專利名稱：生長(zhǎng)變更劑對(duì)微生物菌落影響的確定方法
一般地，本發(fā)明涉及生長(zhǎng)變更劑對(duì)生物樣品中的一種或多種微生物影響的確定方法，具體地說(shuō)，涉及生長(zhǎng)變更劑對(duì)生物樣品中的獨(dú)立的微生物菌落影響的確定方法。
對(duì)病人有效的治療經(jīng)常需要對(duì)生物樣品中的微生物進(jìn)行鑒別，和確定這些微生物對(duì)生長(zhǎng)變更劑的敏感度。歷來(lái)，人們制備生物樣品并將其應(yīng)用于或添加到微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基(稱為“培養(yǎng)物”)中，接著主要進(jìn)行基于肉眼的檢查和測(cè)試。在大多數(shù)常規(guī)測(cè)試中，用病人的樣品接種合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，且接著培養(yǎng)，直至出現(xiàn)可見(jiàn)的微生物生長(zhǎng)跡象。大多數(shù)生物需要至少18至24小時(shí)的培養(yǎng)期，用以形成可見(jiàn)的菌落。獨(dú)立的菌落開(kāi)始為單個(gè)或一小簇用顯微鏡可見(jiàn)的細(xì)胞或活的單位(總稱為菌落形成單位或CFU)，它們被包含于接種物中。在最初的遲滯期之后，有活力的微生物以指數(shù)增長(zhǎng)在一代中一個(gè)細(xì)胞增長(zhǎng)成兩個(gè)細(xì)胞，在三代中增長(zhǎng)到八個(gè)細(xì)胞，在六代中增長(zhǎng)到64個(gè)細(xì)胞，直至產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的菌落，所述的遲滯期是指生物體由于其自身適應(yīng)新環(huán)境和新的歷程幾乎不生長(zhǎng)或沒(méi)有生長(zhǎng)的時(shí)期。
如果接種物包含許多不同的微生物，每種微生物將形成其特有的菌落，能夠或不能夠從彼此之間被辨別出來(lái)。然而對(duì)于大多數(shù)目的，在生物體生長(zhǎng)中只有單獨(dú)一種微生物存在是理想的。例如，某人想要測(cè)試一種生物樣品對(duì)具體的抗生素的敏感度，若該樣品和隨后的培養(yǎng)物含多種生物種類，他就不能確定在培養(yǎng)物中單個(gè)的生物體種類對(duì)抗生素的敏感度。為了確定單個(gè)生物體種類的敏感度，需要制備“純”培養(yǎng)物(即含一種單獨(dú)種類微生物的培養(yǎng)物)，它是通過(guò)在第一固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)初始的樣品接種物，并從第一生長(zhǎng)培養(yǎng)基取單個(gè)菌落、或一組同樣的菌落，并將其接種于第二固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基或在使用液體培養(yǎng)基的情況下形成懸浮液而制備的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公認(rèn)該方法花費(fèi)時(shí)間，且一般需要熟練技術(shù)人員。
在需要知道生長(zhǎng)變更劑(例如抗生素、生長(zhǎng)促進(jìn)劑、營(yíng)養(yǎng)素、防腐劑等)對(duì)生物體的效力的情況下，現(xiàn)有技術(shù)一般的慣例是使用一種下述之一的評(píng)估方法。在一種方法中，生長(zhǎng)變劑在培養(yǎng)之前，被施用于固體接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基區(qū)，且在施用區(qū)生物體的生長(zhǎng)被評(píng)估，或與沒(méi)有施用生長(zhǎng)變更劑的區(qū)域生物體的生長(zhǎng)比較。Kirby-Bauer平板測(cè)試是這種目測(cè)方法的一個(gè)實(shí)例。Kirby-Bauer方法包括培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基直至在整個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基上形成連片生長(zhǎng)。含有從一圓盤擴(kuò)散出來(lái)的有效的生長(zhǎng)變更劑(抗菌劑)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基區(qū)域，如果抗菌劑在清除生物方面是有效的話，不會(huì)含有生物體的生長(zhǎng)。圍繞該圓盤的無(wú)生長(zhǎng)區(qū)域的大小接著與參照進(jìn)行比較，以確定生物體對(duì)臨床中有效濃度的生長(zhǎng)變更劑是否敏感。第二種評(píng)估方法包括向接種了待測(cè)生物的液體培養(yǎng)基中添加已知量的生長(zhǎng)變更劑。渾濁度測(cè)試是這種類型目測(cè)方法的一個(gè)實(shí)例。渾濁度測(cè)試測(cè)量液體樣品的濁度，以確定樣品的生物體含量。樣品濁度的增長(zhǎng)表明樣品中生物體含量的增長(zhǎng)。第三種評(píng)估方法包括觀察生物體生長(zhǎng)對(duì)染色試劑的效果，其中染色試劑對(duì)一種或多種生長(zhǎng)生物體的成分或代謝產(chǎn)物產(chǎn)生反應(yīng)。這些目測(cè)評(píng)估方法任意得到的信息一般說(shuō)，性質(zhì)上也是宏觀的；例如，以具體濃度施用的生長(zhǎng)變更劑或者影響生物體的生長(zhǎng)，或者不影響生物體的生長(zhǎng)。關(guān)于例如死亡機(jī)理、生物是否有橫隔形成、或培養(yǎng)物中生物群體的任何統(tǒng)計(jì)信息，卻只能提供很少或不能提供更多信息。
上述目測(cè)方法的一個(gè)問(wèn)題是由于等待直至生物體的可見(jiàn)層或可接受的生物體濃度的出現(xiàn)而產(chǎn)生的測(cè)試錯(cuò)誤。生物體菌落在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上或其內(nèi)部生長(zhǎng)要競(jìng)爭(zhēng)食物，結(jié)果由于競(jìng)爭(zhēng)而不是由于生長(zhǎng)變更劑導(dǎo)致生長(zhǎng)被抑制。那些同樣的生物體也會(huì)由于其排泄物和代謝副產(chǎn)物而彼此影響。如果沒(méi)有這樣的干擾發(fā)生，則可能更準(zhǔn)確地分析生長(zhǎng)變更劑對(duì)特定微生物的影響。
用生物體目測(cè)評(píng)估的另一個(gè)問(wèn)題是要產(chǎn)生有意義的結(jié)果需要時(shí)間。如上所述，一般需要將生物體培養(yǎng)物培養(yǎng)大致18至24小時(shí)，用以產(chǎn)生出生長(zhǎng)充分的生物體以便目測(cè)評(píng)估(例如，如果生物體每20至60分鐘復(fù)制一次，就需要至少產(chǎn)生20代生物體)。然而實(shí)際地說(shuō)，產(chǎn)生培養(yǎng)物并用常規(guī)方法分析它，由于操作、評(píng)估等至少需要花費(fèi)48小時(shí)。因?yàn)椋⑸锷L(zhǎng)的速率是如此之快，且測(cè)試時(shí)間是如此之長(zhǎng)，所以被懷疑有微生物感染的病人，在確切微生物和其敏感度被鑒別之前，最初經(jīng)常用廣譜抗生素治療。在接受測(cè)試數(shù)據(jù)之后，才進(jìn)行更有針對(duì)性的治療。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，提供更迅速治療的廣譜抗生素相對(duì)于掌握具體信息的更有針對(duì)性的治療不是優(yōu)選的。實(shí)際上，相對(duì)于更有針對(duì)性的藥物，廣譜抗生素可能昂貴得多并更具有負(fù)作用。如今也是相當(dāng)令人擔(dān)憂的就是廣譜抗生素的過(guò)度使用，可能促進(jìn)了生物體抗生素抗性的發(fā)展，因此限制了其藥效。
