專利名稱：利用線粒體dna指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中動物遺傳信息鑒定的方法，特別是涉及利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法。
線粒體DNA指紋(mitochondrial DNA fingerprinting，mtDNA)是指線粒體DNA控制區(qū)內(nèi)的高變異區(qū)堿基突變導(dǎo)致的多態(tài)，以及重復(fù)序列區(qū)變異導(dǎo)致的mtDNA異質(zhì)型多態(tài)、分子長度多態(tài)。通過對mtDNA功能區(qū)堿基高變異區(qū)即左功能區(qū)(D-loop 5′端)和右功能區(qū)(D-loop 3′端)擴(kuò)增片段進(jìn)行的單鏈構(gòu)象多態(tài)(Single Strand ConformationPolymorphism，SSCP)、異源雙鏈分析(Heteroduplex Analysis，HDA)、雙脫氧法指紋分析(dideoxy fingerprinting，ddF)和重復(fù)序列區(qū)擴(kuò)增片段異源雙鏈分析等研究，可獲得高變異的DNA綜合圖譜。
利用mtDNA D-loop堿基突變和重復(fù)序列區(qū)變異分析群體遺傳純度和鑒定不同群體、個體的親緣關(guān)系已在果蠅、海蝦、蟋蟀、蝙蝠、鱘魚、鯨、海豹、十八種食肉目動物、十八種鸛形目鳥類、雞、猴、兔、豬、馬等動物研究中廣泛開展。目前采用的分析技術(shù)均為單一的用單鏈構(gòu)象多態(tài)檢測D-loop左、右功能區(qū)的堿基突變或用限制性內(nèi)切酶(RFLP)檢測重復(fù)序列變異導(dǎo)致的異質(zhì)型多態(tài)和分子長度多態(tài)。
D-loop在mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中的特殊作用，使得D-loop結(jié)構(gòu)、功能的研究成為mtDNA研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，D-loop的堿基替換率比mtDNA分子的其它區(qū)域高5-10倍，是核單拷貝基因的25-100倍。在脊椎動物中，多數(shù)動物的D-loop位于tRNApro和tRNAphe之間，在堿基組成上，D-loop為A-T富集區(qū)，依照堿基A的比率，D-loop可分為包含D-loop 5′端的左功能區(qū)(left domain)、中間保守區(qū)(central domain)和包含D-loop 3’端的右功能區(qū)(right domain)三部分，左功能區(qū)和右功能區(qū)為A堿基富集區(qū)，在遺傳上為高變區(qū)；由保守序列區(qū)(Conserved Sequence Block，CSB)構(gòu)成的中間保守序列區(qū)為G堿基富集區(qū)，遺傳上為保守區(qū)。不同物種中間保守序列區(qū)的結(jié)構(gòu)不盡相同，多數(shù)物種的這一區(qū)域由三個保守序列區(qū)組成，即CSB-1、CSB-2和CSB-3。在D-loop內(nèi)，特別是在各保守序列區(qū)間，多數(shù)物種存在數(shù)目不等的重復(fù)序列(Repeat Sequence，RS)，不同的物種重復(fù)序列所在的位置及重復(fù)基元序列(motif)不同；同種動物不同個體或同一個體不同mtDNA分子的基元序列重復(fù)數(shù)也不盡相同，這種差異在個體間直接表現(xiàn)為mtDNA分子長度多態(tài)(molecule size polymorphism)，在同一個體內(nèi)存在兩種以上因基元序列重復(fù)數(shù)不同的mtDNA分子而導(dǎo)致的多態(tài)則稱為異質(zhì)型多態(tài)(heteropla smic polymorphism)。
常規(guī)的單鏈構(gòu)象多態(tài)和異源雙鏈分析技術(shù)只能檢測200bp左右的DNA片段中堿基的突變，超過200bp的DNA片段，檢測堿基突變的靈敏度將降低，而大多數(shù)動物的mtDNA D-loop功能區(qū)堿基數(shù)均超過200bp，例如豬的mtDNA D-loop左、右功能區(qū)分別為700bp和400bp左右，無法采用常規(guī)的單鏈構(gòu)象多態(tài)和異源雙鏈分析技術(shù)檢測堿基突變。
雙脫氧法指紋分析采用熒光標(biāo)記雙脫氧終止堿基的方法，通過核苷酸序列分析儀檢測DNA片段的堿基突變，實(shí)現(xiàn)了檢測DNA堿基突變的自動化操作，雖然雙脫氧法指紋分析可分析500bp-1000bp的DNA片段，且檢測堿基突變的靈敏度可達(dá)到100％，但實(shí)驗(yàn)成本較高，不易在實(shí)際應(yīng)用中推廣。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，包括以下步驟1)提取動物含有mtDNA的總DNA；2)用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割；3)在引物的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)；4)單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳。
為了更方便、快捷、準(zhǔn)確地研究通過上述方法得到的結(jié)果，所述單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳結(jié)果用凝膠銀染進(jìn)行染色。
本發(fā)明的方法對于動物的遺傳信息鑒定具有普遍性，當(dāng)所述動物為豬時，用……酶進(jìn)行切割；PCR的引物為5′-GCACGACAATCCAAACAAGGTGCT-3′5′-TACCTGCTTATATGCGCGTGTACG-3′PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、72℃ 30秒之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘。
