專利名稱:沙蠶蛋白酶及其分離提取純化方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種溶血栓纖溶酶,特別是提供了一種沙蠶蛋白酶及其分離提取純化方法和應(yīng)用,涉及纖溶酶的分離提取純化方法的生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
血栓栓塞性是臨床最常見的也是最嚴(yán)重的一種血液循環(huán)障礙疾病。治療上述疾病,特別是在發(fā)病初期使用溶栓劑,降低纖維蛋白及纖維蛋白原含量、減少血小板凝集、溶解血栓、恢復(fù)血管再通,是最重要的治療方法,能降低死亡率、減少后遺癥。目前,國內(nèi)外在臨床上多用尿激酶和克栓酶、蛇毒降纖酶等溶栓性藥物。這些藥物價(jià)格都很昂貴,也有不同優(yōu)缺點(diǎn),如選擇性差,半壽期長,抗原性強(qiáng),毒性大,易引起繼發(fā)出血性疾病。因此、發(fā)現(xiàn)研制新型溶栓類藥物仍是制藥工業(yè)非常有重要意義的科研項(xiàng)目,具有極大社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種沙蠶蛋白酶,同時(shí)提供了該酶的分離提取純化方法和應(yīng)用,克服了常規(guī)溶栓劑藥物價(jià)格昂貴,選擇性差、半壽期短、抗原性強(qiáng)等缺點(diǎn),并可以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
沙蠶蛋白酶,英文名稱N-V proteinase(下文減稱N-V蛋白酶)此酶在Swiss prot中的登錄名為N-V proteinase,登錄號為P83433。其分子量在27000-35000之間,等電點(diǎn)在5-7.5之間,最適溫度為45℃,最適pH為8-9。
該酶分子內(nèi)部5個(gè)肽段的氨基酸殘基的序列,其特征是(1)AVYLAGMK(2)NFPNYYINLY(3)VYLAANPTASS(4)QTFNSDTL(5)VYILDTGI沙蠶蛋白酶是一種蛋白水解酶,在體內(nèi)體外都能強(qiáng)烈地水解纖維蛋白原和纖維蛋白,可做為溶栓藥物和抗凝血藥物,預(yù)防和治療心肌梗塞、腦動(dòng)脈血栓形成等疾病的應(yīng)用。
沙蠶蛋白酶系直接水解于纖維蛋白、不具有激酶性質(zhì)的蛋白水解酶,是從環(huán)節(jié)動(dòng)物門Phylum Annelida毛蟲鋼Class Chaetopoda,多毛目polychaeta,沙蠶科Nereidae,分離純化獲得。
本發(fā)明提供五種沙蠶蛋白酶的分離提純方法(一)純化工藝1,包括以下步驟1)取沙蠶,洗凈后絞碎,加入1-10倍體積的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液制成勻漿;0-10℃,3000-9000轉(zhuǎn)/分離心15-60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;2)取N-V蛋白酶粗提液,置冰浴中冷卻至0-10℃,在攪拌條件下,加入-20~0℃預(yù)冷的無水乙醇,使乙醇的濃度達(dá)5~15%,保持在冰浴中使其產(chǎn)生沉淀;-10~10℃,3000~9000轉(zhuǎn)/分離心15~60分鐘,棄沉淀;上清液邊攪拌邊加入預(yù)冷的無水乙醇,終濃度為25-45%,同樣在冰浴中使其充分沉淀;-10~0℃,3000~9000轉(zhuǎn)/分離心15~60分鐘,棄上清液,沉淀盡可能抽干。保存方法,將沉淀溶于適量pH4.0~9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液中,分裝,-20℃保存,或?qū)⒊恋砝鋬龈稍铮?20℃保存,取保存液用pH4.0~9.0,0.01~0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液稀釋10-50倍,在截留值100000~10000之間超濾,獲得超濾液;3)分別用含5-10%乙醇的pH6.5-8.0、0.02~0.1mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液充分平衡N-V蛋白酶超濾液和DEAESepharose Fast Flow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用線性梯度洗脫法洗脫(NaCl,KCl等中性鹽濃度從0~0.5mol/L),收集活性峰并凍干;4)分別用含10-15%乙醇的pH4.0-6.5、0.02-0.1mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液充分平衡經(jīng)上一步DEAE SepharoseFast Flow層析柱純化獲得的凍干活性樣品和CM Sepharose FastFlow層析介質(zhì)。平衡液上樣,采用線性梯度洗脫法洗脫(NaCl,KCl等中性鹽濃度濃度從0-0.5mol/L),收集活性峰并凍干,鑒定活性和純度,進(jìn)行蛋白定量,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.2-0.7‰。
(二)純化工藝2,包括以下步驟1)超濾分離和濃縮取沙蠶,洗凈后絞碎,加入1-10倍體積的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液制成勻漿;0-10℃,3000-9000轉(zhuǎn)/分離心15-60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度;2)CM-52纖維素柱層析分別用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液充分平衡濃縮液和CM-52纖維素層析介質(zhì);平衡液濃縮上柱,采用常液洗脫法洗脫;用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度;3)QAE Sephadex A50柱層析用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液充分平衡QAE Sephadex A50層析介質(zhì);將濃縮液用這種緩沖液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脫法洗脫,收集活性峰,分別測定A260和A280值,用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,PAGE鑒定純度;4)Phenyl-Sepharose