專利名稱：具有增強的體內(nèi)紅細胞生成素活性的融合蛋白的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其具有一種增強的抗惡性貧血藥，紅細胞生成素(在下文中，它也被稱為“EPO”)的體內(nèi)活性。更特別地，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其具有通過用它自身的氨基酸序列，即，不增加糖基化含量，增加它的體內(nèi)半壽期而增強的EPO活性，其中該融合蛋白包含與體內(nèi)天然存在的特定的肽融合的EPO分子。
相關(guān)領域的描述EPO是一種具有在30,000-34,000道爾頓范圍內(nèi)的分子量的糖蛋白，并且是一種促進紅細胞的生產(chǎn)和分化的造血因子。該糖蛋白結(jié)合到紅細胞的前體細胞的受體上以啟動它的造血活性并引起胞內(nèi)鈣離子數(shù)量的增加，DNA生物合成的增強和刺激血色素形成。同樣，重組人EPO(rhEPO)已被批準用于治療與腎衰竭，早熟，甲狀腺機能減退，營養(yǎng)不良等有關(guān)的貧血，并且rhEPO的臨床用途正在不斷地增加。然而，rhEPO的廣泛應用可能由于不方便和高的費用而受到限制，因為由于其短的半壽期使得一周要給藥大約三次。因而，通過保持EPO的體內(nèi)活性更長的時間可以減少用于治療的rhEPO給藥的頻率。
EPO的體內(nèi)生物活性是與它的體內(nèi)半壽期成比例的，而該體內(nèi)半壽期已知與定位于EPO糖鏈末端的唾液酸的含量有關(guān)。因而，該EPO的體內(nèi)生物活性極大地依賴于糖鏈的存在與否。糖鏈的類型隨著細胞類型的不同而發(fā)生改變。因而，當相同的糖蛋白表達在不同的細胞中時，該蛋白的糖鏈類型隨著細胞類型的不同是特性上不同的。已知細菌細胞，例如，大腸桿菌不能在它的蛋白上加上糖鏈。由于已知表達在大腸桿菌中的蛋白不具有任何糖鏈，所以在大腸桿菌中表達的EPO不包含糖鏈。在這種情況下，證實EPO在體外是有生物活性的，但在體內(nèi)根本是無活性的。這是由于與有糖鏈的EPO相比，沒有糖鏈的EPO被更快地從體內(nèi)消除，從而導致一個極短的半壽期。因而，EPO中糖鏈的存在與否在EPO的生物活性中起重要作用。
迄今，人類已努力地進行了很多研究以增加EPO的生物活性。這些研究的大部分集中在通過使用誘變技術(shù)誘導EPO基因變異來取代一些氨基酸。例如，Amgen公司提交的名稱為“紅細胞生成素類似物”的PCT/US94/09257公開了通過誘變增加EPO中的糖鏈含量來增加體內(nèi)半壽期的方法。也已嘗試了通過形成EPO-聚體來增加體內(nèi)半壽期(A.J.Sytkowski等.，J.B.C.vol.274，No.35，pp 24773-24778)。其它增加EPO的體內(nèi)生物活性的方法包括利用遺傳工程融合一種新的氨基酸，肽或蛋白片段到EPO，增加EPO中的糖鏈含量，尤其唾液酸的數(shù)量。然而，用于這種方法的氨基酸，肽或蛋白片段的種類是很有限的。在大多數(shù)情況下，這種遺傳修飾可能導致蛋白的特定活性的減少或喪失，或當在體內(nèi)使用那些物質(zhì)時，導致抗原性問題常常發(fā)生。
已進行了融合蛋白或嵌合蛋白，而不是EPO的研究，并且它們的一個實例是促卵泡激素，其為一種性激素(Furuhashi等.，1995，Mol.Endocrinol)。然而，由于利用遺傳工程進行遺傳修飾的蛋白產(chǎn)生了幾個問題，所以這種蛋白還沒有應用于本領域。被修飾的靶蛋白本身不易獲得，需要高度專業(yè)的技能。同樣，大多數(shù)情況下，通過新的氨基酸的增加或取代可能不利地降低或去除蛋白的活性。
在這種情況下，本發(fā)明人開始廣泛的研究，開發(fā)了一種通過將新的氨基酸，肽或蛋白融合到EPO分子來增加EPO體內(nèi)活性的新方法。在進行這些研究過程中，發(fā)現(xiàn)通過將一種在體內(nèi)天然存在的蛋白，人絨膜促性腺激素(在下文中，它也被稱為“HCG”)的β亞基的羧基末端肽(在下文中，它也被稱為“CTP”)片段與EPO融合而獲得的融合蛋白明顯地增加了該EPO的體內(nèi)半壽期。同樣，該EPO包含具有增加糖基化位點而保留EPO固有活性的功能的氨基酸(參見韓國專利申請第10-2000-0075230)。
本發(fā)明人已意外地發(fā)現(xiàn)其肽內(nèi)的糖基化位點已被去除的CTP變異體也明顯地增加EPO的體內(nèi)半壽期。作為這個發(fā)現(xiàn)的一個結(jié)果，已開發(fā)了可通過利用氨基酸序列，不增加EPO中糖鏈的含量而增加EPO體內(nèi)穩(wěn)定性的CTP變異體，導致本發(fā)明人完成本發(fā)明。
