所述MSP-1蛋白優(yōu)選包括這兩種MSP-1形式的片段。在此特別優(yōu)選的MSP-1F片段是單獨的或組合的p83、p30、p38、p33以及p19。尤其優(yōu)選的MSP-1D片段是單獨的或組合的，在此其中同樣包括與MSP-1F片段的組合，特別是p83、p30、p38、p33以及p19。尤其優(yōu)選p83與p30的組合以及p38與p42的組合。在此所述片段的位點顯示于圖1中，更進一步也包括兩種MSP-1形式的p42片段。MSP-1蛋白同樣也可以是惡性瘧原蟲MSP-1序列的突變蛋白，其通過一個或多個氨基酸的增加、刪除、插入、倒位或置換區(qū)別于野生型的MSP-1序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的病毒包括用于表達的適宜的啟動子，其中編碼msp-1的序列受控于該啟動子。在此該啟動子可以是MVA-啟動子，其中該啟動子可以是早期、中期或晚期的基因啟動子或其組合。然而，也包括在所使用的表達體系中能夠用于表達的非MVA啟動子。在此既可以使用組成型也可以使用誘導(dǎo)型的啟動子。對于大規(guī)模的蛋白生產(chǎn)在此可以使用較強的牛痘病毒啟動子，例如合成的晚期或早/晚啟動子或雜合牛痘苗/T7聚合酶體系；對于體內(nèi)誘導(dǎo)MHC-型I-限制性細胞毒性T細胞應(yīng)答可以優(yōu)選自然存在的早期或串聯(lián)早/晚啟動子。進一步，大腸埃希菌乳糖(E.colilac)抑制子/操縱子體系或雜合牛痘苗/T7-體系可用于基因表達的啟動；(MethodsinMolecularBiology，Volume62，HerausgeberRockyS.Tuan，HumanaPress，BroderundEarl，Seite176，mitweiterenNachweisen)。根據(jù)進一步的優(yōu)選實施方案，該病毒還包括選擇性標(biāo)記。該選擇性標(biāo)記在此適合用于以已知方式進行選擇和/或篩選。適宜的選擇性標(biāo)記在此包括例如大腸桿菌乳糖操縱子(E.colilacZ)體系，該選擇性體系使用大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)基因。此外可以使用改變病毒的宿主特異性的選擇方法(Staibetal.，2000)。可以使用本領(lǐng)域已知的其他選擇性標(biāo)記。根據(jù)進一步優(yōu)選的實施方案，所述核酸在5’末端與使用編碼信號肽序列的核苷序列融合。如由現(xiàn)有技術(shù)已知的，未檢測到來自惡性瘧原蟲的信號序列及錨定在哺乳動物細胞中的表達，或者沒有被正確地進行。(MoranundCaras，1994；Burghausetal.，1999；Yangetal.，1997)。胞內(nèi)開啟的選擇性控制問題通過使用人類信號序列“衰變加速因子”(DAF)(圖2)而被解決。適用的信號肽序列特異于高等真核細胞。除了“衰變加速因子”以外這些信號序列的實例為免疫球蛋白或者不同生長因子或細胞因子的信號肽(vonHeijne，1985)。根據(jù)優(yōu)選的實施方案信號肽序列控制基因產(chǎn)物例如細胞因子、抗體等的分泌。更進一步，優(yōu)選的信號序列導(dǎo)致基因產(chǎn)物的C末端的GPI錨定細胞表面，如在人類DAF的情形下。可供選擇地，優(yōu)選的肽序列可控制基因產(chǎn)物的膜永久性定位，如同M-同種型或者囊狀口腔炎病毒G蛋白的免疫球蛋白的情況。根據(jù)進一步優(yōu)選的實施方案，病毒也可以包括適宜的剪接供體位點以及剪接受體位點，以至于產(chǎn)生適當(dāng)?shù)募艚觤RNA，其適于在待治療的個體中進行翻譯。該核酸此外還含有一個適于作為核糖體結(jié)合位點的序列。根據(jù)本發(fā)明進一步的實施方案提供一種用于生產(chǎn)重組病毒的方法，該方法包括下述步驟a)使用轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)染真核宿主細胞，其中該轉(zhuǎn)移載體i)包含編碼惡性瘧原蟲MSP-1、片段或其突變蛋白的核酸，其中該突變蛋白通過一個或多個氨基酸的增加、刪除、插入、轉(zhuǎn)位或者置換而區(qū)別于MSP-1序列，且任選地包括選擇性標(biāo)記的編碼序列；且包括DNA序列，其作為啟動子用于控制所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄；ii)根據(jù)i)的核酸側(cè)面連接MVA序列5’端和/或3’端，其中該序列適用于在寄主細胞中與基因組MVA-DNA同源重組；b)使用基于MVA的病毒感染，優(yōu)選為MVA；c)在適于同源重組的條件下培養(yǎng)該寄主細胞；且d)分離基于MVA的重組病毒。