CL-4B柱層析將活性峰濃縮液用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸鹽、Tris等緩沖液充分平衡;用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸鹽、Tris等緩沖液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B層析介質(zhì);平衡液濃縮上樣,采用線性梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從1.5~0.05mol/L);收集活性峰,分別測定A260和A280值,用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,PAGE鑒定純度,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.2-0.7‰。
(三)純化工藝3,包括以下步驟1)超濾分離和濃縮取沙蠶,洗凈后絞碎,加入1-10倍體積的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液制成勻漿;0-10℃,3000-9000轉(zhuǎn)/分離心15-60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度;2)采用pH 7.0-8.0,0.02-0.04mol/L磷酸鹽、Tris等緩沖液,以常液洗脫方法,進(jìn)行DEAE Sepharose Fast Flow層析,收集活性峰并超濾濃縮,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度;3)采用pH梯度洗脫(pH 4.0-6.5,0.01-0.02mol/L乙酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液)與鹽梯度洗脫方法(pH5.5-6.5,0.01-0.02mol/L乙酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液,NaCl濃度為0-0.5mol/L)組合,進(jìn)行CMSepharose Fast Flow層析,超濾濃縮,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.2-0.7‰。
(四)純化工藝4,包括以下步驟1)取沙蠶洗凈后絞碎,加入1~5倍體積的pH6.0~8.0,0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液制成勻漿;離心,取上清液即溶栓素粗提液;粗提液經(jīng)15-60%(NH4)2SO4鹽析沉淀;2)重新溶解沉淀,經(jīng)Sephacryl S-100層析柱層析分離,收集活性峰;活性峰凍干濃縮;3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱層析用pH6.0~8.0,0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4緩沖液充分平衡上述樣品、Phenyl-Sepharose CL-4B層析介質(zhì);平衡液上樣,采用線性梯度洗脫法洗脫((NH4)2SO4濃度從1-0.05mol/L),收集活性峰,超濾濃縮,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度。
(五)制備性分離提取純化方法,包括以下步驟用Epoxy-activated Sepharose 6B為介質(zhì),制成介質(zhì)懸液;將純化的兔抗沙蠶蛋白酶抗體溶解于偶聯(lián)緩沖液中,與凝膠顆粒懸液混合,于搖床中作用過夜后裝柱;用偶聯(lián)緩沖液、蒸餾水等依次沖洗過量的抗體;用乙醇胺過夜處理凝膠,以封閉殘余活性基團(tuán);用偶聯(lián)緩沖液徹底沖洗親和柱,用上樣緩沖液洗脫親和介質(zhì);收集洗脫液進(jìn)行蛋白定量,計(jì)算偶聯(lián)率;將制備好的親和介質(zhì)裝柱,以沙蠶蛋白酶超濾液為上樣樣品,以階段洗脫方法,收集活性峰并凍干。
本發(fā)明沙蠶蛋白酶在用于制備血栓性疾病的預(yù)防和治療藥物。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選重量比為0.1%~99.5%活性成分。
本發(fā)明藥物優(yōu)選含有1%~99%的沙蠶蛋白酶和99%~1%的賦形劑。
本發(fā)明藥物優(yōu)選含有10%~90%的沙蠶蛋白酶和90%~10%的藥用賦形劑。
本發(fā)明藥物優(yōu)選含有30%~80%的沙蠶蛋白酶和70%~20%的藥用賦形劑。
本發(fā)明藥物最好含有60%~70%的沙蠶蛋白酶和40%~30%的賦形劑。
本發(fā)明的藥物含有治療有效量的提取物為活性成分,以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明可以組合物的形式通過靜脈、肌肉注射、口服、直腸等給藥方式施用于這種治療的患者。按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備各種劑型如注射劑、片劑、顆粒劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑、口服液體劑型。也可使其活性成分與一種或多種載體或藥物混合,制成所需劑型。
上文的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體,包括如防腐劑、色素、稀釋劑、賦形劑,填充劑,粘合劑,矯味劑,濕潤劑,崩解劑,吸收促進(jìn)劑,表面活性劑,吸附載體。
沙蠶蛋白酶的藥物作用藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1.體內(nèi)血栓形成時(shí)間實(shí)驗(yàn)根據(jù)國家新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編,溶血栓藥體內(nèi)血栓溶解實(shí)驗(yàn)——頸動(dòng)脈血栓形成法,以尿激酶為陽性對照藥,以生理鹽水為陰性對照,靜脈給藥后,用電刺激損傷大鼠頸動(dòng)脈以形成血栓,觀察血栓形成時(shí)間,同時(shí)測定凝血時(shí)間。