其中使用其糖基化位點已被去除的CTP變異體的本發(fā)明與其中通過增加EPO中糖鏈的含量來增加體內(nèi)半壽期的現(xiàn)有技術(shù)是可區(qū)別的，并且是基于發(fā)現(xiàn)CTP變異體能增加EPO的體內(nèi)穩(wěn)定性。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種具有增強的人EPO體內(nèi)活性的融合蛋白，其中該融合蛋白包括一個在它的羧基末端融合到HCGβ亞基的CTP變異體的EPO分子。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該融合蛋白的核苷酸，包含該核苷酸的重組載體，和該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞系。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的細胞系制備具有增強的人EPO活性的融合蛋白的方法。
在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種具有增強的人EPO體內(nèi)活性的融合蛋白，其中該融合蛋白包括一個EPO分子，在它的羧基末端融合HCGβ亞基的CTP變異體(在下文中，它也被稱為“ATP”)。優(yōu)選地，該CTP包括相應于HCGβ亞基112-145位置，優(yōu)選118-145位置的所有或部分氨基酸，SEQ ID No.1描述了這些氨基酸。
為CTP變異體的ATP具有用它自身的氨基酸序列，即不增加EPO的糖鏈含量，增加該EPO分子半壽期的功能。
因而，如果不對靶融合蛋白的增加體內(nèi)EPO活性的作用產(chǎn)生負面影響，則在上述位置范圍內(nèi)經(jīng)歷變化的氨基酸的位置和種類不受特別限制。換句話說，只要該融合蛋白保持增加體內(nèi)EPO活性的活性，位于屬于上述范圍的各位置上的氨基酸可在任何位置，用任何氨基酸取代。
例如，優(yōu)選地，ATP在121，127，132和138位置具有一種或多種氨基酸取代，最優(yōu)選地，在121，127，132和138位置具有用丙氨酸(Ala)殘基取代絲氨酸(Ser)殘基(

圖1)。既然是這樣，按照本發(fā)明的該融合蛋白具有SEQ.ID No.2描述的氨基酸序列?；谏鲜鑫恢玫慕z氨酸殘基可用Ala殘基取代的發(fā)現(xiàn)，對于本領域的技術(shù)人員顯而易見的是，任何具有與丙氨酸相似的大小和電荷的其它的氨基酸，如甘氨酸(Gly)，可以取代絲氨酸。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了編碼該融合蛋白的核苷酸，包含該核苷酸的重組載體，和該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞系，優(yōu)選中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了一種通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的細胞系制備具有增強的人EPO活性的融合蛋白的方法。
發(fā)明詳述現(xiàn)在本發(fā)明將被更詳細地描述。本發(fā)明通過靶融合蛋白的基因的獲得和克隆，靶基因的表達載體的構(gòu)建，動物細胞的轉(zhuǎn)染和EATP表達，表達的EATP的純化和活性測量步驟而完成。(1)基因的獲得EPO的互補DNA(cDNA)可通過利用購自韓國Bioneer公司的RT-PCT預混合試劑盒，使用常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術(shù)而獲得，其中使用與先前從人胚肝cDNA文庫(購自Invitrogen公司)中制備的EPOcDNA的兩個末端互補的引物EP1和EC2。EP1ATGGGGGCACGAATGTCCTGCCTGGCTGG(SEQ ID NO3)EC2GTCCCCTGTCCTGCAGGCCT(SEQ ID NO4)將EPO cDNA克隆到克隆載體pGEM-T(普洛麥格公司)，命名為pGEMT-EPO，并且鑒定它的堿基序列以在隨后的操作中作為模板使用。