寄主細胞優(yōu)選自RK13(兔子腎細胞)、BHK21(幼倉鼠腎細胞)或初期的CEF(小雞胚胎纖維細胞)。所述轉(zhuǎn)移載體可以是經(jīng)典的牛痘病毒轉(zhuǎn)移載體，其例如選自pGS20、pSC59、pMJ601、pSC65、pSC11、pCF11以及pTKgptFls或從中衍生的載體；參見MethodsinMolecularBiology，Volume62，siehevorstehend，BroderundEarl，第176頁及其中提到的參考資料，尤其是Earl，CooperundMoss(1991)inCurrentProtocolsinmolecularbiology(Ausubeletal.)，Wiley-Interscience，NewYork，Seiten16.15.1-16.18.10。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的已知條件進行轉(zhuǎn)染。在此所述核酸可以具有病毒核酸的修飾。根據(jù)i)的所述核酸側(cè)面連接MVA-序列或其互補序列5’端和/或3’端；優(yōu)選側(cè)面連接的MVA-序列是這樣的DNA序列，即其5’端和3’端分別為在MVA基因組中自然發(fā)生的刪除位點，例如刪除位點II、III或VI，如MeyerH.，SutterG，MayrA.(1991)，JGenVirol72，1031-1038或如從MVA病毒的完整的基因組序列(Antoineetal.1998，Virology244，365-396)顯示的。優(yōu)選轉(zhuǎn)移載體進一步包括選擇性標(biāo)記例如抗生素抗性或代謝標(biāo)記。理論上包括所有已知的選擇性標(biāo)記。為了有效地進行同源重組，待插入的側(cè)面連接核酸的MVA-DNA序列的長度分別至少應(yīng)為0.5Kb。使用已知技術(shù)用轉(zhuǎn)染載體對寄主細胞進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的條件使用MVA進行轉(zhuǎn)染(Staibetal.，2000)。根據(jù)選擇性(i)的序列內(nèi)的選擇性標(biāo)記進行重組MVA的分離。所述重組MVA病毒可以或者直接獲自培養(yǎng)寄主細胞的溶菌產(chǎn)物或者獲自培養(yǎng)物上清液。根據(jù)進一步的實施方案提供疫苗，其包括a)根據(jù)本發(fā)明的重組病毒；以及b)藥理學(xué)上相容的載體。在此適宜的藥理學(xué)上相容的載體是所有現(xiàn)有技術(shù)中已知的載體以及稀釋劑。假如意圖用于特定應(yīng)用形式，藥理學(xué)上相容的載體可以用已知技術(shù)進行挑選以及改變。疫苗可通過皮下、經(jīng)肌肉、經(jīng)靜脈、經(jīng)皮膚、經(jīng)腹膜內(nèi)或經(jīng)口服施用。該疫苗用于人類或動物的瘧疾的預(yù)防和/或治療。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，該疫苗可進一步含有MSP-1、其片段或其突變蛋白，其通過一個或多個氨基酸的增加、刪除、插入、倒位或置換而區(qū)別于惡性瘧原蟲MSP-1序列，和/或含有編碼前述序列的核苷酸。在此特別優(yōu)選重組產(chǎn)生MSP-1蛋白，尤其是在大腸桿菌中的重組體。編碼MSP-1或其突變蛋白的核酸優(yōu)選在其AT含量方面是減少的。尤其優(yōu)選的是描述自DE-19640817A1的核酸，其中特別是惡性瘧原蟲密碼子被人類密碼子所置換而不改變氨基酸序列。只要所述疫苗既包含重組病毒也包含MSP-1、其片段或其突變蛋白或者編碼核酸，該疫苗可以試劑盒的形式提供。其適于同時、順次或間隔給予疫苗的兩種成分。下述實施例解釋本發(fā)明但并不構(gòu)成對其的限制。圖1獲自惡性瘧原蟲的FCB-1以及MAD20株的MSP-1的一級結(jié)構(gòu)。序列上的箭頭表示天然蛋白的加工部位(Holderetal.，1987)，其將MSP-1分成片斷p83、p30、p38和p42，其以復(fù)合體形式錨定在寄主表面。