專利名稱：流量控制的磁性顆粒處理的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于磁響應(yīng)顆粒(在此被稱為“磁性顆粒”)的磁性收集系統(tǒng)，以及其后的顆粒受控分散。特別是，本發(fā)明涉及通過目標(biāo)物質(zhì)與磁性顆粒的選擇性交互作用，對目標(biāo)物質(zhì)例如化學(xué)物質(zhì)和/或生物物質(zhì)如生物化學(xué)制品、細(xì)胞、細(xì)胞成分、細(xì)菌、病毒、毒素、核酸、荷爾蒙、蛋白質(zhì)、受體-配體的絡(luò)合物、其它絡(luò)合分子，或以上組合進(jìn)行檢測、隔離、分離和/或處理。所用的磁性顆粒能夠從介質(zhì)中分離，并隨后能再懸浮以便進(jìn)一步分析、隔離或用于其它用途。
背景技術(shù)：
作為本發(fā)明的背景，涉及在流體介質(zhì)中如體液、培養(yǎng)液或環(huán)境樣本中識別、分離和/或處理目標(biāo)實(shí)體如細(xì)胞或微生物的許多技術(shù)已為人所知并被用于現(xiàn)有工藝。人們已經(jīng)注意到這些技術(shù)常常需要多個清洗和粘合步驟。在許多這樣的技術(shù)中由繁重的手工吸液和移注步驟或通過使用大型的、非現(xiàn)場便攜式的自動機(jī)器人系統(tǒng)來實(shí)施這些步驟。這樣的識別、分離和/或處理技術(shù)可能會涉及如分析樣本以確定是否存在具體的污染物、毒素或其它物質(zhì)，并且如果存在的話，確定存在的量；從樣本中提取具體的目標(biāo)物質(zhì)，如核酸片段、蛋白質(zhì)、酶或其它類似物質(zhì)以便隨后的處理或使用；或用于其它類似目的。人們已經(jīng)注意到為了提供精確且有用的信息或?yàn)榱嗽诟綦x技術(shù)中提供合適的試樣，這種技術(shù)常常必須具有顯著的靈敏度，尤其是當(dāng)目標(biāo)物質(zhì)以痕量存在時。
涉及分離、隔離或其它處理痕量有機(jī)分子的一種技術(shù)的實(shí)例為用抗體作為分析試劑的免疫測定技術(shù)。人們已經(jīng)了解免疫測定的原理?？贵w通過遵循特定的交互作用識別具體的分析物。對于低分子量的分析物，如藥物或代謝物，習(xí)慣上進(jìn)行競爭免疫測定。典型地，允許固定的、有限量的特定抗體與已知濃度的標(biāo)記分析物和可能含有一些未知濃度的那種分析物的樣本一起培養(yǎng)。與抗體相關(guān)的標(biāo)記的量與測試樣品中的分析物的量成反比。
盡管有許多免疫測定技術(shù)，只有少數(shù)被廣泛應(yīng)用。其中有間接技術(shù)，其通過與一種免疫試劑共軛的標(biāo)記物種來測量分析物。為了定量，習(xí)慣上進(jìn)行結(jié)合/自由分離，使得能夠檢測到與抗體相關(guān)的被標(biāo)記的分析物。如果免疫反應(yīng)的成分之一被固定在固相上(非均勻化驗(yàn))，實(shí)驗(yàn)方法被簡化。涉及分析物與酶標(biāo)記分析物和抗體的競爭結(jié)合的非均勻免疫測定被稱為酶聯(lián)免疫吸附化驗(yàn)(ELISA)。
對于具有至少兩種可區(qū)別的抗原定子的分析物，一種更簡單更精確的方法就是進(jìn)行夾心免疫測定，其用針對一種抗原位點(diǎn)的第一抗體作為捕獲抗體，并用針對另一特征定子的第二抗體作為信號產(chǎn)生抗體。因此，如果從溶液中分離捕獲抗體或?qū)⑵浣Y(jié)合在某種固體載體上，能夠?qū)⑿盘柨贵w結(jié)合在固體載體上或從溶液中分離的唯一方法就是通過分析物。夾心測試的優(yōu)點(diǎn)為(1)信號與分析物曲線的低端的分析物濃度直接成比例；(2)在低濃度端可以獲得極高的靈敏度；(3)夾心化驗(yàn)是“過量”化驗(yàn)，因?yàn)椴东@抗體和標(biāo)記抗體的量通常都超過了分析物的量，因此誤差主要與樣品輸入有關(guān)；以及(4)可能進(jìn)行寬范圍(范圍寬至104～105)的動態(tài)分析物檢測。夾心化驗(yàn)技術(shù)，與競爭化驗(yàn)相似，采用了寬范圍的系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)合/自由分離。通常在這樣的化驗(yàn)中，所關(guān)心的分析物的抗體以很高的精度放置在固體載體上，以允許分析物在結(jié)合抗體上發(fā)生結(jié)合。接著，加入溶液，其使未結(jié)合的和非特定結(jié)合的分析物從結(jié)合區(qū)離開。然后加入第二被標(biāo)記的抗體，加入溶液以清洗未結(jié)合的第二抗體。如果第二抗體是用酶標(biāo)記的，則加入酶基體以產(chǎn)生可檢測信號(如變色、熒光、導(dǎo)電率改變)，其與特定結(jié)合的酶(因此和分析物)的量成比例。
用特定的固定在固相上的結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合/自由分離有許多途徑，如利用吸附在試管內(nèi)側(cè)或與試管內(nèi)側(cè)共價相連的抗體(覆蓋試管化驗(yàn))，或者，更新的，利用固定在可移動的固相上如可浸沒在液體中并隨后能被抽出的伸長結(jié)構(gòu)，或是小珠，其能夠用過濾器或磁性進(jìn)行離心或分離。典型地，分離系統(tǒng)應(yīng)該具有這樣的特點(diǎn)即可以輕松進(jìn)行分離，可以輕松去除過量試劑，以及非特定結(jié)合分析物能夠被清洗，同時不能清洗掉固定的抗體及其特定結(jié)合的標(biāo)記分析物。
通過不同的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)如上所述的化驗(yàn)中的信號或輻射能響應(yīng)的檢測。實(shí)例之一就是熒光標(biāo)記的抗體、分析物或其它可能與分析物有關(guān)的小分子的熒光檢測。如果系統(tǒng)成分不受被檢測的放射性輻射的影響，還可以進(jìn)行放射性檢測。脂質(zhì)體中可能含有的與抗體或分析物相關(guān)的染料的比色檢測也是可能的?；瘜W(xué)發(fā)光的、生物發(fā)光的、電化學(xué)發(fā)光的或酶的檢測也是可能的，只要在結(jié)合/自由分離之后可以獲得檢測反應(yīng)所用的基體即可。因此，有多種方法可以獲得可讀信號或其它輻射能響應(yīng)。
使用固定結(jié)合物質(zhì)的一大問題就是化學(xué)選擇表面的壽命有限，特別是那些包括生物分子(通常被稱為“生物傳感器”)的表面。室溫下水溶液中的許多生物分子會隨時間化學(xué)降解，通常只有幾小時到約一周的壽命。因此，將生物傳感器表面連續(xù)長時間地浸泡在水溶液中使用是不可行的。溶液的成分也會影響生物傳感器的壽命。生物分子的結(jié)構(gòu)和功能以及生物材料對于環(huán)境條件如鹽濃度、pH和溫度，敏感。溶液成分和溫度的改變能夠不可逆地改變蛋白質(zhì)的本性，使得它們不再結(jié)合特定的配合體。在傳感器系統(tǒng)中使用整個細(xì)胞也面臨著問題，因?yàn)榧?xì)胞需要正確混合代謝物以保持其能生存，并且溶液成分和溶液的流速也影響活細(xì)胞的生長速度。許多生物特殊交互作用的專一性以及因此不可逆的特性也限制了生物傳感表面的壽命。選擇性交互作用，如抗體-抗原交互作用在幾分鐘的時間內(nèi)基本不可逆?？赡苄枰褂每量痰脑噭﹣砣コY(jié)合抗原(和非特定結(jié)合分子)；但是，這降低了抗體自身隨后的結(jié)合活性，使得再生的傳感表面不如新鮮傳感表面有效，消極影響了化驗(yàn)精度和可靠性。而且，由于樣本基體中的材料非特定結(jié)合在生物傳感器表面上導(dǎo)致傳感器表面“結(jié)垢”，經(jīng)常使得生物傳感器的壽命有限。
這些問題導(dǎo)致了生物傳感中可再生表面的大量使用，其中化學(xué)選擇性的化學(xué)變化發(fā)生在小顆粒的表面。衍生顆粒的新鮮等分試樣因此能用于每次分析。在這樣的分析之后，衍生顆?？梢詮南到y(tǒng)中沖洗掉，并用新的顆粒進(jìn)行隨后的分析。
當(dāng)衍生顆粒是磁性顆粒時，用磁性分離或較大梯度磁性分離(HGMS)可以在分析過程中將顆粒從介質(zhì)中隔離。在本文中，術(shù)語“磁性的”是指顆粒的一種性能，通過給它施加一個磁場可以在其上施加一個力。在磁性分離中，相對較大尺寸的顆粒(如直徑大約為0.5微米或更大的顆粒)被捕獲或分離，而在較大梯度磁性分離中，較小的顆粒如膠體磁性顆粒，被分離。
在過去的幾年間，亞毫米級的自動流動分析器和化學(xué)檢測器芯片已經(jīng)達(dá)到了商業(yè)化需要的技術(shù)水平。為了獲得更緊湊的診斷分析器以用于自動免疫測定、DNA凈化和放大、細(xì)胞分離、環(huán)境污染物檢測和其它類似用途的，研發(fā)還在繼續(xù)。
根據(jù)這一背景，有進(jìn)一步研發(fā)用于磁性顆粒的磁性選擇以及隨后受控制的顆粒再懸浮的系統(tǒng)的需要。特別是，需要進(jìn)一步研發(fā)通過目標(biāo)物質(zhì)與磁性顆粒的選擇性交互作用進(jìn)行特殊檢測、隔離、分離和/或處理目標(biāo)物質(zhì)的系統(tǒng)，所用的磁性顆粒能夠從介質(zhì)中分離，并隨后能夠再懸浮以便進(jìn)一步分析、隔離或用于其它用途。本發(fā)明即針對這些需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了在一種或多種流體介質(zhì)中進(jìn)行磁性顆粒分離和再懸浮的新系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，通過控制經(jīng)過捕獲區(qū)的流體流動的速度來控制磁性顆粒的捕獲和釋放，該捕獲區(qū)穿過一個固定的磁場。以低流速穿過捕獲區(qū)時，可重復(fù)并定量地捕獲顆粒。以高流速穿過捕獲區(qū)時，可以將顆粒從磁場中轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明提供了這樣的系統(tǒng)，其通過在目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合在磁性顆粒上的過程中和之后提供處理磁性顆粒的方法，促進(jìn)了目標(biāo)物質(zhì)的隔離。如果需要，隨后可用一種或多種檢測或分析系統(tǒng)如發(fā)光檢測器、分光光度分析、熒光計、質(zhì)譜儀、流動血細(xì)胞計數(shù)器、血液分析器，或其它細(xì)胞計數(shù)或分析裝置測試目標(biāo)物質(zhì)。
本文所用的術(shù)語“目標(biāo)物質(zhì)”指的是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)或環(huán)境學(xué)所關(guān)心的許多不同的物質(zhì)，他們可以單獨(dú)或分組測量。實(shí)例包括細(xì)胞、真核的(例如白血球、紅血球或真菌類)和原核的(例如細(xì)菌、原生動物或支原體)、病毒、細(xì)胞成分、分子(例如蛋白質(zhì))、大分子(例如核酸-RNA，DNA)及化學(xué)制品(例如殺蟲劑、除草劑、炸藥)。與細(xì)胞相關(guān)的目標(biāo)物質(zhì)包括，例如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的成分。在這些與細(xì)胞相關(guān)的結(jié)構(gòu)中有膜結(jié)合蛋白質(zhì)或醣蛋白，包括主細(xì)胞或病毒源的細(xì)胞表面的抗原，組織相容性抗原，或膜受體。這些目標(biāo)物質(zhì)可以作為離散實(shí)體或以復(fù)合體或集合體的形式被結(jié)合。通過本發(fā)明的方法可以實(shí)現(xiàn)這樣的分離，其依賴于結(jié)合物質(zhì)與至少一種特征目標(biāo)物質(zhì)或所關(guān)心的分析物的交互作用。
目標(biāo)物質(zhì)與磁性顆粒的結(jié)合由磁性顆粒的表面化學(xué)性質(zhì)控制。磁性顆粒的化學(xué)性質(zhì)可用于通過非特定的交互作用如靜電交互作用，范德華交互作用，偶極子-偶極子交互作用和/或氫鍵交互作用，結(jié)合目標(biāo)物質(zhì)。例如，當(dāng)需要隔離樣品中所有的或幾乎所有的帶正電的蛋白質(zhì)時，根據(jù)本發(fā)明，利用帶負(fù)電的磁性小珠即可實(shí)現(xiàn)。相似地，帶正電的磁性小珠可用于結(jié)合樣品中所有的或幾乎所有的DNA(其帶負(fù)電)。另一種選擇是，磁性顆?？梢越?jīng)過化學(xué)改性以包括特定的結(jié)合物質(zhì)，其與目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生選擇性的交互作用。根據(jù)本發(fā)明，可用于結(jié)合物質(zhì)的代表性實(shí)例包括抗原、抗體、蛋白質(zhì)受體、配位體、低聚核苷酸、鏈?zhǔn)娇股锼氐鞍住⒖股锼氐鞍?、生物素和外源凝集素。用于與目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生選擇性交互作用的一類特定的結(jié)合物質(zhì)為能夠免疫具體識別抗原的抗體類。本文所用術(shù)語“抗體”包括免疫球蛋白、單細(xì)胞系的或多細(xì)胞系的以及免疫反應(yīng)的免疫球蛋白片段。因此，特征目標(biāo)物質(zhì)及其特定結(jié)合物質(zhì)為受體—荷爾蒙，受體—配合體、促效藥—拮抗劑、RNA或DNA低聚體—互補(bǔ)序列、鼠免疫免疫球蛋白的局部受體—蛋白質(zhì)A，抗生物素蛋白—生物素、以及病毒-受體。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，用本發(fā)明的方法可以確定其它的特定結(jié)合對組合是顯而易見的。