本發(fā)明使用的HCGβ亞基的CTP變異體基因通過人工合成和自身引導PCR(self-priming)獲得。合成的基因片段是EA1，A2，A3和A4EA1AGGGGAGGCCTGCAGGACAGGGGACTCCTCTTCCG(SEQ ID NO5)A2GGAAGG GGGGGGAGGGGCCTT GC GGAAGAGGA(SEQ ID NO6)A3CC CCTTCCAAGCCCA CCCGACTCCCGGGGCCC(SEQ ID NO7)A4TTATTGTGGGAGGATCGGGGTGTC G GGGCCCCG(SEQ ID NO8)(粗體部分指用于氨基酸取代的部分)取各1μL四種基因(50pmole/μL)，使用高保真Taq系統(tǒng)(BoehringerManheim公司)進行PCR。
用1％的瓊脂糖凝膠鑒定大小約100bp的基因片段(修飾的CTP基因)。這些基因編碼一個肽，該肽通過用丙氨酸殘基取代在HCGβ亞基的118-145位置的28個羧基末端氨基酸中第121，127，132和138位置的四個絲氨酸殘基而獲得(參見圖1)。
使用pGEMT-EPO作為模板，EP1和EC2作為引物進行PCR，僅產(chǎn)生EPO基因。然后，使用EPO基因和修飾的CTP基因兩者作為模板，使用EP11和EP12引物，利用高保真Taq系統(tǒng)進一步進行PCR，從而獲得有大約630bp的基因片段(命名為EATP基因)的期望的融合蛋白。
EP11TAAGCTTATGGGGGTGCACGAATGT(SEQ ID NO9)EP22TGGATCCTTATTGTGGGAGGATCGGGGT(SEQ ID NO10)將這些基因克隆到pGEM-T克隆載體，然后鑒定堿基序列(命名為pGEMT-EATP)(參見圖3)。(2)表達載體的構(gòu)建pcDNA3.1載體(Invitrogen公司)被用作表達載體。pGEMT-EATP中EATP基因的兩個末端均具有來自引物EP11和EP22的HindIII和BamHI限制酶位點。用HindIII和BamHI處理pcDNA3.1和該獲得的pGEMT-EATP。使用Qiagen洗脫試劑盒，從瓊脂糖凝膠獲得線性化的pcDNA3.1和EATP基因，然后連接，從而轉(zhuǎn)化E.coli NM522。從在LB-氨卞青霉素固體培養(yǎng)基中過夜溫育后產(chǎn)生的菌落中分離質(zhì)粒，并用限制酶HindIII和BamHI處理。然后，通過1％瓊脂糖凝膠電泳選擇僅插入EATP的菌落。獲得的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-EATP(參見圖3)。(3)CHO細胞的轉(zhuǎn)染和EATP的表達
CHO細胞(DG44)在60mm平皿中生長以制備40-80％鋪滿的細胞(1-4×105個細胞/60mm平皿)。將3μL的superfection試劑(Boehringer Manheim公司)和97u L的培養(yǎng)基(含培養(yǎng)基，不含血清和無抗生素的α-MEM)充分混合，大約2μg的質(zhì)粒pcDNA3.1-EATP DNA(大于0.1μg/μL)和0.2μg包含二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的載體pLTRdhfr26(ATCC37295)加入到獲得的混合物中并且在室溫下反應5-10分鐘，然后加到細胞中。一天后，用不含培養(yǎng)基(包含500μg/mL G418)的含10％FBS的α-MEM代替該培養(yǎng)基。用含500μg/mL G418的培養(yǎng)基填滿細胞并且培養(yǎng)7-10天。然后，不含G418抗性基因的細胞和陰性對照組的細胞全部死亡。充分培養(yǎng)選自G418培養(yǎng)基的細胞后，使用EPO酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(Boehringer Manheim公司)確定表達自該培養(yǎng)基的EATP蛋白。
(4)表達的EATP的純化利用抗-EPO單克隆抗體(R&D公司)，如下制備用于純化的親和樹脂。
0.3克CNBr-活化的瓊脂糖4B在1mM鹽酸中溶脹20分鐘并裝柱，然后用1mM鹽酸洗滌。然后，將獲得的樹脂在4mL偶聯(lián)緩沖溶液(0.1M NaHCO3和0.5M NaCl，pH8.3)中進一步洗滌，移到一個管中并立即在偶聯(lián)緩沖溶液(500μg/小瓶)中與抗-EPO單克隆抗體混合，然后室溫反應2小時。在這時，充分地搖動該管。然后，獲得的產(chǎn)品用封閉緩沖劑(0.2M甘氨酸，pH8.0)置換，攪拌下室溫反應2小時。獲得的樹脂用6.5mL偶聯(lián)緩沖溶液，6.5mL乙酸鹽緩沖溶液(0.1M乙酸，0.5M氯化鈉，pH4)和6.5mL偶聯(lián)緩沖溶液順序地洗滌。將制備的樹脂填充到一個柱中然后進行如下純化。