在第二加工步驟將p42分成p33和p19。圖示下面的箭頭表示合成DNA序列的一次性存在的內(nèi)切酶切割位點。簡寫SP＝信號肽，GA＝GPI-錨圖2在使用重組MVA感染的HeLa-細胞中表達msp1d-38/42。使用rMVA-msp1d/38+42S或rMVA-msp1d/38+42A感染Hela細胞并隨后固定。在第二及第四行分別顯示固定后使用Triton-100進行通透化的細胞，而細胞的細胞膜在第一和第三行保持完整。如此經(jīng)處理的細胞使用mAk5.2和多克隆血清作為第一抗體進行孵育。所述mAk5.2識別一種在MSP-1片段p19的羧基末端特異于MSP-1構(gòu)象(性)表位。所述多克隆血清識別ER蛋白Sec61beta(抗ER標(biāo)記)。這些均使用Cy3-偶聯(lián)抗鼠-IgG(檢測mAk5.2)或FITC-偶聯(lián)抗兔IgG(檢測抗Sec61beta)進行有色標(biāo)記并隨后在共聚焦顯微鏡下進行分析。假如細胞使用rMVA-msp1d/38+42S或rMVA-msp1d/38+42A進行感染且被通透化，所述針對MSP-1D-38/42(mAk5.2)的信號會以ER標(biāo)記聚集顯示。假如細胞相反保持完整，MSP-1D-38/42僅僅在使用rMVA-msp1d/38+42A感染的情況下在被感染的細胞表面可檢測到。在此ER-標(biāo)記作為細胞膜完整狀況的監(jiān)視。簡寫ER＝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；mAk＝單克隆抗體。圖3借助免疫印跡證實經(jīng)重組MVA的感染的Hela細胞中的MSP-1D-42以及MSP-1D-38/42使用rMVA-msp1d/42S、rMVA-msp1d/42A、rMVA-msp1d/38+42S或rMVA-mspld/38+42A感染HeLa細胞A并過夜培養(yǎng)。上清液以及細胞碎片的樣品經(jīng)SDS凝膠電泳在非還原條件下進行分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并借助mAb5.2第一抗體進行辨認。只有由DAF-信號序列及相應(yīng)的MSP-1D-片段組成嵌合體可在被感染的細胞的上清液中被證實，而在所有使用MVA感染的細胞中的細胞內(nèi)表達提供一個信號。圖4使用rMVA-msp1d/42S或rMVA-msp1d/42A進行三次免疫接種及使用來自大腸桿菌的MSP-1D-HX42進行一次免疫接種后體液免疫應(yīng)答的發(fā)展在A中，借助ELISA的體液免疫應(yīng)答分析是使用純化自大腸桿菌的重組產(chǎn)生的MSP-1D-HX42作為抗原而展現(xiàn)的。曲線表示p42特異性抗體的發(fā)展，測量OD405＝1。小鼠分別以三周的間隔使用rMVA-msp1d/42S的106IU(第一次免疫，同時血液取樣S0)和108IU(笫一和第二加強劑量，同時采樣S1及S2)進行免疫。此外，四周后對小鼠使用于不完全的傅氏佐劑中的來自大腸桿菌的各5μgMSP-1D-HX42(血液采樣S3后一周)進行皮下注射。S0至S5代表血液采樣的時間點，且在此S0至S3分別以三周的間隔采樣，采樣S4及S5分別以四周的間隔進行。箭頭標(biāo)示免疫接種的時間點。星號表示使用來自大腸桿菌的MSP-1D-HX42進行第四次免疫接種。B表示針對使用rMVA-msp1d/42A進行免疫接種的相同分析。圖5使用rMVA-msp1d/S或rMVA-msp1d/83+30/38+42A組合使用來自大腸桿菌的MSP-1D免疫接種后體液免疫應(yīng)答的發(fā)展借助ELISA來確定在使用純化自大腸桿菌的重組產(chǎn)生的MSP-1D作為抗原的情形下的體液免疫應(yīng)答。如圖4所示，曲線顯示了MSP-1D特異性抗體的發(fā)展，以O(shè)D405＝1來測定。小鼠分別以三周的間隔(在圖中通過箭頭進行標(biāo)記)進行免疫接種。