專利名稱：施氏假單胞菌Zh9944及其篩選方法和防治青枯病的微生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌及其篩選方法和以該細(xì)菌為主要成分的防治作物如煙草、番茄等的青枯病的微生物制劑。
由青枯病假單胞菌引起的青枯病發(fā)病于煙草、番茄、花生、茄子、辣椒等等作物，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)有效的農(nóng)藥以及防治方法。
本發(fā)明的目的是提供一種施氏假單胞菌及其篩選方法和以該細(xì)菌為主要成分的防治青枯病的微生物制劑。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的中的提供一種施氏假單胞菌的技術(shù)方案是施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)Zh9944(以下簡稱為PSZh9944菌株)，于1999年3月自我國江蘇省常州市郊區(qū)的番茄青枯病發(fā)生地區(qū)的采集樣品中分離篩選而得，已于2000年9月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為NO.0494。
上述施氏假單胞菌的分離篩選和菌株的獲得方法是，采用平皿相互拮抗篩選模型與定向篩選相結(jié)合的方法，其技術(shù)路線為(1)在煙草、番茄等青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊中采集發(fā)病株和健康株的根、莖和根圍土；(2)從采集樣品中分離菌株；(3)通過分離菌株間的平皿相互拮抗試驗(yàn)和分離菌株的致病性試驗(yàn)，區(qū)分出拮抗菌株和病原菌株兩類；(4)以拮抗率、反拮抗率等生物學(xué)參數(shù)分析拮抗菌、病原菌和其他類之間相互關(guān)系以及在細(xì)菌分類上屬假單胞桿菌(Pseudomonas spp.)或芽孢桿菌(Bacillsspp.)選取拮抗菌株；(5)選出的拮抗菌株通過田間小區(qū)多點(diǎn)試驗(yàn)以田間防效不小于60％為基準(zhǔn)挑選有效菌株。
PSZh9944菌株具有下述性質(zhì)1、形態(tài)特征用光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡觀察菌株。結(jié)果表明菌株為單個(gè)桿狀細(xì)胞，大小為0.8×1.5～3.8微米，革蘭氏染色菌體為紅色、呈陰性，不形成芽孢，以單生極毛運(yùn)動，在營養(yǎng)瓊脂上產(chǎn)生銅綠色水溶性色素，不產(chǎn)生熒光色素及膿青素。
在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，菌落圓形，表面光滑，有光澤，邊緣較整齊，淺灰藍(lán)色，半透明，30℃培養(yǎng)48小時(shí)，菌落直徑在0.5～2.0毫米左右。
2、菌株的生理生化特征專性好氧，在厭氧條件下能進(jìn)行反硝化作用，不需要生長因子，在細(xì)胞內(nèi)不積儲聚-β-羥基丁酸鹽顆粒，水解明膠，不水解淀粉，在蔗糖培養(yǎng)基上不產(chǎn)生果聚糖。其它生理生化特征如下氧化酶(+)； 接觸酶 (+)；O/F測定為氧化型產(chǎn)酸； H2S (-)；賴氨酸脫羧酶 (-)；精氨酸雙水解酶(-)；M.R.反應(yīng) (-)；色氨酸脫氨酶 (-)；吲哚試驗(yàn) (+)；V.P.反應(yīng) (-)；脲酶 (-)；41℃生長 (+)；精氨酸脫羧酶 (+)。
由于該菌株革蘭氏試驗(yàn)呈陰性G(-)，直的桿狀，以單生極毛運(yùn)動，氧化酶(+)，O/F為氧化型，在厭氧條件下能進(jìn)行反硝化作用，接觸酶陽性，在細(xì)胞內(nèi)不積累聚-β-羥基丁酸鹽顆粒，不產(chǎn)生熒光色素，在41℃能生長等特征，可歸為施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)。
菌株P(guān)SZh9944與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)模式菌株比較存在相異如下在培養(yǎng)特征上，生長物不粘連在培養(yǎng)物上，始終光滑，呈淺灰藍(lán)色，在營養(yǎng)瓊脂上產(chǎn)生銅綠色水溶性色素，在生理生化性質(zhì)上，PSZh9944水解明膠，不水解淀粉，不能利用麥芽糖。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的中的提供一種防治青枯病的微生物制劑的技術(shù)方案是該微生物制劑為粉劑，以禾本科植物種皮粉、莖干粉為載體，以施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)Zh9944 CGMCC NO.0494為活性成分，每克載體含有活性菌數(shù)500億CFU以上。
上述載體可以是礱糠粉、麩皮粉、稻桿粉、麥桿粉、高粱桿粉或玉米桿粉。
