轉(zhuǎn)化植物、使用轉(zhuǎn)化植物的含糖溢泌物的制造方法
【專利摘要】從植物產(chǎn)生包含高濃度糖的溢泌物。導(dǎo)入編碼具有從被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列導(dǎo)出的規(guī)定的共有序列的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，和/或強(qiáng)化該蛋白質(zhì)的表達(dá)。
【專利說明】
轉(zhuǎn)化植物、使用轉(zhuǎn)化植物的含糖溢泌物的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通過導(dǎo)入規(guī)定的基因而獲得了優(yōu)異特性的轉(zhuǎn)化植物和使用該轉(zhuǎn)化植 物的含糖溢泌物的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物燃料、生物塑料的穩(wěn)定生產(chǎn)要求廉價(jià)且穩(wěn)定的原料糖供給。最具代表性的原 料糖是甘蔗所蓄積的糖。為了從甘蔗取出糖，一般需要在規(guī)定的收獲期采伐甘蔗，進(jìn)行破碎 加工、壓榨、濃縮、純化等處理。另外，收獲后的旱田需要進(jìn)行用于新的栽培的旱田保養(yǎng)、栽 插、散布除草劑和/或防蟲劑等管理作業(yè)。這樣，一直以來，使用甘蔗等植物的原料糖的制造 需要制造工序的成本、栽培成本等巨大的成本。
[0003] 專利文獻(xiàn)1中公開了使用能表達(dá)地導(dǎo)入了異種基因的植物來回收由該異種基因編 碼的異種蛋白質(zhì)的方法。在專利文獻(xiàn)1所公開的方法中，從能表達(dá)地導(dǎo)入了異種基因的植物 采集溢泌物，從采集的溢泌物回收異種蛋白質(zhì)。在專利文獻(xiàn)1中作為溢泌物，例示了作為根 莖的溢泌物和葉的介由排水組織(hydathode)的溢泌物而從植物滲出的吐水(guttation)。 [000 4]另一方面，專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)1中，對(duì)于擬南芥(Arabidopsis thaliana)、稻 (Oryza sativa)，公開了參與植物體內(nèi)的糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)。專利文獻(xiàn)2和非專利文 獻(xiàn)1所公開的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)作為GLUE蛋白質(zhì)或SWEET蛋白質(zhì)已知。通過將編碼專利文獻(xiàn)2 和非專利文獻(xiàn)1所公開的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入植物，有時(shí)對(duì)根的糖運(yùn)輸量提高。
[0005] 另外，非專利文獻(xiàn)2中通過人工地使細(xì)胞膜小分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum;ER)，通過測(cè)定ER中的小分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性而確認(rèn)了細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白的功能。特別是對(duì)于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUTs、SGLTs，使其定位于ER，使用FRET (熒光共振 會(huì)泛量車專移，F(xiàn)orster resonance energy transfer或fluorescence resonance energy transfer)法類推了它們本來的功能。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1:日本特表2002-501755號(hào)公報(bào)
[0009] 專利文獻(xiàn)2:日本特表2012-525845號(hào)公報(bào)
[00?0]非專利文獻(xiàn)
[0011] 非專利文獻(xiàn) l:Nature(2010)468,527-534
[0012] 非專利文獻(xiàn)2:FASEB J. (2010)24,2849-2858

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 發(fā)明要解決的課題
[0014] 如上，為了使用植物制造糖，成本的增大是非常大的問題，但如果能夠使來自植物 的溢泌物中以高濃度含有糖，則能夠通過采集溢泌物來解決上述問題。專利文獻(xiàn)1中雖然公 開了從溢泌物回收異種蛋白質(zhì)，但并沒有公開從溢泌物回收糖。專利文獻(xiàn)2和非專利文獻(xiàn)1 中雖然公開了參與糖運(yùn)輸?shù)谋幻麨镾WEET的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸，但并沒 有公開這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)、編碼它們的核酸與溢泌物中的糖含量的關(guān)系。
[0015] 因此，本發(fā)明鑒于上述事實(shí)，目的在于提供產(chǎn)生包含高濃度的糖的溢泌物的轉(zhuǎn)化 植物和使用該轉(zhuǎn)化植物的糖的制造方法。
[0016] 用于解決課題的方法
[0017] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本
【發(fā)明人】們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在導(dǎo)入了編碼規(guī)定的 組(進(jìn)化枝)所含的SWEET蛋白質(zhì)的核酸，強(qiáng)化了該蛋白質(zhì)的表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物中，溢泌物的糖 含量非常高，從而完成了本發(fā)明。
[0018] 本發(fā)明包含以下內(nèi)容。
[0019] (1)轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中，導(dǎo)入了編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的 核酸，和/或強(qiáng)化了該蛋白質(zhì)的表達(dá)，所述參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)具有共有序列，所 述共有序列包含以下的氨基酸序列：
[0020] (L/1/V/M/F)X(G/A)XX(I/L/V/M/F)xxxx(L/1/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A) T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/G)(7-13aa) (1/ L/V/M)(l-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx (V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x (T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xxff(F/L)xYGxxxxDxx (V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(Μ/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)。
[0021] (2)根據(jù)（1)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是屬于作為基于SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列的分類組的進(jìn)化枝I~V中的進(jìn)化枝III的蛋白 質(zhì)。
[0022] (3)根據(jù)（1)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)，
[0023] (a)包含序列號(hào)15~137的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
[0024] (b)包含與序列號(hào)15~137的任一氨基酸序列有90%以上的同一性的氨基酸序列、 且具有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。
[0025] (4)根據(jù)（1)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述共有序列包含以 下的氨基酸序列：
[0026] G(L/I/V/F/M)xGx(I/V/L)(I/V/L)(S/T)xxxxL(A/S)P(L/V/I/M)(P/S/T/A)TFxx (I/V)x(K/R)xK(S/T)xxx(F/Y)x(S/A)xPYxx(A/S/T)LxSxxLx(L/I/M/V)(Y/F)Y(A/G)(7-9aa)(L/1)(I/V/L)(T/S) INxx(G/A)xx(I/V/M)(E/Q)xxYxxx(F/Y)(L/1/V/F)x(Y/F)Ax(K/R/ N)xxxxx(T/A)(7-8aa)(V/F/L/I/M)(18-19aa)(R/Q/H)xxxxGx(I/V)xxxxx(V/I/L/M)x(V/M) F(A/V)(A/S/T)PLx(I/V)(I/M/V/L)xxV(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)x(F/Y)MP(F/I/L) xLS(L/F/V)xL(T/V)(L/I)xAxxff(F/L)xYG(L/F)xxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(L/F)(G/S)xxQMx (L/V/I)(Y/F)xx(Y/F)〇
[0027] (5)根據(jù)(4)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)，
[0028] (a)包含序列號(hào)15~35的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
[0029] (b)包含與序列號(hào)15~35的任一氨基酸序列有90%以上的同一性的氨基酸序列、 且具有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。
[0030] (6)根據(jù)（1)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述共有序列包含以 下的氨基酸序列：