為解決與進(jìn)行上述宏觀測(cè)試需要花費(fèi)時(shí)間有關(guān)的問(wèn)題，已經(jīng)提出許多用于快速測(cè)定抗生素敏感性的方法，包括測(cè)試單個(gè)生物體的方法。這些方法利用了敏感細(xì)菌當(dāng)暴露于抗生素時(shí)，可以改變其形狀、大小或內(nèi)部的化學(xué)過(guò)程(或其中的一些組合)這樣的一個(gè)事實(shí)。然而，一些種類的細(xì)菌不與抗生素發(fā)生可檢測(cè)的反應(yīng)，直至最初幾代繁殖之后。因此，只考慮最初不多的幾代的生物體的測(cè)試，在各種情況下均不能提供有用的信息，且被認(rèn)為是無(wú)效的，除非預(yù)先知道生物體的行為。由Ledley提出了用于結(jié)核分支桿菌(MTB)抗生素敏感性測(cè)定的具體微生物分析的實(shí)例(美國(guó)專利US5922282)。在Ledley的方法中，通過(guò)添加會(huì)導(dǎo)致活的生物體發(fā)熒光的質(zhì)粒改變單獨(dú)的生物體的DNA。比較添加抗菌劑之前和之后生物體發(fā)出的熒光，以確定抗菌劑是否消除了熒光，因此殺死了MTB微生物。除了產(chǎn)生熒光的手段以外，這個(gè)單一生物體技術(shù)類似于那些早先公開(kāi)的技術(shù)，且只適用于窄范圍的生物體。用于測(cè)定液體肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)變更劑的效果的另一種方法，如歐洲專利說(shuō)明書(shū)EP0635126B1中所述。在該歐洲專利說(shuō)明書(shū)中，圖象處理被用于確定單一生物體大小、數(shù)量或形狀的變化，以確定是否有源于抗生素的效果。這種方法的問(wèn)題之一是由于是在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的，我們相信它不能分析針對(duì)具體的CFU或CFU的特性，例如CFU的復(fù)制速率的效果。
還提出了檢驗(yàn)微生物生長(zhǎng)和新陳代謝的其它方法，就是添加當(dāng)暴露于微生物生長(zhǎng)時(shí)將改變顏色的試劑。還有其它方法(如美國(guó)專利US4724215、US4720463和US4856073所公開(kāi)的)，就是用電視攝像檢驗(yàn)微生物的變化。據(jù)我們所知，所有的這些方法實(shí)際上也是宏觀的，因此不提供有關(guān)單一微生物菌落在其早期的信息，且因此不能在非常短的時(shí)間內(nèi)提供可靠的抗生素抗藥性信息。它們只提供宏觀信息，即生長(zhǎng)變更劑對(duì)微生物生長(zhǎng)有還是沒(méi)有可檢測(cè)的影響。
同樣眾所周知的是，給定群體中的所有細(xì)菌不會(huì)對(duì)任何具體的生長(zhǎng)變更劑以同樣的方式響應(yīng)。在任何微生物群體中均有用任何目前技術(shù)不易定量的對(duì)生長(zhǎng)變更劑抗性的變異。如果這個(gè)群體數(shù)據(jù)是常規(guī)可得的，可以預(yù)知正被討論的微生物產(chǎn)生抗生素抗藥性的可能性，因此有助于確定最佳的治療時(shí)間。
生長(zhǎng)變更劑對(duì)微生物影響的所有前述檢驗(yàn)方法，我們覺(jué)得可以被分成兩個(gè)基本類型。第一組著眼于對(duì)裸眼來(lái)說(shuō)是可見(jiàn)的對(duì)生物體生長(zhǎng)的效果，例如，可見(jiàn)菌落或渾濁度的形成，或與這種生長(zhǎng)相關(guān)的顏色改變。第二組依靠的是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之前，液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)的單一生物體的變化。
需要一種用于確定微生物對(duì)生長(zhǎng)變更劑反應(yīng)的方法，使微生物得到識(shí)別的方法，可以以一般商業(yè)用途方法所花費(fèi)時(shí)間的一小部分來(lái)提供前述信息的方法，以及不需要肉眼可見(jiàn)的生長(zhǎng)且不限制于著眼于單一生物體的方法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于在培養(yǎng)的最初的幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，研究生長(zhǎng)變更劑對(duì)微生物菌落影響的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種鑒別微生物的方法，它是通過(guò)確定何種營(yíng)養(yǎng)素或抑制劑影響其生長(zhǎng)而實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明提供一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)微生物菌落影響的確定方法。本文所用的術(shù)語(yǔ)“微生物菌落”或“小菌落”指的是在易于被裸眼識(shí)別之前的最早期增長(zhǎng)階段的微生物菌落。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)變更劑”包括會(huì)變更、抑制或增強(qiáng)微生物生長(zhǎng)的試劑。生長(zhǎng)變更劑的例子包括但不限于抗生素、防腐劑、營(yíng)養(yǎng)素或生長(zhǎng)促進(jìn)劑。生長(zhǎng)變更劑也可以是環(huán)境類型的條件例如溫度、濕度、光、氣態(tài)環(huán)境。
在本方法下分析的各微生物菌落是單獨(dú)的微觀菌落，由接種物內(nèi)存在的菌落形成單位(CFU)形成。在本發(fā)明方法下，可以產(chǎn)生有意義的信息，其使用的菌落所處的生長(zhǎng)范圍，包括由其CFU翻倍1次至翻倍20次左右[更少]。在本方面方法下，能夠提供有意義的信息的該生長(zhǎng)范圍的菌落也可以按照生長(zhǎng)時(shí)間、菌落大小或后代來(lái)描述。在大多數(shù)情況下，本發(fā)明方法采用的微生物菌落一般不能被人的裸眼看見(jiàn)。因此，本發(fā)明方法可以描述為微觀方法，與現(xiàn)有技術(shù)方法形成對(duì)照，現(xiàn)有技術(shù)方法是用肉眼評(píng)估多個(gè)彼此鄰近的微生物菌落，它們集合在一起足夠大而肉眼看到。另外，本發(fā)明方法可靠地用數(shù)量表示生長(zhǎng)特性。
本發(fā)明方法采用了固體或半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基，且生長(zhǎng)變更劑被混合進(jìn)至少一部分的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，包括下述步驟(a)用具有一種或多種活的菌落形成單位的接種物接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基；
(b)以可能導(dǎo)致菌落形成單位復(fù)制成微生物菌落的方式培養(yǎng)菌落形成單位；(c)對(duì)暴露于生長(zhǎng)變更劑的一種或多種單個(gè)的微生物菌落的一種或多種特性進(jìn)行定量；和(d)評(píng)估該定量的特性，以確定生長(zhǎng)變更劑對(duì)單一微生物菌落的影響。
在量化步驟中，暴露于生長(zhǎng)變更劑的微生物菌落的特性和在一些情況下作為對(duì)照的微生物菌落的特性被量化。菌落特性可以是任何可以被量化以提供有意義的有關(guān)生長(zhǎng)變更劑對(duì)菌落影響的數(shù)據(jù)的性質(zhì)。一般用于確定影響的菌落特性，包括但不限于，菌落面積、周長(zhǎng)、周長(zhǎng)-面積比、邊緣粗糙度、邊緣輪廓和菌落密度的均勻性?？筛淖冇糜诹炕匦缘姆椒ㄒ赃m合已有判定、被量化的特性和提供有用數(shù)據(jù)必須的特異性水平。量化方法包括，但不限于測(cè)量、比較和檢驗(yàn)類型的方法。量化以時(shí)間為函數(shù)進(jìn)行。在所有的情況下，量化特性以確定變化。在大多數(shù)情況下，通過(guò)在時(shí)間軸上的兩個(gè)或更多個(gè)點(diǎn)(例如，在T1、T2、T3、…、TN)的特性比較來(lái)確定變化。然而在一些情況下，通過(guò)在時(shí)間軸上的一個(gè)單獨(dú)的點(diǎn)量化特性就可能獲得有意義的信息。一種或多種微生物菌落必須被量化的次數(shù)取決于收集數(shù)據(jù)的充分性；即關(guān)于生長(zhǎng)變更劑的影響做出臨床上充分的判斷所必需的任何次數(shù)。在量化步驟中采用的設(shè)備一般是成像裝置(例如，數(shù)字照相機(jī)等)，產(chǎn)生出清晰的圖象，足以被測(cè)量、比較、檢驗(yàn)或別的方式量化圖象中截獲的特性?；蛘呖梢允褂闷渌鼒D象裝置例如條形碼掃描儀或飛點(diǎn)掃描儀。小菌落圖象可以實(shí)時(shí)利用和/或儲(chǔ)存。
生長(zhǎng)變更劑對(duì)微生物菌落影響的判定是通過(guò)評(píng)估被量化的特性而作出的。象量化步驟一樣，量化的特性被評(píng)估的方式將依賴于現(xiàn)有的判定、被量化的特性和提供有用的數(shù)據(jù)必需的特異性水平。在一些情況下，評(píng)估只是看一下是否有量化的特性存在(例如，是否有菌落生長(zhǎng)存在，或菌落的邊緣是否粗糙等)，且評(píng)估的作出可采用時(shí)間軸時(shí)上一個(gè)單獨(dú)的點(diǎn)或多個(gè)點(diǎn)收集的特性數(shù)據(jù)作出。在這樣情況下生長(zhǎng)變更劑對(duì)微生物菌落的影響的判定可以只基于量化的特性作出。在其它情況下，可以通過(guò)考慮對(duì)照參照物評(píng)估量化特性作出。