所述動物為牛時，PCR的引物為5’-CATTACAGTCAATGGTCACAGG-3’
5’-GCTTTGGGTTAAGCTACATCAAC-3’PCR的條件為94℃5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘。
所述動物為羊時，PCR的引物為5’-GTCTATCTTAAACATGCAAACGG-3’5’-CCCTACATGCTTCAGTGAAAC-3’PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘。
所述動物為兔時，有兩種情況，一種PCR的引物為5’-CATTCTTTTAATGCTTGTCGGACAT-3’5’-CAATGAATTTACTTAGTGGGGGGGTA-3’PCR的條件為94℃5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘。
所述動物為兔的另一種情況PCR的引物為5’-GCATATTAATTTCCTGCCAAACCCCA-3’5’-CAGTGCTTTGCTTTGTTGTTAAGC-3’PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、53℃ 30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘。
所述動物為雞時，PCR的引物為5’-TATTCCCGCTTGGTTAGACCCCAA-3’5’-TATGTCCGACAAGCATTCACTAAAT-3’PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘。
所述動物為馬時，PCR的引物為5’-CAGTCCATGGTAACAGGACATAG-3’5’-TTTAATGGGGGGTAGGGGGGGTTT-3’PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘。
本發(fā)明創(chuàng)造性地將D-loop序列和DNASIS軟件相結(jié)合，尋找合適的限制性內(nèi)切酶，先將大片段的mtDNA D-loop酶切為小于200bp的DNA片段后，進(jìn)行常規(guī)單鏈構(gòu)象多態(tài)和異源雙鏈分析，檢測mtDNA D-loop堿基的突變，可以更為精確地獲得高度變異的多態(tài)信息。
本發(fā)明同時采用限制性內(nèi)切酶-單鏈構(gòu)象多態(tài)和限制性內(nèi)切酶異源雙鏈分析技術(shù)作為比較，通過兩種不同方法研究mtDNA指紋技術(shù)，操作簡便，成本低，更易于在實(shí)際應(yīng)用中推廣使用。
mtDNA D-loop內(nèi)重復(fù)序列區(qū)的變異包括拷貝數(shù)的變異(異質(zhì)型多態(tài))和分子長度變異(分子長度多態(tài))，本發(fā)明巧妙地采用異源雙鏈分析技術(shù)通過高分辨率凝膠和凝膠銀染技術(shù)直接比較、分析重復(fù)序列區(qū)的變異，獲得高度變異的DNA圖譜以更快捷準(zhǔn)確地確定動物的遺傳特性，進(jìn)行不同品種(品系)親緣關(guān)系鑒定和群體遺傳純度分析。
本發(fā)明利用mtDNA拷貝數(shù)高、無組織特異性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特點(diǎn)，加之研究方法采用PCR技術(shù)，使得mtDNA指紋技術(shù)對樣品的要求了諸多DNA指紋技術(shù)中的最低，同時由于無需放射性同位素標(biāo)記，避免了制備探針、篩選基因文庫、Southern雜交等繁瑣操作，使得mtDNA指紋技術(shù)在操作上具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)、安全的特點(diǎn)。本發(fā)明mtDNA指紋技術(shù)充分利用了mtDNA D-loop高變異區(qū)的堿基突變和重復(fù)序列1 區(qū)變異產(chǎn)生的重復(fù)序列數(shù)目變異(分子長度多態(tài))、不同重復(fù)序列數(shù)目mtDNA分子的變異(異質(zhì)型多態(tài))，DNA圖譜信息度高、實(shí)用性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、靈敏度高，是繼小衛(wèi)星、微衛(wèi)星、RAPD等DNA指紋技術(shù)之后又一新的DNA指紋技術(shù)方案，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做進(jìn)一步說明。
圖2為牛的mtDNA指紋。
圖3為羊的mtDNA指紋。
圖4為兔的mtDNA指紋。
圖5為兔的mtDNA指紋。
圖6為雞的mtDNA指紋。
圖7為馬的mtDNA指紋。
實(shí)施例2、用動物組織制作模板DNA的方法以SE緩沖液(0.25M蔗糖，30mM Tris-HCl，10mM EDTA，2.5mM CaCl2，pH8.0)沖洗組織塊后，剪取0.5g左右的組織塊置于1.5ml EP管內(nèi)，加入10％ SDS至終濃度1％，蛋白酶K 80ng，加入SE緩沖液至0.8ml，65℃保持直至組織塊消化完全(一般需要4-12小時)，之后加入0.6ml飽和苯酚抽提蛋白兩次，每次振蕩15分鐘，12000g離心10分鐘后，水相移入新的1.5mlEP管內(nèi)，加入5M NaCl至終濃度0.25M，加入0.6ml異丙醇，混勻，室溫下放置10分鐘后12000g離心5分鐘，沉淀以70％乙醇洗滌兩次，空氣或真空干燥后溶于0.05ml滅菌的雙蒸水中。