[0031] (A/V)xxxG(I/L/V)xGN(I/L/V)(I/L/V)S(F/L)x(V/T)xL(A/S)P(V/L/I)(P/A)TFxx (I/V)x(K/R)xK(S/T)xx(G/S)(F/Y)(Q/S/E)SxPYxx(A/S/T)LxS(A/C/S)xLx(L/I/M)(Y/F)Y (A/G)xx(K/T)(3-5aa)(L/M/P)(L/I)(I/L/V)(T/S)INxx(G/A)xx(I/V)(E/Q)xxY(I/L)x(L/ M/V/I)(F/Y)(L/I/V/F)x(Y/F)Ax(K/R)xxxxx(T/A)xx(L/M/F/V/I)(L/F/V/I)xxx(N/D)(F/ V/I/L)xx(F/L)xx(I/L/V)xxxxxx(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)xxxxGx(I/V)xxxx(S/A)(V/L/M)(C/ S/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(I/M/V)xxV(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)E(F/Y)MP(F/I) xLS(L/F/V)xL(T/V)(L/1)(S/N)A(V/1)xff(F/L)xYGLxx(K/N)Dxx(V/1)xxPN(V/1)xGxx(F/L) (G/S)xxQMxL(Y/F)xx(Y/F)〇
[0032] (7)根據(jù)(6)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)，
[0033] (a)包含序列號(hào)15~26的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
[0034] (b)包含與序列號(hào)15~26的任一氨基酸序列有90%以上的同一性的氨基酸序列、 且具有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。
[0035] (8)根據(jù)（1)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述共有序列包含以 下的氨基酸序列：
[0036] (M/L/V)xx(T/K/N/S)xxxxAxxFG(L/I/V)LGN(I/L/V)(I/V)SFxVxL(S/A)P(V/I) PTFxxIxK(K/R)K(S/T)x(E/K)(G/S)(F/Y)(Q/E)S(I/L)PYxx(A/S)LxS(A/C)xLx(L/I/M)YY (A/G)xxK(4-5aa)(L/M)(L/I)(I/V)(T/S)IN(A/S/T)(F/V)(G/A)x(F/V)(I/V)(E/Q)xxY(I/ L)x(L/M/I)(F/Y)(F/V/I/L)x(Y/F)Ax(K/R)xx(R/K)xx(T/A)(L/V/M)K(V/L/M/F)(L/I/V/F) xxx(N/D)(F/V/I)xx(F/L)xx(I/L)(L/I/V/F)(L/M/V)(L/V)xx(F/L)(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)x (K/S/Q)x(L/I/V)Gx(I/V)Cxxx(S/A)(V/L)(S/C/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(M/I/V)xxV(I/ V)(K/R)T(K/R)S(V/A)E(Y/F)MPFxLS(L/F)xLT(I/L)(S/N)A(V/I)xff(L/F)xYGLx(L/I)(K/N) Dxx(V/I)A(L/F/I/M)PN(V/I)(L/I/V)Gxx(L/F)GxxQM(I/V)L(Y/F)(V/L/I/M)(V/L/I/M)(Y/ F)(K/R/Q)〇
[0037] (9)根據(jù)(8)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)，
[0038] (a)包含序列號(hào)15~21的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
[0039] (b)包含與序列號(hào)15~21的任一氨基酸序列有90%以上的同一性的氨基酸序列的 蛋白質(zhì)。
[0040] (10)根據(jù)(1)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，是顯花植物。
[0041 ] (11)根據(jù)（10)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述顯花植物是被 子植物。
[0042] (12)根據(jù)（11)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述被子植物是單 子葉植物。
[0043] (13)根據(jù)（12)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述單子葉植物是 禾本科植物。
[0044] (14)根據(jù)（13)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述禾本科植物是 稻屬(Oryza)植物。
[0045] (15)根據(jù)（11)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述被子植物是雙 子葉植物。
[0046] (16)根據(jù)（15)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述雙子葉植物是 十字花科植物。
[0047] (17)根據(jù)（16)所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述十字花科植物 是擬南芥屬(Arabidopsis)植物。
[0048] (18)溢泌物的制造方法，包括栽培上述（1)~（17)的任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化植物，從該 轉(zhuǎn)化植物采集溢泌物的工序。
[0049] (19)根據(jù)（18)所述的溢泌物的制造方法，其特征在于，將栽培所述轉(zhuǎn)化植物的栽 培條件設(shè)置為相對(duì)濕度80 % RH以上。
[0050] (20)根據(jù)(18)所述的溢泌物的制造方法，其特征在于，所述溢泌物是排水液。
[00511本說明書包含作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2013-273128號(hào)的說明書 和/或附圖所記載的內(nèi)容。
[0052]發(fā)明的效果
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，能夠大幅提高來自植物的溢泌物中的糖含量。即，本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn) 化植物，通過導(dǎo)入編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸和/或強(qiáng)化該蛋白質(zhì)的 表達(dá)，能夠產(chǎn)生具有高糖含量這樣的特征的溢泌物。另外，本發(fā)明所涉及的溢泌物的制造方 法，通過利用導(dǎo)入了編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸和/或強(qiáng)化了該蛋白 質(zhì)的表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物，能夠制造高糖含量的溢泌物。進(jìn)而，因?yàn)閺纳鲜鲛D(zhuǎn)化植物采集的溢泌 物是高糖含量的，因此能夠作為制造醇、有機(jī)酸、烷烴和萜類化合物等時(shí)的原料使用。
【附圖說明】
[0054] 圖 1-1 是從美國(guó)生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)提供的數(shù)據(jù)庫(kù) GenBank 收集非專利文獻(xiàn) l(Nature(2010)468,527-532) 中規(guī)定的屬于進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列，基于其氨基酸序列信息制成的系統(tǒng) 樹的概略圖。
[0055] 圖1-2是顯示圖1-1所示的系統(tǒng)樹的部分區(qū)域的放大圖。
[0056]圖1 -3是顯示圖1 -1所示的系統(tǒng)樹的部分區(qū)域的放大圖。
[0057]圖2-1是顯示圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果的圖。 [0058]圖2-2是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖2-1之下的圖。
[0059] 圖2-3是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖2-2之下的圖。
[0060] 圖2-4是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖2-1之右的圖。
[0061] 圖2-5是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖2-2之右的圖。
[0062] 圖2-6是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖2-3之右的圖。
[0063] 圖2-7是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖2-4之右的圖。
[0064] 圖2-8是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖2-5之右的圖。
[0065] 圖2-9是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖2-6之右的圖。
[0066] 圖2-10是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖 2-7之右的圖。
[0067] 圖2-11是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖 2-8之右的圖。
[0068] 圖2-12是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖 2-9之右的圖。
[0069] 圖2-13是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖 2-10之右的圖。
[0070] 圖2-14是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖 2-11之右的圖。
[0071] 圖2-15是圖1-1所示的系統(tǒng)樹所包含的蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖 2-12之右的圖。
[0072] 圖3-1是顯示在非專利文獻(xiàn)l(Nature(2010)468,527-532)中被分類為進(jìn)化枝III 的SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多重比對(duì)分析結(jié)果的圖。
[0073]圖3-2是在非專利文獻(xiàn)l(Nature(2010)468,527-532)中被分類為進(jìn)化枝III的 SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖3-1之下的圖。
[0074]圖3-3是在非專利文獻(xiàn)l(Nature(2010)468,527-532)中被分類為進(jìn)化枝III的 SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖3-2之下的圖。
