專利名稱：一種改進的通過體細胞核轉(zhuǎn)移制備豬克隆胚胎的方法
背景技術(shù)：
但是，盡管不斷地試驗，長期以來使用豬體細胞進行的核轉(zhuǎn)移技術(shù)一直未能成功(Du等，Theriogenology，51201(1999)；Tao等，Cloning，155-62(1999))，只有一篇關(guān)于帶有4-細胞期細胞核的NT胚胎產(chǎn)生小豬的報道(Prather等，Biol.Reprod.，41414-418(1989))。所以，使用體細胞克隆豬被認為是難以實現(xiàn)的任務(wù)，直到最近幾年報道的一些成功的進展(Onishi等，Science，2891188-1190(2000)；Polejaeva等，Nature，407505-509(2000))，這些進展是通過體內(nèi)來源的卵母細胞作為受體胞質(zhì)而實施的。
已知離子載體A23187是一種良好的哺乳動物卵通用激活劑(Steinhardt等，Nature，25241-43(1974))，因為它可誘導(dǎo)幾種動物卵母細胞中皮層顆粒的胞外分泌，第二極體排出以及前核的形成(Marcus，Mol.Reprod.Dev.，161384-1391(1990)；Liu等，Mol.Reprod.Dev.，49298-307(1998)；Wang等，Mol.Reprod.Dev.，51346-353(1998))。離子載體處理過的豬卵母細胞也顯示可形成前核和孤雌發(fā)育至胚泡階段(Funahashi等，Biol.Reprod.，501072-1077(1994)；Wang等，Biol.Reprod.，601020-1028(1999))。
通常，組合的化學試劑如Ca-離子載體/6-DMAP(Cibelli等，Science，2801256-1258(1998)；De Sousa等，Cloning，163-69(1999))，離子霉素/6-DMAP(Wells等，Biol.Reprod.，60996-1005(1999))或者放線菌酮/細胞松弛素B(Zakhartchenko等，J.Reprod.Fertil.，115325-331(1999))，已經(jīng)應(yīng)用于激活用體細胞重建的牛卵母細胞。在豬試驗中，一些重建的卵通過暴露在乙基汞硫代水楊酸鈉/二硫蘇糖醇中而被激活，這些卵顯示發(fā)育成推定胚泡(Tao等，Cloning，155-62(1999))。
電刺激也是一種已知的有效的豬卵母細胞激活劑(Jolliff和Prather，Biol.Reprod.，56544-548(1997)；Wang等，Mol.Reprod.Dev.，51346-353(1998))。當成纖維細胞和豬NT卵被通過電刺激激活并且同時融合時，一些胚胎發(fā)育成胚泡(Du等，Theriogenology，51201(1999))。
在核轉(zhuǎn)移中，使用胚胎或體細胞，通?？捎^察到在去核過程中一部分卵母細胞細胞質(zhì)被去除。最后得到的體積減少的細胞質(zhì)造成隨后的發(fā)育潛能的退化以及牛中NT胚胎細胞數(shù)目的減少(Peura等，Mol.Reprod.Dev.，50185-191(1998))。注射了成纖維細胞的牛NT胚胎顯示了相對低的發(fā)育率，在實驗中，只有12％的胚胎達到胚泡階段(Cibelli等，Science，2801256-1258(1998))，而注射了壁或丘粒的胚胎細胞則導(dǎo)致相對較高的體外發(fā)育率，顯示約有50％胚胎達到胚泡階段(Kato等，Science，2822095-2098(1998)；Wells等，Biol.Reprod.，60996-1005(1999))。這兩種實驗的不同結(jié)果暗示每種不同細胞類型作為核供體可能具有不同的發(fā)育潛能，但是，NT豬胚胎在體外發(fā)育能力的詳細情況至今還沒有清楚的解釋，仍需進一步闡明。
