專利名稱：以葡萄為原料的酒的風味改善用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于改善以葡萄為原料的酒的風味的組合物。還涉及使用該組合物釀造以葡萄為原料的酒的方法，以及以葡萄為原料的酒。通過利用本發(fā)明，可以提供風味得到改善的以葡萄為原料的酒，例如具有優(yōu)良風味的葡萄酒。
背景技術(shù)：
市場上銷售著因原產(chǎn)地不同、釀造方法不同等而各具特有風味的各色葡萄酒。葡萄酒的風味一直很大程度地受到葡萄原料的品質(zhì)的左右。
另一方面，人們也試圖增加所含香氣成分的量，提供香氣豐富、即風味得到改善的葡萄酒。已知改善葡萄酒風味的方法之一，是在葡萄酒制造工藝中添加β-葡糖苷酶，通過該酶的作用來增強香氣的方法。
另外，麝香(muscat)系品種以及Riesling、Kelner等德國系品種的葡萄酒的特征性香氣成分—單萜類，在葡萄中大部分以二糖類的糖苷(α-L-阿拉伯呋喃糖基-β-D-吡喃葡糖苷、α-L-鼠李吡喃糖基-β-D-吡喃葡糖苷、芹菜呋喃糖基-β-D-吡喃葡糖苷)存在。
β-葡糖苷酶具有葡萄糖耐性低的性質(zhì)。因此，在葡萄酒的制造過程中，不能在原料中的葡萄糖濃度高的發(fā)酵工序之前使用，需要隨著發(fā)酵的進程，在葡萄酒原料中的葡萄糖濃度降低后的階段添加，使其作用。因此，應(yīng)用β-葡糖苷酶時，通常將該酶添加于發(fā)酵結(jié)束后的原料葡萄酒中(例如在racking工序(潷洗上清液的工序)添加)，使其作用。即，使用β-葡糖苷酶的方法中，在進行酶反應(yīng)時的制約大，不方便應(yīng)用。
另一方面，消費者的喜好越來越多樣化，對與原來不同風味的葡萄酒的需求增長。鑒于這樣的需求，需要開發(fā)基于與原有不同的機理來增強香氣成分的葡萄酒的制造方法。
本發(fā)明基于上述課題而做，其目的在于提供可用于改善葡萄酒所代表的以葡萄為原料的酒的風味的新型組合物。還提供風味得到改善的以葡萄為原料的酒的制造方法、以及風味得到改善的以葡萄為原料的酒。其它目的還在于提供不會引致制造工序復(fù)雜、以葡萄為原料的酒的制造方法，以及以葡萄為原料的酒。

發(fā)明內(nèi)容
基于以上目的，本發(fā)明人將以葡萄為原料的酒的代表葡萄酒作為模型，嘗試對其風味進行改善。即，首先將注意力集中于二葡糖苷酶的作用，想到將產(chǎn)生二葡糖苷酶的微生物的培養(yǎng)物作為風味改善用組合物使用。于是，在葡萄酒發(fā)酵工序中添加該組合物，使其作用，結(jié)果可有效地帶出原料中的香氣成分，制造出具有極優(yōu)良風味的葡萄酒。由此得到下述認識含有該二葡糖苷酶的組合物對葡萄酒等以葡萄為原料的酒的風味改善是有用的。另外，該組合物可以在以往的β-葡糖苷酶不能作用的發(fā)酵工序中作用，這自然說明是通過與β-葡糖苷酶不同的機理來改善風味，另外還認識到在發(fā)酵工序后除去酵母的同時可以除去該組合物等在制造工藝上有利的發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明基于所述認識而完成，其內(nèi)容如下。
以葡萄為原料的酒的風味改善用組合物，該組合物包含屬于曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、被孢霉屬(Mortierella)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)或游動放線菌屬(Actinoplanes)，且可生產(chǎn)二葡糖苷酶的菌株的培養(yǎng)物。
[1]所述的風味改善用組合物，其中上述菌株屬于黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)或Penicilliummulticolor。
[1]所述的風味改善用組合物，其中上述菌株為黑曲霉IFO4407、黑曲霉IAM 2020、煙曲霉IAM 2046或Penicillium multicolorIAM7153。
風味改善用組合物，該組合物含有Penicillium multicolorIAM7153生產(chǎn)的胞外酶。
[1]-[4]中任一項所述的風味改善用組合物，其中二葡糖苷酶活性換算成干燥重量為0.0001單位/mg以上。
以葡萄為原料的酒的制造方法，該方法包括使[1]-[5]中任一項所述的風味改善用組合物作用的酶處理工序。
[6]所述的制造方法，其中，上述酶處理工序包含在以葡萄為原料的酒的部分制造工序中添加上述風味改善用組合物而進行。
[7]所述的制造方法，其中，上述部分制造工序是選自除梗破碎工序、壓榨工序、發(fā)酵工序、移去皮渣工序和熟化工序中的一個或兩個以上的工序。
以葡萄為原料的酒的制造方法，其特征在于，在發(fā)酵工序和/或熟化工序中，添加[1]-[5]中任一項所述的風味改善用組合物。