[0075]圖4-1是顯示該進(jìn)化枝III中來自擬南芥的SWEET蛋白質(zhì)和來自稻的SWEET蛋白質(zhì) 的多重比對(duì)分析的結(jié)果的圖。
[0076]圖4-2是該進(jìn)化枝III中來自擬南芥的SWEET蛋白質(zhì)和來自稻的SWEET蛋白質(zhì)的多 重比對(duì)分析的結(jié)果，是接著圖4-1之下的圖。
[0077]圖5是顯示該進(jìn)化枝III中來自擬南芥的SWEET蛋白質(zhì)的多重比對(duì)分析的結(jié)果的 圖。
[0078]圖6是顯示實(shí)施例中制作的核酸AtSWEET/pRI201AN的物理圖譜的構(gòu)成模式圖。
[0079] 圖7是對(duì)于擬南芥中在實(shí)施例所記載的條件下產(chǎn)生排水液的部分進(jìn)行拍攝而得的 照片。
[0080] 圖 8 是顯示實(shí)施例中制作的核酸 pZH2B_GW0x_AtSWEETll 和 pZH2B_GW0x_AtSWEET12 的物理圖譜的構(gòu)成模式圖。
[0081] 圖9是對(duì)于稻中在實(shí)施例所記載的條件下產(chǎn)生排水液的部分進(jìn)行拍攝而得的照 片。
【具體實(shí)施方式】
[0082] 以下詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0083] 在本發(fā)明中，將編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)和/ 或強(qiáng)化該蛋白質(zhì)的表達(dá)。由此，能夠從細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了該核酸和/或強(qiáng)化了該蛋白質(zhì)的表達(dá)的 轉(zhuǎn)化植物，采集高糖濃度的溢泌物。其中，溢泌物是指從植物的組織滲出到外部的液體，是 包含例如根溢泌液、種子滲出液、從排水組織滲出的排水液的含義。此外，液體從排水組織 (hy dathode)滲出的現(xiàn)象也稱為吐水現(xiàn)象(gut tat i on)。因此，排水液與吐水是同義的。特別 是細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸和/或強(qiáng)化了該蛋白質(zhì)的 表達(dá)的轉(zhuǎn)化植物能夠產(chǎn)生高糖濃度的排水液。
[0084]此外，在本說明書中，核酸是包含DNA和RNA這樣的天然存在的核酸、PNA(肽核酸）、 在堿基?糖?磷酸二酯部添加了化學(xué)修飾的核酸分子等人工核酸的含義。另外，作為編碼 參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸，是包含基因組中存在的基因和該基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物兩 者的含義。
[0085] 另外，在本說明書中，糖是用匕汨出乂的化學(xué)式表示的物質(zhì)，包含多元醇的醛、酮衍 生物、它們的親緣衍生物、縮合物，是包含多糖、寡糖(低聚糖）、二糖和單糖的含義。也可以 是糖的還原基結(jié)合了醇、苯酚、皂苷、色素等糖苷配基的配糖體。單糖有時(shí)基于碳數(shù)被分類 為丙糖、丁糖、己糖、戊糖等，有時(shí)基于分子內(nèi)的官能基被分類為具有醛基的醛糖、具有酮基 的酮糖等。糖也有時(shí)根據(jù)距離醛基、酮基最遠(yuǎn)的手性碳的立體構(gòu)型而被區(qū)分為D系列和L系 列。作為單糖的具體例，可列舉葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、木酮糖、核糖、赤蘚糖、 蘇糖、赤蘚酮糖、甘油醛、二羥基丙酮等，作為二糖的具體例，可列舉蔗糖、乳糖、麥芽糖、海 藻糖、纖維二糖等。
[0086] 本發(fā)明所適用的植物，通過將編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo) 入細(xì)胞內(nèi)和/或強(qiáng)化該蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而排水液等溢泌物所含的糖量與野生型相比有意 義地提高。上述蛋白質(zhì)可以在植物組織的全體細(xì)胞中表達(dá)，也可以在植物組織的至少一部 分細(xì)胞中表達(dá)。其中植物組織是包含葉、莖、種子、根和花等植物器官的含義。本發(fā)明中導(dǎo)入 核酸，與使編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸的每細(xì)胞的分子數(shù)與野生型中的分子數(shù)相比有意義 地增大是同義的。另外，在本發(fā)明中，強(qiáng)化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的表達(dá)是指通過改變編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)控制區(qū)域和/或?qū)⒃摵怂岜旧碜⑷爰?xì)胞內(nèi)，來提高轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、翻譯產(chǎn) 物的表達(dá)量。
[0087] 參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)基因
[0088] 上述"編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸"，編碼具有共有序列1的 參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)，所述共有序列1包含以下的氨基酸序列：
[0089] (L/1/V/M/F)X(G/A)XX(I/L/V/M/F)xxxx(L/1/V/F)(A/S)(P/S)(1-3aa)(P/S/T/A) T(F/L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/G)(7-13aa)(1/ L/V/M)(l-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx (V/I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x (T/S)x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xxff(F/L)xYGxxxxDxx (V/I)xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(Μ/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)。
[0090] 在上述氨基酸序列中，x表示任意的氨基酸殘基。該氨基酸序列中，由以-連接的2 個(gè)數(shù)值與aa組成的標(biāo)記，表示其位置是由任意的氨基酸組成的序列，其序列由該2個(gè)數(shù)值所 夾的范圍的氨基酸殘基數(shù)組成。在該氨基酸序列中，在括號(hào)內(nèi)將多個(gè)氨基酸用/分開顯示的 標(biāo)記，表示其位置是該多個(gè)氨基酸中的任一氨基酸。此外，對(duì)于本說明書所記載的氨基酸序 列采用本標(biāo)記方法。
[0091] 另外，對(duì)于上述共有序列1，可以換個(gè)說法說成是從N末端到C末端由序列號(hào)1的氨 基酸序列、1~3個(gè)任意的氨基酸殘基、序列號(hào)2的氨基酸序列、7~13個(gè)任意的氨基酸殘基、 序列號(hào)3的氨基酸序列、I/L/V/M中的任一氨基酸殘基、1~2個(gè)的氨基酸殘基、序列號(hào)4的氨 基酸序列、2~7個(gè)氨基酸殘基和序列號(hào)5的氨基酸序列依次連接而成的氨基酸序列。
[0092] 此外，Nature(2010)468,527-534的Supplementary Figure 8中關(guān)于參與糖運(yùn)輸 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)SWEET公開了基于氨基酸序列的系統(tǒng)樹。本文獻(xiàn)中，公開了來自擬南芥的 STCET蛋白質(zhì)、來自稻的SWEET蛋白質(zhì)、來自蒺藜苜蓿的SWEET蛋白質(zhì)、來自萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)的SWEET蛋白質(zhì)、來自小立碗蘚（Physcomitrella patens) 的SWEET蛋白質(zhì)、來自碧冬茄（Petunia hybrida)的SWEET蛋白質(zhì)、來自秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabdi ti s e 1 egans)的SWEET蛋白質(zhì)、來自哺乳類的SWEET蛋白質(zhì)。根據(jù)該系統(tǒng)樹，能 夠理解作為參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的SWEET基于其氨基酸序列的類似性被分類為進(jìn) 化枝I~V的5類。
[0093]對(duì)于本文獻(xiàn)所公開的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)SWEET中來自擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的SWEET蛋白質(zhì)、來自稻（Oryza sativa)的SWEET蛋白質(zhì)、和漠藜 苜蓿(Medicago truncatula)SWEET蛋白質(zhì)和碧冬前(Petunia hybrida)SWEET蛋白質(zhì)，在下 述表1中顯示GenBank ID號(hào)(GenBank ID No)、從基因組數(shù)據(jù)算出的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的索引 (Index in the Genome)、基因名、蛋白質(zhì)名、蛋白質(zhì)符號(hào)、SWEET蛋白質(zhì)進(jìn)化枝號(hào)和來源生 物種的對(duì)應(yīng)。
[0094]表 1
[0096] 此外，本說明書中記載為AtSWEET的情況，指表1中的AtSWEETl、AtSTCET2、 AtSWEET3、AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET6、AtSWEET7、AtSWEET8、AtSWEET9、AtSWEET10、 AtSWEETll、AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET14、AtSWEET15、AtSWEET16 和 AtSWEETT17,記載 為 OsSWEET 的情況，指表 1 中的0sSWEETla、0sSWEETlb、0sSWEET2a、0sSWEET2b、0sSWEET3a、 0sSWEET3b、0sSWEET4、0sSWEET5、0sSWEET6a、0sSWEET6b、0sSWEET7a、0sSWEET7b、 0sSWEET7c、0sSWEETll、0sSWEET12、0sSWEET13、0sSWEET14、0sSWEET15$K)sSWEET16。
