一種評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，公開了一種評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法，通過移植不同數(shù)量級(jí)的血液腫瘤細(xì)胞和實(shí)體腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠模型內(nèi)，構(gòu)建腫瘤小鼠模型后，檢測(cè)腫瘤小鼠模型內(nèi)外周血中腫瘤細(xì)胞GPB的比例、骨髓中腫瘤細(xì)胞GBM的比例、以及脾臟中腫瘤細(xì)胞GSP的比例，根據(jù)所述比例參數(shù)指標(biāo)評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，可以定量評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠的缺陷程度，其中涉及簡(jiǎn)化和總結(jié)通過腫瘤移植效率與小鼠免疫缺陷程度之間的聯(lián)系而獲得的數(shù)學(xué)模型和計(jì)算方法，并且可通過免疫缺陷程度得分以比較免疫缺陷小鼠之間的缺陷差異程度。本發(fā)明所述方法簡(jiǎn)單易行，便于操作，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，特別涉及一種評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 以免疫缺陷小鼠為宿主，構(gòu)建的人源化小鼠模型和病人來源的異種移植模型是人 體免疫系統(tǒng)和人體腫瘤病理機(jī)制研究的重要工具。1963年，科學(xué)家研發(fā)出裸鼠 （Nude mice)，該小鼠 Foxnl基因突變，胸腺惡化或缺失，阻斷T細(xì)胞發(fā)育，導(dǎo)致T細(xì)胞大量劇減，免疫 系統(tǒng)缺陷。但裸鼠擁有B細(xì)胞和自然殺傷(NK，natural ki 1 ler)細(xì)胞，不利于維持人體細(xì)胞 在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。1983年，嚴(yán)重復(fù)合免疫缺陷小鼠（scid，severe combined immunodeficiency)出現(xiàn)，該小鼠 Prdkc基因缺陷，導(dǎo)致其缺失B細(xì)胞和T細(xì)胞。RAG2小鼠 (recombination activating 2deficient)Rag2基因缺失，Β細(xì)胞和Τ細(xì)胞缺失。與scid小鼠 一樣，RAG2小鼠仍然存在大量的NK細(xì)胞，一定程度上限制了人體細(xì)胞的移植。1995年，研究 人員通過將Prdkcscid基因突變導(dǎo)入NOD(non-obese diabetic)近交系小鼠，建立NOD-scid (NOD. Cg-Prkdcscid)小鼠。該小鼠不僅缺失B細(xì)胞和T細(xì)胞，且僅有少量的NK細(xì)胞，固有免疫 系統(tǒng)損傷，是免疫缺陷小鼠的一個(gè)里程碑。而人源化小鼠構(gòu)建的一個(gè)重要的突破是 I12Rg-/_小鼠及基于該小鼠的其它免疫缺陷小鼠的研發(fā)，如N0G(N0D/Shi-Prkdcseid I12rctmlSug/Jic)、NSG(N0D/LtSz-PrkdcscidI12rc tmlWjl/J).IL2Rc 是 IL-2、IL-4、IL-7、IL-15 和IL-21細(xì)胞因子的共有受體，而這些細(xì)胞因子對(duì)T、B、NK等免疫細(xì)胞的發(fā)育具有重要的影 響。所以，IL2Rc-/-免疫缺陷小鼠缺失Τ、B、NK細(xì)胞，同時(shí)該小鼠的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功 能被削弱。與其他免疫缺陷小鼠對(duì)比，NOG、NSG小鼠表現(xiàn)出高水平的移植供體特性:在這兩 種IL2R γ c缺陷小鼠品系中，人造血干細(xì)胞移植表現(xiàn)出極高的移植效率，并且這些造血干細(xì) 胞可分化為多種造血系細(xì)胞，如CD4和CD8單陽(yáng)Τ細(xì)胞;移植的癌細(xì)胞在該小鼠中能快速生長(zhǎng) 并在多次傳代后保持低分化的特性。但盡管免疫缺陷小鼠及其相關(guān)研究越來越多，但是缺 乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)免疫缺陷小鼠進(jìn)行評(píng)估，則導(dǎo)致進(jìn)一步的免疫缺陷小鼠研究和應(yīng)用缺乏參 考和指導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 免疫系統(tǒng)是生物體體內(nèi)一系列的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和進(jìn)程所組成的疾病防御系統(tǒng)，無法 用單一的或簡(jiǎn)單組合的免疫指標(biāo)如Τ、Β、ΝΚ細(xì)胞數(shù)量或者干擾素、趨化因子等表達(dá)情況來判 定免疫強(qiáng)度。同理，小鼠免疫缺陷程度也無法通過這些單一或簡(jiǎn)單組合的免疫細(xì)胞或炎癥 因子的缺陷來評(píng)估。