當(dāng)用于免疫測定時，本發(fā)明提供了很高的靈敏度，但系統(tǒng)收集分析物的范圍還相對較小。用少量來實(shí)現(xiàn)相對低成本的分析物的測試，對于所有需要的結(jié)合、清洗以及混合步驟而言，收集和再懸浮的速度和重現(xiàn)性是重要特征。當(dāng)用于免疫測定或其它這樣的分析時，本發(fā)明有可能使各種樣品的量顯著減少，從而獲得目標(biāo)實(shí)體的更高的濃度，因此允許用更短的分析時間。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)無需移動、倒轉(zhuǎn)或減小用于捕獲磁性顆粒的磁場。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了從含有磁性顆粒的非磁性的載體介質(zhì)中分離磁性顆粒并隨后使分離出的磁性顆粒在合適的分散介質(zhì)中再懸浮的方法。載體介質(zhì)和分散介質(zhì)可以相同或不同。該方法最初涉及提供流體流動通道，其延伸穿過磁場源，并將載體介質(zhì)/磁性顆?；旌衔镆肓黧w流動通道。一個磁場與流體流動通道相交，并在混合物流經(jīng)捕獲區(qū)時，以預(yù)定的捕獲速度捕獲流體流動通道中的磁性顆粒。只有當(dāng)相同或不同的介質(zhì)以更高的速度流經(jīng)捕獲區(qū)、有效地從捕獲區(qū)移動顆粒時，磁性顆粒才能被釋放。
根據(jù)本發(fā)明的方法包括(1)提供流體流動通道，其具有第一和第二端和流體流動控制器，該控制器能有效地、可變化地在流動通道上施加正的或負(fù)的壓力，以引起受控制的流體沿第一或第二方向以預(yù)定的速度流經(jīng)流體流動通道；以及介于第一和第二端之間的捕獲區(qū)，其中一個固定的磁場與流體流動通道在捕獲區(qū)相交；(2)在流體流動通道內(nèi)提供了第一混合物，其包括多個分散在載體介質(zhì)中的固體磁性顆粒；(3)第一混合物以第一預(yù)定捕獲速度穿過捕獲區(qū)，由此通過磁場力使大部分的磁性顆粒在捕獲區(qū)被捕獲并從載體介質(zhì)中分離，從而形成第一磁性顆粒隔離體；(4)用第一分散介質(zhì)灌注第一磁性顆粒隔離體；以及(5)用脈沖使第一分散介質(zhì)以第一預(yù)定分散速度經(jīng)過捕獲區(qū)，有效地將第一磁性顆粒隔離體從捕獲區(qū)移走，從磁場移走磁性顆粒以及在第一分散介質(zhì)中懸浮磁性顆粒以提供第二混合物。如果需要，可以多次捕獲和釋放磁性顆粒。該步驟能夠被用于加強(qiáng)混合，并且因此提高在少量流體中的分子捕獲效率。而且，相同的流體可被用作載體介質(zhì)和分散介質(zhì)。因此，第一和第二混合物可能相同。在捕獲和釋放操作過程中，通過倒轉(zhuǎn)流體流經(jīng)捕獲區(qū)的方向，可以在相同量的流體中發(fā)生捕獲和釋放。
另一種選擇是，捕獲和釋放可以在流經(jīng)捕獲區(qū)的新鮮流體中進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于從含有磁性顆粒的非磁性的流體中分離磁性顆粒的設(shè)備。該設(shè)備包括(1)流體流動通道，該流體流動通道具有第一和第二端以及介于第一和第二端之間的捕獲區(qū)；(2)流體流動控制器，其有效地，可變化地在流動通道上施加正的或負(fù)的壓力，以引起受控制的流體沿第一或第二方向以預(yù)定的速度流經(jīng)流體流動通道；(3)產(chǎn)生固定磁場的磁場源，該源相對于流體流動通道固定，由此該場與流體流動通道在捕獲區(qū)相交；以及(4)用于檢測流動通道內(nèi)的流體的物理或化學(xué)性能的檢測器。
本發(fā)明的目的就是要提供用于捕獲和再懸浮磁性顆粒的新系統(tǒng)和方法，其為現(xiàn)有工藝提供了可選擇的系統(tǒng)和方法。
本發(fā)明的其它的形式、實(shí)施方案、目的、優(yōu)點(diǎn)、好處、方面和特征將結(jié)合附圖作詳細(xì)的描述。


雖然在權(quán)利要求中特別指出了本發(fā)明的特點(diǎn)特征，但是，結(jié)合以下構(gòu)成本發(fā)明一部分的附圖可更好地理解本發(fā)明自身，及其制造和使用方法。其中圖1是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的第一實(shí)施方案的示意圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的第二實(shí)施方案示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明的流量控制器的一個實(shí)施方案的示意圖；圖4是根據(jù)本發(fā)明的流量控制器的另一實(shí)施方案的示意圖；圖5是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的第三實(shí)施方案的示意圖；圖6是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的第四實(shí)施方案的示意圖；圖7是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的第五實(shí)施方案的示意圖；圖8是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的第六實(shí)施方案的示意圖；圖9是根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的第七實(shí)施方案的示意圖；圖10是如實(shí)施例中所述的TNT的多個標(biāo)準(zhǔn)濃度峰的曲線圖；圖11是如實(shí)施例中所述的，在時間長度為43天中單獨(dú)8天的118半自動方法試驗(yàn)結(jié)果，峰面積與TNT的標(biāo)準(zhǔn)濃度的關(guān)系曲線；圖12是如實(shí)施例中所述的自動校準(zhǔn)數(shù)據(jù)的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
為了增進(jìn)對本發(fā)明原理的理解，現(xiàn)在引用優(yōu)選實(shí)施方案并使用專用語言對優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行說明。然而，應(yīng)理解由此不意味著限制本發(fā)明的范圍，如對本發(fā)明的改動和進(jìn)一步修改，在此所述的本發(fā)明原理的其它應(yīng)用被認(rèn)為對于與本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是正常的。
本發(fā)明圍繞通過控制通過收集區(qū)的流體流動速度，用于從流體介質(zhì)中分離出磁性顆粒且在相同或不同的介質(zhì)中使顆粒一次或多次再懸浮的流體流動系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，磁場在收集區(qū)內(nèi)截取(截斷、相交)流體流動通道以實(shí)現(xiàn)分離。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中的磁場為固定磁場，該術(shù)語在此指的是在收集和再懸浮磁性顆粒的過程中基本上保持不變的磁場。在某些實(shí)施方案中，該固定磁場被設(shè)置成永磁體與流體流動通道呈固定關(guān)系定位。例如通過將永磁體直接固定在限定流體流動通道的管路上，或另一種選擇是，通過將永磁體固定在不相對于流體流動通道產(chǎn)生移動的構(gòu)件上可實(shí)現(xiàn)這種關(guān)系。在其它實(shí)施方案中，該固定磁場由與流體流動通道呈固定關(guān)系定位的，且被構(gòu)造以在發(fā)明系統(tǒng)中收集和再懸浮磁性顆粒過程中產(chǎn)生具有相當(dāng)恒定場強(qiáng)的磁場的電磁體設(shè)置。
對于實(shí)施不僅需要從介質(zhì)中分離磁性顆粒，而且還需要在一個或更多連續(xù)步驟中在相同或不同介質(zhì)中使顆粒再懸浮的方法，本發(fā)明的系統(tǒng)有廣泛的應(yīng)用。通過控制選擇進(jìn)入流體流動通道的流體以及控制流體流動的速度和方向，在應(yīng)用于大量不同的化驗(yàn)和其它需要基體與不同的流體按照預(yù)定的順序接觸的技術(shù)中，發(fā)明的系統(tǒng)具有優(yōu)勢。本發(fā)明尤其適于和自動流體流動系統(tǒng)如，但并不局限于被稱為連續(xù)注入分析(SIA)的方法，一起使用。通過使發(fā)明的流體流動分離系統(tǒng)自動化，利用相對較少的試劑和其它材料即可快速且可重復(fù)地獲得精確測量。
參見圖1，系統(tǒng)1包括具有一個第一端20和一個第二端30的流體流動通道10和流體流量控制器50。系統(tǒng)1還包括在第一端20和第二端30之間的收集區(qū)40。收集區(qū)40與流動通道10的區(qū)別在于磁場在收集區(qū)40內(nèi)與流動通道10相交。通過定位磁場源42，使其與流動通道10呈固定關(guān)系而設(shè)置磁場?？刂破?0有效地在流動通道上施加可變正壓或負(fù)壓，以使受控流體流以變化的速度在第一或第二方向通過流體流動通道10。在某些實(shí)施方案中的控制器50還被構(gòu)造以從不同源處吸出介質(zhì)進(jìn)入流動通道10。流動通道10可由如在實(shí)施例中的實(shí)施方案中所述的一根管限定，或另一種選擇是可由微孔道限定。微孔道的內(nèi)徑通常小于約100微米，例如可通過機(jī)加工、微型裝配或現(xiàn)有的模制技術(shù)成形。用于成形微孔道的方法和技術(shù)例如，如美國專利Nos.5611214、5811062、6129973、6192596和6200536所述。
按照使用系統(tǒng)1的方式，在流動通道中設(shè)置第一混合物，該混合物包括分散在載體介質(zhì)中的多個固體磁性顆粒。該第一混合物，也可被稱作懸浮體或漿料，可以多種方式被設(shè)置在流動通道中，在下文中對其非限制性的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明。一旦該第一混合物被定位在流體流動通道10之內(nèi)，流量控制器50在該混合物上施加正壓或負(fù)壓，以該混合物以預(yù)定速度(在此被稱為“收集速度”)通過收集區(qū)40，由此磁性顆粒的主要部分受到磁場力的作用被截留在收集區(qū)40內(nèi)，并由此從載體介質(zhì)中分離出以形成第一磁性顆粒分離物。術(shù)語“主要部分”在此指的是在可接受的精度范圍內(nèi)在給定的分離方法中獲得所需結(jié)果的必要部分。例如，當(dāng)發(fā)明系統(tǒng)被用于進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附化驗(yàn)時，在下文中對其實(shí)施例進(jìn)行更加詳細(xì)地說明，當(dāng)該混合物通過收集區(qū)以確?；?yàn)結(jié)果在可接受的誤差范圍內(nèi)時，通過磁場力收集的磁性顆粒最好至少約占90％重量百分比，至少約95％重量百分比更佳。應(yīng)理解當(dāng)發(fā)明系統(tǒng)被用在不同類型的方法中時，最好有不同范圍的收集效率。
在使用系統(tǒng)1的方法中，在流動通道內(nèi)提供第一混合物，該混合物包括分散在載體介質(zhì)中的多個固體磁性顆粒。該第一混合物，其還能被稱為懸浮液或漿體，可以許多不同的方式在流動通道內(nèi)提供，下文中更詳細(xì)地列出了其非限制性的實(shí)例。一旦第一混合物放置在流體流動通道10內(nèi)，流動控制器50在該混合物上施加一個正的或負(fù)的壓力，以引起該混合物以預(yù)定的速度(本文稱為“捕獲速度”)穿過捕獲區(qū)40，由此磁性顆粒的大部分被收集在捕獲區(qū)40內(nèi)，從而形成第一磁性顆粒隔離群。本文所用術(shù)語“大部分”指的是在可接受的精度范圍內(nèi)，在給定的分離方法中獲得所需結(jié)果所必需的部分。例如，當(dāng)發(fā)明的系統(tǒng)被用于進(jìn)行ELISA化驗(yàn)，下文中列出了更詳細(xì)的實(shí)施例，更適宜地，至少磁性顆粒的重量的90％，更適宜的，至少磁性顆粒的重量的95％在混合物穿過捕獲區(qū)時被磁力捕獲，以確保化驗(yàn)結(jié)果在可接受的誤差范圍以內(nèi)。應(yīng)該了解的是當(dāng)發(fā)明的系統(tǒng)被用于不同類型的方法時，捕獲效率可以有首選的不同的范圍。
預(yù)定的捕獲速度是足夠低的流動速度，使得作用在混合物中的顆粒上的磁性吸引力超過了由載體介質(zhì)的移動所賦予的粘性力和重力。在這樣的流動速度，當(dāng)載流體離開捕獲區(qū)時，那些顆粒在捕獲區(qū)被約束或捕獲。例如，在下文中所描述的一個系統(tǒng)中，其中流體流動通道具有大約0.02英寸的內(nèi)徑(～0.5毫米)，而顆粒直徑大約為0.5微米，該實(shí)施例的首選捕獲速度小于或等于大約13毫米/秒(2.5μl/秒)。更適宜地，該實(shí)施例的捕獲速度介于1.0至13毫米/秒。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已經(jīng)意識到首選速度會根據(jù)給定系統(tǒng)的不同特征如顆粒尺寸、顆粒磁敏感性、磁場強(qiáng)度、磁場源的位置以及流動通道結(jié)構(gòu)(直徑、壁厚、管道系統(tǒng)或路徑材料等等)而變化，并且如果有必要，能夠?qū)Σ东@流動速度進(jìn)行調(diào)整以獲得適宜的顆粒捕獲度。
一旦磁性顆粒隔離群被捕獲，分散介質(zhì)被引入捕獲區(qū)40并且磁性顆粒隔離群被分散介質(zhì)完全覆蓋。灌注之后，分散介質(zhì)以預(yù)定的速度(本文稱為“分散速度”)脈動經(jīng)過捕獲區(qū)40，該速度能有效地使磁性顆粒隔離群從捕獲區(qū)移開；將磁性顆粒從磁場移走，并使磁性顆粒懸浮在分散介質(zhì)中以提供第二混合物。在預(yù)定的分散流動速度，經(jīng)過流體流動通道的更高速度的流動允許流體的粘性力從捕獲區(qū)移開被捕獲的顆粒。某個實(shí)施方案中的發(fā)明的系統(tǒng)甚至能夠從載流體中非破壞性地分離易碎的顆粒，如完整的血細(xì)胞。應(yīng)該了解的是在不同的實(shí)施方案中，該脈動可以從捕獲區(qū)在任一方向內(nèi)移動磁性顆粒。
例如，如下文所詳細(xì)描述的，在一個具有直徑大約為0.02英寸的流體流動通道的系統(tǒng)中，首選的脈動流動速度介于250至2500毫米/秒(在所述系統(tǒng)中，200μl/s＝1018mm/s，500μl/s＝2500mm/s，50μl/s＝250mm/s)之間。更適宜地，這樣的直徑的流動通道內(nèi)的脈動速度介于大約750至1250mm/s之間。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已經(jīng)意識到首選速度會根據(jù)給定系統(tǒng)的其它特征而變化，并且能夠?qū)Ψ稚⑺俣冗M(jìn)行調(diào)整以獲得適宜的顆粒分散度。