體細胞核轉(zhuǎn)移已成為產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，特別是轉(zhuǎn)基因家畜動物的一種有效工具。克隆的轉(zhuǎn)基因動物也已從轉(zhuǎn)染的成纖維細胞中產(chǎn)生(Schnieke等，Science，2782130-2133(1997)；Cibelli等，Science，2801256-1258(1998))。但是，仍需注意到利用以上提及的核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因豬的一個先決條件是在體細胞上進行了基因修飾。盡管近來使用各種體細胞類型作為核供體在綿羊，牛，小鼠，山羊和豬中取得了成功，但體細胞核轉(zhuǎn)移的效率仍然非常低，僅有不到2％。所以，長期以來渴望發(fā)展一種更先進的核轉(zhuǎn)移技術(shù)能更廣泛地應(yīng)用于動物工業(yè)和生物醫(yī)學領(lǐng)域。
圖2舉例說明本發(fā)明建立轉(zhuǎn)基因細胞系和克隆的轉(zhuǎn)基因胚胎的實施方案。在成纖維細胞(A)和NT胚泡(C)中GFP的表達。在光學顯微鏡下觀察到相同的NT胚胎(B)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種改進的通過體細胞核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，包括以下步驟(a)去除受體卵母細胞的核；(b)在體外培養(yǎng)核供體體細胞；(c)將體細胞注射到去核的卵母細胞中；(d)將每個去核卵母細胞與供體體細胞進行電融合；(e)通過第二次電刺激激活重建的胚胎；(f)在體外培養(yǎng)NT胚胎并將NT胚胎轉(zhuǎn)移至受體豬。
以下進一步說明本發(fā)明。
首先，本發(fā)明的特征在于在卵母細胞去核和所述卵母細胞與體細胞通過電刺激融合后，具有一個1-2h(小時)的卵母細胞重建期。通常，除了那些來自人類的外，推薦使用哺乳動物體細胞作為核供體，尤其優(yōu)選取自豬，奶牛，綿羊和小鼠等動物的成纖維細胞或丘細胞。在本發(fā)明中，受體卵母細胞收集自青春期前的豬卵巢，并且不成熟的卵母細胞在體外孵育成熟。然后，僅選擇出那些具有第一極體的成熟卵母細胞，然后進行去核，待用。單個供體體細胞分別被注射到每個去核的卵母細胞中，暴露在160V/mm電脈沖的初次電刺激下30μsec，誘導(dǎo)每個卵母細胞的細胞質(zhì)與每個供體體細胞的細胞核之間分別融合。這樣得到的卵母細胞通過在含有胎牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)中培養(yǎng)進行1-2h的重建。
上述重建的卵母細胞再進行第二次電刺激激活，其中所述卵母細胞暴露在120-150V/mm電脈沖下30μsec。如果電刺激低于120V/mm，激活率降低，當超過150V/mm時，卵母細胞受傷的風險就會增加。然后這些卵母細胞在體外進行進一步發(fā)育。在傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)移方法中，僅對卵母細胞進行一次電刺激，在體外發(fā)育率通常小于5％；與此相反，本發(fā)明通過導(dǎo)入第二次電刺激可以顯著地改進所述卵母細胞的發(fā)育率，使其達到11.6％，即，與那些傳統(tǒng)方法相比具有130％的增加。
重建卵母細胞的激活是在體細胞核轉(zhuǎn)移至受體細胞質(zhì)中后實施。幾種組合的化學處理，例如鈣離子載體/6-DMAP或乙醇/放線菌酮/細胞松弛素B，已經(jīng)用于激活帶有體細胞的牛NT卵母細胞。但是，當單獨使用A23187或使用組合試劑A23187/6-DMAP處理豬NT卵母細胞時，它們顯示出相對較低的激活率。通常，當用一種單獨的化學試劑處理時，豬卵母細胞顯示出較低的激活率，而當用一種結(jié)合的化學試劑，乙基汞硫代水楊酸鈉/DTT處理時，豬卵母細胞發(fā)育成胚泡，盡管它們的發(fā)育率很低。在另一報道中，用巰基試劑激活時，顯示出低卵裂率，這就導(dǎo)致隨后能夠發(fā)育成胚泡的豬NT卵母細胞的發(fā)育率很低。根據(jù)本發(fā)明，電刺激激活的豬NT胚胎與用化學試劑處理的相比，顯示相對較高的發(fā)育率。