[0004] 在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞和機(jī)體的免疫系統(tǒng)相互作用，相互影響。大量的臨床數(shù) 據(jù)表明免疫缺陷的個(gè)體更容易自發(fā)腫瘤。比如，跟沒有免疫缺陷的病人對(duì)比，有免疫缺陷的 病人更傾向于得白血病。跟免疫缺陷的病人相似，免疫缺陷小鼠患自發(fā)腫瘤的概率比免疫 系統(tǒng)正常的小鼠高很多。因此，在免疫缺陷小鼠體內(nèi)，免疫系統(tǒng)的極度缺陷會(huì)導(dǎo)致很大程度 的腫瘤增殖。腫瘤免疫是廣泛動(dòng)員機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤生長(zhǎng)和發(fā)育的過程，所以基于腫 瘤移植的小鼠免疫缺陷程度評(píng)估是全面的。腫瘤免疫包括清除、平衡和逃逸三個(gè)主要階段。 而清除階段又可細(xì)分為四個(gè)階段，一:起始抗腫瘤免疫應(yīng)答，內(nèi)在免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞識(shí)別 正進(jìn)行基質(zhì)重塑，引起組織損傷的腫瘤細(xì)胞。接著，通過釋放炎癥信號(hào)征召和集合內(nèi)在免疫 系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（NK)、自然殺傷T細(xì)胞(NKT)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。集 結(jié)而來的NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞釋放α干擾素（IFN-α)。二:α干擾素效應(yīng)，新合成的α干擾素可誘 導(dǎo)腫瘤凋亡，并促進(jìn)趨化因子CXCL10、CXCL9和CXCL11的產(chǎn)生。這些趨化因子可以通過阻斷 新血管的生成而抑制腫瘤生長(zhǎng)。更多的免疫細(xì)胞將受趨化因子趨化、集結(jié)在腫瘤部位。這階 段，樹突狀細(xì)胞吞噬腫瘤細(xì)胞后，將迀移至淋巴結(jié)。三:擴(kuò)大效應(yīng)，ΝΚ細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過釋 放α干擾素和IL-12相互激活。這些細(xì)胞將進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤凋亡和活性氧、氮中間體的產(chǎn)生。 在淋巴結(jié)中，吞噬腫瘤后的腫瘤特異性樹突狀細(xì)胞可啟動(dòng)輔助性Τ細(xì)胞的分化，接著促進(jìn)腫 瘤殺傷性Τ細(xì)胞即CD8+T細(xì)胞的發(fā)育。四：特異性清除，發(fā)育成熟的腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞迀移至腫瘤部位，并殺傷仍存留的抗原耐受的腫瘤細(xì)胞。平衡階段和逃逸階段， 腫瘤細(xì)胞突變體在清除階段中存活下來，并進(jìn)入平衡階段。在平衡階段，淋巴細(xì)胞和α干擾 素會(huì)給予選擇性清除壓力，腫瘤細(xì)胞會(huì)進(jìn)行基因突變以適應(yīng)，并進(jìn)入逃逸階段。腫瘤免疫廣 泛涉及固有免疫和適應(yīng)性免疫的范圍，基于腫瘤移植模型的免疫缺陷程度評(píng)估可全面反映 小鼠免疫缺陷程度。異種移植的腫瘤細(xì)胞相對(duì)更難適應(yīng)免疫壓力的機(jī)體環(huán)境，同種結(jié)合異 種的腫瘤移植模型評(píng)估可更真實(shí)的反映小鼠免疫缺陷程度。
[0005] 現(xiàn)今，伴隨著各種新型大規(guī)模基因敲除技術(shù)和基因組修飾工具的出現(xiàn)，如TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)和Cas(Type II Clustered, Regularly Interspaced,Short Palindromic Repeat(CRISPR)associated system)技術(shù) 等，構(gòu)建各種免疫缺陷小鼠品系的效率不斷地提高。本發(fā)明人也利用TALEN技術(shù)，成功在 NOD-sc id小鼠品系背景下，敲除IL2Rc基因，獲得NOD-scid IL2Rg-/_(NSI)小鼠品系（專利 申請(qǐng)?zhí)枺篊N201310229629)。然而，隨著免疫缺陷小鼠的不斷出現(xiàn)，目前仍沒有一個(gè)評(píng)估小 鼠免疫缺陷程度的標(biāo)準(zhǔn)方法，很難客觀地評(píng)估基因修飾小鼠品系的免疫缺陷程度，將導(dǎo)致 免疫缺陷小鼠的盲目構(gòu)建和使用，也不利于免疫缺陷小鼠應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一和推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的 方法，其實(shí)現(xiàn)的目的是根據(jù)本發(fā)明方法可量化免疫缺陷小鼠的免疫缺陷程度，從而通過該 方法可以簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確地得到腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠模型的作用，進(jìn)而能夠較好的應(yīng)用在 構(gòu)建免疫缺陷小鼠模型中。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，本發(fā)明公開的一種評(píng)價(jià)免疫缺陷小 鼠模型的免疫缺陷程度的方法，包含以下步驟：
[0008] 通過移植不同數(shù)量級(jí)的血液腫瘤細(xì)胞和實(shí)體腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠模型內(nèi)，構(gòu) 建腫瘤小鼠模型后，檢測(cè)腫瘤小鼠模型內(nèi)外周血中腫瘤細(xì)胞GPB的比例、骨髓中腫瘤細(xì)胞 GBM的比例、以及脾臟中腫瘤細(xì)胞GSP的比例，根據(jù)所述比例參數(shù)指標(biāo)評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模 型的免疫缺陷程度。
