專利名稱：基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)方法和試劑盒。具體的是從基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中提取脫氧核糖核酸(DNA)，應(yīng)用實(shí)時(shí)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)技術(shù)對(duì)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中的基因改造成分(genetically modified organisms，GMOs)進(jìn)行定量檢測(cè)的方法和試劑盒。
1983年，世界上第一例基因改造植物問(wèn)世，這標(biāo)明生物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)可以使植物遵從人類的意愿生長(zhǎng)。1994年，美國(guó)Calgene公司研制的基因改造番茄成為世界上第一個(gè)獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的基因改造農(nóng)作物。此后，在美國(guó)、加拿大、阿根廷和歐洲，先后有數(shù)十種基因改造農(nóng)作物獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，這主要包括基因改造的大豆、玉米、棉花、油菜、馬鈴薯、西葫蘆、番木瓜、番茄和南瓜等。在我國(guó)，目前有五種基因改造農(nóng)作物獲準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，其中三種為基因改造的番茄，另外兩種是基因改造的甜椒和棉花，還有一種基因改造的花卉——矮牽牛也獲準(zhǔn)了商品化生產(chǎn)。
基因改造農(nóng)作物由于具有抗蟲、抗除草劑、抗病毒以及品質(zhì)改善等優(yōu)點(diǎn)而得到大面積推廣。據(jù)統(tǒng)計(jì)，去年全球基因改造農(nóng)作物的種植面積已達(dá)到4000萬(wàn)公頃，其中超過(guò)半數(shù)為基因改造的大豆，另有近30％為基因改造的玉米。作為全球最大的基因改造農(nóng)作物種植國(guó)，美國(guó)出口的食品中約60％含有基因改造成分。
1998年英國(guó)的一位科學(xué)家實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，老鼠食用了基因改造的馬鈴薯后，體重減輕，器官出現(xiàn)異常，且免疫系統(tǒng)受到破壞。這在英國(guó)引起了軒然大波，盡管后來(lái)其所在的實(shí)驗(yàn)室對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行了更正，但基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的安全性依然引起人們的質(zhì)疑盡管目前沒(méi)有直接的證據(jù)顯示基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品對(duì)人類有現(xiàn)實(shí)的危害，但科學(xué)家們也無(wú)法證明已食用的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品對(duì)人類的未來(lái)不存在危害。
因此，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，尤其是歐洲，人們對(duì)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的抵觸情緒。政府也采取相應(yīng)的措施，對(duì)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)并加以標(biāo)簽，標(biāo)明是否含有基因改造成份及其含量，使消費(fèi)者具有知情權(quán)，可以自由選擇基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品。
但由于在基因改造農(nóng)作物中基因改造成分在農(nóng)作物的基因組中所占的比例是非常微小的，且由于產(chǎn)品加工過(guò)程中的高溫高壓處理對(duì)基因的破壞，以及所加工的產(chǎn)品中存在的抑制因子，因此對(duì)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中基因改造成分的檢測(cè)是很困難的。
在國(guó)外，科學(xué)家們正在努力研究與改進(jìn)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)方法，以適應(yīng)種類繁多的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品。而在我國(guó)，目前政府還未出臺(tái)與基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品相關(guān)的法規(guī)和管理標(biāo)準(zhǔn)，在基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)方法上還是空白。
本發(fā)明的目的旨在提供通用的對(duì)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品進(jìn)行定量檢測(cè)的方法及試劑盒。
本發(fā)明的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)方法，步驟如下標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)流程包括三個(gè)部分基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取；利用實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)定量檢測(cè)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中的基因改造成分；對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)的通用的解釋。