細胞在無血清的培養(yǎng)基中生長一天，然后使用超濾濾器，如Centriprep(具有10,000的標稱分子量截止)(Millipore公司)，濃縮僅該培養(yǎng)基大約5倍。然后，將該濃縮溶液裝入一個用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)以流速約20mL/hr平衡的柱中，并用PBS再洗滌。該靶蛋白被洗脫到洗脫緩沖溶液中(0.1M甘氨酸，pH2.8)，然后立即用1M Tris溶液滴定以調(diào)至pH7.5。如同通過SDS-PAGE并銀染所證實的，純化的EATP的純度是97％或更高(參見圖4)。
(5)通過生物測定檢測和生化分析的活性檢測通過使用苯肼處理的鼠脾細胞的生物測定測量該表達的和適當純化的EPO和EATP的生物學活性。結(jié)果表明EATP的活性比EPO的活性高，提示在EATP中加入的羧基末端的存在不抑制EPO的活性。(6)藥物動力學檢測為確定是否該制備的候選物質(zhì)實際地具有更長的體內(nèi)半壽期，在小鼠上進行藥物動力學檢測。這里，以每只小鼠20單位的劑量對四只小鼠靜脈內(nèi)給藥該候選物質(zhì)。為評價在血液中的濃度分布曲線，從鼠取血，并用EIA試劑盒(Boehringer Manheim公司)測量收集的血液的濃度。在小鼠中進行的藥物動力學檢測表明候選物質(zhì)EATP具有比對照物質(zhì)EPO長得多的半壽期(參見圖5)。
在下述實施例中進一步說明本發(fā)明，這些實例不應被誤解為限制本發(fā)明的范圍。
通過人工合成和自身引導PCR獲得HCGβ亞基的被修飾的CTP基因。合成的基因片段是EA1，A2，A3和A4。
取各1μL四種基因(50pmole/μL)，使用高保真Tag系統(tǒng)(BoehringerManheim公司)在55℃(退火)40秒，72℃40秒和94℃20秒的條件下進行15個循環(huán)的PCR。在1％瓊脂糖凝膠中鑒定大小約100bp的基因片段(被修飾的CTP基因)。
這些基因編碼一個肽，該肽通過在HCGβ亞基的28個羧基末端氨基酸中的第121，127，132和138位置用丙氨酸殘基取代四個絲氨酸殘基而獲得(圖1)。
使用pGEMT-EPO模板和EP1和EC2引物進行PCR，僅產(chǎn)生EPO基因。然后，使用EPO基因和獲得的被修飾的CTP基因兩者作為模板，并使用EP11和EP22引物，利用高保真Tag系統(tǒng)，在57℃(退火)42秒，72℃ 60秒和94℃20秒的條件下進一步進行30個循環(huán)的PCR。從而，獲得約630bp的融合基因片段(命名為EATP基因)。使用上述提到的方法將這些基因克隆到pGEM-T中(命名為pGEMT-EATP)，并鑒定它的序列。實施例2表達載體pcDNA3.1-EATP的構(gòu)建使用pcDNA3.1載體(Invitrogen)作為表達載體。在pGEMT-EATP中的EATP基因兩端均具有來自引物EP11和EP22的HindIII和BamHI限制位點。
用限制酶HindIII和BamHI處理pcDNA3.1和獲得的pGEMT-EATP。使用Qiagen洗脫試劑盒，自瓊脂糖凝膠獲得線性化的pcDNA3.1和EATP基因，然后連接，從而轉(zhuǎn)化E.coli NM522。從在LB-氨卞青霉素固體培養(yǎng)基中溫育過夜后產(chǎn)生的菌落中分離質(zhì)粒，并用限制酶HindIII和BamHI處理。然后，通過1％瓊脂糖凝膠電泳選擇僅插入EATP的菌落。獲得的質(zhì)粒被命名為pcDNA3.1-EATP(參見圖3)。實施例3CHO細胞的轉(zhuǎn)染和EATP的表達CHO細胞(DG44)在60mm平皿中生長以制備40-80％鋪滿的細胞(1-4×105個細胞/60mm平皿)。將3μL的superfection試劑(Boehringer Manheim公司)和97μL的培養(yǎng)基(α-MEM，含培養(yǎng)基，不含血清和無抗生素)充分混合，并且將大約2μg的質(zhì)粒pcDNA3.1-EATP DNA(大于0.1μg/μL)和0.2μg包含二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的載體pLTRdhfr26(ATCC37295)加入到獲得的混合物中并且在室溫下反應5-10分鐘，然后加到細胞中。一天過后，用不含培養(yǎng)基(包含500μg/mL G418)的含10％FBS的α-MEM代替該培養(yǎng)基。用含500ug/mL G418的培養(yǎng)基填滿細胞并且培養(yǎng)7-10天。然后，不含G418抗性基因的細胞和陰性對照組的細胞都死亡。充分培養(yǎng)選自G418培養(yǎng)基的細胞后，使用EPO酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(BoehringerManheim公司)確認表達自該培養(yǎng)基的EATP蛋白。實施例4表達的EATP的純化利用抗-EPO單克隆抗體(R&D公司)，如下制備用于純化的親和樹脂。