以組歸納的免疫接種策略如下組120μgMSP-1D(第0天)，108IUrMVA-msp1d/S(第21天)，5個小鼠組220μgMSP-1D(第0天)，108IUrMVA-msp1d/A(第21天)，5個小鼠組320μgMSP-1D(第0天)，108IUrMVA-msp1d/S(第21天)，20μgMSP-1D(第42天)，10個小鼠組420μgMSP-1D(第0天)，108IUrMVA-msp1d/S(第21天)，108IUrMVA-msp1d/S(第42天)，10個小鼠組520μgMSP-1D(第0天)，108IUrMVA-msp1d/83+30/38+42A(第21天)，20μgMSP-1D(第42天)，9個小鼠組620μgMSP-1D(第0天)，108IUrMVA-msp1d/83+30/38+42A(第21天)，108IUrMVA-msp1d/83+30/38+42A(第42天)，10個小鼠組720μgMSP-1D(第0天)，108IUrMVA-msp1d/A(第21天)，20μgMSP-1D(第42天)，5個小鼠。下面，導(dǎo)致以其表面錨定形式生產(chǎn)MSP-1的重組病毒以“A”標(biāo)記，而導(dǎo)致分泌MSP-1的那些以“S”標(biāo)記。表1產(chǎn)生于本發(fā)明范圍內(nèi)的病毒結(jié)構(gòu)體的完全列表感染細胞中MSP-1或其片段的產(chǎn)生以及蛋白的定位可以使用共焦顯微鏡方法證實，并示范性地展示通過rMVA-msp1d/38+42S和rMVA-msp1d/38+42A感染的HeLa細胞(圖2)。來源于使用重組MVA感染的細胞的所有MSP-1的分泌通過細胞上清液的免疫印跡分析證實，并在此示范性地展示用rMVA-msp1d/42S和rMVA-msp1d/38+42S進行的免疫接種(圖3)。隨后在小鼠上進行的免疫接種實驗中研究重組MVA在體液免疫應(yīng)答方面的免疫原活性。在此誘導(dǎo)針對msp-1重組MVA的高滴度抗體以對抗寄主蛋白，其通過ELISA確定。p42-特異性抗體滴度及觀察到的由重組MVA產(chǎn)生的表面錨定蛋白或分泌的蛋白的不同免疫潛力示范性地展示使用rMVA-msp1d/42S和rMVA-msp1d/42A進行的免疫接種(圖4)。引用文獻Aidoo，M.，Ulvani，A.，Whittle，H.C，Hill，A.V.，andRobson，K.J.(1997).RecombinantvacciniavirusesforthecharacterizationofPlasmodiumfalciparum-specificcytotoxicTIymphocytesrecognitionofprocessedantigendespiteIimitedre-stimulationefficacy.IntImmunol9，731-7.Allsopp，C.E.，Plebanski，M.，Gilbert，S.，Sinden，R.E.，Harris，S.，F(xiàn)rankel，G.，Dougan，G.，Hioe，C.，Nixon，D.，Paoletti，E.，Layton，G.，andHill，A.V.(1996).ComparisonofnumerousdeliverysystemsfortheinductionofcytotoxicTIymphocytesbyimmunization.EurJImmunol26，1951-9.Antoine，G.，Scheiflinger，F(xiàn).，Dorner，F(xiàn)，andFalkner，F(xiàn).G.(1998).ThecompletegenomicsequenceofthemodifiedvacciniaAnkarastrainComparisonwithotherOrthopoxviruses.Virology244，365-396.Chang，S.P.，Case，S.E.，Gosnell，W.L.，Hashimoto，A.，Kramer，KJ.，Tarn，L.Q.，Hashiro，C.Q.，Nikaido，C.M.，Gibson，H.L.，Lee-Ng，C.T.，Barr，P.J.，Yokota，B.T.，andHut，G.S.(1996).Arecombinantbaculovirus42-kilodaltonC-terminalfragmentofPlasmodiumfalciparummerozoitesurfaceprotein1protectsAotusmonkeysagainstmalaria.InfectImmun64，253-61.Daly，T.M.andLong，C.A.(1993).Arecombinant15-kilodaltoncarboxyl-terminalfragmentofPlasmodiumyoeliiyoelii17XLmerozoitesurfaceprotein1inducesaprotectiveimmuneresponseinmice.InfectImmmun61，2462-7.Degano，P.