對(duì)照參照物可以是在評(píng)估被考慮的微生物菌落的特性方面提供有用數(shù)據(jù)的任何信息源。例如，如果接種物含已知的生物體，使用提供如下數(shù)據(jù)的對(duì)照參照物可以進(jìn)行評(píng)估，這些數(shù)據(jù)有關(guān)生物體在類似的環(huán)境條件下，正常生長(zhǎng)的特性；例如，臨床上獲得的數(shù)據(jù)等。或者，可使用無(wú)生長(zhǎng)變更劑或處于不同濃度生長(zhǎng)變更劑之下、接種了相同接種物并在類似條件下培養(yǎng)的部份生長(zhǎng)培養(yǎng)基形式的對(duì)照參照物進(jìn)行評(píng)估。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的對(duì)照參照物部分的菌落特性和生長(zhǎng)培養(yǎng)基中施用生長(zhǎng)變更劑區(qū)域的菌落特性被量化，并彼此參照進(jìn)行評(píng)估。在許多情況下，比較評(píng)估得到的數(shù)據(jù)足以作出判定?；蛘咭部梢圆捎闷渌愋偷脑u(píng)估。
本發(fā)明方法相對(duì)于目前使用的生物體對(duì)具體的生長(zhǎng)變更劑敏感性的確定方法有幾個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)。一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)是有關(guān)生長(zhǎng)變更劑對(duì)生物體影響的判定作出的速度。當(dāng)本發(fā)明方法用于確定抗生素對(duì)一種或多種生物體的影響時(shí)，這點(diǎn)是特別確實(shí)的。如上所述，由于最初缺乏來(lái)自病人樣品的特有信息，會(huì)經(jīng)常使用廣譜抗生素。廣譜抗生素不如針對(duì)性強(qiáng)的抗生素，這是因?yàn)樗鼈兘o病人服用可能會(huì)帶來(lái)很大的副作用的風(fēng)險(xiǎn)，它們的過(guò)量使用可能會(huì)促進(jìn)生物體的抗生素抗藥性的產(chǎn)生，而且它們也可能非常昂貴。使用本發(fā)明方法，可以經(jīng)常在2小時(shí)或更短的時(shí)間內(nèi)提供抗生素敏感性的信息，明顯小于使用目前采用方法的一般性周轉(zhuǎn)時(shí)間。結(jié)果，現(xiàn)在經(jīng)常可以一開(kāi)始就有效地使用針對(duì)性強(qiáng)的抗生素，而不是最初用廣譜抗生素處理病人。
這幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)基于這樣的事實(shí)，就是本發(fā)明方法使用由單一的菌落收集的特性數(shù)據(jù)確定生長(zhǎng)變更劑對(duì)生物體的影響。如上所述，本發(fā)明方法在培養(yǎng)物內(nèi)可以不是同樣起源或同樣種類的任何肉眼可見(jiàn)的聚集的菌落出現(xiàn)之前，在培養(yǎng)過(guò)程非常早的階段就利用了菌落(菌落一般有2至20次翻倍)?；趩我痪涞臄?shù)據(jù)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，有可能在一些情況下使用“不純的”培養(yǎng)物。因?yàn)槭菑膯我坏奈⒂^的菌落收集數(shù)據(jù)，故分離不同種類菌落的需要降低，這一點(diǎn)與在固體培養(yǎng)基上或液體懸浮液中進(jìn)行的宏觀方法不同，其中，若宏觀方法在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，很可能會(huì)有許多生物體聚集成肉眼可見(jiàn)的不純的塊，若在液體懸浮液中進(jìn)行，則難以區(qū)別生物體彼此之間的生長(zhǎng)。對(duì)肉眼可見(jiàn)的不純的塊施用生長(zhǎng)變更劑可能會(huì)產(chǎn)生有限的信息，因?yàn)樯L(zhǎng)變更劑對(duì)多種不同的生物體的影響是不可分開(kāi)的。由尿或腦脊髓的樣品制備的培養(yǎng)物是可能不純的培養(yǎng)物的實(shí)例，在其中本發(fā)明可以用于評(píng)估不同組成的生物體，而不用首先將其分離。
基于單一菌落數(shù)據(jù)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以統(tǒng)計(jì)分析有關(guān)生長(zhǎng)變更劑影響的數(shù)據(jù)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可以是有用的，例如，在確定生物體對(duì)抗生素的抗藥性方面。有關(guān)生物體抗生素的抗藥性的信息反過(guò)來(lái)可以提供有關(guān)最佳處理時(shí)間的有價(jià)值的信息。如果，例如生物體被發(fā)現(xiàn)對(duì)高濃度之外的所有的抗生素均具有抗藥性，并且敏感性機(jī)理需要幾代才能變得有效，則此時(shí)抗生素處理比馬上就受抗生素影響的更敏感的生物體的情況需要更長(zhǎng)的時(shí)間。
單一菌落數(shù)據(jù)也有利地允許鑒定生長(zhǎng)變更物質(zhì)非特征性影響的生物體突變。例如，單一菌落的生長(zhǎng)速率可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。如果生長(zhǎng)速率的范圍超過(guò)預(yù)期的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)偏差，說(shuō)明生物體比通常更具有抗藥性，且抗藥性可能正在發(fā)展。強(qiáng)調(diào)任何微生物治療必須直接針對(duì)組內(nèi)最具有抗藥性的生物體是重要的，因?yàn)檫@些生物體即使在更敏感的生物體已經(jīng)被消滅之后，仍然會(huì)繁殖。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是迅速地提供準(zhǔn)確的生長(zhǎng)變更劑的敏感性信息。Kirby-Bauer測(cè)試的缺點(diǎn)是在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中任何給定的點(diǎn)有許多變量影響抗生素濃度?；谇逦鷧^(qū)域大小計(jì)算抗生素濃度的公式已經(jīng)公開(kāi)，但這些公式很少使用，且被認(rèn)為最多是近似值。Kirby-Bauer中，影響抗生素濃度的確定的一個(gè)變量是相鄰的生物體之間的競(jìng)爭(zhēng)。在標(biāo)準(zhǔn)的平板測(cè)試中生物體為了食物競(jìng)爭(zhēng)，且因此可能由于競(jìng)爭(zhēng)而不是生長(zhǎng)變更劑造成生長(zhǎng)受到抑制。通過(guò)它們的排泄和代謝副產(chǎn)物，生物體之間也互相影響。本發(fā)明方法通過(guò)在接種之后很快檢驗(yàn)該菌落而避免了這些類型的干擾，而不是一直等到生物體增殖到一定程度可以被裸眼看見(jiàn)為止。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其多用途。例如，本發(fā)明方法能夠從生物體被施用于生長(zhǎng)培養(yǎng)基的時(shí)候起收集有關(guān)生長(zhǎng)變更劑對(duì)生物體影響的數(shù)據(jù)。本發(fā)明方法因此并不局限于觀察最初幾代微生物，也不局限于后期可以通過(guò)肉眼看見(jiàn)的各代，而是可以在生物體的整個(gè)成長(zhǎng)過(guò)程使用。本發(fā)明方法另一個(gè)多用途的例子是可以用于在一個(gè)單個(gè)的測(cè)試中檢驗(yàn)具體濃度的生長(zhǎng)變更劑或檢驗(yàn)濃度梯度的生長(zhǎng)變更劑。該梯度方法避免了必須創(chuàng)建多稀釋度抗生素，以例如確定抗生素用于具體生物體的最小抑制濃度。本發(fā)明方法的另一個(gè)多用途的例子是其可以用于獸醫(yī)學(xué)。