[0009] 進(jìn)一步的，所述腫瘤細(xì)胞為同種或異種種，采用本發(fā)明方法不僅可以評(píng)價(jià)動(dòng)物源 腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠的作用，還可以用于評(píng)價(jià)人源化的腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠的作 用。
[0010] 進(jìn)一步的，腫瘤細(xì)胞移植的不同數(shù)量級(jí)為L(zhǎng): 1 X 104個(gè)，Μ: 1 X 105個(gè)，Η: 1 X 106個(gè)，該 數(shù)量級(jí)的選擇基于低于該數(shù)量級(jí)，則無法得到腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠模型的作用指標(biāo)， 高于該數(shù)量級(jí)，腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠模型小鼠作用難以區(qū)分開。
[0011] 本發(fā)明專利提供了一種量化免疫缺陷小鼠品系免疫缺陷程度的方法，為免疫缺陷 小鼠的評(píng)估提供標(biāo)準(zhǔn)，以及幫助科研人員挑選合適的小鼠提供依據(jù)，并且為免疫缺陷小鼠 研究和應(yīng)用提供參考和指導(dǎo)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0012] 具體應(yīng)用如，協(xié)助科研人員定義和評(píng)估新研發(fā)的免疫缺陷小鼠；為科研人員選擇 免疫缺陷小鼠開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供依據(jù);為科研人員利用免疫缺陷小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 提供合理參考;為評(píng)估不同免疫缺陷小鼠的相關(guān)免疫能力提供一種可參考的數(shù)學(xué)模型和實(shí) 驗(yàn)設(shè)定。
[0013] 本發(fā)明人根據(jù)腫瘤免疫對(duì)免疫系統(tǒng)的廣泛涉及程度，提出通過在小鼠中移植同種 或異種的腫瘤細(xì)胞，觀察小鼠機(jī)體對(duì)同種或異種腫瘤細(xì)胞的排斥程度，以此反映小鼠的免 疫缺陷程度。所述腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為人源的腫瘤細(xì)胞，其中人血液腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為人慢性髓 系白血病Κ562細(xì)胞系，人實(shí)體腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為人肺癌Α549細(xì)胞系；更優(yōu)選地，所述腫瘤細(xì)胞 為鼠源腫瘤細(xì)胞，血液腫瘤細(xì)胞優(yōu)選小鼠淋巴瘤細(xì)胞系RMA，實(shí)體腫瘤細(xì)胞優(yōu)選小鼠黑色素 瘤細(xì)胞系B16-F10。
[0014] 進(jìn)一步的，根據(jù)檢測(cè)得到的腫瘤小鼠模型內(nèi)外周血中腫瘤細(xì)胞GPB的比例、骨髓中 腫瘤細(xì)胞GBM的比例、以及脾臟中腫瘤細(xì)胞GSP的比例，評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷 程度的方法包括如下步驟，（1)采用公式得到移植每個(gè)數(shù)量級(jí)血液腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小 鼠的作用指數(shù)ΗΤΕI，Gi為GPB、GBM、GSP之和，Di為將血液腫瘤細(xì)胞移植入免疫 缺陷小鼠模型內(nèi)到腫瘤細(xì)胞開始對(duì)免疫缺陷小鼠模型作用間隔的時(shí)間，分別得到每個(gè)數(shù)量 級(jí)血液腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠的作用指數(shù)ΗΤΕΙ (Η)，HTEI (M)，HTEI (L)，最后再求得平均 HTEI；
[0015] (2)采用公式得到移植每個(gè)數(shù)量級(jí)實(shí)體腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠模型的作用指數(shù) m STEI，Sr￡/=y，Wn為將實(shí)體腫瘤移植入免疫缺陷小鼠模型內(nèi)形成的實(shí)體腫瘤的重量，Dn L.hi 為將實(shí)體腫瘤移植入免疫缺陷內(nèi)到腫瘤細(xì)胞開始對(duì)免疫缺陷小鼠模型作用的間隔時(shí)間，分 別得到每個(gè)數(shù)量級(jí)實(shí)體腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠的作用指數(shù)STEI(H)，STEI(M)，STEI(L)， 最后再求得平均STEI;
[0016] (3)根據(jù)步驟（1)和步驟(2)得到的平均HTEI、平均STEI，采用如下公式得到總腫瘤 作用指數(shù)??/*^^胃 6該總腫瘤作用指數(shù)與免疫缺陷程度呈負(fù)相關(guān)。
[0017] 本發(fā)明首次提出一個(gè)量化小鼠的免疫缺陷程度的數(shù)學(xué)模型和計(jì)算方法，通過這個(gè) 數(shù)學(xué)模型，可以定量地獲得免疫缺陷小鼠的缺陷程度程度。并且，通過對(duì)比免疫缺陷程度得 分可以評(píng)估免疫缺陷小鼠之間的缺陷差異程度。研究人員可以利用這個(gè)數(shù)學(xué)模型，挑選出 合適的免疫缺陷小鼠來進(jìn)行特定的實(shí)驗(yàn)。
【附圖說明】
[0018] 圖1為7種小鼠免疫缺陷程度柱狀圖；