為防止PCR結(jié)果對(duì)樣品的污染，DNA的提取、PCR的準(zhǔn)備、PCR的運(yùn)行及PCR結(jié)果的分析要分開(kāi)不同的房間進(jìn)行。
第一步、基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取(一)待測(cè)樣品的前處理；粉末狀的待測(cè)樣品不需處理；非粉末狀的固體待測(cè)樣品要處理成粉末狀；液態(tài)待測(cè)樣品采用冷凍干燥法干燥并研碎成粉末狀；新鮮的待測(cè)樣品清洗干凈即可。如對(duì)于堅(jiān)硬的食品，例如黃豆、玉米粒等，采用食品加工機(jī)或研缽進(jìn)行研磨，成為粉末狀；對(duì)于固體的非堅(jiān)硬食品，例如餅干、薯片等，采用研缽或鑷子將其搗碎，成為粉末狀；對(duì)于固體的粉末狀的食品，例如豆粉、面粉等，可直接用于分析；對(duì)于半固體的食品，例如番茄醬、腐乳等，采用冷凍干燥法，并研碎成為粉末；對(duì)于液體的食品，例如豆奶、啤酒等，采用冷凍干燥法，并研碎成為粉末；對(duì)于新鮮的食品，例如新鮮的馬鈴薯、番茄等，可清洗干凈后，直接用于分析。
在進(jìn)行前處理的時(shí)候，每處理完一個(gè)樣品，要及時(shí)清理器具，采用洗滌液、酒精及高溫滅菌等方式，防止食品的交叉污染。
(二)提取待測(cè)樣品的DNA，方法一如下1.稱取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)離心管中，緩慢加入700微升(μl)CTAB提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/LCTAB，pH8.0，使用前加入體積比為1％的巰基乙醇)，充分混勻。
若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有700μl提取緩沖液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩沖液中搗碎食品。
2.將離心管置于60℃水浴中，放置45分鐘，期間混勻數(shù)次。
3.加入等體積氯仿，充分混勻。
4.室溫下12,000rpm離心10min。
5.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，重復(fù)氯仿抽提過(guò)程一遍。
6.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入1ml樹(shù)脂，例如Promega公司的Resin，充分混勻。
7.將混合液通過(guò)一個(gè)過(guò)濾柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
8.用2ml清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)、清洗過(guò)濾柱，重復(fù)一遍。
9.室溫下11,000rpm離心過(guò)濾柱2min。
10.向過(guò)濾柱上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘。
11.室溫下11,000rpm離心過(guò)濾柱2min。
12.收集洗脫液。
13.用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用。
提取待測(cè)樣品的DNA的方法二如下1.稱取200mg食品粉末，放入1.5ml離心管中，緩慢加入860μl提取緩沖液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)，充分混勻。
若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有860μl提取緩沖液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩沖液中搗碎食品。
2.加入100μl 5M鹽酸胍溶液，混勻。
3.加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻。
4.將離心管置于60℃水浴中，放置3小時(shí)，期間混勻數(shù)次。
5.在室溫下冷卻5分鐘。
6.室溫下13,000rpm離心10min。
7.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入等體積氯仿，充分混勻。
8.室溫下12,000rpm離心10min。
9.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，重復(fù)氯仿抽提過(guò)程一遍。
10.將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入1ml樹(shù)脂，例如Promega公司的Resin，充分混勻。
11.將混合液通過(guò)一個(gè)過(guò)濾柱(column)，例如Promega公司的Minicolumn。
12.用2ml清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過(guò)濾柱，重復(fù)一遍。
13.室溫下11,000rpm離心過(guò)濾柱2min。
14.向過(guò)濾柱上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘。
15.室溫下11,000rpm離心過(guò)濾柱2min。
16.收集洗脫液。
17.用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用。