在還需要將磁性顆粒從分散介質(zhì)中分離的地方，第二混合物接著以預(yù)定的捕獲速度穿過捕獲區(qū)以再次在捕獲區(qū)內(nèi)約束大部分的磁性顆粒，并由此從第一分散介質(zhì)中分開以形成第二磁性顆粒隔離群。應(yīng)該了解的是在只有一個捕獲區(qū)的流動通道內(nèi)，使第二混合物穿過捕獲區(qū)需要在流體流動通道內(nèi)的流體流動方向逆轉(zhuǎn)。這樣的流體流動轉(zhuǎn)向通過流動控制器50實(shí)現(xiàn)，其在混合物上施加反向的壓力以引起流體以預(yù)定的速度沿相反的方向流經(jīng)流動通道。
通過由捕獲區(qū)40內(nèi)的固定磁場控制流體流動速度，如上所述，本發(fā)明提供了這樣的系統(tǒng)，其不同于現(xiàn)有工藝的分離/再懸浮之處在于例如通過物理移動永磁體離開流動通路，或者，當(dāng)用電磁體時，通過關(guān)閉電磁體或?qū)崿F(xiàn)磁場波動或轉(zhuǎn)向，消除移動磁場的需要。而且，由于發(fā)明的系統(tǒng)中精確控制的流體流動，用相當(dāng)少量的試劑、樣品，選擇性表面及其它相似物質(zhì)即可獲得精確的結(jié)果。在某個優(yōu)選實(shí)施方案中，捕獲區(qū)中的流體流動通道基本上沒有被臺架、棒或其它可磁化的基體結(jié)構(gòu)中斷，并且可以只是被捕獲在流動通道管道側(cè)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，鐵磁性結(jié)構(gòu)被放置在流動通道內(nèi)以產(chǎn)生較大的場梯度。這樣的結(jié)構(gòu)對于捕獲如納米顆粒常常是有用的。
載流體和磁性顆粒的成分可以根據(jù)所實(shí)施的方法的細(xì)節(jié)變化。例如，可以獲得許多商業(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)箱，其包括具有選擇化學(xué)性質(zhì)的磁性顆粒(固定的抗體)，以及其它用于特定化驗(yàn)的試劑。因此，在一個實(shí)施方案中，載流體和磁性顆粒包括酶聯(lián)免疫吸附化驗(yàn)材料。如一個代表性的實(shí)施例，由戰(zhàn)略診斷(STRATEGIC DIAGNOSTICS)(紐約、特拉華州)銷售的TNT RaPID化驗(yàn)TM工具箱，其包括TNT-辣根過氧化酶(TNT-HRP)，一種彩色的生長溶液(3，3’，5，5’-N四甲聯(lián)苯胺和H202)，以及不規(guī)則的直徑為0.5微米的磁性顆粒的懸浮液，其帶有固定的抗TNT抗體。正如另一實(shí)施例，可以獲得這樣的顆粒，其與特定的？捕獲探針共價相連。這樣的顆粒能被用于生物樣品的核酸碎片的選擇性凈化。本文所用術(shù)語“核酸”指的是DNA核苷酸和RNA核苷酸，以及任何含有DNA核苷酸或RNA核苷酸的長聚合體。
盡管上述的載體介質(zhì)可以是僅僅為輸送磁性顆粒到達(dá)捕獲區(qū)而選擇的惰性介質(zhì)，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，載體介質(zhì)包括測試樣品，即，其中特定分析物的存在和/或數(shù)量需要確定的樣品。因此，顆粒和載體介質(zhì)的最初接觸啟動了培育期，其只有當(dāng)磁性顆粒如上所述從載體介質(zhì)中分離時才終止。當(dāng)然，在某些化驗(yàn)中，如競爭免疫測定，載體介質(zhì)還可以包括一種或更多種另外的試劑。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易理解為了提供可接受的結(jié)果，許多化學(xué)和生物化驗(yàn)需要一個或更多的清洗步驟，其中未反應(yīng)的試劑和/或未與磁性顆粒結(jié)合的目標(biāo)物質(zhì)被從顆粒上清洗掉。因此，在上述方法中，分散介質(zhì)可以是清洗液。還要了解的是常常希望進(jìn)行多次清洗步驟以提高測試或化驗(yàn)的精確性。因此，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，磁性顆粒的再懸浮和再捕獲可以如上文所述進(jìn)行多次。
許多這樣的測試或化驗(yàn)還需要特定試劑中(本文稱為“分析試劑”)的隔離群的懸浮液。例如，在某種酶聯(lián)免疫測定方法中，被隔離的物質(zhì)與一種物質(zhì)接觸或懸浮在該物質(zhì)中，該物質(zhì)與相聯(lián)的酶作用時發(fā)生變色。因此，某個發(fā)明的方法包括用含有分析試劑的分散介質(zhì)灌注磁性顆粒隔離群，使該介質(zhì)脈動經(jīng)過捕獲區(qū)以便將磁性顆粒隔離群從捕獲區(qū)移開，將磁性顆粒從磁場移開，使磁性顆粒懸浮在含有分析試劑的介質(zhì)中。在懸浮液被允許培養(yǎng)預(yù)定的時間周期后，該懸浮液隨后穿過捕獲區(qū)以便從懸浮液中再次捕獲磁性顆粒，使得含有分析試劑的介質(zhì)或磁性顆粒隔離群自身的一種或更多種的物理和/或化學(xué)性能能夠被測量。
參看圖2，示出了流體流動系統(tǒng)2，其包括檢測區(qū)60和檢測器62。檢測器62與流體流動通道進(jìn)行流體交換或構(gòu)成流體流動通道的一部分，并被安裝以檢測檢測區(qū)中的流體的物理或化學(xué)性能。檢測區(qū)60可以從捕獲區(qū)40分離(如圖2所示)，或者檢測和捕獲區(qū)可以部分或完全交疊。本發(fā)明希望在本發(fā)明的不同應(yīng)用中使用許多不同的檢測器，包括但不局限于光學(xué)檢測器、pH檢測器、輻射檢測器、粘性檢測器及其它檢測器。
依據(jù)本發(fā)明所用的檢測器類型可以根據(jù)所進(jìn)行的分析的特定類型變化，并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員了解依據(jù)本發(fā)明選擇和設(shè)定適宜的檢測器備用。例如，一種化驗(yàn)依靠分析試劑顏色的變化來辨認(rèn)分析物并量化分析物。對于這樣的化驗(yàn)，檢測器可以是分光計或其它光學(xué)檢測器，其被設(shè)置為傳遞特定波長的光或其它電磁輻射經(jīng)過溶液以測量顏色的變化程度。例如，下文中所詳細(xì)介紹的檢測器包括一個U形的透射流槽，其由氟化乙丙烯橡膠(McMaster-Carr，洛山磯，加州)加工而成并被用于在被捕獲的磁性顆粒的下游進(jìn)行吸光率測量。該光通道為1厘米長，并用海洋光學(xué)(Dunedin，佛羅里達(dá))纖維光纖分光光度計和鎢鹵燈進(jìn)行吸光率測量。用400微米的石英纖維進(jìn)行檢測。圖8示出了包括永磁體和光學(xué)檢測器的實(shí)施方案。
對于需要附加靈敏度的化驗(yàn)，人們可能希望用其它的檢測方案如化學(xué)發(fā)光或脂質(zhì)體基的免疫測定改進(jìn)化驗(yàn)，其使靈敏度提高了幾個數(shù)量級。可以使用寬范圍的標(biāo)記(如放射性同位素、生色或發(fā)光物質(zhì)等)，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?yàn)樵S多這種化驗(yàn)選擇并制成適宜的檢測器。
依據(jù)本發(fā)明流體流動控制器50可以有許多不同的結(jié)構(gòu)。在一實(shí)施方案中，如圖3所示，流動控制器50包括多端口選擇閥51；保持線圈54和變速可倒轉(zhuǎn)泵。在該實(shí)施方案中，多端口選擇閥51包括第一端口52和多個第二端口53。第二端口之一與流體流動通道10流體相連，并且第一端口52與保持線圈54流體相連。其它第二端口53可選擇地分別與用于特定分離/再懸浮方法的不同流體源流體相連。其它端口還能用于將空氣吸入保持線圈或從系統(tǒng)驅(qū)散廢物，如下文所詳細(xì)描述的。保持線圈54的近端55與變速可倒轉(zhuǎn)泵58流體相連。在一實(shí)施方案中，泵58為包括分檔電動機(jī)的清洗泵，其在相關(guān)領(lǐng)域已廣為人知。當(dāng)然本發(fā)明并不局限于這種泵，應(yīng)該了解的是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可能用其它的泵設(shè)計。保持線圈54被用作保持樣品、提取材料或試劑的貯藏處。在連續(xù)的注入方法的每個步驟中，液體或漿體通過選擇閥端口被吸入保持線圈，接著該閥被轉(zhuǎn)向流動通道端口，以及線圈中的物質(zhì)被注入流動通道?？諝夥蛛x器防止珠漿體、樣品及其它溶液在保持線圈內(nèi)混合或分散。
在另一實(shí)施方案中，如圖4至6所示，流動控制器50還包括位于保持線圈和變速可倒轉(zhuǎn)泵之間的多端口閥57，其與保持線圈和變速可倒轉(zhuǎn)泵流體相連。在該實(shí)施方案中，保持線圈54的近端55與閥的第一端口相連，而閥的第二端口與變速可倒轉(zhuǎn)泵相連。閥的第三端口能夠方便地與清洗液源59或完成特定化驗(yàn)后用于沖洗和/或清潔流體流動通道的其它試劑相連。因此，在該實(shí)施方案中，在特定系列的分離/再懸浮后，閥57轉(zhuǎn)向與泵58和源59流體相連，并且泵58從源59漿流體吸入貯藏處59a。吸入需要量的流體后，閥57再次轉(zhuǎn)向與泵58和保持線圈54流體相連，并且泵58將流體推過保持線圈、選擇閥51和流動通道10，從而從中沖洗掉任何殘留的磁性顆粒和/或試劑。
在采用該系統(tǒng)的進(jìn)行分離/再懸浮方法的一種方式中，第二端口53與載體介質(zhì)中的磁性顆粒源流體相連。選擇閥51被安裝以便在第一端口52和顆粒/介質(zhì)混合源之間提供流體交換，泵58施加負(fù)壓力，從而將混合物吸入保持線圈54。選擇閥51接著移動以便在保持線圈54和流體流動通道10之間提供流體交換。在進(jìn)一步培育所需的時間之后(如果在特定方法中必須有另外的時間)，泵58施加正壓力，從而將混合物推過選擇閥51，進(jìn)入流體流槽10并穿過捕獲區(qū)40。穿過捕獲區(qū)40的流動速度足夠慢，以允許混合物中磁性顆粒的大部分被磁場力捕獲在捕獲區(qū)40。當(dāng)磁性顆粒是衍生的磁性顆粒并且載體介質(zhì)包括待測試特定分析物的存在和量的樣品，要了解的是顆粒必需在仔細(xì)控制的的一段時間內(nèi)與介質(zhì)保持接觸以提供可接受的化驗(yàn)結(jié)果。因此，在顆粒和樣品之間的接觸要保持特定長度的時間的方法中，從最初接觸的時間開始定時順序是很重要的。
在自動化的系統(tǒng)中，載體介質(zhì)是惰性載體，并且磁性顆粒保持與測試樣品分離直到在保持線圈或流體流槽內(nèi)發(fā)生混合。在該實(shí)施方案中，如果需要，測試樣品和其它試劑被分開放置或放置在預(yù)先混合的溶液中，與另一個第二端口53中的一個或更多個進(jìn)行流體交換。
在磁性顆粒和測試樣品的混合要發(fā)生在保持線圈中的情況下，通過選擇閥51和泵58的協(xié)同運(yùn)動，磁性顆粒懸浮液、測試樣品和其它試劑，分別或以某種預(yù)先混合組合的形式被交替地吸入保持線圈。隨著一定數(shù)量的各種物質(zhì)被交替吸入保持線圈(以形成“堆垛區(qū)”)，這些物質(zhì)被混合，從而開始了保持線圈的“堆垛”過程中的培育期。在顆粒/樣品/試劑被堆積在保持線圈內(nèi)(在這種情況下沒有空氣分離)之后，選擇性地，在進(jìn)一步培育一段預(yù)期的時間之后(如果在特定的分析中需要另外的時間)，選擇閥51移動以在保持線圈54和流動通道10之間提供流體交換，并且泵在流體上施加反向壓力以便使流體經(jīng)過選擇閥51，進(jìn)入流動通道10，并以上述的預(yù)定捕獲速度經(jīng)過捕獲區(qū)，以便將磁性顆粒從其它流體中分離。
在混合發(fā)生在流槽中的情況下，首先通過選擇閥51和泵58的協(xié)同運(yùn)動將惰性載體中的磁性顆粒懸浮液吸入保持線圈，并首先被吸入流動通道并以預(yù)定的捕獲速度經(jīng)過捕獲區(qū)，從而提供磁性顆粒隔離群，其中顆粒的選擇性表面還沒有反應(yīng)。接著，測試樣品和其它試劑，分別地或以某種預(yù)先混合組合的形式經(jīng)過流動通道10，以覆蓋隔離群和再懸浮的顆粒。對于特定分析所需要的特定順序的接觸，當(dāng)然要了解流體被吸入流動通道10的順序由選擇閥51和泵58的協(xié)同控制來控制。而且，如果需要另外的流體混合作為發(fā)明方法的中間步驟，要了解通過上述的選擇閥51和泵58的協(xié)同控制在保持線圈內(nèi)制造“堆垛區(qū)”，可以在保持線圈內(nèi)混合再懸浮磁性顆?；蚱渌黧w。
一旦通過從載體介質(zhì)中分離磁性顆粒形成了磁性顆粒隔離群，用分散介質(zhì)如清洗液，灌注磁性顆粒隔離群。在某實(shí)施方案中，在混合“之后”已經(jīng)在貯藏處59a或保持線圈54內(nèi)存有分散介質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，如圖4所示，可以通過閥57的移動接近分散介質(zhì)源，以在泵58和源59之間提供流體交換，將分散介質(zhì)吸入貯藏處59a，移動閥57以在泵58和保持線圈54之間提供流體交換，并且由泵58施加反向的壓力以引起分散介質(zhì)流過線圈54，經(jīng)過選擇閥51，并進(jìn)入流動通道10。在這樣的實(shí)施方案中，無需選擇閥51的更多移動即能將分散介質(zhì)吸入或分配進(jìn)入流槽10。在另一實(shí)施方案中，通過選擇閥51的一個第二端口53可接近分散介質(zhì)源。在這樣的實(shí)施方案中，通過首先將分散介質(zhì)吸入保持線圈54將分散介質(zhì)吸入流槽10。在這樣的實(shí)施方案在中，保持線圈54和分散介質(zhì)源之間的流體交換由選擇閥51的移動來提供，泵58施加負(fù)壓力，從而將一定量的分散介質(zhì)吸入保持線圈54。選擇閥51隨后移動以再次在保持線圈54和流體流動通道10之間提供流體交換，并且泵58施加正壓力，從而將介質(zhì)推過選擇閥51，進(jìn)入流體流槽10，并經(jīng)過捕獲區(qū)40。流過捕獲區(qū)的速度最初足夠慢以防止磁性顆粒隔離群的分裂。在一些分散介質(zhì)覆蓋隔離群之后，泵58短期地施加更大的壓力(正的或負(fù)的)以引起捕獲區(qū)內(nèi)的流體流動脈動具有足夠高的流動速度，足以使磁性顆粒隔離群從捕獲區(qū)離開，從磁場中移走磁性顆粒，并使磁性顆粒懸浮在分散介質(zhì)中以提供第二混合物。