[0019] 圖2顯示7種小鼠同種腫瘤免疫缺陷程度柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明公開了一種量化小鼠免疫缺陷程度的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文 內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例 進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng) 用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0021] 實(shí)施例一:具體實(shí)施步驟：
[0022] 帶標(biāo)記基因的人血液瘤細(xì)胞系的構(gòu)建
[0023]為了便于本發(fā)明創(chuàng)造的推廣和應(yīng)用，以人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562作為免疫缺 陷數(shù)學(xué)模型的標(biāo)準(zhǔn)(異種)人血液腫瘤細(xì)胞，以人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作為免疫缺陷數(shù)學(xué)模型 的標(biāo)準(zhǔn)（異種）人實(shí)體腫瘤細(xì)胞，并在K562細(xì)胞系中導(dǎo)入標(biāo)記基因（如GFP綠色熒光基因、 Tdtomato紅色熒光基因、Luciferase熒光酶等）。以下介紹GFP綠色熒光基因轉(zhuǎn)染方法，包裝 Lenti-GFP病毒感染腫瘤細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)被感染細(xì)胞后，分選感染成功的GFP陽(yáng)性腫瘤細(xì) 胞，獲得GFP陽(yáng)性細(xì)胞純度大于98 %。
[0024] 血液瘤小鼠模型的構(gòu)建和HTEI的計(jì)算
[0025] 將不同數(shù)量級(jí)（106(田，105(1〇，104(〇)帶標(biāo)記基因的血液瘤細(xì)胞系(1(562-6??)移 植入待評(píng)估的特定免疫缺陷品系實(shí)驗(yàn)小鼠（每一數(shù)量級(jí)移植用5只實(shí)驗(yàn)小鼠），移植腫瘤細(xì) 胞后，每天觀察小鼠狀態(tài)。小鼠病發(fā)時(shí)，記錄小鼠的存活時(shí)間(D〇以及小鼠血液、脾臟、骨髓 中的腫瘤細(xì)胞(GFP陽(yáng)性細(xì)胞）比例(6^6^"采用如下公式分別計(jì)算出每個(gè)數(shù)量級(jí)的 HTEI(H)，HTEI(M)，HTEI(L)，
[0026]
i為Gpb、Gbm、Gsp之和，要注意的是，Gi、Di均是平行重復(fù)試驗(yàn)多次得到 的平均值，本次實(shí)施例采用了5只小鼠平行重復(fù)試驗(yàn)5次，最后得到，再根據(jù)HTEI(H)，HTEI (Μ)，HTEI(L)求得平均HTEI;
[0027] 實(shí)體瘤小鼠模型的構(gòu)建和STEI的計(jì)算
[0028]移植不同數(shù)量級(jí)（106(扣，105(1〇，104(〇)實(shí)體瘤細(xì)胞系(4549移植入待評(píng)估的特 定免疫缺陷品系實(shí)驗(yàn)小鼠（每一數(shù)量級(jí)移植用5只實(shí)驗(yàn)小鼠），移植腫瘤細(xì)胞后，每天觀察小 鼠狀態(tài)。移植人實(shí)體腫瘤細(xì)胞系一定時(shí)間后(不同腫瘤細(xì)胞系的觀察時(shí)間不同，A549細(xì)胞系 則于移植三十天后進(jìn)行觀察記錄），稱量并記錄形成的實(shí)體腫瘤的質(zhì)量(Wn，單位:g)，并將 Dn = 30和Wn代入公式
分別求出STEI(H)，STEI(M)，STEI(L)，最后求得平均 STEI〇
[0029] 評(píng)估該品系小鼠的免疫缺陷程度
[0030] 將前述步驟計(jì)算出來的平均ΗΤΕI和平均STEI待入公式
最后計(jì)算出該品系免疫缺陷小鼠模型總腫瘤作用指數(shù)TEI，該指數(shù)和免疫缺陷程度呈負(fù)相 關(guān)。
[0031] TEI數(shù)值越高，則表示該品系小鼠的免疫缺陷程度越嚴(yán)重;TEI數(shù)值越低，表示該品 系小鼠的免疫系統(tǒng)越完整。以上闡述的方法是綜合評(píng)估小鼠免疫缺陷程度的，對(duì)于具體的 免疫系統(tǒng)情況，如T細(xì)胞或B細(xì)胞或NK細(xì)胞的數(shù)量和功能、針對(duì)HIV病毒感染的免疫系統(tǒng)缺陷 程度等，TEI僅能提供參考作用；
[0032] 對(duì)于具體免疫系統(tǒng)情況評(píng)估，同樣可以運(yùn)用上述公式中介紹的數(shù)學(xué)模型結(jié)合動(dòng)物 模型的方法進(jìn)行評(píng)估，僅需對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)定如腫瘤移植實(shí)驗(yàn)、腫瘤細(xì)胞、移植數(shù)量級(jí)、獲取評(píng)估 參數(shù)等作一定的修改即可。
[0033] 實(shí)施例二：
[0034] 利用本發(fā)明小鼠免疫程度評(píng)估的方法，綜合評(píng)估NSI(N0D-scid IL2rg-/_)小鼠 的免疫缺陷程度(TEInsi)，具體步驟如下：
[0035] 1 · 1 .HTEInsJ^值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的K562-GFP細(xì)胞入NSI小鼠體內(nèi)，每 天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0036] 表1 .NSI小鼠-人血液腫瘤移植模型參數(shù)表
[0037]
[0038]將以上參數(shù)代入公式得：
[0039]
[0040]
[0041]
[0042] HTElNsi = average(HTEI(Nsi,H)，HTEI(Nsi,M)，TEI(nsi,l)) = 0.014