第二步、利用實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)定量檢測(cè)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中的基因改造成分Real-time PCR是一項(xiàng)近幾年才發(fā)展起來(lái)的可用于定量分析樣品中的DNA含量的技術(shù)。在它的PCR反應(yīng)體系中，除設(shè)計(jì)有一對(duì)PCR引物，還設(shè)計(jì)有一個(gè)位于這兩個(gè)引物之間的PCR探針，在探針的5`端標(biāo)記有熒光素，在探針的3`端標(biāo)記有熒光的淬火劑。探針處于游離狀態(tài)時(shí)，因淬火劑的作用，熒光受到抑制。當(dāng)引物和探針都結(jié)合到DNA模板上，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，淬火劑被從探針上切下，熒光開(kāi)始激發(fā)。Real-time PCR儀(例如Perkin Elmer公司的ABI Prism 7700Sequence Detector)能夠隨時(shí)記錄熒光的發(fā)射。熒光的發(fā)射與反應(yīng)體系中PCR產(chǎn)物的積累量呈一定關(guān)系，且與反應(yīng)體系中最初的DNA模板量有關(guān)。因此將待檢測(cè)樣品與一系列已知DNA模板量的標(biāo)準(zhǔn)樣品一同進(jìn)行PCR反應(yīng)，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待檢測(cè)樣品中DNA模板的含量。
(一)確定檢測(cè)標(biāo)記及對(duì)照基因由于在植物基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中所使用的大部分的植物轉(zhuǎn)化中間載體均含有CaMV35S啟動(dòng)子、Nos終止子、抗生素篩選標(biāo)記基因NPTII以及除草劑篩選標(biāo)記基因Bar，因此可以將它們作為通用的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)記。另外由于Monsanto公司的“Roundup Ready”抗除草劑大豆和Novartis公司的“Event176”抗蟲玉米在基因改造農(nóng)作物的市場(chǎng)上占有較大的份額，因此“Roundup Ready”所含有的基因改造成分EPSPS基因和“Event 176”所含有的CryIA(b)基因也可以作為特定的含有“Roundup Ready”大豆或“Event 176”玉米以及其它的含有這些基因改造成分的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)標(biāo)記。
為防止基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品檢測(cè)中的假陰性結(jié)果，需要設(shè)立一系列的對(duì)照基因。選擇大豆特異基因Lectin和玉米特異基因Invertase作為對(duì)照基因。
(二)確定Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線選定混有基因改造的“Roundup Ready”5％的大豆和混有基因改造的“Event176”5％的玉米的DNA，分別稀釋成濃度為20，10，2，1，0.2，0.04ng/ul，各取5ul作為模板，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，則形成相對(duì)于內(nèi)源基因(Lectin和Invertase)為100，50，10，5，1，0.2ng的標(biāo)準(zhǔn)曲線，形成相對(duì)于基因改造成分EPSPS和CryIA(b)為5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以計(jì)算出所檢測(cè)的樣品中所含大豆(或玉米)成分的比例，以及基因改造的“Roundup Ready”大豆(或“Event 176”玉米)的比例。
(三)鑒定檢測(cè)體系的可靠性和靈敏度在開(kāi)始對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)以前，應(yīng)首先進(jìn)行檢測(cè)體系的可靠性和靈敏度的鑒定。
選定混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品定量檢測(cè)體系的可靠性。按照前面所述的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取方法，分別提取它們的DNA，各取100ng作為模板，分別對(duì)各個(gè)檢測(cè)標(biāo)記和對(duì)照基因進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立用重蒸水代替DNA模板的空白對(duì)照。只有當(dāng)檢測(cè)結(jié)果如下時(shí)，才能證明檢測(cè)體系的可靠性以重蒸水代替DNA模板的空白對(duì)照，不能擴(kuò)增出任何檢測(cè)標(biāo)記和對(duì)照基因；“Roundup Ready”0％的大豆，只能夠擴(kuò)增出大豆特異的Lectin基因；“Event 176”0％的玉米，只能夠擴(kuò)增出玉米特異的Invertase基因；“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能夠擴(kuò)增出大豆特異的Lectin基因，且含量基本相同，變異系數(shù)在1％以內(nèi)；“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能夠擴(kuò)增出玉米特異的Invertase基因，且含量基本相同，變異系數(shù)在1％以內(nèi)；“Roundup Ready”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能夠擴(kuò)增出EPSPS基因，且EPSPS基因的含量隨樣品中“Roundup Ready”含量的上升而呈上升趨勢(shì)；“Event 176”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能夠擴(kuò)增出CryIA(b)基因，且CryIA(b)基因的含量隨樣品中“Event 176”含量的上升而呈上升趨勢(shì)。
