專利名稱：蚯蚓纖溶酶多種組分及其分離、純化、制備工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開蚯蚓纖溶酶多種組分及其分離、純化、制備工藝，屬于生物化學(xué)制藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自從1983年日本Mihara等發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)存在強(qiáng)烈溶解血纖維蛋白及血栓作用的蛋白酶以來(Mihara H，Sumi H，Akazawa T，et al.Fibrinolytic enzyme extracted from theearthworm.Thromb Haemostas，1983，50258-263.)，蚯蚓纖溶酶在國(guó)內(nèi)外得到了廣泛的研究，并作為新型溶栓藥物被應(yīng)用于臨床，中科院生物物理所以赤子愛勝蚓(Eisenia Fetida)為原料已制成用于預(yù)防和治療血栓病的口服膠囊。該膠囊的主要成分(蚓激酶粗品)中含有多種活性組分。但是，到目前為止，蚯蚓纖溶酶究竟有多少種組分，哪種組分具有纖溶酶原激化物活性等重要問題并未得到詳細(xì)的研究，各種組分的生化性質(zhì)國(guó)內(nèi)外的報(bào)道也并不一致(從玉文，劉耀明，陳家佩。蚓激酶的研究進(jìn)展，中國(guó)生化藥物雜志，2001，21(3)159-162.)，除Mihara等1993年比較全面地報(bào)道了Lumbricus rubellus蚯蚓纖溶酶各組分外，其它關(guān)于蚯蚓纖溶酶的報(bào)道都不夠系統(tǒng)、深入。這使得對(duì)蚯蚓纖溶酶，特別是我國(guó)廣泛使用的EiseniaFetida蚯蚓纖溶酶進(jìn)行進(jìn)一步系統(tǒng)、深入的研究成為必要，包括該酶各組分的生化性質(zhì)、藥理、藥效、毒理實(shí)驗(yàn)以及蚯蚓纖溶酶的結(jié)構(gòu)與功能的研究等，而對(duì)于所有這些研究，制備大量的蚯蚓纖溶酶各組分的純品都是首要的前提。
CN1089369C的專利公開了一種蚓激酶粗品的制備方法，但是目前尚未見關(guān)于赤子愛勝蚓中蚯蚓纖溶酶各組分精確的分子量、N端序列、等電點(diǎn)以及可以規(guī)?；貜某嘧訍蹌衮局邢到y(tǒng)地分離、純化、制備蚯蚓纖溶酶各個(gè)組分生產(chǎn)工藝的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供來自赤子愛勝蚓的蚯蚓纖溶酶七種組分精確的分子量、N端序列和等電點(diǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種以蚓激酶粗品為原料制備蚯蚓纖溶酶各組分純品的工藝，且制備工藝可根據(jù)需要逐級(jí)放大。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案蚯蚓纖溶酶多種組分及其分離、純化、制備工藝，該工藝包括如下步驟(1)粗分離溶解蚓激酶粗品，用陰離子交換層析柱進(jìn)行粗分離，得到三個(gè)活性峰，D1，D2，D3；(2)精細(xì)純化D1過陰離子交換層析柱，得到三個(gè)活性峰D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3，每個(gè)活性峰分別過疏水層析柱得到純品D1RQ1H即EFE-f，D1RQ2H即EFE-e，D1RQ3H即EFE-d；D2過疏水層析柱，收集活性峰過陰離子交換層析柱純化，得到一活性組分純品，即EFE-a；D3過疏水層析柱得到兩個(gè)活性峰D3H1、D3H2，將D3H1過陰離子交換層析柱純化，得到兩個(gè)活性組分純品D3H1M1即EFE-b，D3H1M2即EFE-c；將D3H2過疏水層析柱收集活性峰，得到一活性組分的純品D3H2P1即EFE-g。
所述的陰離子交換層析柱選自DEAE柱、RESOURCE Q柱、SOURCE 15 Q柱和MonoQ柱。
所述的疏水層析柱選自RESOURCE ISO柱、RESOURCE PHE柱和SOURCE 15 PHE柱。
根據(jù)所述的工藝制備的蚯蚓纖溶酶多利組分，它們分別具有下列分子量(MOLDI-TOFMS測(cè)定值)、N末端序列和等電點(diǎn)值(1)EFE-a，24663，VIGGTNASPGEFPWQLQ， 3.46；(2)EFE-b，29515，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.50；(3)EFE-c，29690，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.50；(4)EFE-g，29595，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.46；(5)EFE-d，24201，IIGGSNASPGEFPWQL， 3.68；(6)EFE-e，24170，IIGGSNASPGEFPWQL， 3.62；(7)EFE-f，23028，VVGGS DTTKGQYP， 3.94。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.首次公開了來源于赤子愛勝蚓的蚯蚓纖溶酶7種組分的精確分子量、N端序列、等電點(diǎn)；2.通過本流程可以系統(tǒng)地制備7個(gè)組分EFE-a、EFE-b、EFE-c、EFE-d、EFE-e、EFE-f、EFE-g。3.通過本流程制備的活性組分純度較高。每種組分在15％的SDS-PAGE上均為一條帶(見說明書附圖)，高效液相層析呈現(xiàn)一個(gè)峰的水平(EFE-d、EFE-e除外)，在適宜條件下都可以結(jié)晶，表明其純度較高，且處于活性形式。4.本流程制備的各組分用纖維平板法測(cè)得其纖溶活性從每mg250尿激酶活性單位到800尿激酶活性單位。5.本流程可以直接滿足實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的制備，對(duì)于生產(chǎn)規(guī)模的制備經(jīng)適當(dāng)調(diào)整相應(yīng)放大后也可滿足。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。