測定電融合后不同水平電壓誘導(dǎo)的豬NT卵發(fā)育能力，結(jié)果顯示，電脈沖(120V/mm DC脈沖)對于激活帶有體細胞的豬NT胚胎十分有效。
當用乙基汞硫代水楊酸鈉/二硫蘇糖醇激活時，約有70％用豬成纖維細胞重建的胚胎未能分裂(Tao等，Cloning，155-62(1999))。在本發(fā)明中，用一次電刺激激活的豬NT卵的平均卵裂率與那些單性生殖的以及體外來源的受精來源(IVF)胚胎相似。這樣，本發(fā)明說明一次電刺激足夠介導(dǎo)使用體細胞的豬NT胚胎的發(fā)育。
本發(fā)明提供了在電融合之后，用體細胞重建的卵最佳的激活時間。在牛中，NT胚胎在供體細胞與MII期細胞質(zhì)融合后4到8h激活，顯示在胚胎發(fā)育中有所改善(Stice等，Biol.Reprod.，54100-110(1996)；Well等，Reprod.Fertil.Dev.，10369-378(1998))。延長被轉(zhuǎn)移的核暴露在卵母細胞細胞質(zhì)因子中的時間也促進了核改建(remodeling)和重新編程(DiBerardino等，Science，224946-952(1984)；Ware等，Gamete Res.，22265-275(1989))。所以，這暗示著，在激活之前使重建的卵母細胞經(jīng)歷幾個小時的滯后期，會促進核改建或重新編程，盡管其機理還不清楚。為測定卵母細胞激活的最佳條件，檢測電融合后不同激活時間誘導(dǎo)的豬NT卵的發(fā)育能力。在本發(fā)明中，融合后1-2h激活的豬NT胚胎與融合后經(jīng)更短時間(0和0.5h)或更長時間(4和6h)激活的相比，顯示出改善的發(fā)育。這可能歸因于不同的物種中，基因組激活的時間不同。在豬中胚胎基因組的激活通常發(fā)生在4-細胞期，而在綿羊和牛中是在8到16-細胞期(Kopscny，Reprod.Nutr.Dev.，29589-600(1989))。這就暗示著電融合后重建的豬卵母細胞的激活時間在體細胞核轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生可成活胚胎的過程中具有決定性的作用。進一步的，還暗示著融合后供體核在受體細胞質(zhì)中的改建和重新編程所需的時間可能因物種不同而不同。
本發(fā)明還公開了核轉(zhuǎn)移后，從體外成熟的卵母細胞成功地產(chǎn)生豬克隆胚胎的方法。通過將體細胞細胞核轉(zhuǎn)移到去核的體內(nèi)來源的卵母細胞，產(chǎn)生NT胚胎，已經(jīng)發(fā)育得到了除牛之外，如綿羊，山羊，小鼠和豬等大多數(shù)克隆動物。體內(nèi)來源卵母細胞通過沖洗促性腺激素處理后超排卵動物的排卵管得到，該激素在各個物種中不同。但是，體內(nèi)來源卵母細胞數(shù)目大體上都在一定的限度內(nèi)，因為該方法費力耗時。作為替代，許多作為受體細胞質(zhì)的卵母細胞可在體外制備。優(yōu)質(zhì)的未成熟卵母細胞可從屠宰場來源的卵巢中得到，體外成熟并在去核后用作受體細胞質(zhì)。最近，還有報道稱體內(nèi)來源的卵母細胞可產(chǎn)生克隆豬(Onishi等，Science，2891188-1190(2000)；Polejaeva等，Nature，407505-509(2000))。但是，本發(fā)明提供一種使用體外來源卵母細胞在體細胞核轉(zhuǎn)移后產(chǎn)生豬NT胚胎的方法。
已有研究暗示帶有體細胞的NT胚胎發(fā)育能力可能根據(jù)哺乳動物中細胞類型而不同(Kato等，Science，2822095-2098(1999)，Zakhartchenko等，Mol.Reprod.Dev.，54264-272(1999))。本發(fā)明中，用作供體核的丘細胞和胎兒成纖維細胞支持NT豬胚胎發(fā)育到植入前階段，這暗示著本發(fā)明的激活體系在核轉(zhuǎn)移中可適用于各種不同細胞類型。