如上所述，可以將磁性顆粒從分散體中分離，并在相同或不同的介質(zhì)一次或多次地再懸浮和再分離?；蛘撸诙旌衔锬軌蚪?jīng)過檢測區(qū)60以檢測一種或多種物理或化學(xué)特征，或者能夠被收集以用于進(jìn)一步的其它類型的處理。
在本發(fā)明的特別的優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇閥51，泵58和閥57(存在的情況下)由預(yù)先設(shè)定程序的序列發(fā)生器70控制，如圖7所示。序列發(fā)生器70控制閥的運(yùn)動以在所需的流槽之間提供流體交換；并控制泵以在適當(dāng)?shù)臅r刻提供所需大小的正或負(fù)壓力(上文中討論了該實(shí)施例)，由此協(xié)調(diào)流經(jīng)流體流動通道10的流體的運(yùn)動。在另一實(shí)施方案中，例如，在序列發(fā)生器70是計算機(jī)的情況下，該計算機(jī)還可以被設(shè)置成接收來自檢測器62和分析物的信息，對這樣的信息進(jìn)行制表、解釋和/或展示。
序列發(fā)生器70可以包括一個或多個元件，其被設(shè)置成單個的單元。或者，當(dāng)是多元件的形式時，序列發(fā)生器70可以具有一個或多個元件，其遠(yuǎn)離其它元件，或者可以具有分布在整個系統(tǒng)中的元件。序列發(fā)生器70可以是可編程的，狀態(tài)邏輯機(jī)或其它類型的專用硬件，或者是可編程和專用硬件的混合組合。序列發(fā)生器70的一個或多個元件可以是電子類的，如數(shù)字電路、模擬電路或二者兼有。作為電子電路的附加或選擇對象，序列發(fā)生器70可以包括一個或多個機(jī)械的、水力的、氣動的或光學(xué)控制的元件。
在一個包括電子電路的實(shí)施方案中，程序裝置70基于可訪問一個或多個固體存儲器裝置(未示出)的固態(tài)集成微處理器或微控制器。這種存儲器最好包含可由微處理器或微控制器執(zhí)行，且設(shè)置用于根據(jù)由程序裝置70執(zhí)行的一個或多個程序讀寫數(shù)據(jù)的編程指令。在另一個實(shí)施方案中，程序裝置70為一具有定制的軟件和硬件以實(shí)施本發(fā)明的工業(yè)級加固抗震程序控制個人計算機(jī)。這一優(yōu)選構(gòu)造可包括通訊界面如調(diào)制解調(diào)器或網(wǎng)絡(luò)鏈路，以及用于容納可更換介質(zhì)如緊致磁盤(CDs)或軟盤的子系統(tǒng)。雖然處理器優(yōu)選易于被軟件可重編程序，它也可由固件編程，或被構(gòu)造成集成狀態(tài)機(jī)，或使用這些技術(shù)的組合。在另外一種形式中，程序裝置70設(shè)有一個或多個可編程邏輯控制器(PLC)。
與程序裝置70相關(guān)的任何存儲器可包括一個或多個類型的固態(tài)電子存儲器且另外或另一種選擇是可包括磁性或光學(xué)類型。例如，該存儲器可包括固態(tài)電子隨機(jī)存取存儲器(RAM)、串行可存取存貯器(SAM)(如先入先出(FIFO)法或后進(jìn)先出(LIFO)法)、可編程序只讀存儲器(PROM)、電可編程序只讀存儲器(EPROM)、或電可擦可編程只讀存儲器(EEPROM)；光盤存儲器(如CD ROM)、磁編碼硬盤、軟盤、磁帶或盒式磁盤介質(zhì)或這些品種的組合。同時該存儲器可以是易失型，或非易失型，或易失和非易失的組合型。
程序裝置70還可包括控制時鐘、界面、信號調(diào)節(jié)器、過濾器、限幅器、模數(shù)(A/D)轉(zhuǎn)換器、數(shù)模(D/A)轉(zhuǎn)換器、通訊端口或本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可使用以實(shí)施本發(fā)明的其它類型的執(zhí)行機(jī)構(gòu)。
使用如上所述的流量控制器用于順序注入對于免疫測定來說具有多種優(yōu)點(diǎn)。使用順序注入得到的高度可再現(xiàn)的同步使得如有需要，在非常短的時限內(nèi)可對非平衡測量進(jìn)行準(zhǔn)確分析，這是使用手工技術(shù)所不能實(shí)現(xiàn)的。注入的樣品體積可以非常小，且試劑的消耗量也非常小。
如上所述，可通過一個與流動通道10具有固定位置關(guān)系的永磁體或與流動通道10具有固定位置關(guān)系且產(chǎn)生基本恒定的場強(qiáng)的電磁體來設(shè)置該與捕獲區(qū)40相交的固定磁場。永磁體的一個優(yōu)點(diǎn)在于在工作過程中其不會產(chǎn)生可能會對分析產(chǎn)生干擾的熱量。當(dāng)由永磁體提供磁場時，該磁體可具有多種構(gòu)造，包括通常被稱為馬蹄形的構(gòu)造或標(biāo)準(zhǔn)條形構(gòu)造。例如，該永磁體或多個永磁體可具有矩形橫截面，且在某些實(shí)施方案中其可被膠粘或通過機(jī)械裝置固定在流體流動管道或非磁性支架上以形成永磁體組件。在另一實(shí)施方案中，該組件可包括一個容納該磁體或多個磁體且增強(qiáng)和聚焦磁場的鐵磁性裝具。該磁體的磁力線最好沿垂直于流動通道的縱軸取向。也可以預(yù)想相對于該容器的交錯的橫截面形狀、取向和磁極取向。
此外，永磁體可具有多種成分。最好使用表面場強(qiáng)度在幾百高斯至幾千高斯范圍內(nèi)的稀土合金永磁體。在一個實(shí)施方案中，該永磁體為由釹-鐵-硼或釤-鈷合金制成的具有高磁能積的永磁體。這種永磁體，和適合本發(fā)明使用相關(guān)的其它多種永磁體已商業(yè)化銷售。各種構(gòu)造和成分被包括在在此使用的術(shù)語“永磁體”中。
在標(biāo)準(zhǔn)條形磁體中，當(dāng)其從北極移動至南極時，由于磁力線是非線性的且“成扇形展開”或鼓起，如圖6和8示意性示出，而存在梯度。這些效應(yīng)通常在高性能實(shí)驗(yàn)室用磁體中產(chǎn)生0.1-1.5千高斯/厘米的梯度。盡管對于本發(fā)明不必要，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員會意識到通過對磁回路進(jìn)行處理以壓縮或增加磁力線密度可使這些梯度增大。例如，如果在條形磁體一個極的強(qiáng)度不夠，與第一磁體相反移動具有相同磁場的第二條形磁體將在這兩個磁體之間產(chǎn)生排斥。雖然磁力線根數(shù)保持不變，但是隨著這兩個磁體受力越來越靠近，磁力線將被壓縮。由此導(dǎo)致磁場梯度增大。向這一偶極構(gòu)造加入反向場磁體以形成四極可進(jìn)一步增大高梯度區(qū)的尺寸。其它構(gòu)造如反向場的相鄰磁體也可以產(chǎn)生高于在相當(dāng)強(qiáng)度條形磁體中梯度的梯度。在外場裝置中增加梯度的另一種方法是改變磁極片設(shè)計。例如，若通過將磁體之一制成尖形磁體改變標(biāo)準(zhǔn)偶極磁體的構(gòu)造，那么圍繞該區(qū)域的梯度將顯著增大。
根據(jù)本發(fā)明，在流體流動通道的捕獲區(qū)中的磁場具有的強(qiáng)度將會以相對較低的流速(如從約1至約13毫米/秒的流速)捕獲根據(jù)本發(fā)明用途選擇的磁性顆粒，且該強(qiáng)度不足以將該顆粒保留在相對較高流速(如從約250至約2500毫米/秒的流速)的流體流中。易于理解即優(yōu)選磁場強(qiáng)度取決于多種因素會發(fā)生變化，這些因素包括，但不限于在捕獲區(qū)中或其它位置處流動單元的內(nèi)部尺寸，在給定方法中使用的磁性顆粒的尺寸和敏感性，以及分離和灌注的所需速度，若給定方法對此有要求的話。考慮到本說明書，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可在其范圍內(nèi)為發(fā)明體系的廣泛應(yīng)用選擇適當(dāng)?shù)拇艌鲈?，無論是永磁體還是電磁體。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該捕獲區(qū)包括0.1-2千高斯/厘米的平均磁場梯度。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，鐵磁性材料被放置在流體通道內(nèi)或緊靠流體通道位置處，以產(chǎn)生用于捕獲較小的或磁性較弱的顆粒的較大磁場梯度。
現(xiàn)在轉(zhuǎn)向磁性顆粒本身，在此所使用的術(shù)語“磁性顆粒”指的是對磁場有反應(yīng)的顆粒。根據(jù)本發(fā)明選擇使用的磁性顆粒最好包括鐵磁性材料，超順磁材料更佳。不考慮其尺寸(通常范圍為25納米至100微米)，當(dāng)被放入磁場中時，超順磁材料僅具有磁性的性質(zhì)。一旦磁場被撤去，其磁性失效且通常被分散成懸浮物。超順磁行為的基礎(chǔ)在于這種材料含有尺寸小于20-25納米的磁性材料，其尺寸被估計小于磁疇尺寸。磁疇是永磁偶極子存在的最小體積單元。因此，這些材料是由不能保持永磁偶極子的一個或多個單元或單元集合成形的。這種磁性顆粒通常為含有少量鐵磁性物質(zhì)如鐵基氧化物，例如磁石、過渡金屬或稀土元素的聚合材料，該聚合材料使以上物質(zhì)能夠被磁場捕獲。雖然也可以使用其它過渡元素氧化物及其混合物，在此所選擇的磁性材料為磁石。
在本發(fā)明的許多優(yōu)選應(yīng)用中，磁性材料的表面涂敷有配合體或受體，例如抗體、外源凝集素、低聚核苷酸或其它生物活性分子，其可將混合物中的目標(biāo)物質(zhì)與其它物質(zhì)結(jié)合。由于在目標(biāo)物質(zhì)和磁性顆粒表面之間存在靜電交互作用，范德華交互作用，偶極子-偶極子交互作用或氫鍵交互作用，因此磁性顆粒的表面化學(xué)性質(zhì)也可被用于捕獲目標(biāo)物質(zhì)。磁性顆粒特別是在衛(wèi)生保健如免疫測定、細(xì)胞分離、和分子生物學(xué)中已被用于多種用途，且許多這種顆粒商業(yè)有售。對實(shí)施這些方法有用的超順磁顆粒應(yīng)具有用于吸附或共價連接特定的一親合結(jié)合對如配合體和受體的一個元件足夠的結(jié)合表面能力。
一些磁性顆粒由球形聚合材料制成，在其中已沉積出磁性晶體。由于其磁石含量和尺寸，這些材料易于在相對較低的磁場(0.5-2千高斯/厘米)中被分離出來，該磁場可很容易地由開放場梯度產(chǎn)生。另一相似種類的材料是通常生產(chǎn)出的尺寸范圍在約0.5-約0.75微米內(nèi)的顆粒。另一種適合的材料包括尺寸約1微米的磁石晶體簇，其上涂覆有可連接生物受體的氨基硅烷聚合物。這種強(qiáng)磁性材料在相對較低的梯度(如梯度小于0.5千高斯/厘米)易于被分離，且由于其尺寸，其可長期保持懸浮。
根據(jù)本發(fā)明所使用的磁性顆粒的優(yōu)選直徑為0.1-300微米。如今具有或無能夠結(jié)合抗體或DNA分子或含有其它結(jié)合位置例如凈化的官能團(tuán)的磁性顆粒在許多地方商業(yè)有售。合適的超順磁顆粒在以下公司商業(yè)有售，這些公司是Lake Success，N.Y.的Dynal Inc.；Cambridge，Mass.的Perspective Diagnostics，Inc；和San Leandro，Calif.的Cortex Biochem Inc.。
根據(jù)本發(fā)明可使用的另一種類型的磁性材料為納米尺寸的膠體(參見，例如Molday的美國專利No.4452773，Owen等的美國專利No.4795698，Yudelson的美國專利No.4965007；以及LIberti等的美國專利申請No.07/397106)。納米尺寸的膠體通常由涂覆有聚合材料的磁石的單晶到多晶凝聚物構(gòu)成，該凝聚物為其提供水相容性。單個晶體的尺寸可為約8-約15納米。這些材料的涂層與水溶液具有足夠的相互作用，以使其差不多保持膠體狀態(tài)，否則永久地。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員意識到由于其尺寸和其與溶劑水之間存在相互作用，需要相當(dāng)大的磁性梯度以分離納米尺寸的膠體。因此，在使用這種膠體的體系中，最好使用更強(qiáng)的磁場。
本發(fā)明的一個有利特征在于可以精確地控制調(diào)節(jié)在給定試劑或其它介質(zhì)中磁性顆粒的懸浮時間。此外，發(fā)明方法允許實(shí)施在微摩爾級濃度范圍內(nèi)更快更靈敏的自動免疫測定。本發(fā)明的一個特別有利應(yīng)用是用于進(jìn)行使用自動順序注入方法的酶聯(lián)免疫吸附化驗(yàn)，該方法利用表面被衍生的磁性顆粒確定在測試樣品中進(jìn)行競爭免疫測定分析物的量。
使用被磁性顆粒結(jié)合的抗體和被酶增強(qiáng)的檢測的競爭免疫測定法涉及諸多步驟。例如在使用TNT作為分析物時，第一步是混合TNT樣品、TNT-酶軛合物和固定抗體。在根據(jù)本發(fā)明的半自動方法中，這些成分例如在聚丙烯小瓶中進(jìn)行混合，用于競爭結(jié)合。使用固定在磁性顆粒上的抗體易于在隨后的步驟中從粘附有抗體的成分中分離出溶液成分。一旦已分離或洗出顆粒，就加入分析純顯色溶液。它包含用于將基體酶催化轉(zhuǎn)變成便于檢測出的有色物質(zhì)的試劑。在精確的反應(yīng)時間后，進(jìn)行吸收性能測試。
典型的順序如下(1)在分析物上涂覆有抗體的磁性顆粒與包括該分析物和分析物-酶軛合物的測試樣品進(jìn)行混合，其中酶起到產(chǎn)生顏色的著色試劑的作用，且培養(yǎng)預(yù)定的一段時間；(2)這種混合物被吸入流體流動單元中并通過固定磁場中的捕獲區(qū)，于是磁場捕獲流動通道中的顆粒以形成磁性顆粒隔離體；(3)該磁性顆粒隔離體通過吸入和用脈沖輸送洗液一次或多次再懸浮，通過逆流和再懸浮顆粒以捕獲流速通過捕獲區(qū)，在捕獲區(qū)中進(jìn)行交替再捕獲；(4)被沖洗的磁性顆粒隔離體通過吸入和脈沖輸送試劑再懸浮在著色試劑中；(5)在預(yù)定長度的反應(yīng)時間后，通過逆流和試劑與顆粒以捕獲流速通過捕獲區(qū)，磁性顆粒在捕獲區(qū)中被再捕獲；(6)該著色試劑通過一個用于顯色檢測的光學(xué)單元；和(7)洗液以相對較高的速度通過流動單元，以從流動單元中沖洗出任何剩余的顆粒和/或試劑，以限定用于后面方法的體系條件。