[6]-[9]中任一項所述的以葡萄為原料的酒的制造方法，其中上述以葡萄為原料的酒是葡萄酒。
通過[6]-[10]中任一項所述的制造方法制造的以葡萄為原料的酒。
本說明書中，“風味的改善”作為包括風味增強的術(shù)語使用，是指以葡萄為原料的酒中存在的香氣成分的量增加，風味變得豐富。例如包括甜香和芳醇香味得到增強的狀態(tài)。另外，本說明書中的“風味的改善”也包括通過某種特定的香氣成分的量得到增強，間接地使對其它香氣成分的感受發(fā)生變化，從而使得所接受的整體香氣的印象有所變化。
另一方面，本說明書中，“常規(guī)的制造工序”是指不包括本發(fā)明的酶處理工序的以葡萄為原料的酒的制造工序。
另外，本說明書中如無特別說明，百分比(％)是指(W/V)％。
實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明之一涉及以葡萄為原料的酒的風味改善用組合物。本發(fā)明的風味改善用組合物(以下簡稱為“組合物”)可由培養(yǎng)可產(chǎn)生二葡糖苷酶的微生物而得到的培養(yǎng)液(包括菌體)來制備。作為可使用的微生物，可以例舉已證實具有二葡糖苷酶活性的曲霉屬、青霉屬、根霉屬、根毛霉屬、踝節(jié)菌屬、被孢霉屬、隱球酵母屬、微桿菌屬、棒桿菌屬、游動放線菌屬等。
作為更優(yōu)選的微生物，可以例舉黑曲霉(例如IFO 4407菌株(購自財團法人發(fā)酵研究所大阪市淀川區(qū)十三本町2-17-85)、IAM 2020菌株)、煙曲霉(例如IAM 2046菌株)、Penicillium multicolor(例如IAM7153菌株(購自東京大學(xué)分子細胞生物學(xué)研究所東京都文京區(qū)彌生1-1-1))。
作為特別優(yōu)選的微生物，為Penicillium multicolorIAM 7153菌株。這是因為來自Penicillium multicolor的β-半乳糖苷酶是刊載于食品添加劑目錄上的安全性得到確認的酶，可以推斷利用所述安全性高的菌得到的組合物，其也具有高的安全性。
為了使用上述各種微生物等來制備本發(fā)明的組合物，可適當設(shè)定適合該微生物培養(yǎng)的方法或條件。例如，作為上述各種菌株的培養(yǎng)方法，可以采用液體培養(yǎng)法、固體培養(yǎng)法的任一種方法，優(yōu)選液體培養(yǎng)法。液體培養(yǎng)例如可如下進行。
作為培養(yǎng)基，只要是產(chǎn)生二葡糖苷酶的微生物可以生長的培養(yǎng)基即可，可以是任何培養(yǎng)基。例如可以使用添加了葡萄糖、蔗糖、龍膽二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有機酸等碳源；以及硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、乙酸銨、或蛋白胨、酵母膏、玉米漿、酪蛋白水解物、麩、肉膏等氮源；還有鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等無機鹽的培養(yǎng)基。
而且，為了生產(chǎn)并富集二葡糖苷酶，可以向培養(yǎng)基中添加各種誘導(dǎo)物。作為誘導(dǎo)物，例如可使用糖類，優(yōu)選使用gentose(例如gentose#80、日本食品化工株式會社)、龍膽二糖、低聚龍膽糖(gentio-oligosaccharide)(例如低聚龍膽糖，和光純藥工業(yè)株式會社)、半乳甘露聚糖等。只要可使目標二葡糖苷酶的產(chǎn)率增加的量，這些誘導(dǎo)物的添加量沒有特別限定，優(yōu)選添加0.01-10％。
培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為例如約3-8，優(yōu)選約5-6左右，培養(yǎng)溫度通常為約10-50℃，優(yōu)選約25-30℃左右，在好氧條件下培養(yǎng)1-15天、優(yōu)選4-7天左右。作為培養(yǎng)方法，例如可利用振蕩培養(yǎng)法、通過小型發(fā)酵罐的好氧深層培養(yǎng)法。不過，上述各種培養(yǎng)條件等可以根據(jù)作為培養(yǎng)對象的微生物或細胞適當變化，只要是生產(chǎn)本發(fā)明的組合物的條件即可，其條件等沒有限定。
可由通過以上的方法培養(yǎng)一定時間后的培養(yǎng)液或菌體得到本發(fā)明的組合物。例如，過濾培養(yǎng)上清液，接著進行適當?shù)臐饪s、緩沖液置換、無菌過濾、冷凍干燥等，可制備本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的組合物的狀態(tài)可以是固體狀(包括粉末狀)，也可以是液體狀。
另外，例如也可以以二葡糖苷酶活性為指標，組合離心分離、UF濃縮、鹽析、離子交換樹脂等各種層析，按照常規(guī)方法處理，進行純化(參考文獻蛋白質(zhì)·酶的基礎(chǔ)實驗法、崛尾武一著、南江堂)。