成功的豬體細胞核轉(zhuǎn)移暗示該技術(shù)可用于產(chǎn)生用于異源移植的或作為疾病模型的轉(zhuǎn)基因豬；事實上，本發(fā)明還成功的將外源DNA導(dǎo)入到豬體細胞內(nèi)。在本發(fā)明中，用轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生的NT胚胎與那些用未轉(zhuǎn)染供體細胞制得的相比，具有相似的發(fā)育能力。并且，在用轉(zhuǎn)染細胞制得的所有NT胚胎早期發(fā)育階段中轉(zhuǎn)基因的表達很強烈，這加強了從在核轉(zhuǎn)移后用轉(zhuǎn)染細胞制得的NT胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎或轉(zhuǎn)基因動物的可能性。實驗詳述體外成熟(IVM)和體外受精(IVF)從當?shù)赝涝讏鍪占啻浩谇暗呢i卵巢，轉(zhuǎn)移到實驗室并在25-30℃，在75μg/ml青霉素G鉀和50μg/ml鏈霉素硫酸鹽補充的0.9％(w/v)鹽水中保存直至使用。使用與10ml一次性注射器連接的18號針頭收集來自直徑3-6mm豬卵泡的丘-卵母細胞復(fù)合物(COC)。COC用Tyrode’s乳酸鹽(TL)-Hepes培養(yǎng)基清洗3遍。在39℃，含有5％CO2的空氣下，在4孔多用板(Nunc，Roskilde，Denmark)上分別含有500μl成熟培養(yǎng)基的每個孔中培養(yǎng)約50個COC。在20到22h培養(yǎng)后，用TL-Hepes培養(yǎng)基清洗卵母細胞3遍，然后在沒有孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨膜促性腺激素(hCG)補充的成熟培養(yǎng)基中進一步培養(yǎng)22h。培養(yǎng)物用溫熱的石蠟油(輕礦物油)覆蓋，使用前在39℃，含有5％CO2的空氣下平衡至少2h。卵母細胞成熟培養(yǎng)基是不含牛血清白蛋白(BSA)的NorthCarolina State University(NCSU)23培養(yǎng)基，用10％(v/v)豬卵泡液，0.57mM半胱氨酸，25μg/ml慶大霉素，10ng/ml表皮生長因子(EGF)，10IU/ml PMSG和10IU/ml hCG補充。豬卵泡液收集自3-6mm直徑的卵泡，1600×g離心30min，通過1.2μm注射器式濾器過濾，以等份試樣保存在-20℃直至使用。
IVF所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基基本與Abeydeera和Day(Biol.Reprod.，57729-734(1997))描述的相同。這種IVF培養(yǎng)基，設(shè)計為改良Tris-緩沖培養(yǎng)基(mTBM)，由113.1mM NaCl，3mM KCl，7.5mM CaCl2·2H2O，20mMTris(結(jié)晶的游離堿；Fisher Scientific，F(xiàn)air Lawn，NJ)，11mM葡萄糖，5mM丙酮酸鈉構(gòu)成，并且不含抗生素。新鮮豬精液由Darby Pig AICenter(Acseong，Korea)每周一次惠贈，并在17℃保存5天。上述精液通過在1mg/ml BSA(V組分)，100μg/ml青霉素和75μg/ml鏈霉素補充的Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(DPBS)中離心進行清洗，清洗后，將精子重懸在Tris緩沖培養(yǎng)基中(pH7.8)。IVM結(jié)束后，通過用0.1％(w/v)透明質(zhì)酸酶在NCSU23培養(yǎng)基中處理去除卵母細胞的丘細胞。