圖1為本發(fā)明純化組分的SDS-PAGE電泳圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1蚯蚓纖溶酶多種組分的分離、提純、制備工藝一、材料1、蚓激酶粗品，中科院生物物理所蚯蚓纖溶酶研究組提供。
2、層析柱HiPrep16/10 DEAE柱，陰離子交換層析柱RESOURCE Q(6ml)，陰離子交換層析柱Mono Q HR5/5，陰離子交換層析柱RESOURCE ISO，疏水層析柱RESOURCE PHE，疏水層析柱以上層析柱均購(gòu)自Pharmacia Biotech公司。
3、溶液(1)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5；(2)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5，含1mol/L NaCl；(3)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5；(4)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl；(5)0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，含3.0mol/L(NH4)2SO4；(6)50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，含1.5mol/L(NH4)2SO4；(7)50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0。
二、方法1、樣品的準(zhǔn)備取蚓激酶粗品5克，用20mmol/L pH7.5的Tris-HCl Buffer溶解，配成50mg/ml的溶液。
2、層析柱的使用以下所用層析柱(均為Pharmacia Biotech公司預(yù)裝柱)的使用均按照層析柱所附說明書進(jìn)行。
3、粗分離采用HiPrep 16/10 DEAE柱進(jìn)行粗分離。每次取上述溶解好的樣品4ml(200mg)上樣。以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5為初始緩沖液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5，含1mol/L NaCl為洗脫緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，流速為3ml/min，溫度為19℃，得到三個(gè)活性峰，D1，D2，D3。
4、精細(xì)純化(1)D1濃縮后對(duì)50mmol/L NH4HCO3透析，然后凍干。每次取凍干產(chǎn)物15mg溶解在20mmol/L pH8.5的Tris-HCl Buffer中，過RESOURCE Q(6ml)柱，以20mmol/L Tris-HClBuffer，pH8.5為初始緩沖液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl為洗脫緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，流速為3ml/min，溫度為19℃，得到三個(gè)活性峰D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3；每個(gè)活性峰濃縮、換緩沖液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5后與含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0等體積混合，然后過RESOURCE ISO柱，以50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0含1.5mol/L(NH4)2SO4，為初始緩沖液，50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0為洗脫緩沖液進(jìn)行(NH4)2SO4梯度洗脫，流速為1ml/min，溫度為23℃，得到純品D1RQ1H(即EFE-f)，D1RQ2H(即EFE-e)，D1RQ3H(即EFE-d)；(2)D2濃縮后對(duì)50mmol/L NH4HCO3透析，然后凍干。每次取凍干產(chǎn)物3mg溶解在50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0，含1.5mol/L(NH4)2SO4，中過RESOURCE ISO柱，以50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0含1.5mol/L(NH4)2SO4，為初始緩沖液，50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0為洗脫緩沖液進(jìn)行(NH4)2SO4梯度洗脫，流速為1ml/min，溫度為23℃，收集活性峰，濃縮、換緩沖液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5后過Mono Q HR5/5純化，以20mmol/LTris-HCl Buffer，pH7.5為初始緩沖液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5，含1mol/L NaCl為洗脫緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，流速為0.5ml/min，溫度為19℃，得到一活性組分純品，即EFE-a；(3)將D3濃縮、換緩沖液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5后(總體積80ml)與含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0等體積混合。