本發(fā)明方法也可以被用來(lái)便于具體生物體的鑒別。例如，如果在一個(gè)具體的測(cè)試中，對(duì)照參照物是不含糖的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，而生長(zhǎng)培養(yǎng)基的測(cè)試區(qū)域含糖，那些可以代謝糖的生物體在測(cè)試區(qū)域中會(huì)比在對(duì)照區(qū)域生長(zhǎng)得更快。因此，可以使用許多不同的生長(zhǎng)增強(qiáng)和生長(zhǎng)抑制物質(zhì)以識(shí)別被懷疑的生物體。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠提供在統(tǒng)計(jì)上小數(shù)量發(fā)生卻具有關(guān)于生長(zhǎng)變更劑對(duì)微生物影響的重要意義的效果、反應(yīng)或沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)的信息。該優(yōu)點(diǎn)基于的事實(shí)是本發(fā)明方法評(píng)估小菌落而不是肉眼可見(jiàn)的菌落。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上給定區(qū)域中小菌落的數(shù)量會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在同樣區(qū)域中肉眼可見(jiàn)菌落的數(shù)量，從而提供對(duì)于評(píng)估該區(qū)域的統(tǒng)計(jì)上更有效的群體。例如，眾所周知一些細(xì)菌具有低的突變率，其中在某一特定環(huán)境下對(duì)具體的抗生素大約在104中有1個(gè)至106中有1個(gè)可以有抵抗力。如果這種有抵抗力的菌株的生長(zhǎng)沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，該菌株很可能被錯(cuò)誤地報(bào)導(dǎo)為是對(duì)抗生素敏感的，而事實(shí)上該菌株是有抗藥性的。本發(fā)明提供的該優(yōu)點(diǎn)也許最好通過(guò)實(shí)例說(shuō)明。如果某人用攝影機(jī)來(lái)記錄常規(guī)瓊脂平板上肉眼可見(jiàn)的菌落(正如目前用一些對(duì)菌落計(jì)數(shù)的儀器)，則在瓊脂平板上沒(méi)有足夠的空間包含出現(xiàn)上述抗性細(xì)菌在統(tǒng)計(jì)上必需數(shù)目的非匯合的肉眼可見(jiàn)的菌落。例如，10cm直徑的平板，每間隔2mm培養(yǎng)出具有肉眼可見(jiàn)的菌落，只可能擁有約2000個(gè)這樣的菌落，該群體明顯對(duì)于發(fā)現(xiàn)這種突變?cè)诮y(tǒng)計(jì)上是不充分的。這種統(tǒng)計(jì)上不充分的群體是為什么用于抗生素敏感性的常規(guī)瓊脂平板菌落太擁擠而產(chǎn)生匯合生長(zhǎng)的另一個(gè)原因。相反地，在本發(fā)明方法中，培養(yǎng)成小菌落的CFU可以以10μm的間距被接種，從而可以對(duì)統(tǒng)計(jì)上數(shù)量充足的每平方厘米104個(gè)小菌落進(jìn)行評(píng)估，而且允許在小菌落彼此匯合之前進(jìn)行評(píng)估。
本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是也可以用于檢測(cè)生長(zhǎng)變更劑的存在。例如，用于在牛奶樣品中確定抗生素或其它生長(zhǎng)變更劑存在。目前牛奶測(cè)試工藝需要預(yù)先已知測(cè)試抗生素的種類；即對(duì)具體的抗生素測(cè)試是特定的。在本發(fā)明方法中，牛奶被混合進(jìn)生長(zhǎng)介質(zhì)中，且接種物被接種進(jìn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基。接種物選擇為有可能受牛奶中生長(zhǎng)變更劑(例如，抗生素殘余物)存在的影響的類型。如果發(fā)源于接種物的小菌落的生長(zhǎng)不同于現(xiàn)有條件下的常規(guī)生長(zhǎng)，則已知或未知的抗生素很可能存在牛奶樣品中。
本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)對(duì)其最佳模式的實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明，并結(jié)合


會(huì)變得顯而易見(jiàn)。
圖1A-1D包括鋪有產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)的固體培養(yǎng)基的影像圖1A和1C包括未處理的影像，圖1B和1D是圖1A和1C同樣的影像，但在量化其特性之前，影像經(jīng)過(guò)了數(shù)字處理來(lái)定位菌落。
圖2A-2D包括了大腸桿菌(E.coli)菌落的影像，其中一些菌落暴露于抗生素。圖2A和2B是在鋪板之后馬上拍攝得到的，而圖2C和2D是在培養(yǎng)約2小時(shí)之后拍攝得到的。
圖3A-3D包括E.faecalis(E.faecalis)的影像，其中一些暴露于抗生素。圖3A和3B是在鋪板之后馬上拍攝得到的，而圖3C和3D是在培養(yǎng)約2小時(shí)之后拍攝得到的。
圖4A-4D包括E.faecium的影像，其中一些暴露于抗生素。圖4A和4B是在鋪板之后馬上拍攝得到的，而圖4C和4D是在培養(yǎng)約2小時(shí)之后拍攝得到的。
用于生長(zhǎng)變更劑對(duì)小菌落影響的確定的本發(fā)明方法，采用了能夠支持微生物菌落生長(zhǎng)的一種或多種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，優(yōu)選凝膠、半固體或可滲透的固體形式。在使用期間可以被再水合的脫水生長(zhǎng)培養(yǎng)基是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兛梢栽谘娱L(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)易于貯存。接種之后是透明或半透明的生長(zhǎng)培養(yǎng)基也是優(yōu)選的，因?yàn)樗阌谙率龅牧炕驮u(píng)估步驟。然而如果采用了將在下面討論的合適的照明小菌落可以用任何生長(zhǎng)培養(yǎng)基量化和評(píng)估?？梢允褂靡环N或多種培養(yǎng)基質(zhì)以適合現(xiàn)有的應(yīng)用。
術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)變更劑”可以是任何化學(xué)或環(huán)境試劑，它們將會(huì)改變、抑制或增強(qiáng)微生物生長(zhǎng)?；瘜W(xué)生長(zhǎng)變更劑包括，但不限于抗生素、防腐劑、營(yíng)養(yǎng)素和生長(zhǎng)促進(jìn)劑。環(huán)境類型生長(zhǎng)變更劑包括但不限于參數(shù)例如，溫度、濕度、光和氣態(tài)環(huán)境?；瘜W(xué)類型生長(zhǎng)變更劑可以以多種途徑被混合進(jìn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在那些期望僅將生長(zhǎng)變更劑摻入部份生長(zhǎng)培養(yǎng)基的情況中，可使用置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基所選部份之上的膠體或其它固體或半固體載體來(lái)?yè)饺肷L(zhǎng)變更劑。在其它情況下，生長(zhǎng)變更劑可以使用滲入整個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的液體載體來(lái)?yè)饺?。環(huán)境類型生長(zhǎng)變更劑可以通過(guò)將生長(zhǎng)培養(yǎng)基暴露于具體的因子而被引入；例如，將一對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基置于不同的溫度、不同水平的濕度或光等條件下。
含生物體的接種物來(lái)源于尿、腦脊液、體腔液或其它樣品來(lái)源，例如，來(lái)源于早先分離的菌落的生物體懸浮液，該接種物被用于接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基。用于接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基的的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的，且不用在以后進(jìn)一步討論。已接種的生長(zhǎng)培養(yǎng)基以可能導(dǎo)致接種物成分復(fù)制成微生物菌落的方式被培養(yǎng)。