同樣地，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種使操作人員介入最小化的自動ELISA儀器。這種ELISA系統(tǒng)如手動方法一樣運(yùn)行，但是試劑體積較小、反應(yīng)時間較短，且由此可被構(gòu)造用于提供能夠可靠地和可再現(xiàn)地分析測試樣品的現(xiàn)場便攜式的儀器。該方法是通用的和靈活的，且由此可適用于許多種不同的用途。用過的磁性顆粒可在每次分析之后可被放電。這消除了反應(yīng)表面不穩(wěn)定的問題，消除了為了不僅節(jié)省時間和增加采樣頻率，而且向單個采樣周期提供磁性顆粒的新鮮和均勻的部分，傳統(tǒng)上要求固體反應(yīng)相再生所需要的附加時間。該用過的磁性顆粒被離線收集，并可在以后再生。減少樣品處理的所要求的小體積和本發(fā)明方法精確的可再現(xiàn)性已顯示出對于改進(jìn)麻煩的、耗時的、使用大量勞力的和半定量的傳統(tǒng)免疫測定有用。
除上述實(shí)施方案之外，多種其它可選擇構(gòu)造的所述系統(tǒng)均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如一個實(shí)施例，本發(fā)明設(shè)想一個系統(tǒng)，其中流動通道包括多個捕獲區(qū)。在這一實(shí)施方案中，可實(shí)施一種方法，其中在流動通道中的流體流是不定向的。在具有多個捕獲區(qū)的系統(tǒng)中，磁性顆粒可在第一捕獲區(qū)中從通常如上所述的載體介質(zhì)中被分離出去，以提供第一磁性顆粒隔離體。然后通過沿第二捕獲區(qū)方向的分散介質(zhì)的脈沖，使該第一隔離體再懸浮，以提供第二混合物。如有需要，然后停止流體流，以在捕獲區(qū)之間提供一段時間的培養(yǎng)期，然后重新沿相同方向使第二混合物通過第二捕獲區(qū)以從分散介質(zhì)中分離出磁性顆粒，并由此形成第二磁性顆粒隔離體。然后可在流體流動通道上的更多捕獲區(qū)中或在同一捕獲區(qū)中同時還使用逆流執(zhí)行更多的再懸浮/再捕獲步驟。例如當(dāng)多個捕獲/再懸浮步驟對于一給定的化驗(yàn)或其它方法必要時，可以使用這種系統(tǒng)。
在另一個實(shí)施方案中，通過加入用于多項化驗(yàn)的試劑與多端口選擇閥51的第二端口53流體相連通，并在大量相同樣品上順序進(jìn)行不同的化驗(yàn)，可在相同測試樣品上可進(jìn)行多項化驗(yàn)。例如可希望在一個樣品上進(jìn)行一項化驗(yàn)，然后在相同樣品上進(jìn)行不同的分析。在這一實(shí)施方案中，在完成化驗(yàn)且使用洗液或其它清洗試劑清洗完系統(tǒng)之后，該系統(tǒng)可被構(gòu)造以自動混合測試樣品、具有連接于其上的不同選擇性官能團(tuán)的磁性顆粒和可能的其它試劑，以順序進(jìn)行其它化驗(yàn)。
針對于某些化驗(yàn)的特定要求可設(shè)想出其它變型。例如應(yīng)理解當(dāng)被暴露于光線中時，某些顯色溶液會經(jīng)歷光催化作用。同樣地，在使用顯色試劑的實(shí)施方案中，限定流體流動通道和傳輸顯色試劑的其它流體傳輸通道的管道由不透明材料制成，或被覆蓋有不透明材料例如一層膠帶，以防止顯色劑暴露于光或其它電磁輻射中。應(yīng)理解膠帶或其它不透明材料也可被用于覆蓋可能含有或輸送其它光敏試劑的流體管線。
相似地，應(yīng)理解本發(fā)明的某些用途涉及溫度敏感的材料，包括但不限于DNA、蛋白質(zhì)及其組合。同樣地，發(fā)明系統(tǒng)可有選擇地包括用于生物分子的樣品處理的溫度控制。溫度控制對優(yōu)化DNA雜交和洗脫的結(jié)合和洗脫速度以及使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它要求熱循環(huán)的酶的增強(qiáng)方法進(jìn)行的DNA擴(kuò)展是有用的。高溫可通過或是在從樣品中提取分析物過程中，或是在后續(xù)清洗步驟中除去干擾物，有助于凈化樣品。正好在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的認(rèn)識范圍內(nèi)，在發(fā)明的設(shè)備中加入溫度控制元件，并且在預(yù)定可控溫度條件下在實(shí)施發(fā)明的方法。
通過參考以下具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解這些實(shí)施例本質(zhì)上還是示例性的，而不是限制性的。
實(shí)施例實(shí)施例1使用一種與酶相關(guān)連的免疫吸附劑化驗(yàn)法對在水中的TNT順序注入分析進(jìn)行一個試驗(yàn)以說明在發(fā)明系統(tǒng)中的磁性顆粒的捕獲或再懸浮情況，如下化學(xué)藥品TNT RaPID化驗(yàn)TM工具箱提供ELISA試劑(StrategicDiagnostics，Newark，DE)。所使用的試劑是TNT-辣根過氧化酶(TNT-HRP)軛合物，顯色溶液(3，3’，5，5’-N四甲聯(lián)苯胺和H2O2)和具有固定的抗-TNT抗體的不規(guī)則0.5微米直徑磁性顆粒的懸浮液。該顯色試劑溶液含有生色基底3，3’，5，5’-N四甲聯(lián)苯胺(TMB)和H2O2。具體配方是私有的，但是最佳的試劑配方已被發(fā)表用于相似的使用辣根過氧化酶-莠去津軛合物的莠去津(atrazine)酶聯(lián)免疫吸附化驗(yàn)中。文獻(xiàn)參見TMB.C.S.Hottenstein，F(xiàn).M.Rubio，D.P.Herzog，J.R.Fleeker and T.S.Lawruk，“Determination of trace atrazinelevels in water by a sensitive magnetic particle-based enzymeimmunoassay”(“通過以磁性敏感顆粒為基的酶的免疫測定確定水中的莠去津的痕量水平”)，J.Agrc.Food Chem.，44(11)，(1996)3576-3581。
洗液由pH6.2 0.033M的磷酸鹽、0.033M的NaCl和0.1％聚山梨醇酯20(P20)(BiaCore，Piscataway，NJ)非離子型表面活化劑組成。洗液在流動系統(tǒng)中還起到載體溶液的作用。DNA ZapTM溶液來自Ambion公司(Austin，TX)。Supelco公司的乙腈中1000微克/毫升TNT的TNT標(biāo)準(zhǔn)溶液被稀釋以制備含pH6.2 0.033M的磷酸鹽、0.033M的NaCl和0.007％P20的TNT溶液。
設(shè)備使用在圖9中提出的流動系統(tǒng)，其中FiaLab 3000系統(tǒng)(FIAlab Instrument，Inc.，Bellevue，WA)為步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動的注射泵設(shè)有一個內(nèi)置三向閥(Carvo，Sunnyvalve，CA)和一個10端口Cheminert選擇閥(Valco，Houston，TX)。沖冼入口、顯色入口和廢物出口處為0.030英寸同前的氟化乙丙烯(FEP)管道(Valco)。顯色入口通過熱縮塑料包管遮蔽光線。保持線圈和單元出口處也遮蔽光線。該600微升的保持線圈為0.030英寸同前的聚醚醚酮(PEEK)，其來自Upchurch Scientific(Oak Habor，WA)。與磁體接觸的、自閥門向光學(xué)單元延伸的流送管為0.02英寸同前的聚醚醚酮(PEEK)。從閥門到磁性區(qū)中央的體積為22微升，且從磁性區(qū)中央到光學(xué)單元的體積為18微升。
一個1/2×1/4×5/8英寸的NdFeB永磁體由Dexter MagneticTechnologies(Winsdor Locks，CT)購得。該磁體的1/4*5/8英寸面為其磁極。一個磁極被放置靠在磁性區(qū)管道上，該管道沿5/8英寸長度方向延伸。通過精銼0.062英寸外徑0.02英寸內(nèi)徑聚醚醚酮(PEEK)管的一側(cè)直至總厚度為0.045英寸，該管道被減薄以產(chǎn)生一個磁體平表面。原則上，這樣在通道和磁體之間留下了0.004英寸的管壁。但是由于管道通道中心的變化，實(shí)際距離可能稍大于或小于該厚度。
一個透射探測元件被鉆出FEP(McMaster-Carr，Los Angeles，CA)。如圖9所示，入口、出口和探測器的光學(xué)路徑成型在U形通道中。該入口和出口被設(shè)計以容納Upchurch管道配件。通過光學(xué)路徑的流動通道為1厘米長且直徑為1毫米。發(fā)光纖維(illuminationfiber)為400微米，而收集纖維為200微米。這兩種纖維均為含在0.062英寸外徑不銹鋼端部的石英。纖維端部摩擦配合進(jìn)入流動單元。FEP的透明度使得在研發(fā)方法過程中流動通道是可見的。在實(shí)際運(yùn)轉(zhuǎn)過程中，在該單元上覆蓋膠帶以防止顯色溶液產(chǎn)生光催化作用。該LS-1型鎢鹵燈和SD-2000型電荷耦合器件(CCD)陣列分光計來自O(shè)ceanOptics(Dunedin，F(xiàn)L)。有必要使用一個NG5型濾光器(Schott GlassTechnologies，Inc.，Duryea，PA)減弱燈光。使用該濾光器，CCD的積分時間被設(shè)置為每次掃描75毫秒，以保持遠(yuǎn)離在630納米光飽和的一個安全限度。吸光度是在酶制品相對于在730納米監(jiān)測的基準(zhǔn)線的λmax即630納米處監(jiān)測到的，以修正儀器變量和混合在光學(xué)路徑中的折射率。
使用Visual C++(Microsoft，Redmond，WA)和用于控制CCD分光計的OOIWinIP動態(tài)鏈接庫(Ocean Optics)寫入系統(tǒng)軟件。
方法，半自動方法流體和磁性顆粒處理使用酶催化增強(qiáng)的在磁性顆粒上的競爭免疫測定需要多個流體和顆粒處理步驟。以下對于一種半自動方法順序進(jìn)行說明，其中競爭免疫測定在一個小瓶中進(jìn)行，以如下順序依次加入100微升的含有分析物的樣品、200微升的具有表面固定抗體的磁性顆粒的懸浮液和100微升的分析物-酶軛合物。
所述的該半自動方法在測試小瓶中混合好競爭性化驗(yàn)混合物之后開始。該儀器定時培養(yǎng)時間以使手動調(diào)節(jié)不必要，且麻煩的手動分離被在磁性流動單元中的自動顆粒捕獲，以及洗液和后面的顯色溶液的流體輸送所取代。顯色反應(yīng)時間不再依賴于手動定時和不需要使用停止溶液。取而代之的是，該儀器在一精確時間后自動輸送有色制品至檢測器。
在該半自動方法中，最初的手動步驟被用于按照如下順序?qū)NT溶液、磁性顆粒懸浮液和酶的軛合物注入到聚丙烯小瓶中，隨后進(jìn)行10秒鐘的混合。在4分鐘的培養(yǎng)時間后，使用如圖9所示的順序注入系統(tǒng)執(zhí)行如表1所示的順序注入方法。為了清楚地說明，省略了標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施細(xì)節(jié)，即在流體之間使用10升的空氣分離器，并在每一次注入之前加載流體進(jìn)入保持線圈。在每次注射移動后確定有至少0.5秒的延遲以允許在轉(zhuǎn)換選擇閥前達(dá)到壓力平衡。這有助于保持空氣部分處于大氣壓下。在流動系統(tǒng)中的載體溶液與洗液相同。較小的空氣部分最好被用于在流量控制器中將試劑從載體溶液中隔離出來，然而，必須小心不要灌注試劑的最后部分和通過流動通道的空氣分離器，這是由于空氣氣泡會干擾光學(xué)檢測。
程序化步驟被用于將競爭化驗(yàn)混合物引入體系中，捕獲具有TNT和連接至反-TNT抗體的酶的軛合物的混合物的磁性顆粒，沖洗該顆粒，將該顆粒與用于酶催化產(chǎn)生有色物質(zhì)的試劑進(jìn)行混合，保持該顆粒一段精確的顯色時間，再捕獲該顆粒，并輸送有色溶液通過用于吸光度測量的透射單元。吸光度測量的峰值面積被用于定量化。表1對標(biāo)準(zhǔn)參考半自動方法進(jìn)行了更詳盡的說明。在這一方法中，顯色時間為4分鐘。從混合物培養(yǎng)時間到吸光度測量、去除顆粒、去除混合物和空氣的顯色入口完成，整個過程耗時17.2分鐘。這一過程與超過40分鐘的手動方法化驗(yàn)時間相比較。
在所試驗(yàn)的所有場所中第二次自交后(抽穗到成行)在植物上沒有觀察到不同TR2’事件對農(nóng)藝性狀的不利之處。
e)抗地中海普通蛀莖夜蛾的功效用pTR2’-cry1Ab構(gòu)建體獲得的5株中輪生體玉米植物每株均用2個卵群感染。14天后計算損傷，并計數(shù)幼蟲數(shù)量。損傷級別為5株植物的均值。未轉(zhuǎn)化的B73植株對照以類似的方法感染。結(jié)果在表6中顯示。
表6.抗地中海普通蛀莖夜蛾的功效

實(shí)施例3.棉花中的Cry1Ab基因I.棉花中Cry1Ab事件的生成制備一用于在棉花中表達(dá)經(jīng)修飾Cry1Ab基因的構(gòu)建體。pTSVH0203構(gòu)建體含有置于組成型啟動子35S(Odell等，1985)調(diào)控下的經(jīng)修飾Cry1Ab編碼序列(編碼Hfte等(1986)所述的Cry1Ab5蛋白質(zhì)部分，該序列在ATG起始密碼子的3’插入一丙氨酸密碼子(GCT))，該序列與來自水稻(Oryza sativa)絨氈層E1基因的前導(dǎo)序列(WO92/13956)連接，具有3’ocs終止子(含有來自章魚堿合成酶基因的3’非翻譯區(qū)的聚腺苷酸化信號的片段，所述基因來自pTiAch5的TL-DNA，De Greve等，1983)。構(gòu)建體額外包含在35S啟動子控制下的bar編碼序列(吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼序列；Thompson等，1987)。

該構(gòu)建體用于轉(zhuǎn)化棉花。對獲得事件進(jìn)行分子分析以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的存在。
初始條件和入口管線準(zhǔn)備。在化驗(yàn)流程的開始，入口被設(shè)置以含有20微升洗液，并自閥門端口向外延伸(這有助于防止在閥門轉(zhuǎn)換過程中進(jìn)入不必要的空氣)，其管子的剩余部分含有空氣。為了在將溶液引入保持線圈前初始化端口，管子的體積(以前測量得到的，在程序中是一個參數(shù))加上5微升被引入保持線圈中，然后這一體積外加30微升的洗液被排廢。這就將入口管中充滿了溶液。在化驗(yàn)后，混合和顯色端口被復(fù)原回初始條件。