每次取混合好的樣品溶液1ml，上RESOURCE ISO柱，初始緩沖液為50mmol/LNa-PiBuffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH7.0，洗脫緩沖液為50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0，采用(NH4)2SO4梯度洗脫，流速為1ml/min，溫度為23℃，得到兩個(gè)活性峰D3H1、D3H2；將D3H1濃縮、換緩沖液至20mmol/l Tris-HCl Buffer，pH7.5后過Mono Q HR5/5純化，以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5為初始緩沖液，20mmol/l Tris-HCl Buffer，pH7.5，含1mol/LNaCl為洗脫緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，流速為0.5ml/min，溫度為19℃，得到兩個(gè)活性組分純品D3H1M1(即EFE-b)，D3H1M2(EFE-c)；將D3H2濃縮后對(duì)50mmol/L NH4HCO3透析，然后凍干。每次取凍干產(chǎn)物3mg溶解在50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH 7.0中，過RESOURCE PHE，初始緩沖液為50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH 7.0，洗脫緩沖液為50mmol/L Na-PiBuffer，pH 7.0，采用(NH4)2SO4梯度洗脫，流速為1ml/min，溫度為23℃，收集活性峰，得到一活性組分的純品D3H2P1(即EFE-g)。
三、結(jié)果通過以上流程，得到各活性組分EFE-a 10.2mg，EFE-b 7.3mg，EFE-c 11.3mg，EFE-d14.2mg，EFE-e 8.6mg，EFE-f 5.2mg，EFE-g 8mg。
實(shí)施例2蚯蚓纖溶酶多種組分的分離、提純、制備工藝一、材料1、蚓激酶粗品，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物物理所百奧公司。
2、層析柱HiPrep 16/10 DEAE柱，陰離子交換層析柱，RESOURCE Q(6ml)，陰離子交換層析柱Mono Q HR5/5，陰離子交換層析柱RESOURCE ISO，疏水層析柱RESOURCE PHE，疏水層析柱以上層析柱均購(gòu)自Pharmacia Biotech公司。
3、溶液(1)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5；(2)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5；(3)20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl；(4)0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，含3.0mol/L(NH4)2SO4；(5)50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，含1.5mol/L(NH4)2SO4；(6)50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0；二、方法2.樣品的準(zhǔn)備取蚓激酶粗品5克，用20mmol/L pH8.5的Tris-HCl Buffer溶解，配成50mg/ml的溶液。
3.層析柱的使用以下所用層析柱(均為Pharmacia Biotech公司預(yù)裝柱)的使用均按照層析柱所附說明書進(jìn)行。
4.粗分離采用HiPrep16/10 DEAE柱進(jìn)行粗分離。每次取上述溶解好的樣品4ml(200mg)上樣。以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5為初始緩沖液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl為洗脫緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，流速為3ml/min，溫度為19℃，得到三個(gè)活性峰，D1，D2，D3。