[0097]上述共有序列1，是從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收集屬于上述文獻(xiàn)中規(guī)定的進(jìn)化枝III的 SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列，基于其氨基酸序列信息通過ClustalW制成系統(tǒng)樹（圖1-1~圖 1-3)和多重比對(duì)（圖2-1~圖2-15)，由制成的系統(tǒng)樹和多重比對(duì)導(dǎo)出的氨基酸序列。即，上 述具有共有序列1的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)包含在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III 的SWEET蛋白質(zhì)，不包含在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝I、II、IV和V的任一類的SWEET蛋白 質(zhì)。換言之，上述共有序列1是在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)和從 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收集的被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)的特征序列，是成為與上述文獻(xiàn) 中進(jìn)化枝I、II、IV和V的各組的明確區(qū)別基準(zhǔn)的序列。
[0098] 此外，圖1 -1顯示系統(tǒng)樹的全體像，圖1 -2~圖1 -3中將圖1 -1所示的全體像的部分 區(qū)域放大而顯示。圖1-1所示的全體像中未記載GenBank ID、蛋白質(zhì)名等，但圖1-2~圖1-3 所示的部分區(qū)域中記載了GenBank ID、蛋白質(zhì)名等。
[0099] 具體地，進(jìn)化枝III如圖1-1~1-3所示，除了包含表1所示的來自擬南芥、稻、蒺藜 苜蓿和碧冬前的SWEET蛋白質(zhì)以外，還包含來自大豆（Glycine max)、日本百脈根（Lotus japonicus)、番前（Solanum lycopersicum)、辣椒（Capsicum annuum)、鷹嘴豆（Cicer arietinum)、黃瓜（Cucumis sativus)、桃（Prunus persica)、草莓（Fragaria vesca)、葡萄 (Vitis vinifera)、養(yǎng)菜（Capsella rubella)、毛果楊（Populus trichocarpa)、蓖麻 (Ricinus communis)、玉米（Zea mays)、高粱（Sorghum bicolor)、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii)、二糖短柄草(Brachypodium distachyon)、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu)、 大麥(Hordeum vulgare)等的SWEET蛋白質(zhì)。
[0100] 對(duì)于這些進(jìn)化枝in所包含的SWEET蛋白質(zhì)中表1所示的來自擬南芥、稻、蒺藜苜蓿 和碧冬茄的SWEET蛋白質(zhì)，將GenBank ID號(hào)、基因名、來源生物種和氨基酸序列的序列號(hào)的 對(duì)應(yīng)示于下述表2。
[0101] 表2
[0103] 另外，對(duì)于來源于除了擬南芥、稻、蒺藜苜蓿和碧冬茄以外的生物種的圖1-1~1-3 所示的SWEET蛋白質(zhì)，將GenBank ID號(hào)、來源生物種和氨基酸序列的序列號(hào)的對(duì)應(yīng)示于下述 表3、4和5。
[0104] 表3


[0110] 此外，對(duì)于表2~5所示的來自各種生物的SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列，將使用 ClustalW多重序列比對(duì)程序(能夠在國(guó)立遺傳學(xué)研究所的DDBJ使用)進(jìn)行比對(duì)分析的結(jié)果 示于圖2-1~2-15。以下顯示分析所用的版本和各種參數(shù)。
[0111] ClustalW Version,2.1
[0112] -Pairwise Alignment Parameters
[0113] --Alignment Type,Slow
[0114] --Slow Pairwise Alignment Options
[0115] ---Protein Weight Matrix,Gonnet
[0116] Gap Open,10
[0117] Gap Extension,0.1
[0118] Multiple Sequence Alignment Parameters
[0119] -Protein Weight Matrix,Gonnet
[0120] -Gap Open,10
[0121] -Gap Extension,0.20
[0122] -Gap Distances,5
[0123] -No End Gaps,no
[0124] -Iteration,none
[0125] -Numiter,1
[0126] -Clustering,NJ
[0127] Output Options
[0128] -Format,Ain w/numbers
[0129] -Order,Aligned
[0130] 如圖2-1~2-15所示，可以理解上述被分類為SWEET蛋白質(zhì)的進(jìn)化枝III的SWEET蛋 白質(zhì)具有上述共有序列1。其中，在上述共有序列1中，規(guī)定的位置所能夠取的氨基酸殘基的 變化根據(jù)以下的理由。如參考文獻(xiàn)（1)(《75/導(dǎo)一生化學(xué)》第3版第5章酸· · 夕>、°夕質(zhì)5.酸，主編：市川厚，主譯:福剛申一，出版人：曾根良介，出版社：（株)化 學(xué)同人、ISBN4-7598-0944-9)中也記載的那樣，氨基酸按照具有同樣的性質(zhì)（化學(xué)性質(zhì)、物 理大?。┑膫?cè)鏈分類是公知的。另外，在保持蛋白質(zhì)的活性的前提下，分類于規(guī)定的組的氨 基酸殘基之間的分子進(jìn)化上的替換高頻率發(fā)生也是公知的?；谠摽紤]，參考文獻(xiàn)（2): Henikoff S.,Henikoff J.G.,Amino-acid substitution matrices from protein blocks，Proc.Natl .Acad. Sci.USA,89,10915-10919( 1992)中的Fig. 2提倡了氨基酸殘基的 替換變異的得分矩陣(BL0SUM)，被廣泛使用。在參考文獻(xiàn)(2)中，側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)相似的氨 基酸彼此的替換是基于帶給蛋白質(zhì)整體的結(jié)構(gòu)、功能變化少這樣的見解。根據(jù)上述參考文 獻(xiàn)（1)和(2)，在多重比對(duì)中考慮的氨基酸的側(cè)鏈的組可以以化學(xué)性質(zhì)、物理大小等指標(biāo)為 基礎(chǔ)考慮。這顯示為在參考文獻(xiàn)(2)所公開的得分矩陣(BL0SUM)中具有得分為0以上的值的 氨基酸、優(yōu)選為具有1以上的值的氨基酸的組。作為代表性的組，可列舉下述8組。其他細(xì)的 分組可以是該得分的值彼此為0以上的氨基酸組、優(yōu)選彼此為1以上的氨基酸組、進(jìn)一步優(yōu) 選為2以上的氨基酸組。
[0131] 1)脂肪族疏水性氨基酸組(ILMV組）
[0132] 該組是上述參考文獻(xiàn)（1)所示的中性非極性氨基酸中具有脂肪屬性的疏水性側(cè)鏈 的氨基酸的組，由V(Val、纈氨酸）、L(Leu、亮氨酸）、I(11 e、異亮氨酸)和M(Met、甲硫氨酸)構(gòu) 成。根據(jù)參考文獻(xiàn)（1)分類為中性非極性氨基酸的氨基酸中FGACWP由于以下理由而不包含 在該"脂肪族疏水性氨基酸組"中。G(Gly、甘氨酸）、A(Ala、丙氨酸)是因?yàn)橛捎趥?cè)鏈為甲基 以下的大小而非極性的效果弱。C(Cys、半胱氨酸)是因?yàn)橛袝r(shí)S-S鍵承擔(dān)重要的作用，另外， 具有與氧原子、氮原子形成氫鍵的特性。F(Phe、苯丙氨酸）、W(Trp、色氨酸)是因?yàn)閭?cè)鏈具有 特別大的分子量，且芳香族的效果強(qiáng)。P(Pro、脯氨酸)是因?yàn)閬啺被嵝Ч麖?qiáng)、固定了多肽 的主鏈的角度。
[0133] 2)具有羥基亞甲基的組(ST組）
[0134]該組是中性極性氨基酸中側(cè)鏈具有羥基亞甲基的氨基酸的組，由S (Ser、絲氨酸） 和T(Thr、蘇氨酸)構(gòu)成。存在于S和T的側(cè)鏈的羥基是糖的結(jié)合部位，因而多是對(duì)于某種多肽 (蛋白質(zhì))具有特定的活性重要的部位。
[0135] 3)酸性氨基酸(DE組）
[0136] 該組是側(cè)鏈具有為酸性的羧基的氨基酸的組，由D(Asp、天冬氨酸)和E(Glu、谷氨 酸)構(gòu)成。
[0137] 4)堿性氨基酸(KR組）
[0138] 該組是堿性氨基酸的組，由K (Ly s、賴氨酸）和R( Arg、精氨酸）構(gòu)成。該K和R在廣泛 的pH范圍內(nèi)帶正電，具有堿性的性質(zhì)。另一方面，被分類為堿性氨基酸的H(His、組氨酸)在 PH7基本不離子化，所以不分類到該組。
[0139] 5)亞甲基=極性基(DHN組）
[0140]該組全部具有在α位碳元素上作為側(cè)鏈結(jié)合了亞甲基并且在亞甲基前面具有極性 基這樣的特征。具有作為非極性基的亞甲基的物理大小酷似的特征，由N(Asn、天冬酰胺、極 性基為酰胺基）、D(Asp、天冬氨酸、極性基為羧基)和H(His、組氨酸、極性基為咪唑基)構(gòu)成。
[0141] 6)二亞甲基=極性基(EKQR組）
[0142] 該組全部具有在α位碳元素上作為側(cè)鏈結(jié)合了二亞甲基以上的直鏈烴并在直鏈烴 的前面具有極性基這樣的特征。具有作為非極性基的二亞甲基的物理大小酷似的特征。由Ε (Glu、谷氨酸、極性基為羧基）、K(Lys、賴氨酸、極性基為氨基）、Q(Gln、谷氨酰胺、極性基為 酰胺基）、R(Arg、精氨酸、極性基為亞氨基和氨基)構(gòu)成。
[0143] 7)芳香族(FYW 組）
[0144] 該組是側(cè)鏈具有苯核的芳香族氨基酸，以具有芳香族特有的化學(xué)性質(zhì)為特征。由F (卩116、苯丙氨酸）、￥(171'、酪氨酸）、￥(1'印、色氨酸)構(gòu)成。
[0145] 8)環(huán)狀&極性(冊(cè)組）
[0146] 該組是側(cè)鏈具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)并同時(shí)具有極性的氨基酸，由H(H、組氨酸、環(huán)狀結(jié)構(gòu)和 極性基都是咪唑基）、Y(Tyr、酪氨酸、環(huán)狀結(jié)構(gòu)為苯核、極性基為羥基)構(gòu)成。
[0147] 基于上述氨基酸組，能夠容易地預(yù)想即使將具有某功能的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中 某一氨基酸殘基替換成屬于同一組的氨基酸殘基也能得到具有同樣的功能的新蛋白質(zhì)。例 如基于上述"1)脂肪族疏水性氨基酸組(ILMV組)"，能夠容易地預(yù)想即使將具有某功能的蛋 白質(zhì)的氨基酸序列中的異亮氨酸殘基替換成亮氨酸殘基也能得到具有同樣的功能的新蛋 白質(zhì)。在具有某功能的蛋白質(zhì)存在多種的情況下，也有時(shí)作為共有序列而記載氨基酸序列， 但即使在這種情況下，也能夠容易地預(yù)想即使將某一氨基酸殘基替換成屬于同一組的氨基 酸殘基也能得到具有同樣的功能的新蛋白質(zhì)。例如，當(dāng)具有某功能的蛋白質(zhì)存在多種，由此 算出的共有序列中的氨基酸殘基為異亮氨酸或亮氨酸(L/I)的時(shí)，基于上述"1)脂肪族疏水 性氨基酸組（ILMV組)"，能夠容易地預(yù)想即使將異亮氨酸或亮氨酸殘基替換成甲硫氨酸或 纈氨酸殘基也能得到具有同樣的功能的新蛋白質(zhì)。