裸露的卵母細胞用2.5mM咖啡因和4mg/ml BSA補充的mTBM清洗3遍，然后置于覆蓋在石蠟油下的50μl mTBM中。將50微升稀釋的精子加入到50μl含有卵母細胞的受精培養(yǎng)基中，使精子的終濃度為5×105細胞/ml。卵母細胞與精子在39℃，含有5％CO2的空氣下共孵育6h。制備體細胞為制備丘細胞，從單個豬卵巢中收集COC。經(jīng)過46h IVM培養(yǎng)后，用0.1％(w/v)透明質(zhì)酸酶補充的TL-HEHES培養(yǎng)基處理，使丘細胞散開。在微型離心機(Vision Scientific Co.，Korea)中以700×g離心5分鐘沉淀丘細胞。細胞沉淀在不含Ca2+，Mg2+的磷酸鹽緩沖液(DPBS(-))中重懸，然后細胞懸浮液在用作供體核之前，在室溫保存2小時以上。胎兒成纖維細胞分離自妊娠期40天的韓國當?shù)刎i(Sus scrofa domesticusL.，)胎兒。簡單地，豬胎用DPBS(-)清洗3遍，鳶尾剪去除豬胎頭部，用2把watch-maker’s鑷子去除肝臟和腸上的軟組織。用DPBS(-)清洗2遍后，將材料用解剖刀在100mm培養(yǎng)皿上切碎。切碎的組織在10ml(w/v)胰蛋白酶/3.65mM EDTA溶液中，在39℃下孵育30min。加入等體積的以15％胎牛血清(FBS；Gibco，Life Technologies Inc.，Grand Island，NY)補充的細胞培養(yǎng)基抑制胰蛋白酶活性。細胞培養(yǎng)基由Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM；Gibco)，15％FBS，1000單位青霉素和1000μg/ml鏈霉素(Gibco)構(gòu)成。經(jīng)過劇烈吸吹后，上清以150×g離心5min。重懸細胞，調(diào)整使其終濃度達到2×106細胞/ml，然后在39℃，含有5％CO2的空氣下，在含有10ml培養(yǎng)基的175cm2組織培養(yǎng)瓶(Nunc，Roskide，Denmark)中進行培養(yǎng)。胎兒成纖維細胞在用作供體核來源之前經(jīng)歷3次傳代。外源DNA轉(zhuǎn)染至體細胞1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)/二甲基亞砜(DMSO)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Kawai和Nishizawa，Mol.Cell Biol.，41172-1174(1984))按下述實施將在30μg/ml 1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(Aldrich，Milwaukee，WI，USA)補充的1ml培養(yǎng)基中的10μg pLNβ-eGFP質(zhì)粒DNA加入到前一天平板培養(yǎng)(5×105細胞/60mm皿)的基于長臂猿白血病病毒的PG13包裝細胞中。37℃含有5％CO2的空氣下經(jīng)過6h孵育后，DNA-培養(yǎng)基混合物被吸出，加入2ml含有25％DMSO的培養(yǎng)基使包裝細胞休克，然后孵育1min。用培養(yǎng)基清洗3次后，用5ml培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞并在分裂轉(zhuǎn)染細胞前孵育過夜。胎兒成纖維細胞靶細胞的感染按改良的Miller和Rosman方法(Biotechniques，7980-982(1989))進行；3ml含病毒培養(yǎng)物經(jīng)過0.22μm孔徑濾器過濾，然后向前一天平板培養(yǎng)的靶細胞中加入1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(終濃度5μg/ml)。靶細胞暴露在混合物中的時間只允許1hr。