專利名稱：年齡同步化細(xì)胞的批量生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明闡述一種方法以收集年齡一致的細(xì)胞群體并維持該細(xì)胞群體年齡的同步化。
自從1950年以來，已有各種方法被用于獲得“同步化”的細(xì)胞群體(見E.Zeuthen著Interscience出版社于1964年在紐約出版的《細(xì)胞分裂與生長的同步化》，C.E.Helmstetter 1969年發(fā)表在《酶學(xué)方法》(Meth.Enzymol.)第1卷327-363頁的論文，以及W.Krek和J.A.DeCaprio1995年發(fā)表在《酶學(xué)方法》(Meth.Enzymol.)第254卷114-124頁的論文)。這些方法可以歸為選擇同步化和誘導(dǎo)同步化兩大類。
在選擇同步化中，細(xì)胞分裂階段中某一理化特征被用作以“細(xì)胞周期”(實(shí)質(zhì)為“細(xì)胞生殖周期”)為基礎(chǔ)的細(xì)胞分離。這些被利用的理化特征可以是細(xì)胞本身固有的特征如細(xì)胞大小和細(xì)胞密度，也可以是人為賦予的特征如摻入到生物質(zhì)中的帶標(biāo)記的分子或貼于細(xì)胞表面的帶標(biāo)記的分子。
在誘導(dǎo)同步化中，處于不同發(fā)育階段的細(xì)胞被停止在或被誘導(dǎo)至某一指定的發(fā)育階段在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，這些細(xì)胞被允許在同一時(shí)間進(jìn)入下一發(fā)育階段而開始同步化。常用的阻止或誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)育的物質(zhì)通常是那些能干予或促進(jìn)“細(xì)胞周期”(實(shí)質(zhì)為“細(xì)胞生殖周期”)的物質(zhì)。
一種被稱為“子代機(jī)器”(Baby Machine)的細(xì)胞同步化裝置已經(jīng)被開發(fā)出來(見C.E.Helmstetter和D.J.Cummings1963年發(fā)表在《美國科學(xué)院通報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)第5Q卷767-774頁的論文，C.E.Helmstetter1991年發(fā)表在《新生物學(xué)》(New Biol.)第3卷1089-1096頁的論文，和C.E.Helmstetter等1992年發(fā)表在《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)第174卷3445-3449頁的論文)。通過這一途徑，從結(jié)合在濾紙上的細(xì)胞釋放下來的子代細(xì)胞被收在一起培養(yǎng)生長。雖然希望如此能得到連續(xù)培養(yǎng)過程中長期的細(xì)胞周期的同步化，可實(shí)際上此希望從未被實(shí)現(xiàn)過。包括當(dāng)此方法被用于大腸桿菌和酵母茵的同步化的時(shí)候(見C.E.Helmstetter1991年發(fā)表在《新生物學(xué)》(New Biol.)第3卷1089-1096頁的論文和C.E.Helmstetter等1992年發(fā)表在《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)第174卷3445-3449頁的論文)。