其中，本發(fā)明的組合物中含有二葡糖苷酶。換言之，本發(fā)明的組合物具有二葡糖苷酶活性。優(yōu)選按干燥重量換算，具有0.0001單位/mg以上的二葡糖苷酶活性。二葡糖苷酶活性的上限值沒有特別限定，例如為20單位/mg。
本發(fā)明中，二葡糖苷酶是被分類為糖鏈水解酶的酶，是指可以以糖苷為底物，通過二糖單元識別底物并切斷，生成糖苷配基的酶，其中，所述糖苷是構(gòu)成糖苷的糖以外的化合物(以下稱為“糖苷配基”)與由單一或多種糖類構(gòu)成的直鏈和支鏈糖鏈經(jīng)由糖鏈的羥基而結(jié)合形成的。另外，這里所述的二葡糖苷酶活性是由下述方法求出的值。
(二葡糖苷酶活性測定方法)使用自動化學(xué)分析裝置(東芝社制、TBA-30R)，將30μl含有給定量的組合物的試樣溶液與200μl下述溶液混合對硝基苯(pNP)櫻草糖苷溶解于乙酸緩沖液(pH5.5)中使之達到2mM；在40℃以22.5秒循環(huán)周期反應(yīng)9.75分鐘，然后加入250μl碳酸鈉，測定412nm下的吸光度。來源于試樣溶液的空白測定是使用20mM乙酸緩沖液(pH5.5)代替底物溶液，進行同樣的測定。在該條件下，以吸光度提高1的酶量作為1單位(AU)。
上述pNP-櫻草糖苷的合成如下使用木糖苷酶(Sigma)作為酶，使pNP-葡糖苷(Merck)和低聚木糖(xylooligosaccharide)(和光純藥社制)反應(yīng)，通過β-1，6鍵將木糖的一個殘基轉(zhuǎn)移至pNP-葡糖苷上。
本發(fā)明的組合物優(yōu)選除二葡糖苷酶之外還含有α-L-鼠李糖苷酶。特別優(yōu)選鼠李糖苷酶活性按干燥重量換算為0.0001單位/mg以上。鼠李糖苷酶活性的上限值并沒有特別限定，例如為30單位/mg。α-L-鼠李糖苷酶是對存在于包括α-鼠李糖在內(nèi)的多糖的非還原末端的α-L-鼠李糖苷殘基進行水解的酶，這里的鼠李糖苷酶活性是由以下方法求出的值。
(鼠李糖苷酶活性測定方法)使用自動化學(xué)分析裝置(東芝社制、TBA-30R)，將30μl含有給定量的組合物的試樣溶液與200μl下述溶液混合對硝基苯(pNP)-α-鼠李糖苷(Sigma)溶解于乙酸緩沖液(pH5.5)中使之達到2mM；在40℃以22.5秒循環(huán)周期反應(yīng)9.75分鐘，然后加入250μl碳酸鈉，測定412nm下的吸光度，來源于試樣溶液的空白測定使用20mM乙酸緩沖液(pH5.5)代替底物溶液，進行同樣的測定。在該條件下，以吸光度提高1的酶量作為1單位(AU)。
本發(fā)明的另一方面涉及利用上述風味改善用組合物制造以葡萄為原料的酒的方法，其特征在于，包含使上述風味改善用組合物作用的酶處理工序(以下簡稱為“酶處理工序”)。
適合本發(fā)明的以葡萄為原料的酒的種類并沒有特別限定。本發(fā)明以葡萄為原料的酒以葡萄酒為代表，包括其蒸餾酒——法國白蘭地等白蘭地，苦艾酒(vermouth)或葡萄汁酒(port wine)、利口酒(liqueur)等混合酒。另外，葡萄酒包括紅葡萄酒、白葡萄酒、玫瑰葡萄酒、汽酒等各種葡萄酒。還包括之后稀釋或添加到其它食品中使用的濃縮狀態(tài)的葡萄酒。
優(yōu)選將本發(fā)明的酶處理工序與以葡萄為原料的酒的部分常規(guī)制造工序同時進行。這是因為無需另外設(shè)置酶處理工序，以實現(xiàn)制造效率的提高。
例如，紅葡萄酒的通常的制造工序包含葡萄的除梗破碎、發(fā)酵、壓榨、移去皮渣、熟化各工序，可以在添加本發(fā)明的組合物的狀態(tài)下進行這其中的任一個或多個工序。另外，白葡萄酒的通常的制造工序包含葡萄的除梗破碎、壓榨、發(fā)酵、移去皮渣、熟化各工序，可以在添加本發(fā)明的組合物的狀態(tài)進行這其中的任一個或多個工序。
如上所述，通過在添加本發(fā)明的組合物的狀態(tài)下進行部分以葡萄為原料的酒的制造工序，可以在該工序中同時進行原本的加工處理和由該組合物中含有的酶進行的酶處理。
其中，葡萄酒(包括紅、白、玫瑰)的場合，優(yōu)選選擇除梗破碎工序、壓榨工序、發(fā)酵工序、移去皮渣工序和/或熟化工序作為進行酶處理的工序。從加工溫度適合酶處理；當制造紅葡萄酒時，一部分果皮組織破碎，形成酶容易作用的狀態(tài)等理由考慮，特別優(yōu)選在發(fā)酵工序和/或熟化工序中添加本發(fā)明的組合物進行酶處理。
另外，如上所述，在添加本發(fā)明組合物的狀態(tài)下進行部分通常的制造工序時，不一定必須在該工序的最初階段添加該組合物，可以在該工序中的適當階段添加該組合物。這樣可以調(diào)節(jié)酶的作用時間，可以進行希望的風味改善。另外，進行酶處理時，可以調(diào)節(jié)該工序的加工溫度，以使酶反應(yīng)良好地進行。