[0043] 1.2.STEINSJi值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的A549-GFP細(xì)胞入NSI小鼠體內(nèi)，每 天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0044] 表2.NSI小鼠-人實(shí)體腫瘤移植模型參數(shù)表
[0045]
[0046] 將以上參數(shù)代入公式得：
[0050] STEInsi = average (STEI(nsi, h)，STEI (nsi,m)，STEI (nsi,L)) = 0 · 040[0051 ] 1 · 3 · NSI小鼠免疫缺陷程度的評(píng)估，TEINSIm值計(jì)算：[0052] 將以上獲得的HTEINsdPSTEINSI的數(shù)值代入公式得
[0047]
[0048]
[0049]
[0053]
[0054]由上可得，NSI小鼠的免疫缺陷程度得分為0.027。
[0055] 實(shí)施例三
[0056]利用本發(fā)明小鼠免疫程度評(píng)估的方法，綜合評(píng)估NOD-scid(簡(jiǎn)寫:NS)小鼠的免疫 缺陷程度(TEIns)，具體步驟如下：
[0057] 1.4. HTEIns數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的K562-GFP細(xì)胞入NOD-scid小鼠體 內(nèi)，每天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0058] 表3.NOD-scid小鼠-人血液腫瘤移植模型參數(shù)表
[0059]
[0060] 將以上參數(shù)代入公式得：
[0061]
[0062]
[0063]
[0064] HTEIns = average (HTEI (ns, h) )，HTEI (ns,m)，TEI (ns, L)) = 0 · 009
[0065] 1.5. STEIns數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的A549-GFP細(xì)胞入NOD-scid小鼠體 內(nèi)，每天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0066] 表4.NOD-scid小鼠-人實(shí)體腫瘤移植模型參數(shù)表
[0067]
[0068]將以上參數(shù)代入公式得：
[0069]
[0070]
[0071]
[0072] STEIns = average (STEI (ns, h) , STEI (ns,m) , STEI (ns, l) ) = 0.023
[0073] 1.6.N0D-scid小鼠免疫缺陷程度的評(píng)估，TEIns數(shù)值計(jì)算：
[0074] 將以上獲得的HTEIns和STEIns的數(shù)值代入公式，得
[0075]
[0076]由上可得，NOD-scid小鼠的免疫缺陷程度得分為0.016。
[0077] 2.實(shí)施例四：
[0078]利用本發(fā)明小鼠免疫程度評(píng)估的方法，綜合評(píng)估CB-17scid(簡(jiǎn)寫：scid)小鼠的 免疫缺陷程度(TEIwd)，具體步驟如下：
[0079] 2.1 .HTEIscid數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的K562-GFP細(xì)胞入CB-17scid小鼠 體內(nèi)，每天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0080] 表5. CB_17scid小鼠-人血液腫瘤移植模型參數(shù)表 「00811
[0082]將以上參數(shù)代入公式得：
[0083]
[0084]
[0085]
[0086] HTEIscid = average(HTEI(scid,H)，HTEI(scid,M)，TEI(scid,L)) =0.001
[0087] 2 · 2 · STEIscid數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的A549-GFP細(xì)胞入CB-17scid小鼠 體內(nèi)，每天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0088] 表6. CB_17scid小鼠-人實(shí)體腫瘤移植模型參數(shù)表
[0089]
[0091 ]將以上參數(shù)代入公式得：
[0095] STEIscid = average(STEI(scid,H) ,STEI(scid,M),STEI(scid,L))=0.011[0096] 2.3. CB-17scid小鼠免疫缺陷程度的評(píng)估，TEIscid數(shù)值計(jì)算：[0097] 將以上獲得的HTEIscid和STEIscid的數(shù)值代入公式，得
[0092]
[0093]
[0094]
[0098]
[0099]由上可得，CB-17scid小鼠的免疫缺陷程度得分為0.006。
[0100] 3.實(shí)施例五：
[0101] 利用本發(fā)明小鼠免疫程度評(píng)估的方法，綜合評(píng)估IL2rg-/_(簡(jiǎn)寫：IL2)小鼠的免疫 缺陷程度(TEIIL2)，具體步驟如下：
[0102] 3.1.HTEIIL2數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的K562-GFP細(xì)胞入IL2rg-/_小鼠體 內(nèi)，每天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0103] 表7. IL2rg-/_小鼠-人血液腫瘤移植模型參數(shù)表
[0104]
[0105] 將以上參數(shù)代入公式得：
[0106]
[0107]
[0108]