競爭性混合物的處理和磁性顆粒的捕獲。在引入混合物或顯色溶液前，10微升空氣部分被引入至保持線圈中。對于競爭性混合物溶液，以40微升/秒的速度將325微升的混合物引入保持線圈，使用10微升的空氣部分將混合物從載體介質(zhì)中分離出來。然后將320微升的樣品以2.5微升/秒的速度推進(jìn)以捕獲在磁性捕捉單元管壁上的磁性顆粒。該空氣部分和被拖動的洗液在混合物端口以200微升/秒的速度被遺棄。速度低于200微升/秒對于從0.03英寸的FEP管壁上除去空氣是不可靠的。至少0.007％的表面活性劑如P20的存在防止空氣在憎水性表面上中止。
清洗步驟。通過首先使用15微升溶液將其以200微升/秒的將顆粒向多端口閥門拉回的脈沖速度再懸浮在溶液中，對被捕獲的磁性顆粒進(jìn)行清洗。因此，懸浮顆粒存在于在該閥門和磁性捕獲區(qū)之間的這22微升的區(qū)域內(nèi)。然后該懸浮顆粒以2.5微升/秒的速度被推回磁性捕獲區(qū)，捕獲顆粒并向其灌注洗液。清洗步驟向前推進(jìn)115微升溶液。在標(biāo)準(zhǔn)方法中有兩個這樣的清洗步驟。其中之一完成了推進(jìn)競爭性混合物溶液通過磁性單元，隨后是清洗溶液；其中之二將該顆粒再懸浮在洗液中，再捕獲和再向其灌注洗液。
顯色和檢測。使用5微升溶液以200微升/秒的脈沖速度將該顆粒再懸浮在磁性單元和閥門之間。初始化顯色端口，并如上所述設(shè)置空氣部分；然后將200微升的顯色試劑溶液引入保持線圈中。從保持線圈向流動單元以2.5微升/秒的速度推入80微升的顯色試劑，以再捕獲磁性顆粒并向其灌注溶液。然后，使用15微升溶液以200微升/秒的脈沖速度將該顆粒再懸浮在試劑溶液中，再次將顆粒留在閥門與磁性捕獲區(qū)之間的22微升的區(qū)域中。這些顆粒存在于此用于顯色時間，在其后當(dāng)溶液以1微升/秒的速度被推進(jìn)通過透射光學(xué)單元時，他們自動被再捕獲在磁性單元中(后面的步驟使用了157微升注入，使用大多數(shù)依舊能推進(jìn)顯色峰通過光學(xué)單元的顯色試劑溶液)。
清洗和復(fù)原步驟。在每一半自動運(yùn)行周期結(jié)束時，混合物和顯色端口的入口管線通過將空氣推出而進(jìn)行清洗。在運(yùn)行之間，設(shè)置該入口至如前所述的開始狀態(tài)，并通過排出額外的載體溶液(洗液)清洗保持線圈。
圖10示出了TNT的多個標(biāo)準(zhǔn)濃度峰。在這一競爭性化驗(yàn)中，無TNT的樣品產(chǎn)生最大峰，且隨TNT的濃度增大，峰值變小。527和5000納克/毫升條件下的試驗(yàn)結(jié)果是不能辨別得出的且被視為濃度無限大(∞)。注意該∞峰面積為非零。使用緩沖溶液代替TNT-HRP軛合物進(jìn)行的試驗(yàn)導(dǎo)致峰面積半自動方法得到的∞峰面積，考慮到該∞基準(zhǔn)線不是由于剩余酶的活度。顆粒含有鐵，這應(yīng)該是在含有H2O2的顯色溶液中通過Fenton反應(yīng)形成一些著色的原因。當(dāng)在空白試驗(yàn)中使用緩沖溶液代替顆粒懸浮液時，則不出現(xiàn)峰值。
圖11示出了在時間長度為43天中單獨(dú)8天的118半自動方法試驗(yàn)結(jié)果，峰面積與TNT的標(biāo)準(zhǔn)濃度的關(guān)系曲線。它示出了校準(zhǔn)曲線預(yù)期的反曲形狀和在長時間內(nèi)的校準(zhǔn)的穩(wěn)定性。
這種類型的免疫測定數(shù)據(jù)的吸光度峰面積B通常適合于方程式1和2之中的反曲關(guān)系之一。文獻(xiàn)出處如下Fare，T.L.；Sandberg，R.G.；Herzog，D.P.；“Considerations in immunoassaycalibration”(“在免疫檢定校準(zhǔn)中需要考慮的事項”)；InEnvironmental Immunochemical Methods；Emon，J.M.V.，Gerlach，C.L.，Johnson，J.C.；American Chemical SocietyWashington，DC，1996；ACS Symposium Series 646；pp.240-253。
B/B0＝{1+(C/C0.5)b}-1(1)(B-d)/(a-d)＝{1+(C/C0.5)b}-1(2)參數(shù)B0給出了空白樣品的峰面積，因此B/B0是作為響應(yīng)量度的樣品與空白樣品的峰面積比值。C是樣品濃度，而C0.5是B/B0為50％時的樣品濃度。參數(shù)“b”則是與曲線線性區(qū)域的斜率相關(guān)的擬合參數(shù)。當(dāng)峰面積在無限濃度條件下為非零時，如圖10中的情況所示，使用方程式2中的關(guān)系式。左側(cè)為“修正的”B/B0。參數(shù)“d”是無限濃度峰面積的擬合值，而參數(shù)“a”是B0的擬合值。圖11示出了使用該半自動方法得到的這些數(shù)據(jù)的擬合曲線。
我們的結(jié)果與經(jīng)銷商具有非常合理的一致性，特別考慮了在免疫檢定中在擬合反曲校對曲線時公認(rèn)的不確定性。我們的方法以與經(jīng)銷商建議使用方法相同的比率混合抗體(在磁性顆粒上)和TNT-HRP軛合物。我們的擬合給出了在峰面積為空白樣品的峰面積(進(jìn)行無限濃度峰面積的修正)的50％時，TNT濃度值為1.51納克/毫升，而經(jīng)銷商文獻(xiàn)中的數(shù)值為1.44。當(dāng)峰面積為90％時，TNT濃度值為0.16納克/毫升，而經(jīng)銷商宣稱的數(shù)值為0.07。經(jīng)銷商使用這一標(biāo)準(zhǔn)限定檢測下限。文獻(xiàn)參見C.S.Hottenstein，F(xiàn).M.Rubio，D.P.Herzog，J.R.Fleeker and T.S.Lawruk，“Determination of trace atrazinelevels in water by a sensitive magnetic particle-based enzymeimmunoassay”(“通過以磁性敏感顆粒為基的酶的免疫測定確定水中的莠去津的痕量水平”)，J.Agrc.Food Chem.，44(11)，(1996)3576-3581。
表3列出了每一測試濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
表3用于半自動方法的每一測試濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
濃度 平均峰面積，標(biāo)準(zhǔn)偏差，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，％點(diǎn)數(shù)納克/毫升吸光度 吸光度空白 0.1087 0.00999.1 380.4681 0.0849 0.00576.7 140.9170.0736 0.00496.7 121.8170.0567 0.014 25 74.2650.0350 0.00277.7 109.3450.0270 0.00259.4 818.760.0212 0.00073 3.4 847.550.0143 0.001711.84110.40.0138 0.00128.9 4527.10.0120 0.00096 8.0 55000 0.0113 0.00048 4.3 5
兩個相對于重復(fù)的空白試驗(yàn)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差是用于限定檢測極限的另一種措施，文獻(xiàn)參見C.S.Hottenstein，F(xiàn).M.Rubio，D.P.Herzog，J.R.Fleeker and T.S.Lawruk，“Determination oftrace atrazine levels in water by a sensitive magneticparticle-based enzyme immunoassay”(“通過以磁性敏感顆粒為基的酶的免疫測定確定水中的莠去津的痕量水平”)，J.Agrc.FoodChem.，44(11)，(1996)3576-3581，且其還被報導(dǎo)為一種工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法。文獻(xiàn)參見Deshpande，S.S.Enzyme ImmunoassaysFrom Conceptto Product Development(酶的免疫檢定從概念到產(chǎn)品研發(fā))；Chapman & HallNew York，1996，p.323?？瞻缀蜆?biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)的絕大多數(shù)數(shù)據(jù)是在平均值的兩個標(biāo)準(zhǔn)偏差之內(nèi)。使用這一標(biāo)準(zhǔn)，我們的數(shù)據(jù)得到檢測極限值為0.4納克/毫升。再次值得注意的是我們的結(jié)果是基于43天的數(shù)據(jù)，而不是在一天內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)。
43天再現(xiàn)性試驗(yàn)是相當(dāng)嚴(yán)格的。對于這種TNT化驗(yàn)工具箱，經(jīng)銷商報導(dǎo)化驗(yàn)中的％CV，且在每5天的5次重復(fù)化驗(yàn)中(25個樣品)％CV在3-8％之間，并規(guī)定％CV為10％。％CV是變化系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值乘以100)，在免疫檢定文獻(xiàn)中被用于相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。文獻(xiàn)參見Deshpande，S.S.Enzyme ImmunoassaysFrom Concept to ProductDevelopment(酶的免疫檢定從概念到產(chǎn)品研發(fā))；Chapman & HallNew York，1996，p.314。我們的43天再現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果中％CV通常為6-9％，這一結(jié)果相當(dāng)好，并與經(jīng)銷商的說明書合理地保持一致。一個濃度(1.8納克/毫升，標(biāo)準(zhǔn)偏差為25％)顯然是非正常值，而幾個濃度為3-4％。為進(jìn)行附加比較，在草不綠的ELISA化驗(yàn)中Young等使用一種自動微板系統(tǒng)。(參考文獻(xiàn)Young B.S.；Parsons，A.；Vampola，C.；Wang，H.；“Evaluation of an automated immunoassay systemfor quantitative analysis of atrazine and alachlor in watersamples”(“對水樣品中的莠去津和草不綠進(jìn)行定量分析的自動免疫檢定系統(tǒng)的評價”)；In Environmental Immunochemical Methods；Emon，J.M.V.，Gerlach，C.L.，Johnson，J.C.；American ChemicalSocietyWashington，DC，1996；ACS Symposium Series 646；pp.183-190)，報導(dǎo)每一五天的重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)的％CV為2-9％。為在單獨(dú)的五天使spiked Milli-Q水樣品增至三倍，％CV值大于7％。對于以磁性顆粒為基礎(chǔ)的莠去津的免疫檢定，已報導(dǎo)重復(fù)超過5天的％CV值為5-10％。文獻(xiàn)參見C.S.Hottenstein，F(xiàn).M.Rubio，D.P.Herzog，J.R.Fleeker and T.S.Lawruk，“Determination of trace atrazinelevels in water by a sensitive magnetic particle-based enzymeimmunoassay”(“通過以磁性敏感顆粒為基的酶的免疫測定確定水中的莠去津的痕量水平”)，J.Agrc.Food Chem.，44，(1996)3576-3581。由此我們得出結(jié)論我們的43天再現(xiàn)性試驗(yàn)的精確性非常好。
與手動方法對比上述該方法被設(shè)計如手動方法一樣操作，只是具有較小的試劑體積和較短的反應(yīng)時間。抗體與酶的軛合物之比與手動方法中的相同，但是我們使用200微升顆粒懸浮液和100微升TNT-HRP軛合物，而在手動方法中分別使用500微升和250微升。分別為4分鐘的培養(yǎng)時間和顯色時間明顯比在手動方法中15分鐘的培養(yǎng)時間和20分鐘的顯色時間短。我們的較短的時間足以得到足夠的峰面積，雖然該較短的時間并不會明顯縮短整個分析時間。
自動控制減少了由于在手動方法中的不一致性而產(chǎn)生的可變性，如培養(yǎng)時間和顯色時間。本發(fā)明對半自動和自動方法進(jìn)行了說明，且在43天再現(xiàn)性試驗(yàn)中顯示出良好的結(jié)果。
顯色數(shù)據(jù)的分析顯色時間的增加如預(yù)期增加了產(chǎn)品的產(chǎn)生，如下表4中空白樣品數(shù)據(jù)(使用標(biāo)準(zhǔn)參考半自動方法)與顯色時間的關(guān)系所示。
表4顯色時間的影響作用

較長的顯色時間可以獲得較大的峰面積，但是這樣做沒有明顯的優(yōu)勢。應(yīng)該注意的是在手動方法中使用500微升顯色溶液，然后加入500微升(中止溶液)stop solution進(jìn)行稀釋。該有色溶液被均勻分配為1毫升。在流動系統(tǒng)中，具有軛合的酶的磁性顆粒在22微升管道區(qū)內(nèi)，且該有色峰以大約50微升泵送體積通過光學(xué)單元。無疑的是1毫米(約0.04英寸)流動單元直徑。因此，該有色產(chǎn)品比手動方法中至少濃20倍。此外，我們已注意到在酸溶液中，中性pH的藍(lán)色產(chǎn)品比黃色產(chǎn)品具有更高的吸光度峰值。
培養(yǎng)時間的增長增加了空白樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品二者的峰面積，如表5所示。