4.精細(xì)純化(1)D1濃縮后換緩沖液至20mmol/L pH8.5 Tris-HCl Buffer(總體積26ml)，每次取750ul，過RESOURCE Q(6ml)柱，以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5為初始緩沖液，20mmol/l Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl為洗脫緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，流速為3ml/min，溫度為19℃，得到三個(gè)活性峰D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3；每個(gè)活性峰濃縮、換緩沖液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5后與含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0等體積混合，然后過RESOURCE ISO柱，以50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0含1.5mol/L(NH4)2SO4，為初始緩沖液，50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0為洗脫緩沖液進(jìn)行(NH4)2SO4梯度洗脫，流速為1ml/min，溫度為23℃，得到純品D1RQ1H(即EFE-f)，D1RQ2H(即EFE-e)，D1RQ3H(即EFE-d)；(2)將D3濃縮、換緩沖液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH7.5后(總體積80ml)與含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0等體積混合。每次取混合好的樣品溶液1ml，上RESOURCE ISO柱，初始緩沖液為50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH 7.0，洗脫緩沖液為50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0，采用(NH4)2SO4梯度洗脫，流速為1ml/min，溫度為23℃，得到兩個(gè)活性峰D3H1、D3H2；將D3H1濃縮、換緩沖液至20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5后過Mono Q HR5/5純化，以20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5為初始緩沖液，20mmol/L Tris-HCl Buffer，pH8.5，含1mol/L NaCl為洗脫緩沖液進(jìn)行NaCl梯度洗脫，流速為0.5ml/min，溫度為19℃，得到兩個(gè)活性組分純品D3H1M1(即EFE-b)，D3H1M2(EFE-c)；將D3H2濃縮、換緩沖液至50mmol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0后與含有3.0mol/L(NH4)2SO4的0.1mol/L Na-Pi Buffer，pH 7.0等體積混合過RESOURCE PHE，初始緩沖液為50mmol/L Na-Pi Buffer，1.5mol/L(NH4)2SO4，pH 7.0，洗脫緩沖液為50mmol/L Na-Pi Buffer，pH7.0，采用(NH4)2SO4梯度洗脫，流速為1ml/min，溫度為23℃，收集活性峰，得到一活性組分的純品D3H2P1(即EFE-g)。
三、結(jié)果通過以上流程，得到各活性組分EFE-b 6.0mg，EFE-c 9.9mg，EFE-d 25.2mg，EFE-e 6.7mg，EFE-f 2.7mg，EFE-g 10.9mg。
備注基于實(shí)驗(yàn)?zāi)康模緦?shí)施例未對(duì)EFE-a進(jìn)行純化；如需純化，其方法同實(shí)施例1。
實(shí)施例3蚯蚓纖溶酶多種組分的鑒定1、分子量、N末端序列和等電點(diǎn)測(cè)定通過以上流程制備的七種組分(EFE-a、EFE-b、EFE-c、EFE-d、EFE-e、EFE-f、EFE-g)的精確分子量(MOLDI-TOF MS測(cè)定值)、N端序列和等電點(diǎn)如下

2、純度測(cè)定按照常規(guī)操作進(jìn)行SDS-PAGE電泳，凝膠濃度15％，點(diǎn)樣量25ug/孔。結(jié)果如圖1所示，其中1為Marker，2為EFE-f，3為EFE-e，4為EFE-d，5為EFE-a，6為EFE-b，7為EFE-c，8為EFE-g，每種組分在15％的SDS-PAGE上均為一條帶。
對(duì)各組分進(jìn)行高效液相層析，呈現(xiàn)一個(gè)峰的水平(EFE-d、EFE-e除外)，各組分在適宜條件下都可以結(jié)晶，表明其純度較高，且處于活性形式。
3、活性測(cè)定本流程制備的各活性組分用纖維平板法測(cè)得其纖溶活性從每mg250尿激酶活性單位到800尿激酶活性單位。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院生物理研究所<120>蚯蚓纖溶酶多種組分及其分離、純化、制備工藝<130>
<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>17<212>PRT<213>赤子愛勝蚓(Eisenia Fetida)<220>
<221>EFE-a的N末端序列<222>(1)..(17)<223>VIGGTNASPGEFPWQLQ<400>1Val Ile Gly Gly Thr Asn Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Len1 5 10 15Gln<210>2<211>19<212>PRT<213>赤子愛勝蚓(Eisenia Fetida)
<220>
<221>EFE-b的N末端序列<222>(1)..(19)<223>IVGGIEARPYEFPPQVSVR<400>2Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Pro Gln Val1 5 10 15Ser Val Arg<210>3<211>19<212>PRT<213>赤子愛勝蚓(Eisenia Fetida)<220>
<221>EFE-c的N末端序列<222>(1)..(19)<223>IVGGIEARPYEFPPQVSVR<400>3Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Pro Gln Val1 5 10 15Ser Val Arg<210>4<211>19