N-V蛋白酶的體內(nèi)血栓實(shí)驗(yàn)研究表明N-V蛋白酶和尿激酶在同等劑量的前提下,N-V蛋白酶的體內(nèi)血栓形成時(shí)間長于尿激酶。
2.體外血栓形成●體外血栓形成實(shí)驗(yàn)根據(jù)國家新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編,以尿激酶為陽性對照藥,以生理鹽水為陰性對照,大鼠靜脈給藥后,腹腔主動(dòng)脈取血,置于體外血栓形成儀中旋轉(zhuǎn),測定血栓長度、濕重、干重。結(jié)果表明N-V蛋白酶的體內(nèi)抗血栓形成效果優(yōu)于尿激酶。
3.凝血相關(guān)生化檢驗(yàn)參考N-V蛋白酶半數(shù)致死量,選擇大、中、小三個(gè)劑量組靜脈給藥,時(shí)間、方法同步驟2。
●纖維蛋白原mg/dL對照組266,小劑量207,中劑量142,大劑量132,尿激酶153,差異顯著;●PT 對照組19.6,小劑量19.2,中劑量18.1,大劑量20.1,尿激酶19.3,差異不顯著;●APTT 對照組20.7,小劑量16.8,中劑量16.8,大劑量19.0,尿激酶19.9,差異不顯著;4.凝血時(shí)間實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈注射N-V蛋白酶后摘出眼球,取血。
●玻片法 單位秒對照組131,小劑量194,中劑量233,大劑量183秒;●毛細(xì)管法單位秒對照組124,小劑量180,中劑量329,大劑量211秒;5.體內(nèi)溶血實(shí)驗(yàn)●大鼠法體內(nèi)注射小、中、大三個(gè)劑量的N-V蛋白酶,不同時(shí)間后取腹主動(dòng)脈血,檸檬酸鈉抗凝,在試管中,離心3000轉(zhuǎn)/秒,5分鐘,血液分上下兩層,上為清亮血漿,無溶血;●家兔法無溶血制劑的熱源實(shí)驗(yàn)用鱟試劑檢測無熱源。
定性鑒定實(shí)驗(yàn)N-V蛋白酶為抗原免疫家兔,分離抗血清。在瓊脂板上做抗原抗體反應(yīng)。N-V蛋白酶產(chǎn)生免疫沉淀線,其他蛋白質(zhì)均無反應(yīng)。
N-V蛋白酶的體外活性測定方法——纖維蛋白平板1.材料人血纖維蛋白原(中國生物制品檢定所)人血凝血酶(中國生物制品檢定所)人尿激酶 (中國生物制品檢定所)其它藥品均為國產(chǎn)分析純2.方法(1)制備0.5%的纖維蛋白原溶液100mg纖維蛋白原粉末溶于0.1MpH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。
(2)制備20U/ml的凝血酶溶液按標(biāo)定單位,將凝血酶溶于0.1MpH7.4Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。
(3)制備纖維蛋白平板在用水平儀校正過的平面上放置直徑9cm的平皿,加入9ml的0.5%的纖維蛋白原溶液和1.0ml 20u/ml的凝血酶溶液,混勻后靜置15分鐘。
(4)測定活性取陰性對照藥(生理鹽水)、陽性對照藥(尿激酶)和N-V蛋白酶各10ul,在纖維蛋白平板上點(diǎn)樣,37℃下放置15分鐘。
用卡尺測量溶斑的長短徑,計(jì)算溶斑面積。
結(jié)果
根據(jù)溶斑面積的大小,判斷N-V蛋白酶活性的高低。溶斑面積越大,N-V蛋白酶的活性越高。
N-V蛋白酶的蛋白定量方法1.方法(1)標(biāo)準(zhǔn)試劑的配制精稱100mg的考馬斯亮藍(lán)G-250,溶于95%的乙醇中,再與100mlw/v的磷酸混合,0.01M pH7.0的磷酸鹽緩沖液定容于1000ml的容量瓶中。
(2)分析方法常規(guī)分析法取5ml標(biāo)準(zhǔn)試劑,加入0.1ml 0.01M pH7.0的磷酸鹽緩沖液溶解的蛋白樣品液中,充分混合,放置5分鐘后,在595nm處測定吸光度。
微量分析法取0.2ml標(biāo)準(zhǔn)試劑,加入0.8ml 0.01M pH7.0的磷酸鹽溶解的蛋白樣品液中,充分混合,放置5分鐘后,在595nm處測定吸光度。
(3)備注常規(guī)分析法的蛋白含量線性范圍0.2~1.4mg/ml微量分析法的蛋白含量線性范圍5~100ug/ml(4)標(biāo)準(zhǔn)定量曲線在常規(guī)分析法和微量分析法蛋白含量線性范圍內(nèi)均勻取濃度點(diǎn),以蛋白濃度為橫坐標(biāo)、595nm處的吸光度為縱坐標(biāo),分別繪制常規(guī)和微量標(biāo)準(zhǔn)定量曲線,并做直線相關(guān)檢驗(yàn)。
2結(jié)果在規(guī)定蛋白濃度范圍內(nèi)蛋白濃度與A595呈直線正相關(guān)(P<0.001)。
N-V蛋白酶溫度影響實(shí)驗(yàn)1.將2mgN-V蛋白酶電泳純純品溶解于1ml生理鹽水。
2.分別放置在20、30、37、45、50、60、70℃水浴箱中保溫1小時(shí)。
3.纖維蛋白平板測定活性(37℃,15分鐘)。
激酶活性分析與纖溶酶原激活分析(一)激酶活性分析1.以10000截留值的超濾離心管,用10mM Tris pH7.4,150mM NaCl,10mM MgCl2緩沖液充分洗滌N-V蛋白酶的電泳純純品,洗滌三次。
2.吸取上清,在37℃條件下,加入ATP、[32P]ATP、以及偶氮酪蛋白、纖維蛋白原等底物,共同孵育15分鐘。
3.加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣液,煮沸終止反應(yīng),離心取上清。
4.進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,以0.25%Coomassie blue(45%甲醇,10%乙酸配制)固定,于X光片曝光,檢查磷酸化的底物帶。結(jié)果表明,N-V蛋白酶無激酶活性。
纖溶酶原激活分析方法1.以生理鹽水配制纖溶酶原溶液、以pH7.4,0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液配制N-V蛋白酶溶液。以5μl、1U/mL纖溶酶原溶液與5μlN-V蛋白酶溶液(①液),以5μl生理鹽水與5μl N-V蛋白酶溶液(②液),以5μl、10U/mL纖溶酶原溶液與5μl N-V蛋白酶溶液(③液),分別混合配制,并分為三份。
2.所有配液同(二)、1,但是在①液與③液加入ATP溶液,②液中不加。分別混合配制,并分為三份。