復(fù)制成小菌落的接種物中的成分本文指的是菌落形成單位(CFU)。CFU可以是接種物中活的單個(gè)生物體細(xì)胞或一叢生物體細(xì)胞。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基被接種，且已經(jīng)開(kāi)始培養(yǎng)之后，各CFU至少會(huì)有一次翻倍(沒(méi)有抑制因素)，且變成小菌落。在本發(fā)明方法下在CFU被翻倍4至8次之前，且?guī)缀蹩偸窃谄湟呀?jīng)翻倍約20次之前，一般可以產(chǎn)生有意義的信息。應(yīng)該注意到本文所用的術(shù)語(yǔ)“翻倍”指的是小菌落面積或體積的翻倍，與單一的生物體不同，因此不能被用于確定單個(gè)生物體的大小。小菌落的“翻倍”可以是由于生物體數(shù)量的翻倍或其平均大小的翻倍或其一些組合。然而，由于單個(gè)的生物體的生長(zhǎng)受限制，特別是經(jīng)過(guò)了幾代的時(shí)間之后，本文指的“翻倍”更經(jīng)常反映的是真實(shí)的復(fù)制生長(zhǎng)，而不是生物體大小的改變。
可以產(chǎn)生有意義的信息的時(shí)期，也可以菌落生長(zhǎng)時(shí)間或大小而不僅是培養(yǎng)期間CFU翻倍的次數(shù)來(lái)定義。例如，如果要被評(píng)估的生物體是已知的，很可能有在類似環(huán)境條件下有關(guān)該生物體翻倍次數(shù)的信息。如果那樣，時(shí)間可以被用作判定中的對(duì)照參數(shù)，而不是必需直接確立生物體有多少次翻倍。在一些情況下，生物體的大小和小菌落面積或體積的增長(zhǎng)速率可以提供有關(guān)生物體的種類和生長(zhǎng)變更劑對(duì)該生物體生長(zhǎng)速率的影響的信息?？梢援a(chǎn)生有意義的信息的時(shí)期，也可以后代來(lái)定義。具體地說(shuō)，在單一小菌落(各菌落代表源于一個(gè)具體的祖先的生長(zhǎng))與其它源于不同祖先生長(zhǎng)的小菌落連接或接近之前，可以進(jìn)行判定?？梢援a(chǎn)生有意義的信息的時(shí)期，也可以小菌落的生長(zhǎng)導(dǎo)致大量的小菌落彼此匯合之前的時(shí)間來(lái)定義。
不管評(píng)估期被如何定義，在本發(fā)明方法下采用的微生物菌落一般不能被人的肉眼看見(jiàn)。因此，本發(fā)明方法可被描述成微觀的，與現(xiàn)有方法形成對(duì)比，現(xiàn)有方法宏觀地評(píng)估彼此接觸的許多微生物菌落，這些菌落集合在一起足夠大，使得肉眼可見(jiàn)。
在開(kāi)始培養(yǎng)且一些菌落形成單位成為適于評(píng)估的小菌落之后，在一或多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上檢驗(yàn)暴露于生長(zhǎng)變更劑的一種或多種小菌落，量化這些菌落相關(guān)的特性。要被量化的菌落特性基于可能顯露出菌落暴露于生長(zhǎng)變更劑的結(jié)果的那些特性，而被選擇。用于量化特性的優(yōu)選方法包括對(duì)含小菌落的一部分生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行電子成像，所述的小菌落暴露于生長(zhǎng)變更劑。如果即將進(jìn)行的測(cè)試使用生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的小菌落作為對(duì)照參照物(該小菌落要么沒(méi)有暴露于生長(zhǎng)變更劑，要么暴露于不同的濃度的生長(zhǎng)變更劑)，則也對(duì)一部分對(duì)比參照生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行電子成像。
可以使用許多設(shè)備對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基和其上含有的一或多種小菌落進(jìn)行電子成像能創(chuàng)建電子圖形文件的數(shù)字照相機(jī)是特別方便的，所述的電子圖形文件可以被個(gè)人計(jì)算機(jī)顯示。數(shù)字照相機(jī)可以設(shè)置于普通顯微鏡上，或優(yōu)選，設(shè)置在例如待審定的美國(guó)專利申請(qǐng)09/255673中所述的自動(dòng)顯微鏡上。在相對(duì)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基小菌落不易被識(shí)別的一些情況下，可以采用有助于使微生物菌落相對(duì)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基形成反差的技術(shù)。透射法是一個(gè)可接受的照明技術(shù)，該技術(shù)利用了小菌落相對(duì)于大多數(shù)生長(zhǎng)培養(yǎng)基具有相當(dāng)不同折光率的事實(shí)。具體地說(shuō)，照射小菌落的光的散射與照射生長(zhǎng)培養(yǎng)基的光的散射不同，因此使小菌落比生長(zhǎng)培養(yǎng)基顯得更暗。利用了光散射性不同的其它技術(shù)包括窄角照明或暗視野檢驗(yàn)。區(qū)分生長(zhǎng)培養(yǎng)基和小菌落的另一種方法包括對(duì)小菌落和承載小菌落的生長(zhǎng)培養(yǎng)基染色的方法。例如，色素/染料(例如，吖啶橙)被混合進(jìn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，然后被小菌落吸收使兩者形成反差?；蛘撸ㄟ^(guò)“負(fù)”染料在兩者之間造成反差，其中染料給生長(zhǎng)培養(yǎng)基提供顏色或熒光，而生長(zhǎng)的小菌落則將顏色和熒光遮擋在外。小菌落的位置和范圍也可以通過(guò)數(shù)字處理軟件來(lái)提供，該軟件探查小菌落的邊緣，且數(shù)字化“填充”小菌落的內(nèi)部區(qū)域，以將其與小菌落的外部區(qū)域分別出來(lái)，反之亦然。或者根據(jù)即將進(jìn)行的測(cè)試的性質(zhì)，也可以使用電子成像系統(tǒng)(例如，實(shí)時(shí)連續(xù)成像)。
如上所述，本發(fā)明方法包括量化作為時(shí)間函數(shù)的一或多種小菌落的特性。如果不止一次量化小菌落特性是必需的，則成像裝置必須能夠不止一次在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行具體位置的定位。具體位置的定位可以通過(guò)多種不同的方式完成。例如，成像裝置和生長(zhǎng)培養(yǎng)基其中之一或這兩者的移動(dòng)和定位，可以通過(guò)機(jī)械控制或機(jī)電一體化控制。也可以通過(guò)定位在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上或與生長(zhǎng)培養(yǎng)基靠得很近的可識(shí)別特性的利用，從而使生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的位置也是可定位的。例如，許多以靜止圖案分散在生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的非反應(yīng)性珠子，可以用作生長(zhǎng)培養(yǎng)基上的導(dǎo)航浮標(biāo)。美國(guó)專利申請(qǐng)09/366881描述了這樣的方法?；蛘咭部梢允褂闷渌ㄎ环椒ɑ驒C(jī)理。
可以通過(guò)檢驗(yàn)、測(cè)量或比較特性來(lái)量化特性。例如在一些情況下，可以通過(guò)檢驗(yàn)一或多種小菌落的邊緣粗糙度，來(lái)收集有用的數(shù)據(jù)。在其它情況下，通過(guò)測(cè)量一或多種小菌落的面積，來(lái)收集有用的數(shù)據(jù)。在另外的一些情況中，通過(guò)比較暴露于生長(zhǎng)變更劑的一或多種小菌落的面積與沒(méi)有暴露于生長(zhǎng)變更劑的其它小菌落的面積，或暴露于不同濃度的同樣的生長(zhǎng)變更劑的小菌落的面積，來(lái)收集有用的數(shù)據(jù)。也可以通過(guò)比較被暴露的菌落與另一暴露于影響是已知的，但品種不同的生長(zhǎng)變更劑的菌落來(lái)收集有用的數(shù)據(jù)。如何使菌落特性被量化的更詳細(xì)的實(shí)例將在下文提供。
量化特性足夠多次，以確?？梢宰鞒鲇嘘P(guān)生長(zhǎng)變更劑對(duì)生物體影響的臨床充分的判定。在一些狀況下，量化菌落的特性一次，就可以是足夠的。例如，在一些情況下，具體特性(例如，生長(zhǎng)、奇異的菌落形態(tài)等)的存在可以足以作出臨床判定。在其它狀況下，臨床充分的判定可以需要量化特性許多次。例如，需要在一段時(shí)間內(nèi)存在具體的影響的臨床判定需要周期性量化特性。