另一方面，也可以將本發(fā)明的酶處理工序作為獨立的工序進行。與其它工序同時進行酶處理工序時，需要根據(jù)情況考慮添加酶對該其它工序的加工處理效率等的影響，但如果使酶處理工序獨立，則無需考慮上述影響。這意味著在酶處理工序中可以自由設(shè)定優(yōu)選的溫度條件、pH條件等，可有效地進行酶處理。
將酶處理工序作為獨立的工序進行時，例如可以在上述通常的制造工序(例如紅葡萄酒的葡萄去梗破碎、發(fā)酵、壓榨、移去皮渣、熟化各工序；白葡萄酒的葡萄去梗破碎、壓榨、發(fā)酵、移去皮渣、熟化各工序)的任意一個或多個工序之前或后進行酶處理工序。
優(yōu)選在酶處理工序之后的適當階段進行使用膨潤土等的過濾，進行熱處理等，進行添加的組合物的除去。所述除去工序可以用在以葡萄為原料的酒的通常的制造過程中進行的移去皮渣工序代行。
本發(fā)明的組合物的添加可通過將液體狀或固體狀(粉末狀)的組合物直接添加到葡萄破碎液(提取液、果汁)中來進行。
酶處理工序中的本發(fā)明的組合物的使用量可以考慮所用葡萄的種類、所需的風味改善程度、酶處理工序中葡萄破碎液的狀態(tài)等適當確定。例如在發(fā)酵工序前或發(fā)酵工序中添加酶進行酶處理時，可以是相對于使用160g葡萄得到的100ml葡萄破碎液，添加0.0026單位-26000單位的二葡糖苷酶的量。優(yōu)選二葡糖苷酶為0.026單位-2600單位，進一步優(yōu)選添加0.26單位-260單位的量。
另外，本發(fā)明的組合物的用量過少時，有可能不能充分獲得目標風味改善效果，相反過多時，則制造成本上升，并且由于組合物中存在的雜質(zhì)的作用和味道，可能反而有損風味，因而不能說是優(yōu)選。
添加本發(fā)明的組合物并使其作用時的溫度通常為4℃-40℃，優(yōu)選10℃-30℃，更優(yōu)選15℃-25℃。作用溫度比上述通常范圍低時，不能充分發(fā)揮組合物中酶的作用，難以獲得風味改善效果；比上述通常的范圍高時，組合物中的酶容易失活，同時葡萄破碎液中的成分受到熱變性，發(fā)生變性，有可能因此而使得風味變差。
另一方面，使本發(fā)明的組合物發(fā)生作用的pH通常為1.5-6.5，優(yōu)選2.0-5.5，更優(yōu)選2.5-4.5。發(fā)生作用的pH比上述通常的范圍低的場合或高的場合，不能充分發(fā)揮組合物中酶的作用，難以獲得風味改善效果，另外，葡萄破碎液中的成分容易受到變性，有可能因此而使得風味變差。
以下，例舉實施例，詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不只限定于這些實施例。
來自微生物的風味改善用組合物的制備(1-1)Penicillium multicolor IAM 7153菌株的培養(yǎng)將含有2.0％脫脂大豆、3.0％葡萄糖、0.5％磷酸二氫鉀、0.4％硫酸銨、0.3％干燥酵母的生長培養(yǎng)基(pH5.6)在121℃下滅菌20分鐘。相對于100mL滅菌后的培養(yǎng)基接種1接種環(huán)(エ-ゼ)的生產(chǎn)菌，在27℃以140min-1的振蕩速度進行預(yù)培養(yǎng)。5天后將20L含有1.0％SunFiber R、2.0％磷酸二氫鉀、1.0％硫酸銨、3.13％Myeast P1G的pH4.9的本培養(yǎng)基用30L容量的發(fā)酵罐(jar fermenter)，以150min-1攪拌，同時在121℃下滅菌20分鐘。將上述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基以1.5％(v/v)接種于該本培養(yǎng)基上，在攪拌數(shù)250min-1，通氣量0.75vvm(15L/min)，內(nèi)壓0.5kg/cm2(48kPa)，27±1℃下培養(yǎng)8天。
(1-2)由培養(yǎng)液制備風味改善用組合物向肉湯培養(yǎng)基(culture broth)中分別添加總液量的2％的ZemlightSuper 56M和Fine Flow A作為過濾輔助材料，進行硅藻土過濾。用超濾膜UF AIP-2020(MW6,000)進行20倍濃縮，同時用pH4.7的20mM乙酸緩沖液置換。將其無菌過濾、冷凍干燥，所得即為風味改善用組合物。
對葡萄酒的風味改善效果的評價(2-1)白葡萄酒用葡萄(北海道產(chǎn)、Kelner品種)果汁(葡萄破碎液)的制備德國系葡萄品種Kelner品種的果汁的制備按如下順序進行。首先，將12kg Kelner品種的葡萄果實(冷凍品)解凍，然后進行破碎、去梗處理。進行該處理時，添加780mg焦亞硫酸鉀，使其在最終所得果汁中的含量為100mg/L(榨汁率按65％計算)。接著采用SkinContact法進行果皮成分的提取(室溫、2小時)。之后用尼龍網(wǎng)布榨汁。結(jié)果得到7.5L果汁。對該果汁進行比重換算糖度測定，結(jié)果比重為1.0847，果汁轉(zhuǎn)化糖分為20.18。