實(shí)施例3、利用豬的線粒體DNA指紋對其進(jìn)行遺傳信息鑒定1、用實(shí)施例1的方法自豬的血樣中提取模板DNA；2、依據(jù)已報道的豬(GenBank accession numberAJ002189)mtDNA序列設(shè)計(jì)引物5′-GCACGACAATCCAAACAAGGTGCT-3′5′-TACCTGCTTATATGCGCGTGTACG-3′3、進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR的條件為94℃5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃30秒、72℃30秒之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘，擴(kuò)增的片段是68+10n(14-29)bp，其中n為串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)；4、PCR產(chǎn)物的純化以Geneclean試劑盒(Biolab LTD)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，溶解于20μl滅菌雙蒸水中。
5、單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入3μl載樣緩沖液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯藍(lán)，0.025％溴酚藍(lán))于95℃保溫5min，立即置于冰上直至電泳。電泳采用15％的acr∶bis為37.5∶1的聚丙烯酰胺凝膠，凝膠中加入5％的甘油；6、凝膠銀染采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的銀染方法進(jìn)行；7、如

圖1所示，為通過上述方法得到的豬的mtDNA指紋，從圖中可以看出，mtDNA指紋可直接鑒定不同母系來源的個體，不存在組織特異性，證明mtDNA指紋可用于動物的個體識別和群體親緣關(guān)系鑒定。
實(shí)施例4、利用牛的線粒體DNA指紋對其進(jìn)行遺傳信息鑒定1、用實(shí)施例1的方法自牛的血樣中提取模板DNA；2、依據(jù)已報道的牛(GenBank accession numberNC001567)mtDNA序列設(shè)計(jì)引物5’-CATTACAGTCAATGGTCACAGG-3’
5’-GCTTTGGGTTAAGCTACATCAAC-3’3、進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘，擴(kuò)增的片段是213bp；4、PCR產(chǎn)物的純化以Geneclean試劑盒(Biolab LTD)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，溶解于20μl滅菌雙蒸水中。
5、單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入3μl載樣緩沖液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯藍(lán)，0.025％溴酚藍(lán))于95℃保溫5min，立即置于冰上直至電泳。電泳采用15％的acr∶bis為37.5∶1的聚丙烯酰胺凝膠，凝膠中加入5％的甘油；6、凝膠銀染采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的銀染方法進(jìn)行；7、如圖2所示，為通過上述方法得到的牛的mtDNA指紋，從圖中可以看出，mtDNA指紋可直接鑒定不同母系來源的個體，證明mtDNA指紋可用于動物的個體識別和群體親緣關(guān)系鑒定。
實(shí)施例5、利用羊的線粒體DNA指紋對其進(jìn)行遺傳信息鑒定1、用實(shí)施例1的方法自羊的血樣中提取模板DNA；2、依據(jù)已報道的羊(GenBank accession numberAF010406)mtDNA序列設(shè)計(jì)引物5’-GTCTATCTTAAACATGCAAACGG-3’5’-CCCTACATGCTTCAGTGAAAC-3’3、進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR的條件為94℃5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、55℃30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘，擴(kuò)增的片段是40+75n(4)，其中n為串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)；4、PCR產(chǎn)物的純化以Geneclean試劑盒(Biolab LTD)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，溶解于20μl滅菌雙蒸水中。
5、單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入3μl載樣緩沖液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯藍(lán)，0.025％溴酚藍(lán))于95C保溫5min，立即置于冰上直至電泳。電泳采用15％的acr∶bis為37.5∶1的聚丙烯酰胺凝膠，凝膠中加入5％的甘油；6、凝膠銀染采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的銀染方法進(jìn)行；7、如圖3所示，為通過上述方法得到的羊的mtDNA指紋，從圖中可以看出，mtDNA指紋可直接鑒定不同母系來源的個體，證明mtDNA指紋可用于動物的個體識別和群體親緣關(guān)系鑒定。
實(shí)施例6、利用兔的線粒體DNA指紋對其進(jìn)行遺傳信息鑒定