表5競爭性混合培養(yǎng)時間的影響作用時間，空白峰面積，標(biāo)準(zhǔn)峰面積，B/B0分鐘 B0B0.5 0.0765 0.0289 0.3781 0.0782 0.0308 0.3942 0.0948 0.0351 0.3704 0.109 0.0350 0.3228 0.160 0.0470 0.294160.224 0.0531 0.237在培養(yǎng)時間長于1分鐘時，用B/B0表示的響應(yīng)隨時間略減小，如圖5所示。例如，對于使用4.3納克/毫升樣品，B/B0值在試驗(yàn)過程中從4分鐘至8分鐘由0.32變至0.29。從4分鐘至16分鐘斜率未發(fā)生變化。由于化驗(yàn)在經(jīng)銷商建議的15分鐘內(nèi)不能達(dá)到平衡態(tài)，因此競爭性混合物的選擇是有些任意的。以注意到非平衡態(tài)化驗(yàn)的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)Deshpande，S.S.Enzyme ImmunoassaysFrom Concept toProduct Development(酶的免疫檢定從概念到產(chǎn)品研發(fā))；Chapman& HallNew York，1996，p.309。不能控制培養(yǎng)時間可影響分析的重現(xiàn)性。在我們的半自動化驗(yàn)中，培養(yǎng)期是自動定時的。
我們檢驗(yàn)了其它一些能夠影響校準(zhǔn)重現(xiàn)性的因素。在方法實(shí)施全過程中為顯色溶液遮蔽光線使得分析的峰面積產(chǎn)生相當(dāng)?shù)牟町悾疫@一點(diǎn)對于重現(xiàn)性很重要。當(dāng)使用光學(xué)潔凈的管道時，通過顯色溶液的光反應(yīng)，室內(nèi)照明已被證明對化驗(yàn)基準(zhǔn)線有影響作用。盡管不是十分必要，該抗體-衍生磁性顆粒、TNT-酶的軛合物和顯色試劑溶液還是被小心地保持在0℃。試劑經(jīng)銷商實(shí)際上已說明即在使用前，酶的軛合物和顆粒必須達(dá)到室溫。作為一個測試，酶和抗體溶液被有意地至于室溫中8.25小時且在室溫中被使用?？瞻讟悠泛?.265納克/毫升TNT的峰面積正好位于如下所述且如圖11所示的校準(zhǔn)重現(xiàn)性試驗(yàn)的誤差容許范圍內(nèi)(該圖實(shí)際包括這些室溫試驗(yàn))。
實(shí)施例2在化驗(yàn)之間的設(shè)備清洗攜帶物清洗為從樣品中去除攜帶物，使用丙酮采用如表2中所示的步驟對系統(tǒng)進(jìn)行清洗。這一沖洗步驟需要進(jìn)行兩分鐘。
表2在運(yùn)行之間的用于清洗的順序注入方法

表2中概述的自動丙酮清洗方法對于從達(dá)到和包括5000納克/毫升TNT的最大測試濃度的半自動方法中去除TNT攜帶物是有效的。未清洗時該攜帶物誤差的特征在于，測試一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，隨后是空白樣品9.3，空白樣品，110，空白樣品，527，空白樣品，5000納克/毫升，空白樣品。基于得出的峰面積，空白樣品的表觀濃度為0.1、0.6、1.2和1.1納克/毫升。使用丙酮清洗方法后，就沒有可測到的攜帶物了。
實(shí)施例3方法，全自動方法除了通過將樣品、顆粒懸浮液和TNT-HRP溶液以疊層的方式拉入保持線圈而自動進(jìn)行樣品和試劑的混合外，該自動方法與半自動方法相同。疊層體積例如，顆粒和TNT-HRP分別為10微升、15微升和15微升，且該層重復(fù)疊置10次以輸出總體積為100、150和150微升的溶液。半自動方法和自動方法的重要差別在于在自動方法中，自由樣品TNT被拉入流動系統(tǒng)中且可受到管道或閥門表面的吸引。在半自動方法中，TNT在流動系統(tǒng)中進(jìn)行處理之前，有機(jī)會粘到磁性顆粒上。
在層疊后，該由三部分構(gòu)成的混合物立即被注入捕獲單元中。因此，自動方法中的競爭性化驗(yàn)培養(yǎng)時間由要求用于層疊的時間加上在磁體處捕獲顆粒的時間(總共為4.25分鐘)限定。整個方法要耗時15.8分鐘，以將溶液吸入保持線圈為開始，并以排出顆粒為結(jié)束。
校準(zhǔn)穩(wěn)定性測試-自動方法為評價自動方法并測試校準(zhǔn)的穩(wěn)定性，使用自動方法在14天時間長度上面對83個校準(zhǔn)樣品，從空白樣品到100納克/毫升進(jìn)行測試。這些自動校準(zhǔn)數(shù)據(jù)如圖12所示。
在兩個星期的測試中，校準(zhǔn)基本穩(wěn)定，但是在最高測試濃度100納克/毫升進(jìn)行的一些測試完成后，很明顯存在攜帶物，低于下一樣品的預(yù)期結(jié)果。這些點(diǎn)被包含在圖12中，在曲線上帶有“X”標(biāo)記，在100納克/毫升進(jìn)行測試后空白樣品的測試是特別值得注意的。這些點(diǎn)未被包括在統(tǒng)計數(shù)據(jù)中。
在無清洗的測試中，100納克/毫升在后面的空白樣品中引起攜帶效應(yīng)，但是在低濃度條件下不行。使用DNA-zap，而不是丙酮作為清洗溶液實(shí)施該自動方法，且這樣不會阻止在100納克/毫升條件下產(chǎn)生攜帶物問題(DNA-zapTM是一種由兩部分構(gòu)成且在混和前和反應(yīng)后無害的試劑，這使得將其作為流動系統(tǒng)清潔劑很具有吸引力。其專有的配方的作用是通過斷開磷酸鹽-糖的連接進(jìn)行在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)增強(qiáng)之前消除表面上的DNA污染物)。
在兩星期校準(zhǔn)調(diào)節(jié)的結(jié)尾，測試一個5000納克/毫升的樣品，這會帶來持久的攜帶物，其不能使用DNA-zap或丙酮清洗去除。拆除和清潔閥門對于解決攜帶物是有必要的。這與半自動方法形成十分鮮明的對比，在半自動方法中，常規(guī)可使用丙酮清洗對5000納克/毫升的樣品進(jìn)行測試，并在后面無清洗的空白樣品測試中產(chǎn)生僅為1.1納克/毫升的表現(xiàn)TNT濃度。
在方法研發(fā)過程中，至少使用96次由0.3M KOH和0.03M Na2SO3組成的水溶液混合物，以通過形成具有氫氧化物和亞硫酸鹽的可溶陰離子型TNT加合物進(jìn)而去除TNT攜帶物。這種方法通常是令人滿意的，但是取代它的丙酮法更加可靠。
實(shí)施例4顆粒捕獲和再懸浮評價通過以不同的流速使一個50微升的顆粒懸浮區(qū)通過磁性捕獲區(qū)和測量吸光度下游對顆粒捕獲進(jìn)行評價。相對于無磁體存在的峰面積，在對流速變化進(jìn)行修正后，混濁度峰面積在2.5微升/秒時，為0.6％；在5微升/秒時，為7％；在10微升/秒時，為60％。因此在2.5微升/秒時，99％的磁性顆粒被捕獲。在以下所述的校準(zhǔn)穩(wěn)定性結(jié)果中，顆粒捕獲和釋放的重現(xiàn)性是明顯的。
流速從零到200微升/秒的突然變化被用于從磁性單元管壁上置換出被捕獲的顆粒。已發(fā)現(xiàn)200和400微升/秒的流速對于顆粒的釋放均是有效的。在隨后的空白樣品測試中無攜帶物酶的活性。然而，以200微升/秒流速分散的顆粒少于400微升/秒流速，因此作為優(yōu)選。顆粒的釋放沿兩個方向進(jìn)行。在完成化驗(yàn)之后，顆粒被釋放向前通過透射光學(xué)單元并被排出。在這種方法中，顆粒以5微升或15微升的脈沖以200微升/秒的速度被釋放返回閥門，以將其再懸浮在磁體和閥門之間的22微升的區(qū)域中。這種方法對于在試劑溶液中懸浮顆粒用于顯色特別有用，但是它也被用于沖洗步驟中。在顯色之后，當(dāng)推動溶液以1微升/秒的速度通過透射光學(xué)單元時，顆粒在捕獲區(qū)被再捕獲。與將顆粒留在靠在磁性單元壁上的層中相比，顆粒再懸浮為沖洗和催化步驟提供了更好的表面可達(dá)性。此外，再懸浮防止形成顆粒凝聚體，如果磁性顆粒留在磁性區(qū)中的時間過長，這將產(chǎn)生問題。這就是為什么剛剛在排出空氣部分和顯色入口初始化步驟前，在表1的步驟4和步驟10中使用5微升脈沖將顆粒再懸浮的原因所在?？諝獠糠直挥糜诜蛛x如上所述的被拉入保持線圈(競爭性混合和顯色試劑溶液)的溶液。
實(shí)施例5另一種可選的方法考慮兩種其它方法。其中之一是首先加入沒有標(biāo)簽的分析物，一種用于增加敏感性的順序性方法。參考文獻(xiàn)Deshpande，S.S.Enzyme ImmunoassaysFrom Concept to Product Development(酶的免疫檢定從概念到產(chǎn)品研發(fā))；Chapman & HallNew York，1996，p.309。在加入TNT-HRP前，當(dāng)4.265納克/毫升的TNT樣品與抗體顆粒被培養(yǎng)16分鐘時，得到的峰面積與混合有3種試劑而無附加培養(yǎng)的情況相同。對于這種改變了的4.265納克/毫升的測試，預(yù)測的峰面積為4.3納克/毫升。
在逆向?qū)嶒?yàn)中，顆粒與TNT-HRP一起進(jìn)行培養(yǎng)，被沖洗三次、并與TNT一起進(jìn)行培養(yǎng)。化驗(yàn)的顯色部分被用作在培養(yǎng)后剩余的粘結(jié)TNT-HRP的一個量度。當(dāng)TNT樣品被培養(yǎng)16分鐘時，TNT-HRP的置換僅在微克/毫升的范圍內(nèi)是有意義的。一個5000納克/毫升的TNT樣品導(dǎo)致形成空白樣品峰面積的71.7％(重復(fù)三次的試驗(yàn)結(jié)果的平均值)。在競爭性化驗(yàn)中，這一濃度表示無限的TNT濃度，其完全消除了在顯色步驟中的HRP的活度。
進(jìn)行一個另外可選的實(shí)驗(yàn)，其中莠去津-HRP軛合物(同樣也來自Strategic Diagnostics)取代TNT-HRP被用在空白樣品測試中，產(chǎn)生空白樣品峰面積為得到的TNT-HRP峰面積的17％。這些結(jié)果表明涂覆有抗體的磁性顆粒還可以粘結(jié)莠去津-HRP，建議不考慮軛合的分析物或分析物-類似物，可存在一些HRP親和力。
被引用或列在本發(fā)明書中的全部參考文獻(xiàn)，包括出版物、專利和專利申請在此作為參考被加入，這就好象每一單個參考文獻(xiàn)逐一地和單獨(dú)地被指向作為參考被加入并在此整體被列出。此外，任何理論、建議的操作機(jī)制、或在此所陳述的發(fā)現(xiàn)均意味著進(jìn)一步增強(qiáng)對本發(fā)明的理解，且不是以任何方式將本發(fā)明限制在這種理論、建議的操作機(jī)制、或發(fā)現(xiàn)中。
盡管在附圖和前面的說明中已詳細(xì)示出并對本發(fā)明進(jìn)行了說明，應(yīng)認(rèn)為在性質(zhì)上它是示例性的，而非限制性的。應(yīng)該理解僅示出優(yōu)選實(shí)施例并對優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了說明，在本發(fā)明精神范圍內(nèi)進(jìn)行任何改動或變化是受到保護(hù)的。
權(quán)利要求
1.一種方法，包括提供流體流動通道，該流體流動通道具有第一和第二端，能有效地、可變化地在流動通道上施加正的或負(fù)的壓力，以使受控制的流體沿第一或第二方向以預(yù)定的速度流經(jīng)流體流動通道的流體流動控制器；以及介于第一和第二端之間的捕獲區(qū)，其中一個固定的磁場與流體流動通道在捕獲區(qū)相交；在流體流動通道內(nèi)提供第一混合物，其包括多個分散在載體介質(zhì)中的固體磁性顆粒；使第一混合物以第一預(yù)定捕獲速度穿過捕獲區(qū)，由此通過磁場力使大部分的磁性顆粒在捕獲區(qū)被捕獲并由此從載體介質(zhì)中分離，從而形成第一磁性顆粒隔離體；用第一分散介質(zhì)灌注第一磁性顆粒隔離體；以及用脈沖使第一分散介質(zhì)以第一預(yù)定分散速度通過捕獲區(qū)，有效地將第一磁性顆粒隔離體從捕獲區(qū)移走，從磁場移走磁性顆粒以及在第一分散介質(zhì)中懸浮磁性顆粒以提供第二混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述第一混合物經(jīng)過、所述灌注、所述脈沖發(fā)生和所述第二混合物經(jīng)過期間，該固定磁場的強(qiáng)度基本上是恒定的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該固定磁場由與流體流動通道具有固定的相互關(guān)系的永磁體提供。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該固定磁場由與流體流動通道具有固定的相互關(guān)系并能夠產(chǎn)生固定的磁場的電磁體提供。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該磁性顆粒包括對于目標(biāo)物質(zhì)具有有選擇的親和性的表面粘附的選擇性藥劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中帶有表面粘附的選擇性藥劑的該磁性顆粒對于在樣品中有選擇地留存化合物或生物物質(zhì)是有效的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該磁性顆粒包括適于通過非特定的交互作用吸附多種目標(biāo)物質(zhì)的性質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中該非特定的交互作用從以下由靜電交互作用、范德華交互作用、偶極子-偶極子交互作用和氫鍵交互作用構(gòu)成的組中進(jìn)行選擇。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該第一分散介質(zhì)包括樣品。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該選擇性藥劑有效地將生物物質(zhì)留存在樣品中，且其中該選擇性藥劑從以下由抗原、抗體、蛋白質(zhì)受體、配位體、低聚核苷酸、鏈?zhǔn)娇股锼氐鞍?、抗生物素蛋白、生物素和外源凝集素?gòu)成的組中進(jìn)行選擇。