一種平板釋放技術(shù)已被用于對柄桿茵的同步化(見S.T.Degnen和A.Newton1972年發(fā)表在《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)第64卷671-680頁的論文)。柄桿茵因?yàn)榉至殉梢粋€(gè)游動(dòng)細(xì)胞和一個(gè)帶柄桿的組胞而被稱為非對稱細(xì)茵。由于柄桿頂端的吸盤具有粘性，帶柄桿的細(xì)胞會(huì)貼在表分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)第64卷671-680頁的論文)。柄桿茵因?yàn)榉至殉梢粋€(gè)游動(dòng)細(xì)胞和一個(gè)帶柄桿的組胞而被稱為非對稱細(xì)菌。由于柄桿頂端的吸盤具有粘性，帶柄桿的細(xì)胞會(huì)貼在表面如培養(yǎng)皿平板之上，并在以后的細(xì)胞分裂過程中仍貼在那里。與此相反，游動(dòng)細(xì)胞由于帶有一極端鞭毛而具有動(dòng)力。一旦從貼在表面的柄桿細(xì)胞分離開就可游入液體中。因此，對柄桿茵進(jìn)行細(xì)胞年齡的同步化只需在短期內(nèi)收集從貼著的柄桿細(xì)胞分裂來的游動(dòng)細(xì)胞就可達(dá)到。然而，很多研究已反復(fù)證明，如對這些年齡同步化的游動(dòng)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞周期的同步化從第二個(gè)細(xì)胞周期開始就會(huì)喪失。這是因?yàn)?，雖然柄桿細(xì)胞可在完成第一個(gè)細(xì)胞周期后就進(jìn)行下一次的分裂，游動(dòng)細(xì)胞必須先長成柄桿細(xì)胞之后才能進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期。因此，如要達(dá)到柄桿菌的連續(xù)的細(xì)胞周期同步化，必須重復(fù)進(jìn)行密度離心以分開這兩種類型的細(xì)胞。這種反復(fù)離心過程耗力耗時(shí)。因此關(guān)于柄桿菌的研究很少延伸到其生命過程的第二個(gè)細(xì)胞周期。
有一些方法已被發(fā)展出來以獲得發(fā)芽的老的酵母茵細(xì)胞。其中一種方法是利用較大的母細(xì)胞和較小的芽細(xì)胞之間所存在的大小/密度上的差異而反復(fù)進(jìn)行蔗糖密度梯度的角速度離心以分離大的老細(xì)胞與小的年輕細(xì)胞(見N.K.Egilmez等1990年發(fā)表在《老年生物科學(xué)雜志》(J.Gerontol.Biol.Sci.)第45卷B9-B17頁的論文)。另一方法取決于用生物素選擇性地標(biāo)記年輕的細(xì)胞，當(dāng)這些細(xì)胞長老之后利用生物素與被包在磁粒上的抗生物素蛋白的相結(jié)合而獲得帶有生物素標(biāo)記的老細(xì)胞(見T.J.Smeal等1996年發(fā)表在《細(xì)胞》(Cell)第84卷633-642頁的論文)。
眾所周知，所有已知的細(xì)胞同步化的方法均不能維持細(xì)胞分裂的同步化到幾個(gè)細(xì)胞周期以上，不管被處理的細(xì)胞是原核單細(xì)胞微生物，真核單細(xì)胞微生物，還是真核多細(xì)胞生物的組織細(xì)胞(見E.Zeuthen著Interscience出版社于1964年在紐約出版的《細(xì)胞分裂與生長的同步化》和C.E.Helmstetter等1992年發(fā)表在《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)第174卷3445-3449頁的論文)。然而已同步化的細(xì)胞究竟為何會(huì)在以后的連續(xù)培養(yǎng)中如此快地失去同步性始終是一個(gè)不解之謎。
現(xiàn)有同步化方法或明或暗地都聲稱這么一個(gè)假設(shè)，即由一個(gè)細(xì)胞分裂而來的兩個(gè)細(xì)胞是屬于同一代的兩個(gè)姐妹細(xì)胞而具有相同的年齡(見F.C.Neidhardt等著Sinauer Associates公司于1990年在美國麻省Sunderland市出版的《細(xì)菌細(xì)胞的生理學(xué)》和B.Alberts等著Garland出版社于1989年在美國紐約出版的《細(xì)胞的分子生物學(xué)》)。由于這個(gè)廣為傳播但實(shí)際上并未證實(shí)的假設(shè)，一般都認(rèn)為一旦一個(gè)細(xì)胞群體是在同一細(xì)胞分裂階段得到，那么在其以后的培養(yǎng)中就會(huì)自動(dòng)地給予分裂階段(常常被誤以為年齡)同步化的細(xì)胞。