(2-2)酒精發(fā)酵、酶處理以及成分等的分析酒精發(fā)酵如下進行首先將酵母(商品名UvafermBC，Novozymes制造)懸濁于40℃的溫水中，使之達到0.1g/ml，放置5分鐘，使其活化，然后將其中的15ml添加到果汁中。
按照以下表1所示的條件添加實施例1的風味改善用組合物來進行酶反應(yīng)。作為比較例，采用以增強白葡萄酒香氣為目的的市售的β-葡糖苷酶制劑代替風味改善用組合物進行酶反應(yīng)。


另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。β-葡糖苷酶的活性根據(jù)以下方法測定。
(β-葡糖苷酶活性測定法)使用自動化學(xué)分析裝置(東芝公司制造、TBA-30R)，將30μl含有規(guī)定量的組合物的試樣溶液與200μl將對硝基苯基(pNP)-β-葡糖苷(Sigma公司制)溶解于乙酸緩沖液(pH5.5)使之達到2mM得到的溶液混合，在40℃以22.5秒周期反應(yīng)9.75分鐘，然后加入250μl碳酸鈉，測定412nm下的吸光度。關(guān)于來源于試樣溶液的空白測定，使用20mM乙酸緩沖液(pH5.5)代替底物溶液，同樣進行測定。在該條件下，以使吸光度提高1的酶量作為1單位(AU)。
酶制劑的添加和酶反應(yīng)通過以下兩種方法進行。即，①將酶制劑的添加與酵母的添加同時進行，使酒精發(fā)酵與酶反應(yīng)并行的方法；以及②向果汁中添加酵母，進行酒精發(fā)酵，然后添加酶制劑進行酶反應(yīng)的方法。具體地說，前者的方法(上述①的方法)中，向果汁中添加酵母和酶制劑后，在20℃靜置7天，進行酒精發(fā)酵和酶反應(yīng)。而且，在添加后的第2天和第4天以及發(fā)酵結(jié)束時(第7天)進行取樣。將各樣品以3000rpm離心分離10分鐘，將得到的上清用于各種分析。分析項目為pH、酒精含量、滴定酸度(N/10氫氧化鈉)、感官評價和通過GC/MS對萜類香氣成分進行的定量。
另一方面，后者的方法(上述②的方法)中，只向果汁中添加酵母，在20℃靜置7天，進行發(fā)酵，然后添加酶，再在20℃靜置1個月(酶反應(yīng))。酶反應(yīng)結(jié)束后取樣。將各樣品以3000rpm離心分離10分鐘，將得到的上清用于各種分析。分析項目為一般成分(pH、酒精含量、滴定酸度(N/10氫氧化鈉))的分析、感官評價和通過GC/MS對萜類香氣成分進行的定量。
由①的方法(酒精發(fā)酵和酶反應(yīng)并行的方法)得到的樣品的一般成分(pH、酒精含量、滴定酸度(N/10氫氧化鈉))的分析結(jié)果如表2所示。


另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
確認添加風味改善用組合物，未見這些成分有大的變化。另外，除這些成分之外，還研究了多酚含量、比重、色調(diào)，也均未見大的變化(未顯示數(shù)據(jù))。以上結(jié)果表明，添加風味改善用組合物，一般成分幾乎不受影響，無需改變以這些成分為基準的品質(zhì)即可進行酶處理。
下面使用由①的方法得到的發(fā)酵結(jié)束時(第7天)的樣品進行感官評價，結(jié)果如表3所示。采用8位評價師，按照5級(評分5強、評分4稍強；評分3普通；評分2稍弱；評分1弱)對muscat系及德國系品種的葡萄酒中最受重視的萜香味的強度進行評價，給出各評價師的評分、評價師全體的總分、以及平均分。


另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
如表3所示，表明通過添加風味改善用組合物，萜香氣明顯增強。
接著在表4中表示通過GC/MS對萜類香氣成分的分析結(jié)果。



另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
如表4所示，關(guān)于橙花醇、香葉醇，與風味改善用組合物添加量的增加沒有聯(lián)動關(guān)系(由于是小規(guī)模試驗，推測在發(fā)酵中以及酶反應(yīng)中受到了氧化等的影響)，除此以外的香氣成分各含量均隨風味改善用組合物添加量的增加而增加。另外還證實各香氣成分含量的變化大致與添加開始后的天數(shù)也有聯(lián)動關(guān)系。另一方面，用添加量進行比較時，可知風味改善用組合物比市售的β-葡糖苷酶對香氣成分的增強更有效果。另外，表4的最下行表示用市售的德國葡萄酒測定各香氣成分的結(jié)果。
其次，酒精發(fā)酵后進行酶反應(yīng)時(上述②的方法)的感官評價試驗和GC/MS分析結(jié)果分別如表5和表6所示。感官評價試驗采用由評價師從添加風味改善用組合物得到的樣品和添加市售的β-葡糖苷酶制劑得到的樣品中選擇強烈感受到萜香味的樣品的方法。


關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