[0148] 其中，上述"特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)"，可以作為在上述共有序列1的 N末端側(cè)和C末端側(cè)添加規(guī)定的氨基酸殘基，并且具有包含在規(guī)定的位置限定了能夠取的氨 基酸的變化的氨基酸序列的共有序列2的蛋白質(zhì)而規(guī)定。共有序列2的氨基酸序列如下。
[0149] G(L/I/V/F/M)xGx(I/V/L)(I/V/L)(S/T)xxxxL(A/S)P(L/V/I/M)(P/S/T/A)TFxx (I/V)x(K/R)xK(S/T)xxx(F/Y)x(S/A)xPYxx(A/S/T)LxSxxLx(L/I/M/V)(Y/F)Y(A/G)(7-9aa)(L/1)(I/V/L)(T/S) INxx(G/A)xx(I/V/M)(E/Q)xxYxxx(F/Y)(L/1/V/F)x(Y/F)Ax(K/R/ N)xxxxx(T/A)(7-8aa)(V/F/L/I/M)(18-19aa)(R/Q/H)xxxxGx(I/V)xxxxx(V/I/L/M)x(V/M) F(A/V)(A/S/T)PLx(I/V)(I/M/V/L)xxV(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)x(F/Y)MP(F/I/L) xLS(L/F/V)xL(T/V)(L/I)xAxxff(F/L)xYG(L/F)xxxDxx(V/I)xxPNxxGxx(L/F)(G/S)xxQMx (L/V/I)(Y/F)xx(Y/F)
[0150] 另外，對(duì)于共有序列2的氨基酸序列，可以換個(gè)說法說成是從N末端到C末端由序列 號(hào)6的氨基酸序列、7~9個(gè)任意的氨基酸殘基、序列號(hào)7的氨基酸序列、7~8個(gè)任意的氨基酸 殘基、V/F/L/I/M中的任一氨基酸殘基、18~19個(gè)的氨基酸殘基和序列號(hào)8的氨基酸序列依 次連接而成的氨基酸序列。
[0151] 共有序列2是在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)所共有的氨基酸序 列。即，共有序列2,是對(duì)于上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的來自擬南芥的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn) 運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)、來自稻的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)、來自蒺藜苜蓿的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn) 運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)和來自碧冬茄的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的各氨基酸序列，與上述同樣 地利用ClustalW進(jìn)行分析，由制成的多重比對(duì)導(dǎo)出的氨基酸序列。因此，共有序列2是在上 述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)的特征序列，是成為與上述文獻(xiàn)中進(jìn)化枝I、 II、IV和V的各組的明確區(qū)別基準(zhǔn)的序列。
[0152]此外，對(duì)于在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列，將使 用ClustalW多重序列比對(duì)程序(能夠在國(guó)立遺傳學(xué)研究所的DDBJ使用）進(jìn)行比對(duì)分析的結(jié) 果示于圖3-1~3-3(分析中使用的版本和各種參數(shù)如上所述）。如圖3-1~3-3所示，能夠理 解在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)具有上述共有序列2。
[0153] 進(jìn)一步地，上述"特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)"，可以作為在上述共有序 列2的N末端側(cè)添加規(guī)定的氨基酸殘基，并且具有包含在規(guī)定的位置限定了能夠取的氨基酸 的變化的氨基酸序列的共有序列3的蛋白質(zhì)而規(guī)定。共有序列3的氨基酸序列如下。
[0154] (A/V)xxxG(I/L/V)xGN(I/L/V)(I/L/V)S(F/L)x(V/T)xL(A/S)P(V/L/I)(P/A)TFxx (I/V)x(K/R)xK(S/T)xx(G/S)(F/Y)(Q/S/E)SxPYxx(A/S/T)LxS(A/C/S)xLx(L/I/M)(Y/F)Y (A/G)xx(K/T)(3-5aa)(L/M/P)(L/I)(I/L/V)(T/S)INxx(G/A)xx(I/V)(E/Q)xxY(I/L)x(L/ M/V/1)(F/Y)(L/1/V/F)x(Y/F)Ax(K/R)xxxxx(T/A)xx(L/M/F/V/1)(L/F/V/1)xxx(N/D)(F/ V/I/L)xx(F/L)xx(I/L/V)xxxxxx(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)xxxxGx(I/V)xxxx(S/A)(V/L/M)(C/ S/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(I/M/V)xxV(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)E(F/Y)MP(F/I) xLS(L/F/V)xL(T/V)(L/1)(S/N)A(V/1)xff(F/L)xYGLxx(K/N)Dxx(V/1)xxPN(V/1)xGxx(F/L) (G/S)xxQMxL(Y/F)xx(Y/F)
[0155] 另外，對(duì)于共有序列3的氨基酸序列，可以換個(gè)說法說成是從N末端到C末端由序列 號(hào)9的氨基酸序列、3~5個(gè)任意的氨基酸殘基、序列號(hào)10的氨基酸序列、5~6個(gè)任意的氨基 酸殘基和序列號(hào)11的氨基酸序列依次連接而成的氨基酸序列。
[0156]共有序列3是對(duì)于在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)中來自擬南芥 的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)和來自稻的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的各氨基酸序 列，與上述同樣地利用ClustalW進(jìn)行分析，由制成的多重比對(duì)導(dǎo)出的氨基酸序列。因此，共 有序列3是在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的來自擬南芥的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白 質(zhì)和來自稻的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的特征序列，是成為與上述文獻(xiàn)中進(jìn)化枝I、 II、IV和V的各組的明確區(qū)別基準(zhǔn)的序列。
[0157] 此外，對(duì)于在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的來自擬南芥的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn) 蛋白蛋白質(zhì)和來自稻的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列將使用ClustalW多重 序列比對(duì)程序(能夠在國(guó)立遺傳學(xué)研究所的DDBJ使用)進(jìn)行比對(duì)分析的結(jié)果示于圖4-1~4-2(分析中使用的版本和各種參數(shù)如上所述）。如圖4-1~4-2所示，能夠理解在上述文獻(xiàn)中被 分類為進(jìn)化枝III的來自擬南芥的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)和來自稻的參與糖運(yùn)輸?shù)?轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)具有上述共有序列3。
[0158] 進(jìn)而另外，上述"特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)"可以作為在上述共有序列 3的N末端側(cè)和C末端側(cè)添加規(guī)定的氨基酸殘基，并且具有包含在規(guī)定的位置限定了能夠取 的氨基酸的變化的氨基酸序列的共有序列4的蛋白質(zhì)而規(guī)定。共有序列4的氨基酸序列如 下。
[0159] (M/L/V)xx(T/K/N/S)xxxxAxxFG(L/I/V)LGN(I/L/V)(I/V)SFxVxL(S/A)P(V/I) PTFxxIxK(K/R)K(S/T)x(E/K)(G/S)(F/Y)(Q/E)S(I/L)PYxx(A/S)LxS(A/C)xLx(L/I/M)YY (A/G)xxK(4-5aa)(L/M)(L/I)(I/V)(T/S)IN(A/S/T)(F/V)(G/A)x(F/V)(I/V)(E/Q)xxY(I/ L)x(L/M/I)(F/Y)(F/V/I/L)x(Y/F)Ax(K/R)xx(R/K)xx(T/A)(L/V/M)K(V/L/M/F)(L/I/V/F) xxx(N/D)(F/V/I)xx(F/L)xx(I/L)(L/I/V/F)(L/M/V)(L/V)xx(F/L)(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)x (K/S/Q)x(L/I/V)Gx(I/V)Cxxx(S/A)(V/L)(S/C/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(M/I/V)xxV(I/ V)(K/R)T(K/R)S(V/A)E(Y/F)MPFxLS(L/F)xLT(I/L)(S/N)A(V/I)xff(L/F)xYGLx(L/I)(K/N) Dxx(V/I)A(L/F/I/M)PN(V/I)(L/I/V)Gxx(L/F)GxxQM(I/V)L(Y/F)(V/L/I/M)(V/L/I/M)(Y/ F)(K/R/Q)
[0160] 另外，對(duì)于共有序列4的氨基酸序列，可以換個(gè)說法說成是從N末端到C末端由序列 號(hào)12的氨基酸序列、4~5個(gè)任意的氨基酸殘基、序列號(hào)13的氨基酸序列、5~6個(gè)任意的氨基 酸殘基和序列號(hào)14的氨基酸序列依次連接而成的氨基酸序列。