優(yōu)選的載體是礱糠粉，礱糠粉的粒度以能通過20～60目篩為準(zhǔn)，粉劑的顏色為褐色至土黃色。
上述載體含有活性菌數(shù)的優(yōu)選范圍是每克1000～6000億CFU。
培養(yǎng)方法可以用常規(guī)的微生物制劑發(fā)醇罐方法培養(yǎng)PSZh9944。所得的培養(yǎng)液以一定的比例與礱糠粉混合，物料含水量應(yīng)降低在15％以內(nèi)，約為8％～15％，即制得本發(fā)明所述的微生物制劑。培養(yǎng)方法為液體培養(yǎng)，將生產(chǎn)菌的菌懸浮液接種到培養(yǎng)基上，并進(jìn)行通氣攪拌。
對培養(yǎng)基的營養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，其中碳源為淀粉、葡萄糖，不宜用蔗糖。氮源可為胨、大豆粉、肉膏、玉米漿等，其它營養(yǎng)源，例如磷酸鹽、硫酸鎂等可適當(dāng)添加。
對溫度限定在29～31℃之間，pH值可保持在消后6.9～7.0，培養(yǎng)時(shí)間為20～24小時(shí)。發(fā)醇罐培養(yǎng)終止后，及時(shí)將培養(yǎng)液與礱糠以適合比例混合，并在干燥通風(fēng)的條件下，使物料含水量為8％～15％以內(nèi)，活菌量保持在每克500億CFU以上。
如以上所得的微生物制劑具有下述物理與生物性質(zhì)1、形狀褐色至土黃色粉末。
2、含活菌量每克500億活菌以上；以下毒性試驗(yàn)中含活菌量為每克3000億活菌。
3、急性毒性分級大鼠經(jīng)口LD50＞4640mg/kg，大鼠經(jīng)皮LD50＞2000mg/kg。按GB-15670-1995“農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法”中農(nóng)藥急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，屬低毒類農(nóng)藥。
4、急性眼睛皮膚刺激分級急性眼刺激積分指數(shù)為2(1小時(shí))，急性皮膚刺激分值為0(1小時(shí))。按GB-15670-1995“農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法”中農(nóng)藥急性皮膚眼睛刺激分級標(biāo)準(zhǔn)，對眼睛、皮膚均無刺激性。
5、對鳥類、魚類、蜜蜂、家蠶的毒性安全性評價(jià)對鳥類，用高于最高使用濃度一倍的溶液一次性劑量直接經(jīng)口注入灌胃，經(jīng)10天試驗(yàn)觀察無死亡現(xiàn)象及其他中毒癥狀，說明鵪鶉對粉劑的耐受劑量LD0＞100億CFU/kg，因此，正常使用該生物制劑對鳥類是安全的。
對魚類，斑馬魚在高于最高使用濃度一倍的溶液中，經(jīng)一周試驗(yàn)觀察，無死亡現(xiàn)象及其他中毒癥狀，斑馬魚對粉劑的最大耐受濃度LC0＞300倍稀釋液(10000億CFU/升)。因此，正常使用該生物制劑對魚類是安全的。
對蜜蜂，以田間常用量及兩倍田間常用量的藥液對蜜蜂進(jìn)行胃殺毒性和觸殺毒性試驗(yàn)，受試蜜蜂在試驗(yàn)觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)中毒癥狀及死亡現(xiàn)象。該生物制劑對蜜蜂低毒，正常使用時(shí)對蜜蜂安全。
對家蠶，以田間常用量及兩倍田間常用量的藥液浸漬過的桑葉飼喂受試二齡起蠶，24小時(shí)后改喂未浸藥桑葉，受試家蠶在24小時(shí)、48小時(shí)，至三齡起蠶的觀察期內(nèi)未出現(xiàn)中毒癥狀及死亡。繼續(xù)觀察至四齡起，生長正常。以上結(jié)果表明，該生物制劑對蠶低毒，正常使用對家蠶安全。
本發(fā)明具有積極的效果(1)由于因青枯假單胞菌引起的青枯病日趨嚴(yán)重(包括感病程度、作物和地區(qū)的上升和擴(kuò)展)，迄今為止無任何農(nóng)藥可治。本發(fā)明所提供的可以有效用于防治細(xì)菌性青枯病的細(xì)菌菌株以PSZh9944為主要成分制造出微生物農(nóng)藥，是一種高效、無毒、安全、無殘留的新型微生物農(nóng)藥。(2)PSZh9944能在感病作物體內(nèi)外拮抗青枯病原菌。該菌株具有在感病作物根際土壤中繁殖的能力，并向作物根部聚集和進(jìn)入根組織內(nèi)部，向上轉(zhuǎn)移至莖。并且定植于根和莖的韌皮部薄壁細(xì)胞間，構(gòu)成所謂“拮抗防線”，并與感病作物形成互生關(guān)系。PSZh9944對青枯假單胞菌拮抗能力的大小與向田間接種PSZh9944的菌量成對應(yīng)關(guān)系。(3)本發(fā)明的微生物制劑對因青枯假單胞菌引起的煙草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很強(qiáng)的抑制作用，田間防效達(dá)60～80％左右。(4)本發(fā)明所述的PSZh9944為主的微生物制劑不僅對青枯假單胞菌引起的青枯病害有治療作用，而且使受施作物具有對青枯病害的預(yù)防作用，還能刺激作物生長。(5)在制造所述的微生物制劑時(shí)，以纖維類物質(zhì)、尤以礱糠粉為載體吸附較適宜，不能與其他殺菌劑混配或混合使用。