，Schneider，J.，Hannsn，C.M.，Gilbert，S.C.，andHill，A.V.(1999).GenegunintradermalDNAimmmunizationfollowedbyboostingwithmodifiedVacciniavirusAnkaraenhancedCD8+Tcellimmunogenicityandprotectiveefficacyintheinfluenzaandmalariamodels.Vaccine18，623-32.Egan，A.F.，Blackman，M.J.，andKaslow，D.C.(2000).VaccineefficacyofrecombinantPlasmodiumfalciparummerozoitesurfaceprotein1inmalaria-naive，-exposed，and/or-rechallengedAotusvociferansmonkeys.InfectImmun68，1418-27.Etlinger，H.M.，andAltenburger，W.(1991).Overcominginhibitionofantibodyresponsestoamalariarecombinantvacciniaviruscausedbypriorexposuretowildtypevirus.Vaccine9，470-2.Genton，B.，Al-Yaman，F(xiàn).，Anders，R.，Saul，A.，Brown，G.，Pye，D.，Irving，D.O.，Briggs，W.R.，Mai，A.，Ginny，M.，Adiguma，T.，Rare，L.，Giddy，A.，Reber-Liske，R.，Stuerchler，D.，andAlpers，M.P.(2000).Safetyandimmunogenicityofathree-componentblood-stagemalariavaccineinadultslivinginanendemicareaofPapuaNewGuinea.Vaccine18，2504-11.Gilbert，S.C.，Schneider，J.，Plebanski，M.，Hannan，C.M.，Blanchard，T.J.，Smith，G.L.，andHill，A.V.(1999).Tyvirus-likeparticles，DNAvaccinesandModifiedVacciniaVirusAnkara；comparisonsandcombinations.BiolChem380.299-303.Hirunpetcharat，C.，Tian，J.H.，Kaslow，D.C.，vanRooijen，N.，Kumar，S.，Berzofsky，J.A.，Miller，L.H.，andGood，M.F.(1997).Completeprotectiveimmunityinducedinmicebyimmunizationwiththe19-kllodaltoncarboxyl-terminalfragmentofthemerozoitesurfaceprotein-1(MSP1[19])ofPlasmodiumyoeliiexpressedinSaccharomycescerevisiaecorrelationofprotectionwithantigen-specificantibodytiter，butnotwitheffectorCD4+Tcells.JImmunol159，3400-11.Holder，A.A.，andFreeman，R.R.(1981).Immunizationagainstblood-stagerodentmalariausingpurifiedparasiteantigens.Nature，294，361-364.Holder，A.A.，Sandhu，J.S.，Hillman，Y.，Davey，L.S.，Nicholls，S.C.，Cooper，H.，andLockyer，M，J.(1987).ProcessingoftheprecursortothemajormerozoitesurfaceantigensofPlasmodiumfalciparum.Parasitology94，199-208.Kaslow，D.C.，Isa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