將0.3克CNBr-活化的瓊脂糖4B在1mM鹽酸中溶脹20分鐘并裝柱，然后用ImM鹽酸洗滌。然后，獲得的樹脂在4mL偶聯(lián)緩沖溶液(0.1MNaHCO3和0.5M NaCl，pH8.3)中進一步洗滌，轉(zhuǎn)移到一個管中并立即在偶聯(lián)緩沖溶液(500μg/管瓶)中與抗-EPO單克隆抗體混合，然后攪拌下室溫反應2小時。在這時，充分地搖動該管。然后，獲得的產(chǎn)品用封閉緩沖劑(0.1M甘氨酸，pH8.0)置換，室溫反應2小時。獲得的產(chǎn)品用6.5mL偶聯(lián)緩沖溶液，6.5mL乙酸鹽緩沖溶液(0.1M乙酸，0.5M氯化鈉，pH4)和6.5mL偶聯(lián)緩沖溶液順序地洗滌。將制備的樹脂填充到一個柱中然后進行如下純化。
細胞在無血清的培養(yǎng)基中生長一天，然后使用Centriprep(具有10,000的標稱分子量截止)(Millipore公司)超濾濾器濃縮僅僅該培養(yǎng)基大約5倍。然后，將該濃縮溶液裝入一個用PBS以流速約20mL/hr平衡，并用PBS再洗滌的柱中。該靶蛋白被洗脫到洗脫緩沖溶液中(0.1M甘氨酸，pH2.8)，然后立即用1M Tris溶液滴定以調(diào)至pH7.5。如同通過SDS-PAGE并銀染所證實的，純化的EATP的純度是97％或更高(參見圖4)。實施例5通過生物測定檢測的活性測量以60mg/kg的劑量一天一次，對小鼠給藥苯肼兩天。三天后，從鼠中分離增大的脾，用均漿器磨碎以獲得脾細胞。將脾細胞稀釋至6×106細胞/mL的濃度，并將每100μL的稀釋樣品移至96孔平板。將標準的EPO(0-500mU/mL)和表達的EPO和EATP(各100mU/mL)加到各自的孔中。然后，將平板貯藏在保持在37℃下的二氧化碳培養(yǎng)箱中22小時。每孔中加入50u L的二甲基-3H-胸苷(20μCi/mL)。該獲得的平板進一步反應2小時，然后將每孔的樣品溶液吸收至玻璃濾器(Nunc 1-73164)。用鹽水洗滌該濾器3次，并用貝它(β)計數(shù)器測量濾器的放射性。測量顯示EATP的活性基本上等于或稍高于EPO的活性，表明在EATP中加入的羧基末端的存在不抑制EPO的活性。實施例6藥物動力學檢測為確認是否該制備的候選物質(zhì)實際地具有更長的體內(nèi)半壽期，在小鼠中進行了藥物動力學檢測。這里，以每只鼠20單位的劑量對四只鼠靜脈內(nèi)給藥按實施例5中描述的方法純化的該融合蛋白。為評價在血液中的濃度分布曲線，按固定的時間間隔，即開始時每30分鐘，2小時后每2小時從鼠中采集血液，并用EIA試劑盒(Boehringer Manheim公司)測定采集的血液中的濃度。圖5表示藥物動力學檢測的結(jié)果。如圖5所示，該候選物質(zhì)EATP具有比對照物質(zhì)EPO長得多的(長2.5倍以上)半壽期。
按照本發(fā)明，能通過用其自身的氨基酸，即不增加EPO的糖鏈含量，增加體內(nèi)半壽期而保持該EPO固有活性從而增強EPO的體內(nèi)活性。
<110>第一制糖株式會社<120>具有增強的體內(nèi)紅細胞生成素活性的融合蛋白<130>OV017299<150>KR 10-2001-75994<151>2001-12-03<160>10<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>34<212>PRT<213>智人<220><221>肽<222>(1)..(34)<223>位于人絨膜促性腺激素(HCG)β亞基的112-145位置的氨基酸<400>1Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser1 5 10 15Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu20 25 30Pro Gln<210>2<211>220<212>PRT<213>人工序列<220><223>紅細胞生成素(EPO)和人絨膜促性腺激素(HCG)β亞基的羧基末端肽的變異體(ATP)的融合蛋白(EATP)<400>2Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn lle Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala lle Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp180 185 190Ser Ser Ser Ala Lys Ala Pro Pro Pro Ala Leu Pro Ser Pro Ala Arg195 200 205Leu Pro Gly Pro Ala Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln210 215 220<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>具有與EPO cDNA末端序列互補的核苷酸序列的引物EP1<400>3atgggggcac gaatgtcctg cctggctgg 29<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>具有與EPO cDNA末端序列互補的核苷酸序列的引物EC2<400>4gtcccctgtc ctgcaggcct 20<210>5<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>HCG β亞基CTP基因片段EA1的變異體<400>5aggggaggcc tgcaggacag gggactcctc ttccg 35<210>6<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>HCGβ亞基CTP基因片段A2的變異體<400>6ggaagggcgg ggggaggggc cttggcggaa gagga 35<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>HCGβ亞基CTP基因片段A3的變異體<400>7ccgcccttcc aagcccagcc cgactcccgg ggccc 35<210>8<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>HCGβ亞基CTP基因片段A4的變異體<400>8ttattgtggg aggatcgggg tgtcggcggg ccccg 35<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于為了獲得期望的融合基因EATP而進行PCR的引物EP11<400>9taagcttatg ggggtgcacg aatgt 25<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于為了獲得期望的融合基因EATP而進行PCR的引物EP22<400>10tggatcctta ttgtgggagg atcggggt 28權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其包含具有羧基末端的人紅細胞生成素(EPO)和連接到該羧基末端的突變體，所述突變體是在CTP片段中具有一至四個氨基酸取代的人絨膜促性腺激素(HCG)β亞基的羧基末端肽(CTP)片段。
2.按照權(quán)利要求1的該融合蛋白，其中該CTP片段包括對應于HCGβ亞基的112-145位置的所有或部分的氨基酸，這些氨基酸如SEQ ID NO1所描述。
3.按照權(quán)利要求2的該融合蛋白，其中該突變體在HCGβ亞基的121，127，132和138位置具有一個或多個氨基酸取代。
4.按照權(quán)利要求3的該融合蛋白，其中該突變體在HCGβ亞基的121，127，132和138位置上具有絲氨酸殘基被丙氨酸或甘氨酸所取代。
5.一種核苷酸，其編碼按照權(quán)利要求1-4中的任一項要求的融合蛋白。
6.一種制備具有增強的體內(nèi)EPO活性的融合蛋白的方法，其包含培養(yǎng)一種用包含權(quán)利要求5中要求的核苷酸的重組體載體轉(zhuǎn)染的細胞系。
全文摘要
提供了一種用于增加EPO體內(nèi)半壽期活性的融合蛋白,其在人紅細胞生成素(EPO)的羧基末端包括一種具有在人絨膜促性腺激素(HCG)β亞基的羧基末端肽(CTP)片段中的1－4個氨基酸取代的突變體。該體內(nèi)半壽期可在不增加糖鏈含量的情況下被極大地延長,而保持EPO固有的活性。
文檔編號C12P21/02GK1422870SQ0213188
公開日2003年6月11日 申請日期2002年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月3日
發(fā)明者李東億, 吳明錫, 金起完, 鄭普燮, 樸持淑 申請人:第一制糖株式會社