含病毒培養(yǎng)基收集自前一天用非選擇培養(yǎng)基飼養(yǎng)的產(chǎn)病毒細胞。感染后培養(yǎng)1天，感染細胞用胰蛋白酶處理，然后在非選擇培養(yǎng)基中分裂(splitting)。在轉(zhuǎn)染和感染過程中，在分裂后第二天加入G418選擇培養(yǎng)基(600μg/ml)。轉(zhuǎn)染的細胞在用作核供體源之前傳代14次。豬卵母細胞的去核IVM 44-46h后，卵母細胞轉(zhuǎn)移到500μl補充0.1％透明質(zhì)酸酶的TL-Hepes培養(yǎng)基中，并通過渦旋3min去除丘細胞。按Tsunoda等人(J.Exp.Zool.，240119-125(1986))的描述，用細玻璃針將卵母細胞的透明帶部分分裂。卵母細胞的操作，包括去核和細胞注射，通過使用配有倒置顯微鏡的顯微操作儀(Leitz，Ernst Leitz Wetzlar GmbH，Germany)進行。用于卵母細胞操作的培養(yǎng)基是含有7.5μg/ml細胞松弛素B的DPBS(-)。第一極體以及推定含有分裂中期II染色體的部分細胞質(zhì)通過使用內(nèi)徑20μm的微量加樣器共同取出。去核后，卵母細胞用5μMbisbenzimide(Hoechst 33342)染色5min，然后在落射熒光顯微鏡下觀察(Olympus，Tokyo，Japan)。細胞注射，電融合以及激活單個的成纖維細胞被分別轉(zhuǎn)移進每個去核的卵母細胞中。帶有光滑表面的小細胞用作核供體源。重建的胚胎在50μl細胞融合培養(yǎng)基液滴中平衡10-20sec，然后轉(zhuǎn)移到帶有兩個分開1mm的電極、并覆蓋有細胞融合培養(yǎng)基的融合室中。細胞融合培養(yǎng)基由0.3M甘露醇，0.5mM Hepes，0.01％BSA，0.1mM CaCl2和0.1mM MgCl2構(gòu)成。使用BTX Electro-cellManipulator 2001(BTX，San Diego，CA，USA)，用160V/mm單直流脈沖誘導(dǎo)細胞融合30μsec。電融合后，經(jīng)過3V/mm交流電脈沖5sec后再用120V/mm直流電脈沖30μsec激活胚胎。豬卵母細胞的單性生殖激活豬卵母細胞的單性生殖激活如前所述實施(Wang等，Mol.Reprod.Dev.，51346-353(1998))。簡言之，去除丘細胞的卵母細胞在0.5mMHepes，0.01％BSA(無脂肪酸)，0.01mM CaCl2和0.01mM MgCl2補充的0.3M甘露醇溶液中平衡1min，然后轉(zhuǎn)移到帶有兩個分開1mm的電極并覆蓋有激活溶液的室中。卵母細胞經(jīng)過3V/mm單交流電脈沖5μsec后再用180V/mm單直流電脈沖30μsec處理。NT胚胎的體外培養(yǎng)在所有的試驗中，被激活的卵在37℃含有5％CO2的空氣下，在4mg/mlBSA補充的50μl NCSU23培養(yǎng)基液滴中培養(yǎng)。經(jīng)過72h培養(yǎng)后，選擇出處于分裂期的胚胎。40到50分裂的胚胎在37℃含有5％CO2的空氣下，在10％FBS補充的50μl NCSU23培養(yǎng)基液滴中共培養(yǎng)3天。經(jīng)過6天的培養(yǎng)，觀察到胚泡的形成，Hoechst 33342(2.5μg/ml)染色后在熒光顯微鏡下計數(shù)胚泡的細胞數(shù)。NT胚胎的細胞數(shù)目所有使用體細胞從NT胚胎發(fā)育得到的胚泡在Hoechst染色后計數(shù)細胞核。簡言之，室溫下，胚胎用1％甲醛在PBS中固定10min，然后將其置于載玻片上的一滴封固培養(yǎng)基中。封固培養(yǎng)基由25％(v/v)甘油在含有2.5mg/ml疊氮化鈉的PBS中和2.5μg/ml Hoechst 33342構(gòu)成。用蓋玻片覆蓋到胚胎上，蓋玻片的邊緣用指甲油密封。在落射熒光顯微鏡(Olympus，Japan)下計數(shù)核數(shù)目。