[0109] HTEIiL2 = average(HTEI(iL2,H)，HTEI(iL2,M)，TEI(il2,l)) = 0.0003
[0110] 3.2. STEIIL2數(shù)值計(jì)算:分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的A549-GFP細(xì)胞入IL2Rg-/_小鼠體 內(nèi)，每天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0111] 表8. IL2Rg-/_小鼠-人實(shí)體腫瘤移植模型參數(shù)表
[0112]
[0114]將以上參數(shù)代入公式得：
[0115]
[0116]
[0117]
[0118] STEIil2 = average (STEI(il2, η)，STEI (il2,m)，STEI (il2l) ) = 0 · 002
[0119] 3.3. IL2Rg-/_小鼠免疫缺陷程度的評(píng)估，TEIIL2數(shù)值計(jì)算：
[0120] 將以上獲得的ΗΤΕIIL2和STEIIL2的數(shù)值代入公式得
[0121]
[0122] 由上可得，IL2Rg_/_小鼠的免疫缺陷程度得分為0.001。
[0123] 4.實(shí)施例六：
[0124] 利用本發(fā)明小鼠免疫程度評(píng)估的方法，綜合評(píng)估Rag2-/_(簡(jiǎn)寫:Rag2)小鼠的免疫 缺陷程度(TEIRag2)，具體步驟如下：
[0125] 4.1 .HTEIRag2數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的K562-GFP細(xì)胞入Rag2-/_小鼠體 內(nèi)，每天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0126] 表9 .Rag2_/_小鼠-人血液腫瘤移植模型參數(shù)表
[0127]
[0128] 將以上參數(shù)代入公式得：
[0129]
[0130]
[0131]
[0132] HTElRag2 = average(HTEI(Rag2,η) ,HTEI(Rag2,M) ,TEI(Rag2,L)) =0.000
[0133] 4.2.STEIRag2數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的A549-GFP細(xì)胞入Rag2-/-小鼠體 內(nèi)，每天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0134] 表10.Rag2-/_小鼠-人實(shí)體腫瘤移植模型參數(shù)表
[0135]
[0136] 將以上參數(shù)代入公式得：
[0137]
[0138]
[0139]
[0140] STElRag2 = average(STEI(Rag2,H) ,STEI(Rag2,M) ,STEI(Rag2,L)) =0.005
[0141] 4.3. Rag2_/_小鼠免疫缺陷程度的評(píng)估，TEIRag2數(shù)值計(jì)算：
[0142] 將以上獲得的HTEIRag2和STEIRag2的數(shù)值代入公式得
[0143]
[0144] 由上可得，Rag2_/_小鼠的免疫缺陷程度得分為0.0025。
[0145] 5.實(shí)施例七
[0146] 利用本發(fā)明小鼠免疫程度評(píng)估的方法，綜合評(píng)估nude(簡(jiǎn)寫:Nu)小鼠的免疫缺陷 程度(TEINu)，具體步驟如下：
[0147] 5.1. HTEINu數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的K562-GFP細(xì)胞入nude小鼠體內(nèi)，每 天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0148] 表11 .nude小鼠-人血液腫瘤移植模型參數(shù)表
[0149]
[0150]將以上參數(shù)代入公式得：
[0151]
[0152]
[0153]
[0154] HTElNu = average(HTEI(Nu,H)，HTEI(nu,m),TEI(nu,l)) =〇·〇〇〇
[0155] 5.2. STEINJi值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的A549-GFP細(xì)胞入nude小鼠體內(nèi)，每 天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0156] 表12.nude小鼠-人實(shí)體腫瘤移植模型參數(shù)表
[0157]
[0159]將以上參數(shù)代入公式得：
[0160]
[0161]
、、χ·-·_ *.[0163] STEInu = average (STEI (Nu, η)，STEI (nu,m)，STEI (Nu, l) ) = 0 · 008[0164] 5.3. nude小鼠免疫缺陷程度的評(píng)估，TEINlJ^值計(jì)算：[0165] 將以上獲得的HTEINl^STEINu的數(shù)值代入公式1，得
[0162]
[0166]
[0167] 由上可得，nude小鼠的免疫缺陷程度得分為0.004。
[0168] 6.實(shí)施例八：
[0169] 利用本發(fā)明小鼠免疫程度評(píng)估的方法，綜合評(píng)估C57BL/6(簡(jiǎn)寫:B6)小鼠的免疫缺 陷程度(TEIB6)，具體步驟如下：
[0170] 6.1.HTEIB6數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的K562-GFP細(xì)胞入nude小鼠體內(nèi)，每 天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0171] 表13. C57BL/6小鼠-人血液腫瘤移植模型參數(shù)表
[0172]
[0173] 將以上參數(shù)代入公式得：