<212>PRT<213>赤子愛勝蚓(Eisenia Fetida)<220>
<221>EFE-g的N末端序列<222>(1)..(19)<223>IVGGIEARPYEFPPQVSVR<400>4Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg Pro Tyr Glu Phe Pro Pro Gln Val1 5 10 15Ser Val Arg<210>5<211>16<212>PRT<213>赤子愛勝蚓(Eisenia Fetida)<220>
<221>EFE-d的N末端序列<222>(1)..(16)<223>IIGGSNASPGEFPWQL<400>5Ile Ile Gly Gly Ser Asn Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Leu1 5 10 15<210>6<211>16
<212>PRT<213>赤子愛勝蚓(Eisenia Fetida)<220>
<221>EFE-e的N末端序列<222>(1)..(16)<223>IIGGSNASPGEFPWQL<400>6Ile Ile Gly Gly Ser Asn Ala Ser Pro Gly Glu Phe Pro Trp Gln Leu1 5 10 15<210>7<211>13<212>PRT<213>赤子愛勝蚓(Eisenia Fetida)<220>
<221>EFE-f的N末端序列<222>(1)..(13)<223>VVGGSDTTKGQYP<400>7Val Val Gly Gly Ser Asp Thr Thr Lys Gly Gln Tys Pro1 5 10
權(quán)利要求
1.蚯蚓纖溶酶多種組分的分離、純化、制備工藝，其特征在于該工藝包括如下步驟(1)粗分離溶解蚓激酶粗品，用陰離子交換層析柱進(jìn)行粗分離，得到三個(gè)活性峰，D1，D2，D3；(2)精細(xì)純化D1過陰離子交換層析柱，得到三個(gè)活性峰D1RQ1，D1RQ2，D1RQ3，每個(gè)活性峰分別過疏水層析柱得到純品D1RQ1H即EFE-f，D1RQ2H即EFE-e，D1RQ3H即EFE-d；D2過疏水層析柱，收集活性峰過陰離子交換層析柱純化，得到一活性組分純品，即EFE-a；D3過疏水層析柱得到兩個(gè)活性峰D3H1、D3H2，將D3H1過陰離子交換層析柱純化，得到兩個(gè)活性組分純品D3H1M1即EFE-b，D3H1M2即EFE-c；將D3H2過疏水層析柱收集活性峰，得到一活性組分的純品D3H2P1即EFE-g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于所述的陰離子交換層析柱選自DEAE柱、RESOURCEQ柱、SOURCE 15 Q柱和MonoQ柱。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于所述的疏水層析柱選自RESOURCE ISO柱、RESOURCE PHE柱和SOURCE 15 PHE柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的工藝制備的蚯蚓纖溶酶七種組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的七種組分，其特征在于它們分別具有下列分子量、N末端序列和等電點(diǎn)值(1)EFE-a，24663，VIGGTNASPGEFPWQLQ， 3.46；(2)EFE-b，29515，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.50；(3)EFE-c，29690，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.50；(4)EFE-g，29595，IVGGIEARPYEFPPQVSVR，3.46；(5)EFE-d，24201，IIGGSNASPGEFPWQL， 3.68；(6)EFE-e，24170，IIGGSNASPGEFPWQL， 3.62；(7)EFE-f，23028，VVGGSDTTKGQYP， 3.94。
全文摘要
本發(fā)明公開了蚯蚓纖溶酶多種組分及其分離、純化、制備工藝，該工藝包括(1)粗分離蚓激酶粗品過陰離子交換層析柱，得到三個(gè)活性峰，D1，D2，D3；(2)精細(xì)純化D1過陰離子交換層析柱，得到三個(gè)活性峰，每個(gè)活性峰分別過疏水層析柱得到純品EFE－f，EFE－e，EFE－d；D2過疏水層析柱，收集活性峰過陰離子交換層析柱純化，得到活性組分EFF－a純品；D3過疏水層析柱得到兩個(gè)活性峰D3H1、D3H2，將D3H1過陰離子交換層析柱純化，得到活性組分EFE－b和EFE－c純品；將D3H2過疏水層析柱收集活性峰，得到活性組分EFE－g的純品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能系統(tǒng)地獲得純度和活性都較高的蚯蚓纖溶酶的七個(gè)組分，可滿足實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的制備，經(jīng)適當(dāng)放大可適應(yīng)生產(chǎn)規(guī)模的制備。
文檔編號(hào)C12N9/68GK1504568SQ02153848
公開日2004年6月16日 申請(qǐng)日期2002年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月5日
發(fā)明者王 鋒, 望超, 李梅, 張季平, 桂璐璐, 常文瑞, 鋒 王 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所