[0161] 共有序列4是對(duì)于在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)中來自擬南芥 的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的各氨基酸序列，與上述同樣地利用ClustalW進(jìn)行分析， 由制成的多重比對(duì)導(dǎo)出的氨基酸序列。因此，共有序列4是在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝 III的來自擬南芥的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的特征序列，是成為與上述文獻(xiàn)中進(jìn)化 枝I、II、IV和V的各組的明確區(qū)別基準(zhǔn)的序列。
[0162] 此外，對(duì)于在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的來自擬南芥的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn) 蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列，將使用ClustalW多重序列比對(duì)程序(能夠在國(guó)立遺傳學(xué)研究所 的DDBJ使用)進(jìn)行比對(duì)分析的結(jié)果示于圖5(分析中使用的版本和各種參數(shù)如上所述）。如圖 5所示，能夠理解在上述文獻(xiàn)中被分類為進(jìn)化枝III的來自擬南芥的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白 蛋白質(zhì)具有上述共有序列4。
[0163] 如上，能夠在本發(fā)明中使用的"編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核 酸"，只要是編碼具有上述的共有序列1、2、3或4的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸，就 不特別限定。換言之，作為該核酸，不限于編碼表2~5中列舉的具體的SWEET蛋白質(zhì)的核酸， 還包含編碼來自與表2~5所列的生物種不同的生物種的SWEET蛋白質(zhì)的核酸。例如，也可以 使用編碼來自序列數(shù)據(jù)未存儲(chǔ)在GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)的生物的具有共有序列1、2、3或4的參與 糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸。
[0164] 具體地，作為特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)，如表2~5所示，可以列舉包含 序列號(hào)15~131的任一項(xiàng)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。特別是，作為特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn) 蛋白蛋白質(zhì)，優(yōu)選為包含序列號(hào)15~35的任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(表2)，更優(yōu)選 為包含序列號(hào)15~26的任一項(xiàng)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)(來自擬南芥或稻），進(jìn)一步優(yōu)選為 包含序列號(hào)15~21的任一項(xiàng)所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)（來自擬南芥）。進(jìn)一步地，作為特定 的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)，最優(yōu)選為包含序列號(hào)17的氨基酸序列的AtSWEETll、包含 序列號(hào)18的氨基酸序列的AtSWEET12、包含序列號(hào)25的氨基酸序列的0sSWEET14和包含序列 號(hào)26的氨基酸序列的0sSWEET15。
[0165] 此外，能夠在本發(fā)明中使用的"編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸" 不限于如上所述編碼用具體的序列號(hào)特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸，只要是 編碼具有上述的共有序列1、2、3或4的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，就可以使用任何核 酸。
[0166] 編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，是指由該核酸編碼的蛋白質(zhì)具有參與糖運(yùn)輸 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，是例如非專利文獻(xiàn)1和2的Methods所記載那 樣的用細(xì)胞質(zhì)定位或ER定位的FRET(焚光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)orster resonance energy transfer 或 fluorescence resonance energy transfer)|l|傳感器 定向內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (endoplasmic reticulum;ER)內(nèi)外的糖運(yùn)輸而得的活性。
[0167] 此外，規(guī)定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)是否具有共有序列1、2、3或4,或者編 碼該蛋白質(zhì)的核酸是否編碼具有共有序列1、2、3或4的蛋白質(zhì)，可以通過將該蛋白質(zhì)的氨基 酸序列或者由該核酸編碼的氨基酸序列與共有序列1、2、3或4所示的氨基酸序列比較來容 易地判別。
[0168] 其中，作為包含與序列號(hào)15~131的氨基酸序列不同的氨基酸序列、且具有共有序 列1、2、3或4的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)，例如，也可以編碼包含在序列號(hào)15~131的任 一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替換、添加或插入了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的氨基酸序列、 且具有共有序列1、2、3或4、具有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。其中，作為多個(gè)氨基 酸，是指例如，1~20個(gè)、優(yōu)選為1~10個(gè)、更優(yōu)選為1~7個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為1個(gè)~5個(gè)、特別優(yōu) 選為1個(gè)~3個(gè)。此外，氨基酸的缺失、替換或添加可以通過將上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋 白蛋白質(zhì)的堿基序列通過該技術(shù)領(lǐng)域公知的方法改變來進(jìn)行。為了在堿基序列中導(dǎo)入突 變，可以通過Kunkel法或Gapped duplex(缺口雙鏈體)法等公知方法或依據(jù)此的方法來進(jìn) 行，例如，使用利用了定點(diǎn)誘變法的突變導(dǎo)入用試劑盒(例如Mutant-K、Mutant-G(均為商品 名，TAKARA Bio社制））等，或者使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒（商品名、 TAKARA Bio社制）來導(dǎo)入突變。另外，作為突變導(dǎo)入方法，可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯）、 5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N 硝基-N-亞硝基胍、其他致癌性化合物為代表那 樣的化學(xué)誘變劑的方法，也可以是通過以X射線、α射線、β射線、γ射線、離子束為代表那樣 的放射線處理和/或紫外線處理來進(jìn)行的方法。
[0169] 另外，作為包含與序列號(hào)15~131的氨基酸序列不同的氨基酸序列、且具有共有序 列1、2、3或4的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)，例如，也可以編碼具有相對(duì)于序列號(hào)15~131 的任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的類似度(Similarity)或同一1性（identity)例如為70%以上、 優(yōu)選為80 %以上、更優(yōu)選為90%以上、最優(yōu)選為95 %以上的氨基酸序列、且具有共有序列1、 2、3或4、具有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。類似度和同一性的值是指使用安裝了 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序的計(jì)算機(jī)程序和存儲(chǔ)了基因序列信息 的數(shù)據(jù)庫(kù)以默認(rèn)設(shè)定求得的值。
[0170]進(jìn)一步地，編碼包含與序列號(hào)15~131的氨基酸序列不同的氨基酸序列、且具有共 有序列1、2、3或4的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸，在植物基因組信息不明的情況 下，可以通過從成為對(duì)象的植物提取核酸，分離與編碼序列號(hào)15~131的氨基酸序列的核酸 在嚴(yán)格條件下雜交的核酸來鑒定。其中，嚴(yán)格條件是指形成所謂特異性雜種、不形成非特異 性雜種的條件?？闪信e例如，在45°C、6XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉）下雜交、然后在50~65°C、 0.2~1 X SSC、0.1 %SDS下洗滌，或者作為這樣的條件，可列舉在65~70°C、1 X SSC下雜交、 然后在65~70°C、0.3XSSC下洗潘。雜交按照J(rèn).Sambrook et al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)所記載的方法等現(xiàn) 有公知的方法來進(jìn)行。
[0171]如上，作為具有共有序列1、2、3或4的蛋白質(zhì)而定義本發(fā)明中使用的"特定的參與 糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)"。但是，能夠在本發(fā)明中使用的"特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白 蛋白質(zhì)"不限于具有該共有序列1、2、3或4的蛋白質(zhì)。