然而，這種教條式的細(xì)胞生命和細(xì)胞同步化的觀點(diǎn)與許多形式的細(xì)胞生命的現(xiàn)實(shí)不相符合并且從邏輯上講也是錯(cuò)誤的(見S.V.Liu2000年發(fā)表在《邏輯生物學(xué)》(Logical Biology)第2000卷5-16頁的論文)。一個(gè)新的細(xì)胞生命模式提出，一個(gè)細(xì)胞分裂而來的兩個(gè)細(xì)胞實(shí)際上應(yīng)屬上下相傳的兩代而具有不同的年齡(S.V.Liu1999年發(fā)表在《中國科學(xué)》(Science in China)第42卷644-654頁的論文)。如果這一新的學(xué)說是正確的話，那么就意味著大多數(shù)現(xiàn)有的細(xì)胞同步化方法所依賴的基本假設(shè)是站不住腳的。
歸納起來，現(xiàn)有的細(xì)胞同步化方法具有以下一種或多種缺陷(a)用于開始細(xì)胞同步化的初始細(xì)胞群體往往具有不同的年齡。長期以來很多人都認(rèn)為處于同一分裂(生殖)階段的細(xì)胞具有相同的年齡。然而這一假設(shè)并不反映所有的現(xiàn)實(shí)，并且邏輯上也是站不住腳的。例如，說所有即將分裂的細(xì)胞是同一年齡的細(xì)胞，就如同說所有產(chǎn)前的母親都具有相同年齡一樣。這一說法并不完全真實(shí)。因?yàn)榧词故遣煌挲g的婦女也有可能在同一時(shí)間開始懷孕而表現(xiàn)為在生殖周期上的同步化。
(b)即使起始細(xì)胞群的分裂階段或者年齡是同步化的，其繼續(xù)培養(yǎng)過程中不同代的細(xì)胞仍混在一起。一個(gè)母細(xì)胞分裂為兩個(gè)姐妹細(xì)胞的假設(shè)違反了生物學(xué)的基本原則，即生殖意味著傳代和遺傳物質(zhì)的繼續(xù)。盡管對這一錯(cuò)誤假設(shè)的消除仍需進(jìn)一步的科學(xué)研究，但要指出這一辯論的邏輯錯(cuò)誤和與生命普遍原則的矛盾并不難。例如，誰也不會(huì)相信一個(gè)婦女會(huì)在她生育之后就變成她的后代之一。因此，如不將子代與母代分離開，即使開始是年齡同步化的細(xì)胞群體也會(huì)在其繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)自然發(fā)生上下代的混合而導(dǎo)致年齡的不均一性。以我們最為熟悉的生命即人類為例說明，如果允許新生兒仍與她們的母親呆在一起的話，誰也不會(huì)相信這一群體仍具相同的年齡并保持年齡的同步化。
(c)現(xiàn)有的誘導(dǎo)同步化方法僅能達(dá)到細(xì)胞分裂(生殖)周期的同步化，但這并不意味細(xì)胞年齡的同步化。從理論上講，所有影響細(xì)胞周期(細(xì)胞生殖周期)的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)對所有細(xì)胞都有作用，不管它們的年齡如何。因?yàn)槿绱瞬趴赡苁共煌挲g的細(xì)胞被停在或被誘導(dǎo)入同一生殖周期階段。從這一點(diǎn)看，細(xì)胞周期上同步化的細(xì)胞群體并不一定是細(xì)胞年齡上同步。