經(jīng)常檢驗(yàn)小菌落的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它是采用這種動(dòng)力學(xué)技術(shù)，可以發(fā)現(xiàn)在最早期的時(shí)間里的相關(guān)信息，從而提供快速的臨床結(jié)果。多次量化特性也可以產(chǎn)生額外的令人滿意的信息。例如，一些生物體，當(dāng)存在一些抗生素時(shí)，顯示了早期生長(zhǎng)的形態(tài)，隨著抗菌劑控制的影響，接著生長(zhǎng)緩慢和停止或退化。在其它情況下，生物體生長(zhǎng)非常緩慢，隨著最終突破了抗菌劑，接著就加速生長(zhǎng)。在兩種情況下，通過(guò)對(duì)幾代的生長(zhǎng)進(jìn)行檢驗(yàn)，可說(shuō)明有抗藥性模式或缺乏抗藥性模式?？股孛舾行缘臋C(jī)理也可以通過(guò)檢驗(yàn)小菌落形狀和密度的變化而得到說(shuō)明。例如，具有靜止的而不是殺滅影響的那些抗生素可以通過(guò)CFU的持久性被看見(jiàn)，然而具有殺滅影響的抗生素將顯示出CFU的消失，或在一些生長(zhǎng)之后，小菌落大小突然降低。由于殺滅影響是更強(qiáng)大的，且經(jīng)常需要較短過(guò)程的處理，這種區(qū)別是重要的。
一旦特性被量化，就會(huì)被評(píng)估以確定是否生長(zhǎng)變更劑對(duì)小菌落有影響。用于評(píng)估量化特性的標(biāo)準(zhǔn)依賴于已有的測(cè)試，特性和提供有用數(shù)據(jù)所必需的特異性水平。在一些情況下，評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)可以是簡(jiǎn)單的，不管是否有量化特性。特性被量化以確立其存在，是否生長(zhǎng)變更劑具有影響的判定以特性的存在為前提；例如，是否已經(jīng)有菌落生長(zhǎng)；小菌落的邊緣是否粗糙等。在這樣的情況下，量化的特性獨(dú)自能夠作出判定。在其它情況下，優(yōu)選鑒于對(duì)照參照物評(píng)估量化的特性。
在評(píng)估被考慮的小菌落的特性中，對(duì)照參照物可以是提供有用數(shù)據(jù)的任何信息源。例如，如果接種物含已知的生物體，使用對(duì)照參照物可以進(jìn)行評(píng)估，該對(duì)照參照物提供有關(guān)在類似環(huán)境條件下生物體正常生長(zhǎng)特性的數(shù)據(jù)，例如臨床上獲得的數(shù)據(jù)等。作為一個(gè)例子，如果給定的生物體已知在現(xiàn)有的環(huán)境下，以每30分鐘翻倍一次的速率生長(zhǎng)，而實(shí)際翻倍速率(例如，菌落體積或面積的改變)小于已知速率，則推測(cè)生長(zhǎng)變更劑延遲了生物體的倍增和生長(zhǎng)?；蛘?，可使用無(wú)生長(zhǎng)變更劑或處于不同濃度生長(zhǎng)變更劑之下、接種了相同接種物并在類似條件下培養(yǎng)的部份生長(zhǎng)培養(yǎng)基形式的對(duì)照參照物進(jìn)行評(píng)估。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基的對(duì)照參照物部分的一或多種菌落的特性和生長(zhǎng)培養(yǎng)基的施用生長(zhǎng)變更劑的區(qū)域中的一或多種菌落的特性被量化，并通常通過(guò)比較彼此參照進(jìn)行評(píng)估。
如上所述，用于確定生長(zhǎng)變更劑對(duì)小菌落影響的本發(fā)明方法相對(duì)于目前使用的方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)。下文提供本發(fā)明方法在使用中的實(shí)施例，以便于獲得對(duì)本發(fā)明方法的全面了解。但是，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
在有關(guān)的小菌落的面積被量化之后，即對(duì)各小菌落的面積值比較性地進(jìn)行評(píng)估(T1對(duì)T2)，以確定生長(zhǎng)變更劑的影響。在一些測(cè)試中，可以采用多次評(píng)估(即，在T1、T2、T3、T4等)。可以基于平均小菌落面積進(jìn)行評(píng)估，或通過(guò)在有或沒(méi)有生長(zhǎng)變更劑的區(qū)域中小菌落面積的分布進(jìn)行評(píng)估。在第一種情況下，如果生長(zhǎng)變更劑導(dǎo)致生長(zhǎng)速率的增加(或降低)，則具有生長(zhǎng)變更劑的區(qū)域中小菌落的面積會(huì)大于(或小于)對(duì)照參照物中小菌落的面積。在第二種情況下，可能有一些小菌落比平均值生長(zhǎng)得更快(或更慢)，且雖然平均面積可以是相同的，但在具有生長(zhǎng)變更劑的區(qū)域和對(duì)照參照物的區(qū)域之間，菌落面積的分布是不同的。如果進(jìn)行兩次以上的評(píng)估，通過(guò)評(píng)估順序的時(shí)間之間的特性可以確定生長(zhǎng)速率的變化。
為了說(shuō)明量化和評(píng)估小菌落的特性，特別是小菌落的生長(zhǎng)的步驟，圖1A-1D中所示的生長(zhǎng)培養(yǎng)基沒(méi)有暴露于生長(zhǎng)變更劑。圖1C和1D中所包括的圖像清楚地顯示了小菌落的生長(zhǎng)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)從該實(shí)施例中了解到，可以在2個(gè)小時(shí)內(nèi)獲得有用的信息，在該時(shí)間里小菌落的直徑只有約3-5μm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于它們可以被肉眼看見(jiàn)。可以輕易地了解，在這兩個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)期里，可以確定生長(zhǎng)從而確定生長(zhǎng)變更劑的影響。
雖然本發(fā)明已經(jīng)顯示和描述了有關(guān)詳細(xì)的實(shí)施方案，應(yīng)該理解本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以作出形式和細(xì)節(jié)上的許多改變。例如，上述詳細(xì)描述說(shuō)明測(cè)試區(qū)域可以位于生長(zhǎng)培養(yǎng)基的第一部分，而對(duì)照參照物可以位于同樣的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的第二部分?；蛘?，測(cè)試區(qū)域可以位于第一生長(zhǎng)培養(yǎng)基，而對(duì)照參照物位于第二生長(zhǎng)培養(yǎng)基。另一個(gè)可以在不背離本發(fā)明精神和范圍前提下所做的改變的例子是步驟的順序。例如，優(yōu)選在用接種物接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并培養(yǎng)該接種物之前將生長(zhǎng)變更劑混合進(jìn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的一部分或全部。然而可以改變步驟順序而仍保持在本發(fā)明方法范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1．一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)一種或多種微生物菌落影響的確定方法，包括以下步驟提供一種固體或半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基；將所述的生長(zhǎng)變更劑混合進(jìn)所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的至少一部分；用接種物對(duì)所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種，所述的接種物具有一種或多種有活力的菌落形成單位；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；量化暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的一種或多種所述微生物菌落的一個(gè)或多個(gè)特性；和評(píng)估所述的特性以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的微生物菌落的影響。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在所述的菌落形成單位已經(jīng)翻倍一次之后，和所述的菌落形成單位翻倍超過(guò)20次之前，對(duì)暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的一種或多種所述微生物菌落的所述特性進(jìn)行量化。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中在所述的菌落形成單位已經(jīng)翻倍8次之前，對(duì)暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的一種或多種所述微生物菌落的所述特性進(jìn)行量化。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始面積，且在至少一些所述的微生物菌落其面積增長(zhǎng)到其所述的初始面積的兩倍之后和大多數(shù)所述的微生物菌落其面積增長(zhǎng)到其所述初始面積的20倍之前，對(duì)所述的微生物菌落的所述特性進(jìn)行量化。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始體積，且在至少一些所述的微生物菌落其體積增長(zhǎng)到其所述的初始體積的兩倍之后和大多數(shù)所述的微生物菌落其體積增長(zhǎng)到其所述初始體積的20倍之前，對(duì)所述的微生物菌落的所述特性進(jìn)行量化。