選定混有基因改造的“Roundup Ready”5％的大豆(或混有基因改造的“Event176”5％的玉米)的DNA，分別稀釋成濃度為20，10，2，1，0.2，0.04ng/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品定量檢測(cè)體系的靈敏度。各取5ul作為模板，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，則相對(duì)于基因改造成分EPSPS(或CryIA(b))，模板的含量分別為5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng。
如果EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng和以上的大豆(或玉米)的DNA模板，可以擴(kuò)增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且檢測(cè)出的基因含量隨樣品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趨勢(shì)，則此時(shí)檢測(cè)體系的靈敏度為0.01ng，即該檢測(cè)體系最低可以檢測(cè)出的基因改造成分含量為0.01ng。若無(wú)法從EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng大豆(或玉米)中擴(kuò)增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，而可以從EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.05ng和以上的大豆(或玉米)中擴(kuò)增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且檢測(cè)出的基因含量隨樣品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趨勢(shì)，則此時(shí)檢測(cè)體系的靈敏度為0.05ng，即該檢測(cè)體系最低可以檢測(cè)出的基因改造成分含量為0.05ng。依此類推。
(四)確定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)PCR引物和探針Real-time PCR要求所擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度在50-150堿基對(duì)(bp)之間，5`端不能出現(xiàn)連續(xù)的G，引物的復(fù)性溫度在58-60℃之間，探針的復(fù)性溫度比引物的復(fù)性溫度高10℃。
我們選定符合以上條件的PCR引物和探針的位置范圍見(jiàn)下表基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)PCR引物和探針位置范圍列表(表一)
(表一)
針對(duì)上面列表中的PCR引物和探針位置范圍，我們尋找到最佳的引物和探針序列見(jiàn)下表基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)最佳PCR引物和探針列表(表二)
(五)確定PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系如下TaqMan buffer A 1×MgCl24mMdATP 0.2mMdCTP 0.2mMdGTP 0.2mMdUTP 0.4mMAmpliTaqGod DNA polymerase0.025U/μlAmp Erase UNG 0.01U/μlPrimer0.2μMTaqMan Probe 0.2μMDNA template 100ng(樣品)重蒸水補(bǔ)至25μl(六)確定PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)條件如下50℃2分鐘，95℃ 10分鐘，然后在如下條件進(jìn)行50個(gè)循環(huán)95℃ 15秒和60℃ 1分鐘。
第三步、對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行解釋在檢測(cè)體系的可靠性得到確認(rèn)以后，對(duì)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)結(jié)果解釋如下如果得到Lectin基因的含量(以X表示，單位為ng)，則證明該樣品中含有大豆成分，且大豆的含量為X％；如果同時(shí)得到Lectin基因的含量(以X表示，單位為ng)和EPSPS基因的含量(以P表示，單位為ng)，則證明該樣品含有基因改造成分，且所含的大豆中(P/X)％為“Roundup Ready”基因改造大豆；如果得到Invertase基因的含量(以Y表示，單位為ng)，則證明該樣品中含有玉米成分，且玉米的含量為Y％；如果同時(shí)得到Invertase基因的含量((以Y表示，單位為ng)和CryIA(b)基因的含量(以Q表示，單位為ng)，則證明該樣品含有基因改造成分，且所含的玉米中(Q/Y)％為“Event 176”基因改造玉米。
本發(fā)明的專用于實(shí)施基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)方法的試劑盒，由如下試劑構(gòu)成
DNA提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS，pH8.0)；樹(shù)脂；過(guò)濾柱(column)；清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；TaqMan緩沖液A；MgCl2；dATP；dCTP；dGTPdUTP；AmpliTaqGod DNA polymerase；Amp Erase UNG；PCR引物，為前述表一或表二中全部的引物；PCR探針，為前述表一或表二中全部的探針。
采用本發(fā)明的方法和試劑盒，可以定量地判定一種農(nóng)作物或其加工產(chǎn)品是否含有基因改造成分。