本發(fā)明在以下實施例中更加具體地說明，但不能將本發(fā)明保護范圍限定于此。
表1.不同激活處理對于用丘細胞制得的NT豬胚胎體外發(fā)育的影響
這些實驗每組同時分別重復(fù)5次。
ab欄中不同的上標表示差異顯著(P＜0.05)。
檢測的胚胎數(shù)目在圓括號中顯示。
表2.激活電壓對于用體細胞制得的豬NT胚胎體外發(fā)育的影響
％*分裂卵數(shù)目/檢測的卵數(shù)目×100。％**胚泡數(shù)目/檢測的卵數(shù)目×100。ab欄中不同的上標表示差別顯著(P＜0.05)。檢測的胚胎數(shù)目在圓括號中顯示。
表3.電融合后不同時間激活的豬NT胚胎的體外發(fā)育
ab欄中不同的上標表示差別顯著(P＜0.05)。檢測的胚胎數(shù)目在圓括號中顯示。
相較于IVF來源的(21.4±1.9％，43/201)或單性生殖的胚胎(22.4±7.2％，43/201)，使用成纖維細胞的NT胚胎顯示更低的胚泡發(fā)育率(9.4±0.9％，20/289)(p＜0.01)，盡管在各實驗組間胚胎的卵裂率沒有顯著差別(表4)。培養(yǎng)6天后，多數(shù)來自NT胚胎的胚泡(16/20)被孵化(


圖1)，盡管核平均數(shù)小于IVF來源的胚泡(圖2)。NT胚泡早期孵化的原因似乎歸因于去核過程中透明帶的部分剖分。NT胚胎的平均細胞數(shù)(28.9±11.5，范圍從14到61，n＝18)小于IVF來源的胚泡平均細胞數(shù)(36.2±9.7，范圍從18到67，n＝22)(P＜0.05)，而與單性生殖胚胎平均細胞數(shù)(29.9±12.1，范圍從13到50，n＝24)相似(表4)。這些結(jié)果代表使用成纖維細胞的豬NT胚胎可以體外發(fā)育成胚泡，盡管相比于IVF來源的胚胎，它們的發(fā)育能力較低。
比較使用丘細胞(NT+)或/和成纖維細胞(NT)進行核轉(zhuǎn)移得到的豬卵母細胞與IVF來源胚胎的發(fā)育潛能(表5)。電融合后與丘細胞或成纖維細胞重建的去核卵母細胞融合率分別為67％(257/374)或69％(273/396)。這樣在2種供體細胞類型之間NT胚胎的卵裂率沒有顯著差別。但是，來自兩種細胞類型的NT胚胎顯示胚泡發(fā)育率低于IVF來源的胚胎(P＜0.01)。IVF來源的，NT+，NT的胚泡平均核數(shù)目分別是38.6<p>2、該電動機的全壓軟起動更優(yōu)于其它目前所有使用中的軟起動方式1)、起動電流，時間可按負載不同靈活調(diào)節(jié)，取得最小的電流沖擊。
2)、平滑、漸進的起動過程減少起動電流對電網(wǎng)的沖擊，降低設(shè)備的振動和噪聲，延長了機械傳動系統(tǒng)的使用壽命和改善了工人的勞動環(huán)境。
3)、起動電流可根據(jù)負載調(diào)整、減小起動損耗以最小的電流產(chǎn)生最佳轉(zhuǎn)矩。
4)、可遠程控制、微機聯(lián)網(wǎng)。
5)、雙電源分離保證控制部分不受強電干擾。
3、其它性能特點一體化電動機與同型號、同規(guī)格的普通電動機并附加相應(yīng)起動器的組合作比較，具有這樣的特色體積小、重量輕、線路簡捷、沒有壽命殺手、不發(fā)熱、不需可控硅軟起動器設(shè)置的自冷卻風扇和散熱片，綜合成本低廉。所采用的開關(guān)為均流開關(guān)，觸點少弧運行，優(yōu)越的抗過載能力、綿長的電壽命，該電動機設(shè)計思路簡捷，使用安裝方便。
4、經(jīng)濟性能對比見表二表二經(jīng)濟性能對比表
5、電動機成本的比較見表三表三Y系列普通電動機組合與一體化電動機成本比較表(11KW——90KW)
毒感染將外源β-肌動蛋白啟動子/GFP基因?qū)胴i成纖維細胞，G418處理約2周后得到存活的集落。落射熒光顯微鏡下證實了轉(zhuǎn)染的成纖維細胞中GFP的表達(