6．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的特性被量化，而各微生物菌落是具體始祖菌落形成單位的產(chǎn)物。
7．一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基支持的一種或多種微生物菌落影響的確定方法，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基中至少一部分摻入了所述的生長(zhǎng)變更劑，所述的方法包括以下步驟用含一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；量化暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的一種或多種所述微生物菌落的一個(gè)或多個(gè)特性；和將所述的一個(gè)或多個(gè)特性與對(duì)照參照物進(jìn)行比較，以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的微生物菌落的影響。
8．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的生長(zhǎng)變更劑被混合進(jìn)所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的第一部分，而所述對(duì)照參照物包括沒(méi)有所述生長(zhǎng)變更劑的所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的第二部分。
9．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的生長(zhǎng)變更劑以第一濃度被混合進(jìn)所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的第一部分，而所述的對(duì)照參照物包括所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的第二部分并且所述的生長(zhǎng)變更劑以不同于所述第一濃度的第二濃度被混合進(jìn)所述的第二部分。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述的第二濃度小于所述的第一濃度。
11．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的生長(zhǎng)變更劑以濃度梯度的方式被使用，所述的濃度梯度具有較大的濃度端和較小的濃度端，而其中所述的對(duì)照參照物緊臨所述的較低濃度端。
12．根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中在所述較低端的所述生長(zhǎng)變更劑的所述濃度對(duì)所述的微生物菌落沒(méi)有影響。
13．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的對(duì)照參照物包括臨床獲得的數(shù)據(jù)。
14．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的對(duì)照參照物包括一種或多種具有公知生長(zhǎng)特性的比較微生物菌落。
15．根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述的對(duì)照參照物定位于獨(dú)立的第二生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
16．一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基支持的一種或多種微生物菌落影響的確定方法，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中至少一部分摻入了所述的生長(zhǎng)變更劑，所述的方法包括以下步驟用含一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；定期量化暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的所述的一種或多種微生物菌落的一個(gè)或多個(gè)特性；和對(duì)所述特性的所述定期量化進(jìn)行評(píng)估，以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的微生物菌落的影響。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述的定期量化一種或多種微生物菌落的步驟包括定期使所述微生物菌落成像。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的評(píng)估步驟包括比較所述的定期圖像，以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的微生物菌落的影響。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述的評(píng)估步驟包括將所述的定期圖像與對(duì)照參照物進(jìn)行比較，以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的微生物菌落的影響。
20．根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中在所述的菌落形成單位已經(jīng)翻倍一次之后，和所述的菌落形成單位翻倍超過(guò)20次之前，對(duì)暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的一種或多種所述微生物菌落所述特性進(jìn)行定期成像。
21．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始面積，且在至少一些所述的微生物菌落其面積增長(zhǎng)到其所述的初始面積的兩倍之后和大多數(shù)所述的微生物菌落其面積增長(zhǎng)到其所述初始面積的20倍之前，對(duì)所述的微生物菌落的所述特性進(jìn)行定期成像。
22．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的微生物菌落均具有初始體積，且在至少一些所述的微生物菌落其體積增長(zhǎng)到其所述的初始體積的兩倍之后和大多數(shù)所述的微生物菌落其體積增長(zhǎng)到其所述初始體積的20倍之前，對(duì)所述的微生物菌落的所述特性進(jìn)行定期成像。
23．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的特性被定期成像，而各微生物菌落是具體始祖菌落形成單位的產(chǎn)物。
24．一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基上支持的一種或多種微生物菌落影響的確定方法，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基中至少一部分摻入了所述的生長(zhǎng)變更劑，所述的方法包括以下步驟用含一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；定期使暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的一種或多種所述的微生物菌落成像，以顯示所述的微生物菌落的特性；和對(duì)所述特性進(jìn)行評(píng)估，以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的微生物菌落的影響。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述的特性選自由微生物菌落面積、周長(zhǎng)、周長(zhǎng)與面積比、邊緣粗糙度、邊緣輪廓和菌落密度均勻性組成的組。