1、用實(shí)施例1的方法自兔的血樣中提取模板DNA；2、依據(jù)已報道的兔(GenBank accession numberAJ001588)mtDNA序列設(shè)計(jì)引物；5’-CATTCTTTTAATGCTTGTCGGGACAT-3’5’-CAATGAATTTACTTAGTGGGGGGGTA-3’3、進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘，擴(kuò)增的片段是152+20n(1-10)，其中n為串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)；4、PCR產(chǎn)物的純化以Geneclean試劑盒(Biolab LTD)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，溶解于20μl滅菌雙蒸水中。
5、單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入3μl載樣緩沖液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯藍(lán)，0.025％溴酚藍(lán))于95℃保溫5min，立即置于冰上直至電泳。電泳采用1％的acr∶bis為37.5∶1的聚丙烯酰胺凝膠，凝膠中加入5％的甘油；6、凝膠銀染采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的銀染方法進(jìn)行；7、如圖4所示，為通過上述方法得到的兔的mtDNA指紋，從圖中可以看出，mtDNA指紋可直接鑒定不同母系來源的個體，證明mtDNA指紋可用于動物的個體識別和群體親緣關(guān)系鑒定。
實(shí)施例7、利用兔的線粒體DNA指紋對其進(jìn)行遺傳信息鑒定1、用實(shí)施例2的方法自兔的組織樣中提取模板DNA；2、依據(jù)已報道的兔(GenBank accession numberAJ001588)mtDNA序列設(shè)計(jì)引物5’-GCATATTAATTTCCTGCCAAACCCCA-3’5’-CAGTGCTTTGCTTTGTTGTTAAGC-3’3、進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、53℃ 30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘，擴(kuò)增的片段是124+153n(1-4)，其中n為串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)；4、PCR產(chǎn)物的純化以Geneclean試劑盒(Biolab LTD)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，溶解于20μl滅菌雙蒸水中。
5、單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入3μl載樣緩沖液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯藍(lán)，0.025％溴酚藍(lán))于95℃保溫5min，立即置于冰上直至電泳。電泳采用2.5％的acr∶bis為37.5∶1的聚丙烯酰胺凝膠，凝膠中加入5％的甘油；6、凝膠銀染采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的銀染方法進(jìn)行；7、如圖5所示，為通過上述方法得到的兔的mtDNA指紋，從圖中可以看出，mtDNA指紋可直接鑒定不同母系來源的個體，證明mtDNA指紋可用于動物的個體識別和群體親緣關(guān)系鑒定。
實(shí)施例8、利用雞的線粒體DNA指紋對其進(jìn)行遺傳信息鑒定1、用實(shí)施例2的方法自雞的組織樣中提取模板DNA；2、依據(jù)已報道的雞(GenBank accession numberNC001323)mtDNA序列設(shè)計(jì)引物5’-TATTCCCGCTTGGTTAGACCCCAA-3’5’-TATGTCCGACAAGCATTCACTAAAT-3’3、進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR的條件為94℃5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分鐘，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘，擴(kuò)增的片段是902+29n(2)，其中n為串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)；4、PCR產(chǎn)物的純化以Geneclean試劑盒(Biolab LTD)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，溶解于20μl滅菌雙蒸水中。
5、單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入3μl載樣緩沖液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯藍(lán)，0.025％溴酚藍(lán))于95℃保溫5min，立即置于冰上直至電泳。電泳采用15％的acr∶bis為37.5∶1的聚丙烯酰胺凝膠，凝膠中加入5％的甘油；6、凝膠銀染采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的銀染方法進(jìn)行；7、如圖6所示，為通過上述方法得到的雞的mtDNA指紋，從圖中可以看出，mtDNA指紋可直接鑒定不同母系來源的個體，證明mtDNA指紋可用于動物的個體識別和群體親緣關(guān)系鑒定。