(d)繁鎖和非自然的過程被用于細(xì)胞年齡的同步化。到目前為止，僅有極少數(shù)的方法可以獲得年齡大于一個(gè)細(xì)胞生殖周期的真正意義上的年齡均一化的細(xì)胞群體。這些方法被用于獲得老的酵母茵細(xì)胞(見N.K.Egilmez等1990年發(fā)表在《老年生物科學(xué)雜志》(J.Gerontol.Biol.Sci.)第45卷B9-B17頁的論文和T.J.Smeal等1996年發(fā)表在《細(xì)胞》(Cell)第84卷633-642頁的論文)。然而，這些方法需要繁鎖的過程和特別的物質(zhì)或設(shè)備。例如，為了收集老的酵母細(xì)胞并把它們與年輕的芽細(xì)胞分開以保持對起始細(xì)胞的長期培養(yǎng)，需要進(jìn)行反復(fù)的離心。這種反復(fù)離心麻煩而耗人力，而且細(xì)胞在此處理過程中經(jīng)歷非自然的生理?xiàng)l件。另外一個(gè)用來收集特定年齡的酵母細(xì)胞群體的方法需要先用生物素標(biāo)記子代酵母細(xì)胞，然后在這些細(xì)胞長老后用涂在磁粒表面的抗生物素蛋自來與生物素特異結(jié)合而收集所標(biāo)記細(xì)胞(見T.J.Smeal等1996年發(fā)表在《細(xì)胞》(Cell)第84卷633-642頁的論文)。這種方法人為地改變細(xì)胞特性，而且只能用于那些能夠?qū)⑸锼負(fù)胶系郊?xì)胞表面的細(xì)胞。該方法還需要一特別設(shè)備即磁分離器。
另外一種具有前途的能夠獲得特定年齡細(xì)胞的技術(shù)是流動(dòng)細(xì)胞儀，如果細(xì)胞可在指定年齡被標(biāo)記而且這種標(biāo)記分子能被流動(dòng)細(xì)胞儀跟蹤的話。然而，如果收集細(xì)胞的過程散布在一較長的時(shí)間范圍，所收集的不同細(xì)胞之間仍會(huì)有年齡上的差別。因此，流動(dòng)細(xì)胞儀也許不太適于用來獲取大量的年齡同步化的細(xì)胞。而且這種方法肯定是昂貴的。
從本質(zhì)上講，所有的“一步”同步化(即期望獲得同一分裂階段或同一年齡的起始細(xì)胞群就可達(dá)到長期細(xì)胞同步化)的方法從理論上講是無法在后續(xù)培養(yǎng)中產(chǎn)生真正的年齡同步化的細(xì)胞群。那些“多步”同步化方法又往往需要反復(fù)離心分離或需先標(biāo)記然后獲取標(biāo)記的細(xì)胞。這些方法能夠收集真正年齡均一的老細(xì)胞。但要花很多的時(shí)間、費(fèi)用和人力。如此方法獲得的細(xì)胞往往經(jīng)歷不自然的生活條件。這些人為的壓力也許會(huì)干擾對這些細(xì)胞生理狀態(tài)的研究。
本發(fā)明的目的是糾正上述傳統(tǒng)方法的根本錯(cuò)誤和克服已有改良方法的不足而創(chuàng)造一種自然、簡便、經(jīng)濟(jì)、易行、適于實(shí)時(shí)監(jiān)測、符合不同規(guī)模需要、能獲得真正年齡同步化的細(xì)胞群體的方法。
本發(fā)明是基于發(fā)明者所提出的新的細(xì)胞生命的理論，即一個(gè)細(xì)胞分裂而來的兩個(gè)細(xì)胞之間具有親子關(guān)系而具有不同的年齡。從這一觀點(diǎn)出發(fā)，發(fā)明者認(rèn)為要實(shí)現(xiàn)真正意義的細(xì)胞群體的年齡同步化，必須不斷地將親代細(xì)胞與它們的子代細(xì)胞分離。因此本發(fā)明的目的是通過如下措施來達(dá)到(a)在很短的時(shí)間內(nèi)收集初始的細(xì)胞群體到一表面，(b)在細(xì)胞衰老過程中不斷地移走它們的子代而使表面僅附有初始收集的細(xì)胞群體，(c)在細(xì)胞衰老過程中根據(jù)需要不時(shí)地取部分表面以收獲不同年齡的同步化的細(xì)胞或進(jìn)行監(jiān)測觀察。
以上步驟的結(jié)合使本發(fā)明與已有的細(xì)胞同步化方法均不同。首先，起始細(xì)胞群體是在一個(gè)非常短的時(shí)間內(nèi)被捕獲到一表面以保證起始細(xì)胞群體具有高度化的年齡均一性。第二，被保留的細(xì)胞僅是起始時(shí)被捕獲的細(xì)胞，而它們的子代細(xì)胞被不停地移走，以維持起始細(xì)胞群體在年齡上的純度。第三，表面材料的質(zhì)量和數(shù)量可根據(jù)需要靈活適當(dāng)?shù)剡x擇。例如可使用透明的表面材料捕獲起始細(xì)胞群體以方便對細(xì)胞同步化的過程進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)視。起始細(xì)胞群體可以是被捕獲到分別相互獨(dú)立的不同表面以便在不同細(xì)胞年齡進(jìn)行多次采樣而不會(huì)影響整個(gè)細(xì)胞同步化過程。