[0172] 即，作為"特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)"，也可以編碼包含在序列號(hào)15~ 131的任一項(xiàng)所示的氨基酸序列中缺失、替換、添加或插入了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的氨基 酸序列、且具有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。其中，作為多個(gè)氨基酸，是指例如，1 ~20個(gè)、優(yōu)選為1~10個(gè)、更優(yōu)選為1~7個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為1個(gè)~5個(gè)、特別優(yōu)選為1個(gè)~3個(gè)。 此外，氨基酸的缺失、替換或添加可以通過將上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的堿 基序列通過該技術(shù)領(lǐng)域公知的方法改變來進(jìn)行。在堿基序列中導(dǎo)入突變的方法可以適宜應(yīng) 用上述的方法。
[0173] 另外，作為"特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)"，例如，也可以編碼具有相對(duì)于 序列號(hào)15~131的任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的類似度(Similarity)或同一 1性（identity)例 如為70 %以上、優(yōu)選為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、最優(yōu)選為95 %以上的氨基酸序列、且 具有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。類似度和同一性的值可以通過上述的方法求 出。
[0174] 進(jìn)一步地，作為"特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)"，例如，也可以編碼以下蛋 白質(zhì)：由與編碼序列號(hào)15~131的氨基酸序列的核酸在嚴(yán)格條件下雜交的核酸編碼、且具有 參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。其中，嚴(yán)格條件與上述是同樣的。
[0175] 應(yīng)用本發(fā)明的植物，通過將編碼如上所述定義的"特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白 蛋白質(zhì)"的核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，或者強(qiáng)化由該核酸編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而能夠產(chǎn)生高糖濃 度的溢泌物。作為將該編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方法，可列舉例如， 將以能夠表達(dá)編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DNA的方式配置的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的方 法。另外，作為強(qiáng)化編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的表達(dá)的方法，可列舉改變位于作為 對(duì)象的植物體中的編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DNA附近的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的方法。特別優(yōu)選 將以在能夠恒常表達(dá)的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)上述的編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DNA的方 式配置的表達(dá)載體導(dǎo)入對(duì)象植物的細(xì)胞的方法。
[0176] 編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人工基因
[0177] 作為上述"編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸"，只要是編碼具有共有序列 1、2、3或4、且參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，則不限于具有與自然界中存在的核酸相同的 堿基序列的核酸，也可以是具有人工設(shè)計(jì)的堿基序列的核酸、即人工基因。其中人工基因是 指作為編碼人為設(shè)計(jì)的氨基酸序列的核酸的、具有天然不存在的堿基序列的DNA。人工基因 可以是編碼將天然存在的蛋白質(zhì)的一部分改變(氨基酸殘基的缺失、替換、插入等)而得的 蛋白質(zhì)的基因，也可以是編碼將天然存在的氨基酸序列接合而成的嵌合蛋白質(zhì)的基因，也 可以編碼從N末端到C末端全序列獨(dú)立設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)的基因。
[0178] 作為人工基因，只要是具有編碼包含共有序列1、2、3或4的氨基酸序列的堿基序列 的DNA即可。另外，作為人工基因設(shè)計(jì)參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因時(shí)，特別優(yōu)選設(shè)計(jì)成也包 含跨膜結(jié)構(gòu)域那樣。這是因?yàn)?，認(rèn)為通過該結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位在更優(yōu)選的位置，從而有 助于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。
[0179] 更具體地，作為編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人工基因，可以設(shè)計(jì)成編碼序列號(hào) 132~137所示的氨基酸序列那樣。這些序列號(hào)132~137所示的氨基酸序列中，上述共有序 列存在于N末端側(cè)，另外，C末端側(cè)包含跨膜結(jié)構(gòu)域。將具有序列號(hào)132所示的氨基酸序列的 蛋白質(zhì)稱為SWol，將具有序列號(hào)133所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)稱為SWo2，將具有序列號(hào) 134所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)稱為SWo3，將具有序列號(hào)135所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)稱 為SWo4，將具有序列號(hào)136所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)稱為SWo5，將具有序列號(hào)137所不的 氨基酸序列的蛋白質(zhì)稱為SWo6。
[0180] 表達(dá)載體
[0181 ]表達(dá)載體以包含具有能夠恒常表達(dá)的啟動(dòng)子堿基序列的核酸、和編碼上述參與糖 運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸(包含具有天然存在的堿基序列的核酸和人工基因兩者。以下同樣） 的方式構(gòu)建。作為成為表達(dá)載體的母體的載體，可以使用現(xiàn)有公知的各種載體。例如，可以 使用質(zhì)粒、噬菌體、或粘粒等，可以根據(jù)所導(dǎo)入的植物細(xì)胞、導(dǎo)入方法適宜選擇。具體地，可 列舉例如，pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI 系列的載體 等。特別是在向植物細(xì)胞導(dǎo)入載體的導(dǎo)入法是使用農(nóng)桿菌的方法時(shí)，優(yōu)選使用PBI系列的雙 元載體。作為pBI系列的雙元載體，具體可列舉例如，pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221 等。
[0182] 啟動(dòng)子只要是能在植物體內(nèi)表達(dá)編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的啟動(dòng)子就 不特別限定，優(yōu)選使用公知的啟動(dòng)子。作為該啟動(dòng)子，可列舉例如，花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng) 子(CaMV35S)、各種肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子、各種遍在蛋白基因啟動(dòng)子、胭脂堿合成酶基因的 啟動(dòng)子、煙草的PRla基因啟動(dòng)子、番茄的核酮糖1，5_二磷酸羧化酶/加氧酶小亞基基因啟動(dòng) 子、Napin(油菜貯藏蛋白）基因啟動(dòng)子、油質(zhì)蛋白基因啟動(dòng)子等。其中，更優(yōu)選使用花椰菜花 葉病毒35S啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子或遍在蛋白基因啟動(dòng)子。如果使用上述各啟動(dòng)子， 則能夠使任意的核酸在被導(dǎo)入植物細(xì)胞內(nèi)時(shí)增強(qiáng)表達(dá)。
[0183] 另外，作為啟動(dòng)子，還可以使用具有使核酸在植物中部位特異性地表達(dá)的功能的 啟動(dòng)子。作為這樣的啟動(dòng)子，可以使用現(xiàn)有公知的任何啟動(dòng)子。通過使用這樣的啟動(dòng)子，部 位特異性地導(dǎo)入上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，從而能夠提高由導(dǎo)入了該核酸的 細(xì)胞形成的植物器官、植物組織產(chǎn)生的溢泌物所含的糖含量。
[0184] 此外，表達(dá)載體除了啟動(dòng)子和上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸之外，還可 以包含具有其他片段序列的核酸。對(duì)該具有其他片段序列的核酸不特別限定，可列舉具有 終止子堿基序列的核酸、具有轉(zhuǎn)化體篩選標(biāo)志物堿基序列的核酸、具有增強(qiáng)子堿基序列的 核酸、具有用于提高翻譯效率的堿基序列的核酸等。另外，上述重組表達(dá)載體還可以具有Τ'-DNA 區(qū)域。 T-DNA 區(qū)域特別是在使用農(nóng)桿菌將具有上述重組表達(dá)載體中的堿基序列的核酸導(dǎo) 入植物細(xì)胞時(shí)能夠提高核酸導(dǎo)入的效率。
[0185] 具有終止子堿基序列的核酸只要具有作為轉(zhuǎn)錄終止部位的功能即可，不特別限 定，可以是公知的終止子。例如，具體來說，優(yōu)選使用胭脂堿合成酶基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（Nos 終止子）、花椰菜花葉病毒35S的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（CaMV35S終止子)等。其中更優(yōu)選使用Nos終止 子。在上述重組載體中，可以通過將終止子配置在適當(dāng)?shù)奈恢茫瑥亩乐拱l(fā)生在導(dǎo)入植物細(xì) 胞之后合成不必要的長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物這樣的現(xiàn)象。