[0174]
[0175]
[0176]
[0177] HTElB6 = average(HTEI(Nu,H)，HTEI(nu,m)，TEI(nu,l)) =0 ·000
[0178] 6.2. STEIB6數(shù)值計(jì)算：分別移植H、M、L數(shù)量級(jí)的A549-GFP細(xì)胞入nude小鼠體內(nèi)，每 天觀察小鼠，于小鼠病發(fā)時(shí)獲取并記錄實(shí)驗(yàn)參數(shù)如下表：
[0179]表14. B6小鼠-人實(shí)體腫瘤移植模型參數(shù)表 [0180]
[0182] 將以上參數(shù)代入公式得：
[0186] STEIB6 = average (STEI (B6, h)，STEI (B6,M)，STEI (B6, L)) = 0 · 〇〇〇[0187] 6.3. B6小鼠免疫缺陷程度的評(píng)估，TEIB6數(shù)值計(jì)算：[0188] 將以上獲得的HTEIB6和STEIB6的數(shù)值代入公式得
[0183]
[0184]
[0185]
[0189]
[0190] 由上可得，B6小鼠的免疫缺陷程度得分為0.000。
[0191 ]由實(shí)施例二到八可知，七種品系小鼠的免疫缺陷程度對(duì)比（如下圖）S:NSI>N0D-scid>scid>nude>Rag2-/->IL2rg-/->C57BL/6(WT)，這為研究人員動(dòng)物模型構(gòu)建實(shí)驗(yàn) 選擇合適的免疫缺陷小鼠提供了重要的參考依據(jù)；同時(shí)，由圖1可知，NSI小鼠擁有最強(qiáng)的免 疫缺陷程度，因此在研究人員研發(fā)新型免疫缺陷小鼠時(shí)，應(yīng)以NSI小鼠作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估新 研發(fā)小鼠品系的免疫缺陷程度。
[0192] 7.實(shí)施例九
[0193] 因抵抗、殺傷異種移植的腫瘤細(xì)胞將更大程度的動(dòng)用免疫系統(tǒng)，所以可通過腫瘤 異種移植結(jié)合數(shù)學(xué)模型的方法(如以上闡述），綜合評(píng)估小鼠的免疫缺陷程度。而需要對(duì)某 一特定功能、某一特定免疫細(xì)胞等免疫缺陷程度的評(píng)估，則需對(duì)腫瘤移植模型試驗(yàn)和相對(duì) 應(yīng)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行一定的修改，以評(píng)估某特定免疫系統(tǒng)缺陷程度，如本實(shí)施例一一利用腫 瘤同種移植模型結(jié)合數(shù)學(xué)模型的方法，評(píng)估腫瘤同種移植的免疫缺陷程度。詳細(xì)如下：
[0194] 8.1數(shù)學(xué)模型參數(shù)含義修改：
[0? 95] HTEI (strain, allograft)，同種血液瘤移植能力得分，表示待評(píng)估的某品系（Strain )小 鼠移植小鼠血液瘤細(xì)胞重建血液腫瘤(Hemato 1 ogic Tumor)的能力得分，在此以小鼠淋巴 瘤細(xì)胞系RMA移植為標(biāo)準(zhǔn)。
[0196] 同種實(shí)體瘤移植能力得分，表示待評(píng)估的某品系（Strain)小鼠移植小鼠實(shí)體瘤細(xì) 胞重建實(shí)體腫瘤(Solid Tumor)的能力得分，在此以小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10為標(biāo)準(zhǔn)。
[0197] 表示某品系(Strain)小鼠同種腫瘤移植能力得分，以此評(píng)估該品系小鼠對(duì)同種腫 瘤的免疫缺陷程度。
[0198] 8.2具體實(shí)施步驟：
[0199] 8.2.1帶標(biāo)記基因的小鼠血液瘤細(xì)胞系的構(gòu)建
[0200] 在RMA細(xì)胞系中導(dǎo)入標(biāo)記基因（如GFP綠色熒光基因、Tdtomato紅色熒光基因、 Lucif erase熒光酶等）。以下以GFP綠色熒光基因?yàn)槔榻B標(biāo)記基因?qū)敕椒?，包裝Lenti-GFP病毒感染腫瘤細(xì)胞系，擴(kuò)大培養(yǎng)被感染細(xì)胞后，分選感染成功的GFP陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，獲得 GFP陽(yáng)性細(xì)胞純度大于98%。
[0201] 8.2.2血液瘤小鼠模型的構(gòu)建和HTEIstrain的計(jì)算
[0202] 將不同數(shù)量級(jí)（106(田，105(1〇，104(〇)帶標(biāo)記基因的血液瘤細(xì)胞系（1?^-6??)移 植入待評(píng)估的特定免疫缺陷品系實(shí)驗(yàn)小鼠（每一數(shù)量級(jí)移植用5只實(shí)驗(yàn)小鼠），移植腫瘤細(xì) 胞后，每天觀察小鼠狀態(tài)。小鼠病發(fā)時(shí)，記錄小鼠的存活時(shí)間(Dn)以及小鼠血液、脾臟、骨髓
中的腫瘤細(xì)胞(GFP陽(yáng)性細(xì)胞)比例(Gpb、Gsp、Gbm)，并代人公另 計(jì)算出
[0203] 8.2.3實(shí)體瘤小鼠模型的構(gòu)建和STEIstrain的計(jì)算
[0204] 移植不同數(shù)量級(jí)（106(!〇，105(1〇，104(〇)實(shí)體瘤細(xì)胞系(816?1〇-6??)移植入待評(píng) 估的特定免疫缺陷品系實(shí)驗(yàn)小鼠（每一數(shù)量級(jí)移植用5只實(shí)驗(yàn)小鼠），移植腫瘤細(xì)胞后，每天 觀察小鼠狀態(tài)。移植人實(shí)體腫瘤細(xì)胞系一定時(shí)間后（不同腫瘤細(xì)胞系的觀察時(shí)間不同， B16F10細(xì)胞系則于移植二十天后進(jìn)行觀察記錄），稱量并記錄形成的實(shí)體腫瘤的質(zhì)量(Wn， 單位:g)，并將Dn=2(^PWn代入公?