如表5所示，確認與添加市售的β-葡糖苷酶制劑的場合相比，添加風味改善用組合物的場合萜香味明顯增強。另外，兩者香味感覺不同，由此認為獲得了與添加現(xiàn)有的β-葡糖苷酶制劑所產(chǎn)生的香氣成分增強效果不同的新型的香氣增強效果。


關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
如表6所示，添加了風味改善用組合物的場合，各香氣成分的含量多，結(jié)果證明了上述感官評價。另外，添加風味改善用組合物時，檢測出了橙花醇，可知進行了與添加市售的β-葡糖苷酶制劑的場合本質(zhì)上不同的風味改善。
風味改善用組合物的添加量的研究、以及與其它酶制劑的比較為了進一步研究風味改善用組合物添加量與香氣成分增強效果的關(guān)系，集中于酶添加量，再次進行白葡萄酒的下料試驗。另外，該試驗中，對添加風味改善用組合物進行酶處理的樣品以及添加市售的β-葡糖苷酶制劑進行酶處理的樣品進行比較。表7中表示了所使用的風味改善用組合物和β-葡糖苷酶制劑的二葡糖苷酶活性(DGL)、鼠李糖苷酶活性(Rhm)和β-葡糖苷酶活性(Glc)。


(*)以pNP-β-櫻草糖苷為底物進行測定(**)以pNP-α-鼠李糖苷為底物進行測定(***)以pNP-β-吡喃葡糖苷為底物進行測定首先，按照與實施例2同樣的方法，以6kg Kelner果實為起始原料，制備Kelner果汁。所得果汁的比重為1.0794，果汁轉(zhuǎn)化糖分率為18.83。
分別取用于添加各種酶的果汁，然后分別添加酵母(商品名UvafermBC，Novozymes制造)，接著添加各酶制劑。酵母中加入水，使之達到0.1g/ml，在40℃放置5分鐘使其活化，然后將15mL添加到果汁中。另外，各酶制劑的添加是將各酶制劑溶解于水中，使其達到規(guī)定的添加量，以水溶液的狀態(tài)添加。各酶制劑的添加量和下料量如下表8所示。


另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
將添加了酵母和酶制劑后的果汁在20℃下靜置，進行酒精發(fā)酵和各酶反應(yīng)。發(fā)酵結(jié)束時(第6天)分別取樣20ml。將各樣品以3000rpm離心分離10分鐘，使用得到的上清進行一般成分(滴定酸度(N/10氫氧化鈉溶液)、pH、酒精含量)和香氣成分的分析以及感官評價。
香氣成分量的分析使用TDS熱脫附系統(tǒng)/Agilent GC/MSD系統(tǒng)(GERSTEL公司制)。柱使用HP-INNO Wax聚乙二醇(30.0m×250μm×0.25μm)的柱，移動相為氦，流速1.0ml/min，氣化溫度為40℃、5分鐘→(5℃/min)→240℃、15分鐘，分流比為1∶50。另外，向10mL樣品中加入2.0g NaCl、內(nèi)標物(4-壬醇5μg)，加入Twister(攪拌子；GERSTEL公司)，攪拌30分鐘，然后開始分析。另外，測定的香氣成分(單萜烯醇類)和定量中使用的m/z值如下。
內(nèi)標物4-壬醇(m/z＝101)芫荽醇(m/z＝93)α-松油醇(m/z＝121)香茅醇(m/z＝123)橙花醇(m/z＝93)香葉醇(m/z＝123)另外，定量用的系數(shù)(factor)是向0.5％蘋果酸溶液中加入～1000ppb的單萜烯醇類，與試樣同樣進行分析而求出。
下述表9中顯示了使用發(fā)酵結(jié)束時的各樣品進行的滴定酸度(N/10氫氧化鈉溶液)、pH、酒精含量的分析結(jié)果。


另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
添加風味改善用組合物的場合，各成分值沒有大的變化。另外，也沒有因添加量的不同而導(dǎo)致各成分值產(chǎn)生大的變動。由以上結(jié)果可以確認，可通過風味改善用組合物進行酶處理，對作為測定對象的一般成分幾乎不產(chǎn)生影響，即，不改變以這些一般成分為基準的品質(zhì)，即可通過風味改善用組合物進行酶處理。
接著，將香氣成分量的分析結(jié)果表示在表10中。



另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
如表10所示，確認添加了風味改善用組合物的場合，各香氣成分的含量大致與添加量的增加聯(lián)動而增加。
使用發(fā)酵結(jié)束后的樣品進行的感官評價試驗采用10位評價師進行。將包括口中香氣在內(nèi)的萜類香味的強度用5個等級(評分5強；評分4稍強；平分3普通；評分2稍弱；評分1弱)進行評價，給出了各評價師的評分、評價師全體的總分及平均分。感官評價試驗的結(jié)果如表11所示。


另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