3.將上述兩種方法制備的各三份配液,第一份在混合后直接在纖維蛋白平板上點(diǎn)樣,第二份混合后于37℃下放置10分鐘,在纖維蛋白平板上點(diǎn)樣,第三份混合后于37℃下放置20分鐘在纖維蛋白平板上點(diǎn)樣。點(diǎn)樣完成后,于37℃下放置15分鐘,后測定活性。結(jié)果顯示N-V蛋白酶無纖溶酶原激活作用。
N-V蛋白酶血塊溶解實(shí)驗(yàn)a)取Wister大鼠,麻醉后腹主動(dòng)脈取血,放置于平皿,室溫形成血栓,切割并稱量血塊,裝入試管中。
b)將尿激酶和N-V蛋白酶加入血塊試管中,37℃恒溫,于不同時(shí)間觀測溶解情況。結(jié)果表明10小時(shí)內(nèi)完全溶解,而磷酸鹽緩沖液對照組無溶解。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取200g沙蠶,洗凈后絞碎,加入4.5倍體積的pH7.0,0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4,緩沖液制成勻漿;4℃,9000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml,置冰浴中冷卻至0℃,在攪拌條件下,加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇,使乙醇的濃度達(dá)5%,保持在冰浴中使其產(chǎn)生沉淀;-10℃,9000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,棄沉淀;上清液邊攪拌邊加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇,終濃度為30%,同樣在冰浴中使其充分沉淀;-10℃,9000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,棄上清液,沉淀盡可能抽干。將沉淀溶于適量pH5.8,0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液中,分裝。用前以pH8.0,0.02mol/L Tris-HCl緩沖液稀釋5倍,在截留值100000-10000之間超濾,獲得超濾液。分別用含5%乙醇的pH8.0、0.02mol/L Tris-HCl緩沖液充分平衡N-V蛋白酶超濾液和DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從0-0.5mol/L),收集活性峰并凍干,以纖維蛋白平板法鑒定活性和以聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,進(jìn)行蛋白定量。分別用含15%乙醇的pH4.0、0.02mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液充分平衡經(jīng)上一步DEAE Sepharose Fast Flow層析柱純化獲得的凍干活性樣品和CM Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從0-0.5mol/L),以纖維蛋白平板法鑒定活性和以聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,進(jìn)行蛋白定量。獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.23‰。
實(shí)施例2取200g沙蠶,洗凈后絞碎,加入8倍體積的pH8.0,0.08mol/LTris緩沖液制成勻漿;4℃,6000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml,置冰浴中冷卻至0℃,在攪拌條件下,加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇,使乙醇的濃度達(dá)10%,保持在冰浴中使其產(chǎn)生沉淀;-10℃,6000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘,棄沉淀;上清液邊攪拌邊加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇,終濃度為25%,同樣在冰浴中使其充分沉淀;-10℃,8000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,棄上清液,沉淀盡可能抽干。將沉淀溶于適量pH5.8,0.01mol/L HAC-NaAC緩沖液中,分裝。用前以pH7.8,0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液稀釋5倍,在截留值100000-10000之間超濾,獲得超濾液。分別用含5%乙醇的pH7.8,0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液充分平衡N-V蛋白酶超濾液和DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從0-0.5mol/L),收集活性峰并凍干,以纖維蛋白平板法鑒定活性和以聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,進(jìn)行蛋白定量。分別用含25%乙醇的pH6.0、0.02mol/L檸檬酸鹽緩沖液充分平衡經(jīng)上一步DEAE Sepharose Fast Flow層析柱純化獲得的凍干活性樣品和CM Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(KCl濃度從0-0.5mol/L),以纖維蛋白平板法鑒定活性和以聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,進(jìn)行蛋白定量。獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.21‰。