圖1A)。轉(zhuǎn)染成纖維細胞制得的NT卵母細胞融合率(67％，195/292)與非轉(zhuǎn)染細胞的融合率相似(71％，197/277)。轉(zhuǎn)染與非轉(zhuǎn)染細胞的NT胚胎胚泡發(fā)育率也相似(表6)。所有來源于轉(zhuǎn)染細胞的NT胚胎如
圖1C所示，顯示出強烈的GFP表達。結(jié)果顯示用轉(zhuǎn)染細胞與非轉(zhuǎn)染細胞制得的豬NT胚胎具有相似的發(fā)育潛能。這樣，我們發(fā)明的激活NT胚胎的方法可應(yīng)用于從轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因NT胚胎。
表6.用轉(zhuǎn)染細胞制得的豬NT胚胎的體外發(fā)育
*每組分別同時進行四次實驗。檢測的胚胎數(shù)目在圓括號中顯示。
權(quán)利要求
1.一種通過核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，包括(a)重建去核豬卵母細胞的步驟，該卵母細胞通過電刺激與被注射到所述去核卵母細胞中的供體體細胞或供體體細胞細胞核進行融合；(b)通過第二次電刺激激活所述重建的豬卵母細胞的步驟。
2.權(quán)利要求1的通過核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，其中被注射到所述去核卵母細胞中的所述供體體細胞或所述供體體細胞細胞核是從除人之外的哺乳動物的成纖維細胞或丘細胞制備的轉(zhuǎn)染體細胞或轉(zhuǎn)染體細胞細胞核。
3.權(quán)利要求2的通過核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，其中所述哺乳動物是豬，牛，綿羊和小鼠。
4.權(quán)利要求1的通過核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，其中所述重建期進行1-2h。
5.權(quán)利要求1的通過核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，其中所述作為受體胞質(zhì)體的豬卵母細胞在去核前進行體外成熟。
6.權(quán)利要求1-3的通過核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，其中所述供體細胞或供體細胞核制備自胎兒或成年組織。
7.權(quán)利要求1的通過核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，其中所述第二次電刺激是應(yīng)用120-150V/mm的單個直流電脈沖處理30μsec。
8.權(quán)利要求1-3和6的通過核轉(zhuǎn)移大規(guī)模生產(chǎn)豬克隆胚胎的方法，其中所述豬供體體細胞或供體體細胞核制備自韓國當?shù)刎i(Sus scrofadomesticus L.)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種改進的通過體細胞核移植大規(guī)模生產(chǎn)豬胚胎克隆的方法。詳細地說，從屠宰場來源的卵巢制備卵母細胞，然后體外成熟。在體外成熟(IVM)完成之后，卵母細胞去核并通過電刺激單個地與體細胞融合。重建的卵通過第二次電刺激激活，然后在體外培養(yǎng)。本發(fā)明試圖建立激活重建的卵母細胞的最佳條件，以及提高核轉(zhuǎn)移(NT)胚胎的活力，最終得到可成活的克隆胚胎和克隆動物。所以，本發(fā)明豬體細胞核轉(zhuǎn)移可應(yīng)用于擴大原種豬以及培育用作異種移植或作為疾病模型的轉(zhuǎn)基因豬。
文檔編號C12N15/09GK1407851SQ00816831
公開日2003年4月2日 申請日期2000年11月16日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月19日
發(fā)明者韓龍萬, 李景廣, 具德本, 樸貞宣, 姜龍國, 崔英喜, 柳大烈 申請人:韓國生命工學研究院