與常規(guī)方法和其它改良方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明不僅獲得高度年齡均一化的起始細(xì)胞群體，而且還在后續(xù)培養(yǎng)過程中不斷地保持其年齡的純度。在子代機(jī)器中，被固定到表面的細(xì)胞通常取自對數(shù)生長期的培養(yǎng)物。從細(xì)胞大小廣泛分布來看，此期實(shí)際上包括各種年齡的細(xì)胞。此外，與細(xì)胞生殖周期的長度相比，細(xì)胞與表面接觸的時(shí)間也是太長。這種在長時(shí)間范圍內(nèi)收集起始細(xì)胞群的做法導(dǎo)致所獲細(xì)胞間的年齡差別較大。由于這些缺點(diǎn)，所獲細(xì)胞并不以同步化的方式進(jìn)行分裂。如果細(xì)胞同步化是從一年齡混合的細(xì)胞群體開始，要想達(dá)到長期的細(xì)胞年齡同步化將是十分困難，如果不是完全不可能的話。本發(fā)明克服了這些缺點(diǎn)，通過在一非常短的時(shí)間內(nèi)只捕獲新生的細(xì)胞，本發(fā)明能保證起始細(xì)胞群在年齡上的高度同步化。子代機(jī)器雖然能獲得子代細(xì)胞以開始細(xì)胞同步化，它并不在其之后對這起始細(xì)胞群的培養(yǎng)中分離子代與親代細(xì)胞。因此造成后續(xù)培養(yǎng)物中細(xì)胞年齡的混合。本發(fā)明通過不斷從起始捕獲的細(xì)胞移走它們的后代而克服這一年齡混合的缺點(diǎn)。
本發(fā)明使用更為自然和簡單的方法。與那些被用來獲取老的酵母菌細(xì)胞的方法相比，本發(fā)明利用一些細(xì)胞能自動(dòng)粘附到表面這一特點(diǎn)，因而不必使用任何外加力量來強(qiáng)行收集這些微生物。另外，本發(fā)明還可采用一些具有吸引力的表面對不能自然粘附到表面的細(xì)胞進(jìn)行收集。與一些靠反復(fù)離心才能達(dá)到長期同步化的方法相比，本發(fā)明代表一種靠自然或非常接近自然的過程達(dá)到細(xì)胞同步化的方法。
除此之外，本發(fā)明還具有以下優(yōu)點(diǎn)(a)設(shè)備和試劑上的費(fèi)用很低。
(b)能快速地獲得同步化的細(xì)胞。
(c)具有滿足不同需要的靈活性。
(d)便于對同步化過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。
(e)便于在不同年齡獲取細(xì)胞。
(f)便于自動(dòng)化。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。


圖1象征性地顯示獲取年齡均一化的細(xì)胞，并在其連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)程中保持年齡純度的方法。
對年齡均一化的起始細(xì)胞群體的獲取可以通過不同的方式進(jìn)行，在一種被推薦的方法中，大量的非同步化的細(xì)胞被允許粘附到一表面。粘有細(xì)胞的這一表面應(yīng)當(dāng)被洗滌數(shù)次以去除粘附不牢的細(xì)胞。然后將此表面以粘附細(xì)胞朝上的方向放入另一含有新培養(yǎng)基的容器內(nèi)，以使得牢固粘附的細(xì)胞在表面上繼續(xù)生長。在預(yù)計(jì)的生殖時(shí)間到來之前的瞬間，將另一表面放到離粘附細(xì)胞很近但又不直接接觸的位置，此新表面的放置時(shí)間應(yīng)當(dāng)很短，以使捕獲的細(xì)胞間具有最小的年齡差別。