實(shí)施例3取200g沙蠶,洗凈后絞碎,加入8倍體積的pH5.0,0.04mol/LHAC-NaAC,緩沖液制成勻漿;4℃,4000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml,置冰浴中冷卻至0℃,在攪拌條件下,加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇,使乙醇的濃度達(dá)10%,保持在冰浴中使其產(chǎn)生沉淀;-10℃,4000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘,棄沉淀;上清液邊攪拌邊加入-20℃預(yù)冷的無水乙醇,終濃度為25%,同樣在冰浴中使其充分沉淀;-10℃,6000轉(zhuǎn)/分離心45分鐘,棄上清液,沉淀盡可能抽干。將沉淀溶于適量pH5.8,0.01mol/LHAC-NaAC緩沖液中,分裝。用前以pH7.8,0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液稀釋5倍,在截留值100000-10000之間超濾,獲得超濾液。分別用含20%乙醇的pH6.0,0.03mol/L檸檬酸鹽緩沖液充分平衡N-V蛋白酶超濾液和DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從0-0.5mol/L),收集活性峰并凍干,以纖維蛋白平板法鑒定活性和以聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,進(jìn)行蛋白定量。分別用含25%乙醇的pH 4.0、0.02mol/L檸檬酸鹽緩沖液充分平衡經(jīng)上一步DEAE Sepharose Fast Flow層析柱純化獲得的凍干活性樣品和CM Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(KCl濃度從0-0.5mol/L),以纖維蛋白平板法鑒定活性和以聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純度,進(jìn)行蛋白定量。獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.26‰。
實(shí)施例4取沙蠶300g,洗凈后絞碎,加入2倍體積的pH7.0,0.025mol/L磷酸鹽緩沖液制成勻漿;4℃,9000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液。分別用pH4.6 0.01mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉+0.01mol/L NaCl緩沖液充分平衡濃縮液和CM-52纖維素層析介質(zhì)。平衡液濃縮上柱,采用常液洗脫法洗脫,超濾濃縮。用pH4.6 0.01mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉+0.01mol/L NaCl緩沖液充分平衡QAE Sephadex A50層析介質(zhì)。將濃縮液用這種緩沖液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脫法洗脫,收集活性峰,超濾濃縮。將活性峰濃縮液用pH7.0 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1.5mol/LNaCl緩沖液充分平衡。用pH7.0 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1.5mol/L NaCl緩沖液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B層析介質(zhì)。平衡液濃縮上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從1.5~0.05mol/L),收集活性峰,分別測定A260和A280值,超濾濃縮,PAGE鑒定純度,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.3‰。
實(shí)施例5取沙蠶300g,洗凈后絞碎,加入5倍體積的pH5.0,0.02mol/L乙酸鹽緩沖液制成勻漿;4℃,6000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液。分別用pH5.0,0.02mol/L乙酸鹽緩沖液充分平衡濃縮液和CM-52纖維素層析介質(zhì)。平衡液濃縮上柱,采用常液洗脫法洗脫,超濾濃縮。用pH5.0,0.02mol/L乙酸鹽緩沖液充分平衡QAE Sephadex A50層析介質(zhì)。將濃縮液用這種緩沖液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脫法洗脫,收集活性峰,超濾濃縮。將活性峰濃縮液用pH7.5 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1mol/LNaCl緩沖液充分平衡。用pH7.5 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1mol/L NaCl緩沖液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B層析介質(zhì)。平衡液濃縮上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從1~0.05mol/L),收集活性峰,分別測定A260和A280值,超濾濃縮,PAGE鑒定純度,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.35%。
實(shí)施例6取沙蠶300g,洗凈后絞碎,加入10倍體積的pH6.0,0.02mol/L乙酸鹽緩沖液制成勻漿;4℃,4000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液。分別用pH6.0,0.02mol/L乙酸鹽緩沖液充分平衡濃縮液和CM-52纖維素層析介質(zhì)。平衡液濃縮上柱,采用常液洗脫法洗脫,超濾濃縮。用pH6.0,0.02mol/L乙酸鹽緩沖液充分平衡QAE Sephadex A50層析介質(zhì)。將濃縮液用這種緩沖液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脫法洗脫,收集活性峰,超濾濃縮。將活性峰濃縮液用pH7.5 0.01mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+0.5mol/L NaCl緩沖液充分平衡。用pH7.5 0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+0.5mol/L NaCl緩沖液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B層析介質(zhì)。平衡液濃縮上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從0.5~0.05mol/L),收集活性峰,分別測定A260和A280值,超濾濃縮,PAGE鑒定純度,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.33‰。