實(shí)施例用于實(shí)施基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品定量檢測(cè)的試劑盒由下列試劑組成DNA提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；樹(shù)脂；過(guò)濾柱(column)；清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；TaqMan緩沖液A；MgCl2；dATP；dCTP；dGTP；dUTP；AmpliTaqGod DNA polymerase；Amp Erase UNG；PCR引物，為表二中全部的引物；PCR探針，為表二中全部的探針。
所檢測(cè)的食品為購(gòu)自超市的豆奶。用冷凍抽干機(jī)將豆奶凍干，并研成粉末。采用前述基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取方法一得到樣品的DNA，同時(shí)提取混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米的DNA，并按前述確定Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法分別稀釋成一系列的用于作標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度。按照前述PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，分別利用各對(duì)引物對(duì)各個(gè)檢測(cè)標(biāo)記和對(duì)照基因進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)可靠性和靈敏度的鑒定。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到所檢測(cè)食品中的大豆和玉米含量，并可以得到基因改造的“RoundupReady”大豆和“Event 176”玉米的含量。按照前述對(duì)檢測(cè)結(jié)果的解釋整理出相應(yīng)的檢測(cè)報(bào)告。
權(quán)利要求
1.基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)方法，包括如下步驟第一步、基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品DNA的提取(一)待測(cè)樣品的前處理粉末狀的待測(cè)樣品不需處理；非粉末狀的固體待測(cè)樣品要處理成粉末狀；液態(tài)待測(cè)樣品采用冷凍干燥法干燥并研碎成粉末狀；新鮮的待測(cè)樣品清洗干凈即可(二)提取待測(cè)樣品的DNA，方法如下DNA的提取方法一(1)稱取200毫克(mg)食品粉末，放入1.5毫升(ml)離心管中，緩慢加入700微升(μl)CTAB提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0，使用前加入體積比為1％的巰基乙醇)，充分混勻；若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有700μl提取緩沖液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩沖液中搗碎食品；(2)將離心管置于60℃水浴中，放置45分鐘，期間混勻數(shù)次；(3)加入等體積氯仿，充分混勻；(4)室溫下12,000rpm離心10min；(5)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，重復(fù)氯仿抽提過(guò)程一遍；(6)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入1ml樹(shù)脂，充分混勻；(7)將混合液通過(guò)一個(gè)過(guò)濾柱(column)；(8)用2ml清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過(guò)濾柱(column)，重復(fù)一遍；(9)室溫下11,000rpm離心過(guò)濾柱(column)2min；(10)向過(guò)濾柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘；(11)室溫下11,000rpm離心過(guò)濾柱(column)2min；(12)收集洗脫液；(13)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用；DNA的提取方法二(1)稱取200mg食品粉末，放入1.5ml離心管中，緩慢加入860μl提取緩沖液(10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％SDS，pH8.0)，充分混勻；若是新鮮食品，則直接稱取200mg放入盛有860μl提取緩沖液的1.5ml離心管中，用鑷子在緩沖液中搗碎食品；(2)加入100μl 5M鹽酸胍溶液，混勻；(3)加入40μl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻；(4)將離心管置于60℃水浴中，放置3小時(shí)，期間混勻數(shù)次；(5)在室溫下冷卻5分鐘；(6)室溫下13,000rpm離心10min；(7)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入等體積氯仿，充分混勻；(8)室溫下12,000rpm離心10min；(9)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，重復(fù)氯仿抽提過(guò)程一遍；(10)將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入1ml樹(shù)脂，充分混勻；(11)將混合液通過(guò)一個(gè)過(guò)濾柱(column)；(12)用2ml清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)清洗過(guò)濾柱(column)，重復(fù)一遍；(13)室溫下11