實(shí)施例9、利用馬的線粒體DNA指紋對其進(jìn)行遺傳信息鑒定1、用實(shí)施例2的方法自馬的組織樣中提取模板DNA；2、依據(jù)已報道的馬(EMBL accession numberX79547)mtDNA序列設(shè)計(jì)引物5’-CAGTCCATGGTAACAGGACATAG-3’5’-TTTAATGGGGGGTAGGGGGGGTTT-3’3、進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR的條件為94℃ 5分鐘后進(jìn)行30個循環(huán)的94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒，之后，反應(yīng)于72℃延伸5分鐘，擴(kuò)增的片段是123+8n(1-22)，其中n為串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)；4、PCR產(chǎn)物的純化以Geneclean試劑盒(Biolab LTD)回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，溶解于20μl滅菌雙蒸水中。
5、單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入3μl載樣緩沖液(95％甲酰胺，20mMNaOH，0.025％二甲苯藍(lán)，0.025％溴酚藍(lán))于95℃保溫5min，立即置于冰上直至電泳。電泳采用15％的acr∶bis為37.5∶1的聚丙烯酰胺凝膠，凝膠中加入5％的甘油；6、凝膠銀染采用Caetano-Anolles and Gresshoff(Caetano-Anolles G，Gresshoff PM.Staining nucleic acids with silver.Promega notes.1994，45，15-18)的銀染方法進(jìn)行；7、如圖6所示，為通過上述方法得到的馬的mtDNA指紋，從圖中可以看出通過mtDNA指紋可直接鑒定不同母系來源的個體，證明mtDNA指紋可用于動物的個體識別和群體親緣關(guān)系鑒定。
權(quán)利要求
1.一種利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，包括以下步驟1)提取動物含有mtDNA的總DNA；2)在引物的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)；3)單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，其特征在于所述單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳結(jié)果用凝膠銀染進(jìn)行染色。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，其特征在于所述動物為豬時，PCR的引物為5′-GCACGACAATCCAAACAAGGTGCT-3′5′-TACCTGCTTATATGCGCGTGTACG-3′
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，其特征在于所述動物為牛時，PCR的引物為5’-CATTACAGTCAATGGTCACAGG-3’5’-GCTTTGGGTTAAGCTACATCAAC-3’
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，其特征在于所述動物為羊時，PCR的引物為5’-GTCTATCTTAAACATGCAAACGG-3’5’-CCCTACATGCTTCAGTGAAAC-3’
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，其特征在于所述動物為兔時，PCR的引物為5’-CATTCTTTTAATGCTTGTCGGACAT-3’5’-CAATGAATTTACTTAGTGGGGGGGTA-3’
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，其特征在于所述動物為兔時，PCR的引物為5’-GCATATTAATTTCCTGCCAAACCCCA-3’5’-CAGTGCTTTGCTTTGTTGTTAAGC-3’
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，其特征在于所述動物為雞時，PCR的引物為5’-TATTCCCGCTTGGTTAGACCCCAA-3’5’-TATGTCCGACAAGCATTCACTAAAT-3’
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，其特征在于所述動物為馬時，PCR的引物為5’-CAGTCCATGGTAACAGGACATAG-3’5’-TTTAATGGGGGGTAGGGGGGGTTT-3’
全文摘要
本發(fā)明的名稱為利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法。本發(fā)明的目的是提供一種較準(zhǔn)確，并且較簡單的利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種利用線粒體DNA指紋進(jìn)行動物遺傳信息鑒定的方法，包括以下步驟1)提取動物含有mtDNA的總DNA；2)用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割；3)在引物的作用下進(jìn)行PCR反應(yīng)；4)單鏈構(gòu)象多態(tài)電泳。本發(fā)明mtDNA指紋技術(shù)充分利用了mtDNA D－loop高變異區(qū)的堿基突變和重復(fù)序列區(qū)變異產(chǎn)生的重復(fù)序列數(shù)目變異和不同重復(fù)序列數(shù)目mtDNA分子的變異，DNA圖譜信息度高、實(shí)用性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、靈敏度高，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1428439SQ01144868
公開日2003年7月9日 申請日期2001年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者趙興波, 李寧, 吳常信, 劉丑生 申請人:趙興波