實(shí)施例71)抗原的獲得采用制備型電泳獲得目標(biāo)蛋白—沙蠶蛋白酶。連續(xù)系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,凝膠濃度為10%。電泳結(jié)束后剝膠,切下一窄條膠塊,放入染色液中染色10分鐘,即可觀察到活性帶;剩余的凝膠塊用保鮮膜包好,保存在4℃條件下。將染色的膠塊與未染色的膠塊在玻璃板上對齊,切下未染色的大膠塊上與活性蛋白帶相對應(yīng)的膠條,切下的膠條封入透析袋中,內(nèi)裝少量緩沖液A,放入水平電泳槽電泳,80mA,電泳4小時(shí)。收集袋內(nèi)液體,用蒸餾水透析除鹽,離心,過微孔濾膜除菌,然后凍干,即獲得電泳純抗原。
2)免疫動(dòng)物2.1)卡介苗致敏給每只家兔兩后足皮內(nèi)注射活卡介苗,每只1mg。
2.2)基礎(chǔ)免疫兩星期后進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。在高壓滅菌的研缽中加入弗氏不完全佐劑,再滴加滅活的卡介苗,邊滴加邊研磨,制成弗氏完全佐劑(2mg卡介苗/ml弗氏完全佐劑);將凍干的抗原溶于適量的高壓滅菌的緩沖液A中,滴加入完全佐劑中,邊滴加邊研磨,再加入青霉素鈉溶液、硫酸鏈霉素溶液少許,研磨均勻,制成油包水乳劑,抗原濃度為100μg/ml乳劑。給每只兔子背部皮下多點(diǎn)注射,每只2ml。
2.3)加強(qiáng)免疫每3周加強(qiáng)免疫一次,方法基本與基礎(chǔ)免疫相同,不同的是用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑,加強(qiáng)注射的劑量可適當(dāng)降低。每次加強(qiáng)免疫后7~10天,耳緣靜脈取血,用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)[31]測定抗血清效價(jià),當(dāng)效價(jià)≥8時(shí),從耳緣靜脈放血20~30ml/只。放血后繼續(xù)飼養(yǎng),繼續(xù)免疫。效價(jià)穩(wěn)定后,可每間隔1周從耳緣靜脈放血20~30ml/只,直至血清效價(jià)下降,最后從兔主動(dòng)脈取全血。
2.4)在用電泳純?nèi)芩ㄋ孛庖咚闹煌米拥耐瑫r(shí),用沙蠶勻漿上清液免疫另外兩只兔子,作為對照。
2.5)取抗血清每次獲得的血樣收集于滅菌的離心管中(不加抗凝劑),于室溫放置使之凝固。用一玻棒沿管壁旋松凝塊,再室溫放置數(shù)小時(shí),使抗血清完全析出;5000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘,上清即為抗血清。分裝,-20℃貯存。
3)IgG的提純3.1)取適量抗血清凍融,加入等體積的預(yù)冷的緩沖液B混勻。冰浴條件下滴加飽和(NH4)2SO4溶液,邊加邊攪拌,使溶液的(NH4)2SO4飽和度達(dá)到50%,4℃靜置2小時(shí),4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘,棄上清。
3.2)沉淀用同體積的緩沖液B溶解,冰浴條件下逐滴加入飽和(NH4)2SO4溶液,邊加邊攪拌,使溶液的(NH4)2SO4飽和度達(dá)33%,4℃靜置2小時(shí),4000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘,棄上清;重復(fù)4.2操作兩次。
3.3)將沉淀溶于少量緩沖液B中,裝入透析袋,4℃對緩沖液C透析除鹽平衡,離心,上清為較純的IgG溶液。
3.4)上步得到較純的IgG過DEAE Sepharose Fast Flow柱層析,平衡緩沖液是緩沖液C,洗脫液是緩沖液D,常液洗脫,收集第一峰,用PEG20000濃縮。雜蛋白用緩沖液E洗脫。提純的IgG用SDS-PAGE鑒定。
4)親和層析介質(zhì)的制備與親和層析用Epoxy-activated Sepharose6B為介質(zhì),制成介質(zhì)懸液;將純化的兔抗溶栓素抗體溶解于偶聯(lián)緩沖液中,與凝膠顆粒懸液混合,于37℃搖床中作用16小時(shí)后裝柱;用偶聯(lián)緩沖液、蒸餾水等依次沖洗過量的抗體;用1M乙醇胺,37℃過夜處理凝膠,以封閉殘余活性基團(tuán);用偶聯(lián)緩沖液徹底沖洗親和柱,用上樣緩沖液洗脫親和介質(zhì);收集洗脫液進(jìn)行蛋白定量,計(jì)算偶聯(lián)率。將制備好的親和介質(zhì)裝柱,以溶栓素超濾液為上樣樣品,以階段洗脫方法,收集活性峰并凍干。
實(shí)施例8取沙蠶300g,洗凈后絞碎,加入2倍體積的pH8.0,0.03mol/L Tris緩沖液制成勻漿;4℃,6000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液。以pH8.0,0.03mol/L Tris緩沖液充分平衡濃縮液和DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì),并進(jìn)行常液洗脫,收集活性峰并超濾濃縮。以乙酸鹽緩沖液充分平衡濃縮液和CM Sepharose Fast Flow層析介質(zhì),以0.02mol/L乙酸鹽緩沖液(pH4.5-pH6.5)進(jìn)行pH梯度洗脫,以pH6.5 0.02mol/L乙酸鹽緩沖液(NaCl 0-0.5mol/L)進(jìn)行鹽梯度洗脫,超濾濃縮。采用pH7.0,0.02mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行Sephadex G-50層析,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度。獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.32‰。