,000rpm離心過(guò)濾柱(column)2min；(14)向過(guò)濾柱(column)上加入70℃重蒸水50μl，溫育5分鐘；(15)室溫下11,000rpm離心過(guò)濾柱(column)2min；(16)收集洗脫液；(17)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，稀釋成終濃度為50ng/μl，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，備用；第二步、利用實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)定量檢測(cè)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中的基因改造成分(一)確定檢測(cè)標(biāo)記及對(duì)照基因選定下列要素作為檢測(cè)標(biāo)記存在于植物基因轉(zhuǎn)化過(guò)程中所使用的大部分的植物轉(zhuǎn)化中間載體中的CaMV35S啟動(dòng)子、Nos終止子、抗生素篩選標(biāo)記基因NPTII以及除草劑篩選標(biāo)記基因Bar；存在于Monsanto公司的“Roundup Ready”抗除草劑大豆中的基因改造成分EPSPS基因；存在于Novartis公司的“Event 176”抗蟲玉米中的CryIA(b)基因；同時(shí)，選擇大豆特異基因Lectin和玉米特異基因Invertase作為對(duì)照基因；(二)確定Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線選定混有基因改造的“Roundup Ready”5％的大豆和混有基因改造的“Event176”5％的玉米的DNA，分別稀釋成濃度為20，10，2，1，0.2，0.04 ng/ul，各取5ul作為模板，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，則形成相對(duì)于內(nèi)源基因(Lectin和Invertase)為100，50，10，5，1，0.2ng的標(biāo)準(zhǔn)曲線，形成相對(duì)于基因改造成分EPSPS和CryIA(b)為5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng的標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以計(jì)算出所檢測(cè)的樣品中所含大豆(或玉米)成分的比例，以及基因改造的“Roundup Ready”大豆(或“Event 176”玉米)的比例；(三)鑒定檢測(cè)體系的可靠性和靈敏度選定混有基因改造的“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆和混有基因改造的“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品定量檢測(cè)體系的可靠性；按照前面所述的DNA提取方法，分別提取它們的DNA，各取100ng作為模板，分別對(duì)各個(gè)檢測(cè)標(biāo)記和對(duì)照基因進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立用重蒸水代替DNA模板的空白對(duì)照；只有當(dāng)檢測(cè)結(jié)果如下時(shí)，才能證明檢測(cè)體系的可靠性以重蒸水代替DNA模板的空白對(duì)照，不能擴(kuò)增出任何檢測(cè)標(biāo)記和對(duì)照基因；“Roundup Ready”0％的大豆，只能夠擴(kuò)增出大豆特異的Lectin基因；“Event 176”0％的玉米，只能夠擴(kuò)增出玉米特異的Invertase基因；“Roundup Ready”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能夠擴(kuò)增出大豆特異的Lectin基因，且含量基本相同，變異系數(shù)在1％以內(nèi)；“Event 176”0％，0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能夠擴(kuò)增出玉米特異的Invertase基因，且含量基本相同，變異系數(shù)在1％以內(nèi)；“Roundup Ready”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的大豆，均能夠擴(kuò)增出EPSPS基因，且EPSPS基因的含量隨樣品中“Roundup Ready”含量的上升而呈上升趨勢(shì)；“Event 176”0.1％，0.5％，1％，2％，5％的玉米，均能夠擴(kuò)增出CryIA(b)基因，且CryIA(b)基因的含量隨樣品中“Event 176”含量的上升而呈上升趨勢(shì)；選定混有基因改造的“Roundup Ready”5％的大豆(或混有基因改造的“Event176”5％的玉米)的DNA，分別稀釋成濃度為20，10，2，1，0.2，0.04ng/ul，作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)鑒定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品定量檢測(cè)體系的靈敏度；各取5ul作為模板，進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，則相對(duì)于基因改造成分EPSPS(或CryIA(b))，模板的含量分別為5，2.5，0.5，0.25，0.05，0.01ng；如果EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng和以上的大豆(或玉米)的DNA模板，可以擴(kuò)增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且檢測(cè)出的基因含量隨樣品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趨勢(shì)，則此時(shí)檢測(cè)體系的靈敏度為0.01ng，即該檢測(cè)體系最低可以檢