以下就本發(fā)明的制造、試驗(yàn)事例舉例說明。
制造例以葡萄糖1.5％、淀粉2.0％、酵母粉1.5％、蛋白胨0.4％，MgSO4為0.05％，KH2PO4為0.05％，CaCO3為0.6％的比例制成培養(yǎng)基，滅菌前pH值為7.2～7.4，在250毫升三角瓶放置70毫升培養(yǎng)基，將PSZh9944接種于該培養(yǎng)基中。在30℃、220r.p.m下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)作為種子液，取1000ml種子液于1噸發(fā)醇罐中，內(nèi)盛600升的上述相同比例的培養(yǎng)基。在30℃，向發(fā)酵罐通風(fēng)、攪拌培養(yǎng)20～24小時(shí)。培養(yǎng)終止后，及時(shí)將培養(yǎng)液與粒度為過40目篩的礱糠以1∶1～1∶3的比例混合，通風(fēng)干燥至物料含水量為8～15％，活菌量達(dá)1000～6000億CFU/g，色澤為土黃色至褐色。
試驗(yàn)和應(yīng)用例根據(jù)細(xì)菌性青枯病的發(fā)病原理，對于此類病害的控制，能被普遍接受的方法只能用以生物防治為主的預(yù)防方法，以此達(dá)到阻止青枯病菌侵入植物根內(nèi)潛伏和發(fā)展成為病害。因此，使用本發(fā)明的生物制劑的時(shí)機(jī)應(yīng)在播種、假植、定植和定植后的20～60天，總共4～5次，總用量為2～2.5kg(3000億CFU/g)，在使用時(shí)以水為“溶劑”、使菌體釋放出來，防效可達(dá)60～80％。具體的試驗(yàn)例見表1、應(yīng)用例見表2。表1
表權(quán)利要求
1.一種施氏假單胞菌，其特征在于施氏假單胞菌Zh9944，已于2000年9月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為NO.0494。
2.一種施氏假單胞菌的篩選和菌株的獲得方法是，采用平皿相互拮抗篩選模型與定向篩選相結(jié)合的方法，其技術(shù)路線為(1)在煙草、番茄等青枯病發(fā)生地區(qū)的田塊中采集發(fā)病株和健康株的根、莖和根圍土；(2)從采集樣品中分離菌株；(3)通過分離菌株間的平皿相互拮抗試驗(yàn)和分離菌株的致病性試驗(yàn)，區(qū)分出拮抗菌株和病原菌株兩類；(4)以拮抗率、反拮抗率等生物學(xué)參數(shù)分析拮抗菌、病原菌和其他類之間相互關(guān)系以及在細(xì)菌分類上屬假單胞桿菌屬或芽孢桿菌屬選取拮抗菌株；(5)選出的拮抗菌株通過田間小區(qū)多點(diǎn)試驗(yàn)以田間防效不小于60％為基準(zhǔn)挑選有效菌株。
3.一種防治青枯病的微生物制劑，該微生物制劑為粉劑，其特征在于以禾本科植物種皮粉、莖干粉為載體，以施氏假單胞菌Zh9944 CGMCC NO.0494為活性成分，每克載體含有活性菌數(shù)500億CFU以上；含水量為8～15％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治青枯病的微生物制劑，其特征在于載體是礱糠粉、麩皮粉、稻草粉、麥桿粉、高粱桿粉或玉米桿粉。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的防治青枯病的微生物制劑，其特征在于載體是礱糠粉，礱糠粉的粒度以能通過20～60目篩為準(zhǔn)，粉劑的顏色為褐色至土黃色。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5之一所述的防治青枯病的微生物制劑，其特征在于每克載體含有活性菌數(shù)1000～6000億CFU。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌及以該細(xì)菌為主要成分的防治作物的青枯病的微生物制劑。所述的細(xì)菌為施氏假單胞菌Zh9944。所述的防治青枯病的微生物制劑,以施氏假單胞菌Zh9944為活性成分,以禾本科植物種皮粉或莖桿粉為載體,每克載體含有活菌數(shù)500億CFU以上;含水量為8～15%。本發(fā)明的微生物制劑是一種高效、無毒、安全、無殘留的新型微生物農(nóng)藥。對因青枯假單胞菌引起的煙草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很強(qiáng)的抑制作用,田間防效達(dá)60～80%左右。
文檔編號C12N1/20GK1347981SQ00119018
公開日2002年5月8日 申請日期2000年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月11日
發(fā)明者楊仲華, 張春明, 任熾麓, 安鳳霞, 任敏, 張逸慶, 張華泉 申請人:常州蘭陵制藥有限公司, 張春明