另一種方法是使用不同的物質(zhì)使細(xì)胞發(fā)育被停止在或被誘導(dǎo)至某一指定階段。然后允許這些細(xì)胞進(jìn)行生殖并在很短時(shí)間內(nèi)將新生細(xì)胞捕獲到一新的表面。
還有一種收集年齡均一化的細(xì)胞群體的方法，是將指定年齡的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，然后利用能與這些標(biāo)記細(xì)胞相結(jié)合的方法收集被標(biāo)記的細(xì)胞。最好這些標(biāo)記只摻入新生細(xì)胞，這樣細(xì)胞可在出生時(shí)或出生不久的瞬間被收集。例如，生物素可被用來標(biāo)記新生細(xì)胞，這些已標(biāo)記新生細(xì)胞可與其它年齡的細(xì)胞分離。其做法是用被在磁粒表面的抗生物素蛋白與生物素相結(jié)合。
在后續(xù)培養(yǎng)過程中對細(xì)胞年齡純度的維持可利用不同的去除子代細(xì)胞的方法來達(dá)到。在一推薦的方法中，一個(gè)水平方向的液流可被用來沖走從母細(xì)胞上掉下來的子細(xì)胞。連續(xù)注入新的培養(yǎng)基到培養(yǎng)室，并排除老的培養(yǎng)基，就可創(chuàng)造這一液流以帶走脫離的細(xì)胞。
另一種方法是將含有粘附細(xì)胞的表面不時(shí)地升出液面和放進(jìn)液體，這樣創(chuàng)造一種擾動(dòng)以幫助子代細(xì)胞的脫離。液體培養(yǎng)基被不時(shí)地更換以避免或者至少極大地減少子代細(xì)胞粘附到含有起始細(xì)胞的表面上。
為了減少操作上的費(fèi)用，用過的培養(yǎng)基可以通過過濾以去除所含細(xì)胞。這種不含細(xì)胞和重新調(diào)理的培養(yǎng)基可被再次循環(huán)使用。
本發(fā)明聽使用的表面材料可以是任何一種物質(zhì)，只要這種物質(zhì)對所感興趣的細(xì)胞有足夠的粘附力以在較長的培養(yǎng)過程中能保持住這些細(xì)胞。這些表面材料包括但不限于塑料和玻璃。這些材料的表面可以是未處理過的，也可以是用其它物質(zhì)處理過的以增強(qiáng)對細(xì)胞的吸引和對細(xì)胞的粘著。這種用于處理表面的物質(zhì)包括但不限于左旋多聚賴安酸。
為了說明本發(fā)明如何達(dá)到細(xì)胞年齡的同步化，
圖1象征性地描述其總的過程。一個(gè)培養(yǎng)室101被培養(yǎng)基102所填充。此培養(yǎng)基含有未同步化的各種年齡的細(xì)胞。這些細(xì)胞年齡上的差異雖然未被測定，但可從其不同的大小和形態(tài)看出，如分裂前細(xì)胞103，伸長了的生長細(xì)胞104和新生的小細(xì)胞105。
為了收集作為將來同步化所用的母細(xì)胞，一個(gè)表面平板106被放在液體培養(yǎng)物的表面。由于本身的粘附力或者由于被動(dòng)的吸引一些細(xì)胞被吸附到已處理過的表面，這些細(xì)胞很可能處于不同年齡和不同生殖階段。粘有細(xì)胞的表面需用新鮮的培養(yǎng)基洗滌以去除任何粘附不牢的細(xì)胞。然后整個(gè)表面以細(xì)胞朝上的方向被放入另一新的培養(yǎng)基中。
為了收集從粘著母細(xì)胞生育下來的新生細(xì)胞，一個(gè)新的表面平板107被放于臨近粘附細(xì)胞的地方。此新表面只在此放置很短一段時(shí)間，這樣使得所獲新生細(xì)胞之間只有很小的年齡差別，如同均一大小和形態(tài)的細(xì)胞110所示。然后，此一含有新生細(xì)胞的表面平板被放入另一新的容器的新的培養(yǎng)基中，從此開始細(xì)胞年齡的同步化過程。
在接下來的培養(yǎng)過程中，上述新生細(xì)胞逐漸長老而成為生育細(xì)胞111，并最終生產(chǎn)子代112。為了維持起始細(xì)胞的年齡的純度，有必要防止新生細(xì)胞也粘附到表面之上。為達(dá)到此目的，可用一液流113洗掉已脫離的子代。
隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，起始細(xì)胞將繼續(xù)衰老，如同繪圖中細(xì)胞暗度增加所示由斜杠111到交叉114、到全黑115。然而，由于不斷地移走它們的子代，起始收集的細(xì)胞群體始終保持高度的年齡純度。
對年齡同步化的細(xì)胞的收集，可以在同步化進(jìn)程的任一所需的時(shí)間進(jìn)行。收集的方式也可以是多種，如從一較大的表面割取局部或從一含有多個(gè)表面的矩陣中取某個(gè)表面。這些被收集的細(xì)胞可被用于形態(tài)觀察、生理生化測試、遺傳與基因組研究等多種用途。
應(yīng)當(dāng)指出的是，適合本發(fā)明的細(xì)胞包括但不限于單細(xì)胞生物如細(xì)菌和酵母菌，有可能用此發(fā)明同步化多細(xì)胞生物的組織細(xì)胞。因此，本發(fā)明的范圍不應(yīng)以所舉例子而應(yīng)以附加的權(quán)力要求和其法律上的解釋而定。
權(quán)利要求
1.一個(gè)在長期培養(yǎng)過程中產(chǎn)生年齡同步化細(xì)胞群體的方法，包括(a)一種收集年齡均一的初始細(xì)胞群體的手段，和(b)一種在繼續(xù)培養(yǎng)過程中保持初始細(xì)胞群體年齡同一定性的手段。
2.權(quán)力要求1所指獲取年齡均一的初始細(xì)胞群體的手段包括將細(xì)胞固定到某一指定表面的手段和只收集未貼附的新生細(xì)胞到某一新表面的手段。
3.權(quán)力要求2所指表面可選自下列一組材料其中包括玻璃、塑料、纖維、紙張和金屬。
4.權(quán)力要求2所指表面可涂有能粘附細(xì)胞和吸引細(xì)胞的材料如左旋多聚賴氨酸。
5.權(quán)力要求1所指收獲年齡均一化的初始細(xì)胞的手段包括在指定細(xì)胞年齡標(biāo)記細(xì)胞和特異性地收集被標(biāo)記細(xì)胞的手段。
6.權(quán)力要求5所指標(biāo)記細(xì)胞的手段包括使用下列一組物質(zhì)其中包括生物素。
7.權(quán)力要求5所指特異性收集標(biāo)記細(xì)胞的方法包括使用以下方法其中包括配體結(jié)合。
8.權(quán)力要求1所指維持初始細(xì)胞群體年齡均一性的手段包括以下方式創(chuàng)造液體流動(dòng)以從粘附的起始細(xì)胞分離其后代細(xì)胞(a)將液體培養(yǎng)基以水平方向流過含有上述細(xì)胞的表面，(b)將液體培養(yǎng)基以垂直方向流過含有上述細(xì)胞的表面，(c)將含有上述初始細(xì)胞的表面經(jīng)常地浮出，然后又浸入液體培養(yǎng)基，和(d)向培養(yǎng)室間斷地輸入和從培養(yǎng)室間斷地輸出用于培養(yǎng)粘附在表面的初始細(xì)胞的液體培養(yǎng)基。
9.權(quán)力要求1所述細(xì)胞包括而不限于各種類型的微生物細(xì)胞和不同來源的組織細(xì)胞。
10.權(quán)力要求1所述細(xì)胞年齡均一和細(xì)胞年齡同步化是指一般科學(xué)所接受的一定范圍的相對水平的細(xì)胞年齡均一和細(xì)胞年齡同步化。
全文摘要
本發(fā)明闡述一種生產(chǎn)具有相同年齡的細(xì)胞群體的方法。某一指定年齡的細(xì)胞被收獲在一表面上,在接下來的連續(xù)培養(yǎng)過程中,所獲細(xì)胞被保留在上述表面,并通過分離它們的子代而防止它們與其后代的混合。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間從表面上取樣就可獲得所需年齡的細(xì)胞群體以供檢查、測試和其它不同的用途。
文檔編號(hào)C12N5/00GK1333337SQ0110328
公開日2002年1月30日 申請日期2001年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月20日
發(fā)明者劉實(shí) 申請人:劉勝, 劉實(shí)