實(shí)施例9取沙蠶300g,洗凈后絞碎,加入2倍體積的含10%乙醇的pH8.0,0.03mol/L Tris緩沖液制成勻漿;4℃,6000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液。以pH7.5,0.025mol/LTris緩沖液充分平衡濃縮液和DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì),并進(jìn)行常液洗脫,收集活性峰并超濾濃縮。以檸檬酸鹽緩沖液充分平衡濃縮液和CM Sepharose Fast Flow層析介質(zhì),以0.04mol/L乙酸鹽緩沖液(pH4.5-pH6.5)進(jìn)行pH梯度洗脫,以pH6.5 0.04mol/L檸檬酸鹽緩沖液(NaCl 0-0.5mol/L)進(jìn)行鹽梯度洗脫,超濾濃縮。采用pH7.0,0.04mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行Sephadex G-75層析,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度。獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.39‰。
實(shí)施例101)取500g沙蠶,洗凈后絞碎,加入4.5倍體積的pH7.0,0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液制成勻漿;4℃,9000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘,取上清液即溶栓素粗提液;粗提液經(jīng)15-60%(NH4)2SO4鹽析沉淀;2)重新溶解沉淀,經(jīng)Sephacryl S-100層析柱層析分離,收集活性峰;活性峰凍干濃縮;3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱層析用pH7.0、0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4緩沖液充分平衡上述樣品、Phenyl-Sepharose CL-4B層析介質(zhì);平衡液上樣,采用線性梯度洗脫法洗脫((NH4)2SO4濃度從1-0.05mol/L),收集活性峰,超濾濃縮,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度。
實(shí)施例11N-V蛋白酶制劑工藝制劑種類和每瓶裝量凍干制劑,N-V蛋白酶1-3mg/瓶;賦型劑種類和用量甘露醇10-40mg,右旋糖苷10-40mg,L賴氨酸5-15mg,人血白蛋白2-10mg,各組成成分以上述用量任意配比,以單方或復(fù)方形式,凍干賦型。
凍干操作一級凍干-30~-20℃凍干16-48小時(shí);二級凍干0-10℃凍干16-24小時(shí)。
權(quán)利要求
1.一種沙蠶蛋白酶,直接水解于纖維蛋白、不具有激酶性質(zhì)的蛋白水解酶,其分子量在27000-35000之間,等電點(diǎn)在5-7.5之間,最適溫度為40-50℃,最適pH為8-9,N-V蛋白酶最適pH8-9,pH4-12均有活性,加熱70℃10分鐘,活性喪失,酶分子內(nèi)部5個(gè)肽段的氨基酸殘基的序列如下(1)AVYLAGMK(2)NFPNYYINLY(3)VYLAANPTASS(4)QTFNSDTL(5)VYILDTGI
2.沙蠶蛋白酶的分離提取純化方法,包括以下步驟1)取沙蠶,洗凈后絞碎,加入1-10倍體積的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液制成勻漿;0-10℃,3000-9000轉(zhuǎn)/分離心15-60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;2)取N-V蛋白酶粗提液,置冰浴中冷卻至0-10℃,在攪拌條件下,加入-70-0℃預(yù)冷的無水乙醇,使乙醇的濃度達(dá)5-15%,保持在冰浴中使其產(chǎn)生沉淀;-10-0℃,3000-9000轉(zhuǎn)/分離心15-60分鐘,棄沉淀;上清液邊攪拌邊加入預(yù)冷的無水乙醇,終濃度為25-45%,同樣在冰浴中使其充分沉淀;-10-0℃,3000-9000轉(zhuǎn)/分離心15-60分鐘,棄上清液,沉淀盡可能抽干。保存方法,將沉淀溶于適量pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液中,分裝,-20℃保存,或?qū)⒊恋砝鋬龈稍铮?20℃保存取保存液用pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液稀釋10-50倍,在截留值100000-10000之間超濾,獲得超濾液;3)分別用含5-10%乙醇的pH6.5-8.0、0.02-0.1mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液充分平衡N-V蛋白酶超濾液和DEAESepharose Fast Flow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl,KCl等中性鹽濃度從0~0.5mol/L),收集活性峰并凍干;4)分別用含10-15%乙醇的pH4.0-6.5、0.02-0.1mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液充分平衡經(jīng)上一步DEAE SepharoseFast Flow層析柱純化獲得的凍干活性樣品和CM Sepharose FastFlow層析介質(zhì)。平衡液上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl,KCl等中性鹽濃度濃度從0-0.5mol/L),收集活性峰并凍干,鑒定活性和純度,進(jìn)行蛋白定量,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.2-0.7‰。