,計(jì)算出
[0205] 8.2.4評(píng)估該品系小鼠的免疫缺陷程度TEIstrain
[0206] 將上述計(jì)算出來的和待入公￥
，最后計(jì)算出該品系小 鼠同種腫瘤移植能力得分，并將該數(shù)值定義為該品系小鼠對(duì)同種腫瘤的免疫缺陷程度。 [0207] 8.2.5評(píng)估7種品系小鼠的同種腫瘤移植能力得分
[0208]通過本發(fā)明方法，分別獲取 NSI、IL2rg-/-、N0D-scid、scid、Rag2-/-、nude、C57BL/ 6七種小鼠的H、M、L移植數(shù)量級(jí)的HTEI和STEI數(shù)值，并最后求出不同品系的TEIaiiogrrft得分 (如表15和圖2)。
[0209]表15.同種腫瘤免疫缺陷程度TEI [0210]
[0211] 由實(shí)施例九結(jié)果可得，對(duì)同種腫瘤的免疫缺陷程度對(duì)比為:NSI>IL2rg-/->N0D-scid>scid>Rag2-/->nude>C57BL/6(WT)，NSI小鼠對(duì)同種腫瘤移植的免疫缺陷程度最高。
[0212] 同種，腫瘤免疫缺陷程度的高低排序與綜合免疫缺陷程度大致相同，可見，綜合免 疫缺陷程度的評(píng)估對(duì)小鼠特定免疫系統(tǒng)缺陷程度評(píng)估具有一定的參考價(jià)值。
[0213] 識(shí)別和殺傷同種腫瘤更多需要?jiǎng)佑霉逃忻庖呦到y(tǒng)特別是NK自然殺傷細(xì)胞，而 IL2rg-/_和Rag2-/_小鼠的NK細(xì)胞缺陷程度更高，所以IL2rg-/_和Rag2-/_小鼠的同種腫瘤 免疫缺陷程度排序相對(duì)向前移動(dòng)。由此可知，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)合數(shù)學(xué)模型的方法不僅可用于綜 合免疫缺陷程度的評(píng)估，而且可準(zhǔn)確評(píng)估小鼠的特定免疫系統(tǒng)缺陷程度。
[0214] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法，包含以下步驟： 通過移植不同數(shù)量級(jí)的血液腫瘤細(xì)胞和實(shí)體腫瘤細(xì)胞到免疫缺陷小鼠模型內(nèi)，構(gòu)建腫 瘤小鼠模型后，檢測(cè)腫瘤小鼠模型內(nèi)外周血中腫瘤細(xì)胞Gpb的比例、骨髓中腫瘤細(xì)胞Gbm的比 例、以及脾臟中腫瘤細(xì)胞Gsp的比例，根據(jù)所述比例參數(shù)指標(biāo)評(píng)價(jià)免疫缺陷小鼠模型的免疫 缺陷程度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞為同種或異種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，腫瘤細(xì)胞移植的不同數(shù)量級(jí)為L(zhǎng)=IXlO4個(gè)， M:1X105 個(gè)，H:1X106 個(gè)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述異種腫瘤細(xì)胞為人源的腫瘤細(xì)胞，其 中人血液腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為人慢性髓系白血病K562細(xì)胞系，人實(shí)體腫瘤細(xì)胞優(yōu)選為人肺癌 A549細(xì)胞系；。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述同種腫瘤細(xì)胞為鼠源腫瘤細(xì)胞，血液 腫瘤細(xì)胞優(yōu)選小鼠淋巴瘤細(xì)胞系RMA，實(shí)體腫瘤細(xì)胞優(yōu)選小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16-F10。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，根據(jù)檢測(cè)得到的腫瘤小鼠模型內(nèi)外周血中 腫瘤細(xì)胞Gpb的比例、骨髓中腫瘤細(xì)胞Gbm的比例、以及脾臟中腫瘤細(xì)胞Gsp的比例，評(píng)價(jià)免疫 缺陷小鼠模型的免疫缺陷程度的方法包括如下步驟，（1)采用公式得到移植每個(gè)數(shù)量級(jí)血 液腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠的作用指數(shù)!^^1，枉727 = 2-6丨為6^、6疆、6講之和，0丨為將血 Di ' 液腫瘤細(xì)胞移植入免疫缺陷小鼠模型內(nèi)到腫瘤細(xì)胞開始對(duì)免疫缺陷小鼠模型作用間隔的 時(shí)間，分別得到每個(gè)數(shù)量級(jí)血液腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠的作用指數(shù)HTEI(H)，HTEI(M)， HTEI (L)，最后再求得平均HTEI; (2) 采用公式得到移植每個(gè)數(shù)量級(jí)實(shí)體腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠模型的作用指數(shù) Wn STEI，V/L/=T Wn為將實(shí)體腫瘤移植入免疫缺陷小鼠模型內(nèi)形成的實(shí)體腫瘤的重量，Dn 為將實(shí)體腫瘤移植入免疫缺陷內(nèi)到腫瘤細(xì)胞開始對(duì)免疫缺陷小鼠模型作用的間隔時(shí)間，分 別得到每個(gè)數(shù)量級(jí)實(shí)體腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫缺陷小鼠的作用指數(shù)STEI (H)，STEI(M) ,STEI(L)， 最后再求得平均STEI; (3) 根據(jù)步驟（1)和步驟(2)得到的平均HTEI、平均STEI，采用如下公式得到總腫瘤作用 指數(shù)TEI，€總腫瘤作用指數(shù)與免疫缺陷程度呈負(fù)相關(guān)。
【文檔編號(hào)】A01K67/02GK105994125SQ201610056933
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年1月26日
【發(fā)明人】李鵬, 葉未, 肖毅仁, 蔣治武, 林思妙, 姚瑤, 王素娜, 李柏衡
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院