在添加了風味改善用組合物的組中，與對照(未添加酶)相比較，得到了萜類的香味大致同等或增強的評價。添加量為3.9單位時，比對照低，未得到足夠的香氣成分增強效果。另一方面，添加量為7.8單位時，評價明顯比對照高，可知得到了足夠的香氣成分增強效果。而且，在添加量為較多的39單位時，可以確認香氣成分進一步增強。以上顯示，如果其添加量至少有7.8單位，則通過添加風味改善用組合物可得到香氣成分增強的效果。
對紅葡萄酒的風味改善效果的評價對紅葡萄酒的風味改善效果按以下順序評價。首先，準備市售的紅葡萄酒(法國產(chǎn)Bordeaux Superieur(國分株式會社進口))，按照以下表12所示的條件添加實施例1的風味改善用組合物，在20℃下使之作用9天。之后將各樣品以3000rpm離心分離10分鐘，使用得到的上清進行香氣成分的分析。另外，作為比較例，使用以增強白葡萄酒的香氣為目的的市售的β-葡糖苷酶制劑。


香氣成分量的分析使用Headspace(HP7694 Headspace sampler，Alilent technologies公司制)-GC/MSD(HP5973GC/HP6890MSD，Agilent technologies公司制)系統(tǒng)。柱使用HP-WAX(60m×250μm×0.25μm)，移動相為氦，流速為1.0mL/min。將分析樣品裝入小瓶中，在85℃加熱20分鐘，然后對氣體取樣，以分流比25∶1注入GC/MS。將初期的烘箱在35℃下保持5分鐘，以5℃/min的速度升溫至100℃，然后再以10℃/min的速度升溫至230℃，保持10分鐘。
另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-葡糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
分析結(jié)果如表13所示。


另外，關(guān)于酶制劑的添加量，在添加風味改善用組合物的組中，用所添加的組合物中含有的二葡糖苷酶活性量表示。同樣，在添加β-葡糖苷酶制劑的組中，用所添加的β-萄糖苷酶制劑中含有的β-葡糖苷酶活性表示。
另外，表中的未添加表示以未添加風味改善用組合物的狀態(tài)同樣進行處理(20℃下放置9天)得到的樣品的分析結(jié)果。表13只表示了相對于該未添加(對照)發(fā)生變化的成分。各峰中，上行表示峰面積，下行表示相對于未添加的面積比?？芍ㄟ^使風味改善用組合物作用，已知作為前體以糖苷的形式存在的香氣成分中，苯甲醛、水楊酸甲酯和苯甲醇的含量顯著增加。另外，可知除此以外，丙酸乙酯、辛酸乙酯這些酯等也增加。另一方面，作為比較例的使β-葡糖苷酶作用的場合，確認雖然也有幾種成分增加，但其增加的程度低。另外，使風味改善用組合物作用的場合，香味呈現(xiàn)花樣的甜味，確認進行了香氣的改善(未顯示數(shù)據(jù))。
由以上各實施例結(jié)果可以確認，在葡萄酒制造工序中，使本發(fā)明的風味改善用組合物作用，是對葡萄酒的香氣成分進行改善的有效手段。另外，本發(fā)明的風味改善用組合物作用于作為葡萄酒原料的葡萄果汁中的成分，可帶出香氣，因此不僅對上述作為實例使用的白葡萄酒和紅葡萄酒，對于玫瑰葡萄酒等其它葡萄酒自然同樣發(fā)揮效果，對于其他以葡萄為原料的酒的制造，本發(fā)明的風味改善用組合物作為增強其香氣成分的手段也可以說是有效的。
以下公開下述事項。
(11)權(quán)利要求1-4中任一項的風味改善用組合物，其中鼠李糖苷酶活性按干燥重量換算為0.0001單位/mg以上。
(21)以葡萄為原料的酒的制造方法，包含使二葡糖苷酶作用的酶處理工序。
(22)(21)的制造方法，其中上述酶處理工序包括在部分以葡萄為原料的酒的制造工序中添加二葡糖苷酶而進行。
(23)(22)的制造方法，其中上述部分制造工序為選自壓榨工序、發(fā)酵工序、移去皮渣工序和熟化工序中的一個或兩個以上的工序。
(24)以葡萄為原料的酒的制造方法，其特征在于，在發(fā)酵工序和/或熟化工序中添加二葡糖苷酶。
(25)(21)-(24)中任一項的制造方法，其中上述二葡糖苷酶來自微生物。
(26)(21)-(24)中任一項的制造方法，其中上述二葡糖苷酶來自Penicillium multicolor。
(27)(21)-(24)中任一項的制造方法，其中上述二葡糖苷酶來自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。
(28)(21)-(27)中任一項的以葡萄為原料的酒的制造方法，其中上述以葡萄為原料的酒是葡萄酒。
(29)以葡萄為原料的酒，通過(21)-(28)中任一項的制造方法制造。
(30)以葡萄為原料的酒，通過二葡糖苷酶的作用，風味得到改善。
(31)葡萄酒，通過二葡糖苷酶的作用，風味得到改善。
(41)以葡萄為原料的酒的制造方法，包含使二葡糖苷酶和鼠李糖苷酶作用的酶處理工序。
(42)(41)的制造方法，其中上述酶處理工序包括在部分以葡萄為原料的酒的制造工序中添加二葡糖苷酶和鼠李糖苷酶而進行。