測(cè)出的基因改造成分含量為0.01ng；若無(wú)法從EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.01ng大豆(或玉米)中擴(kuò)增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，而可以從EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量0.05ng和以上的大豆(或玉米)中擴(kuò)增出EPSPS基因(或CryIA(b)基因)，且檢測(cè)出的基因含量隨樣品中已知的EPSPS基因(或CryIA(b)基因)含量的上升而呈上升趨勢(shì)，則此時(shí)檢測(cè)體系的靈敏度為0.05ng，即該檢測(cè)體系最低可以檢測(cè)出的基因改造成分含量為0.05ng；依此類推；(四)確定基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)PCR引物和探針?biāo)鶖U(kuò)增的片段長(zhǎng)度在50-150堿基對(duì)(bp)之間，5`端不能出現(xiàn)連續(xù)的G，引物的復(fù)性溫度在58-60℃之間，探針的復(fù)性溫度比引物的復(fù)性溫度高10℃；我們選定符合以上條件的PCR引物和探針的位置范圍見(jiàn)下表基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)PCR引物和探針位置范圍列表(表一)
(表一)(五)確定PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系如下TaqMan buffer A 1×MgCl24mMdATP0.2mMdCTP0.2mMdGTP0.2mMdUTP0.4mMAmpli TaqGod DNA polymerase 0.025U/μlAmp Erase UNG 0.01U/μlPrimer 0.2μMTaqMan Probe0.2μMDNA template100ng(樣品)重蒸水 補(bǔ)至25μl(六)確定PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)條件如下50℃ 2分鐘，95℃ 10分鐘，然后在如下條件進(jìn)行50個(gè)循環(huán)95℃ 15秒和60℃ 1分鐘；第三步、對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行解釋在檢測(cè)體系的可靠性得到確認(rèn)以后，對(duì)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)結(jié)果解釋如下如果得到Lectin基因的含量(以X表示，單位為ng)，則證明該樣品中含有大豆成分，且大豆的含量為X％；如果同時(shí)得到Lectin基因的含量(以X表示，單位為ng)和EPSPS基因的含量(以P表示，單位為ng)，則證明該樣品含有基因改造成分，且所含的大豆中(P/X)％為“Roundup Ready”基因改造大豆；如果得到Invertase基因的含量(以Y表示，單位為ng)，則證明該樣品中含有玉米成分，且玉米的含量為Y％；如果同時(shí)得到Invertase基因的含量((以Y表示，單位為ng)和CryIA(b)基因的含量(以Q表示，單位為ng)，則證明該樣品含有基因改造成分，且所含的玉米中(Q/Y)％為“Event 176”基因改造玉米。
2.如權(quán)利要求1所述的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)方法，其特征在于基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)最佳PCR引物和探針見(jiàn)下表基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)最佳PCR引物和探針列表(表二)
(表二)
3.一種實(shí)施如權(quán)利要求1或2所述的基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于試劑盒由如下試劑構(gòu)成DNA提取緩沖液(0.1M Tris-Cl，1.4M NaCl，20mM EDTA，20g/L CTAB，pH8.0；或者10mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，1％ SDS，pH8.0)；樹(shù)脂；過(guò)濾柱(column)；清洗緩沖液(80mM KAC，8.3mM Tris-HCl，40uM EDTA，pH7.5)；TaqMan緩沖液A；MgCl2；dATP；dCTP；dGTP；dUTP；AmpliTaqGod DNA polymerase；Amp Erase UNG；PCR引物，為表一或表二中全部的引物；PCR探針，為表一或表二中全部的探針。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)方法和試劑盒,屬分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。具體的是從基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中提取脫氧核糖核酸(DNA),應(yīng)用實(shí)時(shí)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real－time PCR)技術(shù)對(duì)基因改造農(nóng)作物及其加工產(chǎn)品中的基因改造成分(genetically modifiedorganisms,GMOs)進(jìn)行定量檢測(cè)的方法和試劑盒。采用本發(fā)明的方法和試劑盒,可以定量地判定一種農(nóng)作物或其加工產(chǎn)品是否含有基因改造成分。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1370841SQ0110421
公開(kāi)日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月26日
發(fā)明者安利忻 申請(qǐng)人:安利忻