26．一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)生物樣品影響的確定方法，該樣品被接種進(jìn)固體或半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)以產(chǎn)生由所述樣品中存在的菌落形成單位復(fù)制的微生物菌落，所述的方法包括下述步驟將所述生長(zhǎng)變更劑混合進(jìn)所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的至少一部分；在一段時(shí)間內(nèi)，當(dāng)幾乎所有的所述微生物菌落彼此分離時(shí)，對(duì)暴露于所述生長(zhǎng)變更劑的所述微生物菌落成像；和評(píng)估所述的微生物菌落特性，以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的微生物菌落的影響。
27．一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基上支持的一種或多種微生物菌落作用機(jī)理的確定方法，包括以下步驟用含一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；將所述生長(zhǎng)變更劑混合進(jìn)所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的至少一部分；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；定期對(duì)暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的所述的一種或多種所述的微生物菌落成像；和對(duì)所述的定期成像進(jìn)行評(píng)估，以確定所述的生長(zhǎng)變更劑的作用機(jī)理。
28．一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)生物體影響的確定方法，包括以下步驟將所述生長(zhǎng)變更劑混合進(jìn)固體或半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基的至少一部分；用含源于所述微生物的一種或多種有活力的菌落形成單位的接種物接種所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的生物體小菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；對(duì)暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的一種或多種所述的小菌落成像許多次，從而創(chuàng)建按時(shí)間順序編排的所述的一種或多種小菌落的圖像；和評(píng)估所述的按時(shí)間順序編排的圖像，以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的生物體的影響。
29．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述的按時(shí)間順序編排的圖像，創(chuàng)建于所述的菌落形成單位已經(jīng)翻倍一次之后，和所述的菌落形成單位翻倍超過(guò)20次之前。
30．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中按時(shí)間順序編排的圖像，創(chuàng)建于至少一些所述的小菌落其面積增長(zhǎng)到兩倍之后和大多數(shù)所述的小菌落其面積增長(zhǎng)到20倍之前。
31．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中按時(shí)間順序編排的圖像，創(chuàng)建于至少一些所述的小菌落其體積增長(zhǎng)到兩倍之后和大多數(shù)所述的小菌落其體積增長(zhǎng)到20倍之前。
32．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中創(chuàng)建所述的按時(shí)間順序編排的圖像，而各微生物菌落是具體始祖菌落形成單位的產(chǎn)物。
33．根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中單個(gè)所述小菌落的特性作為測(cè)試組被評(píng)估，并與對(duì)照組相比較，以確定是否所述測(cè)試組的所述特性與所述對(duì)照組的特性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同。
34．根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述的統(tǒng)計(jì)比較用于對(duì)所述的生長(zhǎng)變更劑敏感性的變異進(jìn)行預(yù)報(bào)。
35．根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述的變異是對(duì)抗微生物劑的抵抗力增加。
36．一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)一種或多種微生物菌落影響的確定方法，包括以下步驟提供一種固體或半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基；將所述的生長(zhǎng)變更劑混合進(jìn)所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的至少一部分；用接種物對(duì)所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種，所述的接種物具有許多菌落形成單位，其中所述的菌落形成單位分散于所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，彼此分開(kāi)的距離一般不小于5μm，并不大于100μm；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成所述的微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；在大多數(shù)所述的小菌落彼此匯合之前，量化暴露于所述的生長(zhǎng)變更劑的一種或多種所述微生物菌落的一個(gè)或多個(gè)特性；和評(píng)估所述的特性以確定所述的生長(zhǎng)變更劑對(duì)所述的微生物菌落的影響。
37．一種探查樣品中生長(zhǎng)變更劑存在的方法，包括以下步驟提供一種固體或半固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基；將所述的樣品混合進(jìn)所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的至少一部分；用接種物對(duì)所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種，所述的接種物具有一種或多種有活力的菌落形成單位；以可能使所述的菌落形成單位復(fù)制成一種或多種微生物菌落的方式培養(yǎng)所述的菌落形成單位；量化暴露于所述的樣品的一種或多種所述微生物菌落的一個(gè)或多個(gè)特性；和評(píng)估所述的特性以探查所述的生長(zhǎng)變更劑的存在。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生長(zhǎng)變更劑對(duì)一種或多種微生物菌落影響的確定方法。該方法采用將生長(zhǎng)變更劑混合進(jìn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的至少一部分,并包括以下步驟:(a)以可能使菌落形成單位復(fù)制成微生物菌落的方式培養(yǎng)菌落形成單位;(b)用接種物對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基接種,所述的接種物具有一種或多種有活力的菌落形成單位;(c)量化暴露于生長(zhǎng)變更劑的一種或多種單個(gè)微生物菌落的一個(gè)或多個(gè)特性;和(d)評(píng)估量化的特性以確定生長(zhǎng)變更劑對(duì)單個(gè)微生物菌落的影響。
文檔編號(hào)C12M1/34GK1321773SQ01117809
公開(kāi)日2001年11月14日 申請(qǐng)日期2001年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月17日
發(fā)明者斯蒂芬·C·沃德羅, 羅伯特·A·利費(fèi)恩 申請(qǐng)人:沃德羅合伙公司