(43)(42)的制造方法，其中上述部分制造工序為選自壓榨工序、發(fā)酵工序、移去皮渣工序和熟化工序的一個或兩個以上的工序。
(44)以葡萄為原料的酒的制造方法，其特征在于，在發(fā)酵工序和/或熟化工序中添加二葡糖苷酶和鼠李糖苷酶。
(45)(41)-(44)中任一項的制造方法，其中上述二葡糖苷酶來自微生物。
(46)(41)-(44)中任一項的制造方法，其中上述二葡糖苷酶和鼠李糖苷酶來自Penicillium multicolor。
(47)(41)-(44)中任一項的制造方法，其中上述二葡糖苷酶和鼠李糖苷酶來自煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。
(48)(41)-(47)中任一項的以葡萄為原料的酒的制造方法，其中上述以葡萄為原料的酒是葡萄酒。
(49)以葡萄為原料的酒，通過(41)-(48)中任一項的制造方法制造。
(50)以葡萄為原料的酒，通過二葡糖苷酶和鼠李糖苷酶的作用，風味得到改善。
(51)葡萄酒，通過二葡糖苷酶和鼠李糖苷酶的作用，風味得到改善。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，可提供因香氣成分增強而使風味得到改善的以葡萄為原料的酒。特別是與以往使用的市售β-葡糖苷酶制劑對風味進行改善的情況相比，可以提供風味更好的以葡萄為原料的酒。
另外，通過本發(fā)明的組合物的使用量，可以調(diào)節(jié)香氣成分的增強程度，可提供具有各種香氣平衡的以葡萄為原料的酒。
而且，本發(fā)明的組合物還可以在發(fā)酵工序前或發(fā)酵工序中添加、使其作用。即，添加時期的制約少，在制造工序上利于。如果在發(fā)酵工序前或發(fā)酵工序中添加使用，在除去酵母的同時，也可除去本發(fā)明的組合物，起到簡化制造工序、降低制造成本等效果。
權(quán)利要求
1.以葡萄為原料的酒的風味改善用組合物，其包含屬于曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、被孢霉屬(Mortierella)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)或游動放線菌屬(Actinoplanes)，且可生產(chǎn)二葡糖苷酶的菌株的培養(yǎng)物。
2.權(quán)利要求1的風味改善用組合物，其中，上述菌株屬于黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)或Penicilliummulticolor。
3.權(quán)利要求1的風味改善用組合物，其中，上述菌株為黑曲霉IFO4407、黑曲霉IAM 2020、煙曲霉IAM 2046或Penicillium multicolorIAM7153。
4.風味改善用組合物，其含有Penicillium multicolor IAM7153生產(chǎn)的胞外酶。
5.權(quán)利要求1的風味改善用組合物，其中二葡糖苷酶活性按干燥重量換算為0.0001單位/mg以上。
6.以葡萄為原料的酒的制造方法，包括使權(quán)利要求1的風味改善用組合物作用的酶處理工序。
7.權(quán)利要求6的制造方法，其中上述酶處理工序包含在以葡萄為原料的酒的部分制造工序中添加上述風味改善用組合物而進行。
8.權(quán)利要求7的制造方法，其中，上述部分制造工序是選自去梗破碎工序、壓榨工序、發(fā)酵工序、移去皮渣工序和熟化工序中的一個或兩個以上的工序。
9.以葡萄為原料的酒的制造方法，其特征在于，在發(fā)酵工序和/或熟化工序中添加權(quán)利要求1的風味改善用組合物。
10.權(quán)利要求6的以葡萄為原料的酒的制造方法，其中，上述以葡萄為原料的酒是葡萄酒。
11.以葡萄為原料的酒，通過權(quán)利要求6的制造方法制造。
全文摘要
本發(fā)明提供可用于改善葡萄酒所代表的以葡萄為原料的酒的風味的新型組合物。一種以葡萄為原料的酒的風味改善用組合物，其包含屬于曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、被孢霉屬(Mortierella)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)或游動放線菌屬(Actinoplanes)，且可生產(chǎn)二葡糖苷酶的菌株的培養(yǎng)物。
文檔編號C12H1/00GK1662641SQ03814018
公開日2005年8月31日 申請日期2003年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月16日
發(fā)明者鶴喰壽孝, 天野仁, 森茂治, 后藤奈美, 荒卷功, 藤田晃子 申請人:天野酶株式會社, 獨立行政法人酒類綜合研究所