3.沙蠶蛋白酶的分離提取純化方法,包括以下步驟1)超濾分離和濃縮取沙蠶,洗凈后絞碎,加入1-10倍體積的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液制成勻漿;0-10℃,3000-9000轉(zhuǎn)/分離心15-60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度;2)CM-52纖維素柱層析分別用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液充分平衡濃縮液和CM-52纖維素層析介質(zhì);平衡液濃縮上柱,采用常液洗脫法洗脫;用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度;3)QAE Sephadex A50柱層析用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液充分平衡QAE Sephadex A50層析介質(zhì);將濃縮液用這種緩沖液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脫法洗脫,收集活性峰,分別測定A260和A280值,用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,PAGE鑒定純度;4)Phenyl-Sepharose CL-4B柱層析將活性峰濃縮液用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸鹽、Tris等緩沖液充分平衡;用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸鹽、Tris等緩沖液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B層析介質(zhì);平衡液濃縮上柱,采用直線梯度洗脫法洗脫(NaCl濃度從1.5~0.05mol/L);收集活性峰,分別測定A260和A280值,用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,PAGE鑒定純度,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.2-0.7‰。
4.沙蠶蛋白酶的分離提取純化方法,包括以下步驟1)超濾分離和濃縮取沙蠶,洗凈后絞碎,加入1-10倍體積的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、Tris等緩沖液制成勻漿;0-10℃,3000-9000轉(zhuǎn)/分離心15-60分鐘,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超濾,濾出液由10000MW膜截留濃縮,得濃縮液,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度;2)采用pH7.0-8.0,0.02-0.04mol/L磷酸鹽、Tris等緩沖液,以常液洗脫方法,進(jìn)行DEAE Sepharose Fast Flow層析,收集活性峰并超濾濃縮,分別測定A260和A260值,PAGE鑒定純度;3)采用pH梯度洗脫(pH 4.0-6.5,0.01-0.02mol/L乙酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液)與鹽梯度洗脫方法(pH 5.5-6.5,0.01-0.02mol/L乙酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液,NaCl濃度從0-0.5mol/L)組合,進(jìn)行CMSepharose Fast Flow層析,超濾濃縮,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度,獲得N-V蛋白酶產(chǎn)率為0.2-0.7‰。
5.沙蠶蛋白酶的分離提取純化方法,包括以下步驟1)取沙蠶洗凈后絞碎,加入1~5倍體積的pH6.0~8.0,0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4緩沖液制成勻漿;離心,取上清液即溶栓素粗提液;粗提液經(jīng)15-60%(NH4)2SO4鹽析沉淀;2)重新溶解沉淀,經(jīng)Sephacryl S-100層析柱層析分離,收集活性峰;活性峰凍干濃縮;3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱層析用pH6.0~8.0,0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4緩沖液充分平衡上述樣品、Phenyl-Sepharose CL-4B層析介質(zhì);平衡液上樣,采用線性梯度洗脫法洗脫((NH4)2SO4濃度從1-0.05mol/L),收集活性峰,超濾濃縮,分別測定A260和A280值,PAGE鑒定純度。
6.沙蠶蛋白酶的制備性分離提取純化方法,包括以下步驟用Epoxy-activated Sepharose 6B為介質(zhì),制成介質(zhì)懸液;將純化的兔抗沙蠶蛋白酶抗體溶解于偶聯(lián)緩沖液中,與凝膠顆粒懸液混合,于搖床中作用過夜后裝柱;用偶聯(lián)緩沖液、蒸餾水等依次沖洗過量的抗體;用乙醇胺過夜處理凝膠,以封閉殘余活性基團(tuán);用偶聯(lián)緩沖液徹底沖洗親和柱,用上樣緩沖液洗脫親和介質(zhì);收集洗脫液進(jìn)行蛋白定量,計(jì)算偶聯(lián)率;將制備好的親和介質(zhì)裝柱,以沙蠶蛋白酶超濾液為上樣樣品,以階段洗脫方法,收集活性峰并凍干。
7.沙蠶蛋白酶在制備血栓性疾病的預(yù)防和治療藥物。
8.沙蠶蛋白酶作為治療有效量的活性成分,以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求5、6所述的藥物組合物,優(yōu)選重量比為0.1%~99.5%活性成分。
10.根據(jù)權(quán)利要求5、6所述的藥物,其特征在于所說的藥物是任何一種藥劑學(xué)上所說的劑型。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種沙蠶蛋白酶,同時(shí)提供了其分離提取純化方法,此酶的英文名稱N-V proteinase在Swissprot中的登錄名為N-V proteinase,登錄號為P83433。其分子量在27000-35000之間,等電點(diǎn)在5-7.5之間,最適溫度為45℃,最適pH為7.8。該酶分子內(nèi)部10個(gè)肽段的氨基酸殘基的序列,其特征是(1)AVYLAGMK(2)NFPNYYINLY(3)VYLAANPTASS(4)QTFNSDTL(5)VYILDTGI沙蠶蛋白酶是一種蛋白水解酶,在體內(nèi)體外都能強(qiáng)烈地水解纖維蛋白原和纖維蛋白,可做為溶栓藥物和抗凝血藥物,預(yù)防和治療心肌梗塞、腦動(dòng)脈血栓形成等疾病的應(yīng)用。
文檔編號C12N9/68GK1500873SQ02144828
公開日2004年6月2日 申請日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者洪敏 , 程熠, 白若倫, 洪 敏 申請人:洪敏 , 洪 敏