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中該選擇性藥劑為抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該樣品包括用于酶聯(lián)免疫吸附化驗(yàn)(ELISA)的分析物樣品；其中該選擇性藥劑為有選擇地留存分析物的抗體；且其中該樣品進(jìn)一步包括分析物-酶的軛合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該分析物-酶的軛合物包括一種具有特定催化活性和對分析試劑具有專一性的酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該載體介質(zhì)包括樣品。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中該混合物被培養(yǎng)第一段時間，以有效地使選擇性藥劑接觸并存留在該物質(zhì)中。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該第一分散介質(zhì)為第一洗液。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，進(jìn)一步包括使第二混合物以第二預(yù)定捕獲速度穿過捕獲區(qū)，在該速度下通過磁場力大部分的磁性顆粒在捕獲區(qū)被捕獲并由此從第一分散介質(zhì)中去除，從而形成第二磁性顆粒隔離體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，進(jìn)一步包括用第二分散介質(zhì)灌注第二磁性顆粒隔離體；以及用脈沖使第二分散介質(zhì)以第二預(yù)定分散速度通過捕獲區(qū)，有效地將第二磁性顆粒隔離體從捕獲區(qū)移走，從磁場移動磁性顆粒以及在第二分散介質(zhì)中懸浮磁性顆粒以提供第三混合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中該第二分散介質(zhì)包括分析試劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，進(jìn)一步包括使第三混合物以第三預(yù)定捕獲速度穿過捕獲區(qū)，在該速度下通過磁場力大部分的磁性顆粒在捕獲區(qū)被捕獲并由此從第二分散介質(zhì)中去除，從而形成第三磁性顆粒隔離體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中該流動通道進(jìn)一步包括一個一個檢測區(qū)，且其中定位一個檢測器以檢測該檢測區(qū)中的流體的物理或化學(xué)性能；且進(jìn)一步包括在使第三混合物穿過捕獲區(qū)之后，檢測從以下由第二分散介質(zhì)和第三磁性顆粒隔離體構(gòu)成的組中選擇的構(gòu)件的物理或化學(xué)性能。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中該分析試劑為著色劑；且其中該檢測器為光學(xué)檢測器。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，進(jìn)一步包括使第二溶液穿過檢測區(qū)；并測定第二溶液的性質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中該第二分散介質(zhì)包括第二洗液。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，進(jìn)一步包括使第三混合物以第三預(yù)定捕獲速度穿過捕獲區(qū)，在該速度下通過磁場力大部分的磁性顆粒在捕獲區(qū)被捕獲并由此從第二分散介質(zhì)中去除，從而形成第三磁性顆粒隔離體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，進(jìn)一步包括用第三分散介質(zhì)灌注第三磁性顆粒隔離體；以及用脈沖使第三分散介質(zhì)以第三預(yù)定分散速度通過捕獲區(qū)，有效地將第三磁性顆粒隔離體從捕獲區(qū)移走，從磁場移動磁性顆粒以及在第三分散介質(zhì)中懸浮磁性顆粒以提供第四混合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，進(jìn)一步包括使第四混合物以第四預(yù)定捕獲速度穿過捕獲區(qū)，在該速度下通過磁場力大部分的磁性顆粒在捕獲區(qū)被捕獲并由此從第三分散介質(zhì)中去除，從而形成第四磁性顆粒隔離體。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該流動通道進(jìn)一步包括一個一個檢測區(qū)，且其中定位一個檢測器以檢測該檢測區(qū)中的流體的物理或化學(xué)性能；且進(jìn)一步包括在使第四混合物穿過捕獲區(qū)之后，檢測從以下由第三分散介質(zhì)和第四磁性顆粒隔離體構(gòu)成的組中選擇的構(gòu)件的物理或化學(xué)性能。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中該第二分散介質(zhì)包括分析試劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中該分析試劑為著色劑；且其中該檢測器為光學(xué)檢測器。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該磁場在捕獲區(qū)中具有從約0.1至約2千高斯/厘米的磁場梯度。
32.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該流動通道具有從約0.01至約50微升的體積。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該流動通道具有從約0.001至約5毫米的平均直徑。
34.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一預(yù)定捕獲速度大小為約1.0-約13毫米/秒。
35.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一預(yù)定分散速度大小為約250-約2500毫米/秒。
36.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該流動通道為微通道。
37.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一混合物的穿過包括沿第一方向穿過；其中所述第一分散介質(zhì)的穿過包括沿與第一方向相反的第二方向穿過；且其中所述第二混合物的穿過包括沿第一方向穿過。
38.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該流量控制器包括包括一個一級端口和多個二級端口的多端口選擇閥，其中第一個二級端口與流體流動通道的入口流體相連；具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的保持線圈，其中該遠(yuǎn)端與該選擇閥的一級端口流體相連；具有與該保持線圈的近端流體相連的第一端口；與該變速可倒轉(zhuǎn)泵流體相連的第二端口；和與洗液組分源流體相連的第三端口的三向閥。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中該變速可倒轉(zhuǎn)泵為步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動的注射泵。
40.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中該多端口選擇閥、三向閥和泵由預(yù)編程序的計算機(jī)進(jìn)行控制。
41.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在捕獲區(qū)中的該流動通道基本上沒有固定的可磁化的固體基體結(jié)構(gòu)。
42.一種設(shè)備，包括流體流動通道，該流體流動通道具有第一和第二端以及介于第一和第二端之間的捕獲區(qū)；流體流動控制器，其有效地，可變化地在流動通道上施加正的或負(fù)的壓力，以引起受控制的流體沿第一或第二方向以預(yù)定的速度流經(jīng)流體流動通道；產(chǎn)生固定磁場的磁場源，該源相對于流體流動通道固定，由此該場與流體流動通道在捕獲區(qū)相交；以及用于檢測流動通道內(nèi)的流體的物理或化學(xué)性能的檢測器。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該檢測器為光學(xué)檢測器。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該固定磁場源包括永磁體。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該固定磁場源包括電磁體。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該磁場具有從約0.1至約2千高斯/厘米的場強(qiáng)。
47.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中在捕獲/分散區(qū)域內(nèi)的該流動通道具有從約1至約50微升的體積。
48.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該流動通道具有從約0.1至約5毫米的平均直徑。
49.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該流體流量控制器有效地在流體流動通道中任一方向上提供最高達(dá)約2500毫米/秒的流速。
50.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該控制器包括一個與流體流動通道流體連通的可倒轉(zhuǎn)泵。
51.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該流量控制器包括包括一個一級端口和多個二級端口的多端口選擇閥，其中第一個二級端口與流體流動通道的入口流體相連；具有一個近端和一個遠(yuǎn)端的保持線圈，其中該遠(yuǎn)端與該選擇閥的主端口流體相連；具有與該保持線圈的近端流體相連的第一端口；與該變速可倒轉(zhuǎn)泵流體相連的第二端口；和與洗液組分源流體相連的第三端口的三向閥。
52.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該變速可倒轉(zhuǎn)泵為步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動的注射泵。
53.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中該多端口選擇閥、三向閥和泵由預(yù)編程序的計算機(jī)進(jìn)行控制。
54.根據(jù)權(quán)利要求42所述的設(shè)備，其中在捕獲區(qū)中的該流動通道基本上沒有固定的可磁化的固體基體結(jié)構(gòu)。
55.一種設(shè)備，包括一條流體流動通道，該流體流動通道具有第一和第二端以及介于第一和第二端之間的捕獲區(qū)；一個流體流動控制器，其有效地，可變化地在流動通道上施加正的或負(fù)的壓力，以引起受控制的流體沿第一或第二方向以預(yù)定的速度流經(jīng)流體流動通道；以及多個磁場源，每一磁場源產(chǎn)生固定磁場，且每一磁場源相對于流體流動通道以固定關(guān)系定位，由此每一磁場與流體流動通道在捕獲區(qū)相交；其中每一捕獲區(qū)通過一個基本沒有磁場的區(qū)域與一個或多個其它捕獲區(qū)分離開。
56.一種設(shè)備，包括具有第一和第二端以及介于第一和第二端之間的捕獲區(qū)的流體流動通道裝置；用于在流體流動通道中提供包括有分散在載體介質(zhì)中的多個固體磁性顆粒的第一混合物的裝置；用于可變化地在流體流動通道裝置上施加正的或負(fù)的壓力，以引起受控制的流體沿第一或第二方向以預(yù)定的速度流經(jīng)流體流動通道的裝置；以及用于提供與流體流動通道在捕獲區(qū)相交的固定磁場的裝置。
57.一種方法包括使包括有分散在載體介質(zhì)中的多個固體磁性顆粒的混合物以第一預(yù)定捕獲速度穿過延伸通過固定磁場的管道，由此磁性顆粒在該磁場作用下被捕獲并由此從載體介質(zhì)中分離，從而形成磁性顆粒隔離體；使分散介質(zhì)進(jìn)入該管道并與磁性顆粒隔離體相接觸；以及用脈沖使分散介質(zhì)以第一預(yù)定分散速度通過該管道，有效地在磁場中移動磁性顆粒以及在分散介質(zhì)中懸浮磁性顆粒。
58.一種方法包括使包括有分散在載體介質(zhì)中的多個固體磁性顆粒的第一混合物以第一預(yù)定捕獲速度穿過延伸通過固定磁場的管道，由此磁性顆粒在該磁場作用下被捕獲并由此從載體介質(zhì)中分離，從而形成磁性顆粒隔離體；通過用脈沖使分散介質(zhì)以第一預(yù)定分散速度通過該管道，從磁場中釋放磁性顆粒隔離體，以有效地在磁場中移動磁性顆粒以及在分散介質(zhì)中懸浮磁性顆粒，以提供第二混合物；以及通過使第二混合物沿與所述第一混合物運(yùn)動相反的方向以第二預(yù)定捕獲速度通過該磁場，再捕獲磁性顆粒，由此磁性顆粒在該磁場作用下被捕獲并由此從載體介質(zhì)中分離，從而形成磁性顆粒隔離體。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中該第一混合物具有與第二混合物不同的成分。
全文摘要
發(fā)明的方法和設(shè)備(1，2)對于在一個或多個磁場中收集磁性顆粒并將顆粒再懸浮在分散介質(zhì)中，并通過控制流經(jīng)流體流動通道(10)的流體流的方向和速度，有選擇地在相同或不同介質(zhì)中有選擇地重復(fù)進(jìn)行一次或多次收集/再懸浮是有用的。該方法提供用于測試樣品和試劑接觸衍生顆粒、過量試劑的去除、磁性材料的沖洗、和在其它用途中再懸浮以用于分析。該方法適用于寬范圍的對磁性標(biāo)記包括例如細(xì)胞、病毒、低聚核苷酸、蛋白質(zhì)、荷爾蒙、受體－配合體的絡(luò)合物、環(huán)境污染物等敏感的化合物和生物材料。
文檔編號C12Q1/25GK1650162SQ02821759
公開日2005年8月3日 申請日期2002年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者J·W·格拉特, C·J·布魯克納－李, D·A·霍爾曼 申請人:巴特爾紀(jì)念研究院