[0186] 作為具有轉(zhuǎn)化體篩選標(biāo)志物堿基序列的核酸，例如，可以使用包含耐藥性基因的 核酸。作為所述耐藥性基因的具體例子，可列舉例如，包含針對(duì)潮霉素、博來霉素、卡那霉 素、慶大霉素、氯霉素等的耐藥性基因的核酸。由此，通過選擇在含有上述抗生素的培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)的植物體，可以容易地篩選出被轉(zhuǎn)化的植物體。
[0187] 作為具有用于提高翻譯效率的堿基序列的核酸，可列舉例如具有來自煙草花葉病 毒的omega序列的核酸。通過將該具有omega序列的核酸配置在蛋白質(zhì)編碼區(qū)上游的非翻譯 區(qū)（5'UTR)，能夠提高上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的表達(dá)效率。這樣，上述重組 表達(dá)載體中，根據(jù)其目的可以包含具有各種DNA片段序列的核酸。
[0188] 對(duì)于重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法不特別限定，可以在適宜選擇的成為母體的載體中 以規(guī)定的順序?qū)肷鲜鼍哂袉?dòng)子堿基序列的核酸、上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核 酸和根據(jù)需要的上述具有其他DNA片段序列的核酸。例如，可以將上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn) 運(yùn)蛋白的核酸、具有啟動(dòng)子堿基序列的核酸和(根據(jù)需要的具有終止子堿基序列的核酸等） 連接，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入載體中。
[0189] 另外，對(duì)上述重組表達(dá)載體的增殖方法(生產(chǎn)方法）也不特別限定，可以使用現(xiàn)有 公知的方法。一般可以以大腸桿菌為宿主使其在該大腸桿菌內(nèi)增殖。這時(shí)，可以根據(jù)載體的 種類來選擇優(yōu)選的大腸桿菌的種類。
[0190] 轉(zhuǎn)化
[0191] 上述表達(dá)載體可通過一般的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入對(duì)象植物細(xì)胞。對(duì)將表達(dá)載體導(dǎo)入植物 細(xì)胞的方法(轉(zhuǎn)化方法)不特別限制，可以根據(jù)植物細(xì)胞而使用適當(dāng)?shù)默F(xiàn)有公知的方法。具 體地說，例如，可以使用利用農(nóng)桿菌的方法、直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。作為利用農(nóng)桿菌的 方法，例如，可以使用 Bechtold，E.，Ellis，J.和 Pelletier，G.(1993)In Plan ta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants.C.R.Acad.Sci.Paris Sci.Vie，316,1194-1199.或Zyprian E，Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology，1990,15(2) ,245-256.所記載的方法。
[0192] 作為將表達(dá)載體直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法，例如，可以使用微注射法、電穿孔法、 聚乙二醇法、基因槍法、原生質(zhì)體融合法、磷酸鈣法等。
[0193] 另外，如果采用將上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方 法，則只要是包含編碼作為對(duì)象的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸表達(dá)所需的轉(zhuǎn)錄單元、例如具有啟動(dòng)子 堿基序列的核酸、具有轉(zhuǎn)錄終止子堿基序列的核酸和編碼作為對(duì)象的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的核 酸就足夠了，載體功能并不是必須的。進(jìn)而，即使是不具有轉(zhuǎn)錄單元的僅包含上述編碼參與 糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的核酸，只要能夠整合到宿主基因組中的轉(zhuǎn)錄單 元內(nèi)、能夠表達(dá)成為對(duì)象的基因即可。另外，即使在不整合到宿主基因組中的情況下，只要 上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸能夠在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄且/或翻譯就足夠了。
[0194] 作為導(dǎo)入上述表達(dá)載體、不含表達(dá)載體的成為對(duì)象的編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白 的核酸的植物細(xì)胞，可列舉例如，花、葉、根等植物器官中的各組織的細(xì)胞、愈傷組織、懸浮 培養(yǎng)細(xì)胞等。這里，表達(dá)載體既可以根據(jù)要生產(chǎn)的植物體的種類來適宜構(gòu)建適當(dāng)載體，也可 以預(yù)先構(gòu)建通用的表達(dá)載體，將其導(dǎo)入植物細(xì)胞。
[0195] 作為由成為表達(dá)載體的導(dǎo)入對(duì)象的細(xì)胞形成的植物，不特別限定。即，通過導(dǎo)入上 述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，能夠?qū)τ谒兄参矬w提高排水液等溢泌物所含的糖 濃度。作為成為對(duì)象的植物，例如，優(yōu)選為顯花植物，在顯花植物中更優(yōu)選為被子植物。作為 成為對(duì)象的被子植物，可列舉例如，雙子葉植物、單子葉植物，屬于例如十字花科、禾本科、 茄科、豆科、楊柳科等的植物(參照下述），但不限于這些植物。
[0196] 十字花科：擬南芥（Arabidopsis thaliana)、深山旗竿（玉山筷子芥） (Arabidopsis lyrata)、油菜（Brassica rapa、Brassica napus、Brassica campestris)、 卷心菜（Brassica oleracea var · capitata)、白菜（Brassica rapa var · pekinensis)、青 菜（Brassica rapa var. chinensis)、完青（Brassica rapa var.rapa)、野澤菜（Brassica rapa var .hakabura)、日本完青（Brassica rapa var. lancinifolia)、小松菜（Brassica rapa var · peruviridis)、小白菜（八夕于3七Brassica rapa var .(311；!_11611818)、蘿卜 (Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica) >^^(Capsella rubella)^〇
[0197] 藜科：甜菜(Beta vulgaris)
[0198] 械樹科：糖楓XAcer saccharum)
[0199] 大戟科:蓖麻(Ricinus communis)
[0200] 前科：煙草（Nicotiana tabacum)、前子（Solanum melongena)、馬鈴薯（Solaneum tuberosum)、番前（So lanum ly coper si cum)、辣椒（Cap si cum annuum)、矮牽牛（Petunia hybrida)^〇
[0201] 豆科：大豆(Glycine max)、碗豆（Pisum sativum)、香豆（Vicia faba)、多花紫藤 (Wisteria f loribunda)、花生(Arachis .hypogaea)、日本百脈根（Lotus japonicus)、菜豆 (Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vigna angularis)、金合歡(Acacia)、漠藜苜蓿(Medicago truncatula) >0^S(Cicer arietinum)^〇
[0202] 菊科：菊（Chrysanthemum morifolium)、向日葵（Helianthus annuus)等。
[0203] 棕櫚科：油棕(非洲油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、椰 子(Cocos nucif era)、海率(Phoenix dactyl if era)、巴西棕櫚(Copernicia)等。
[0204] 漆樹科：野漆樹（Rhus succedanea)、腰果（Anacardium occidentale)、漆樹 (Toxicodendron vernicif luum)、芒果（Mangifera indica)、阿月渾子（Pistacia vera) 等。
[0205] 萌蘆科：南瓜（輿瓜（Cucurbita maxima)、中國(guó)南瓜（Cucurbita moschata)、美洲 南瓜（Cucurbita pepo))、黃瓜（Cucumis sativus)、王瓜（Trichosanthes cucumeroides)、 萌蘆（Lagenaria siceraria ￥81'.區(qū)〇11獷(1&)等。
[0206] 薔薇科：扁桃(Amygdalus communis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria vesca)、櫻 (Prunus)、蘋果（Malus pumila var.domestica)、桃（Prunus persica)等。
[0207] 葡萄科：葡萄(Vitis vinifera)
[0208] 石竹科：康乃馨(Dianthus caryophyllus)等。
[0209] 楊柳科：楊（毛果楊（Populus trichocarpa)、黑楊（Populus nigra)、歐洲山楊 (Populus tremula))等。
[0210] 禾本科：玉米（Zea mays)、稻（Oryza sativa)、大麥（Hordeum vulgare)、小麥 (Triticum aestivum)、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu)、節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)、 二糖短柄草（Brachypodium distachyon)、毛竹屬（Phyllostachys)、甘鹿（Saccharum of fi c inarum)、象草（Pennisetum pupureum)N^^fe|l;^(Erianthus ra venae)、芒 (Miscanthus virgatum)、高粱（Sorghum bicolor)、泰屬（Panicum)等。
[0211]百合科：有卩金香屬(Tulipa)、百合屬(Lilium)等。
[0212] 其中，優(yōu)選以甘蔗、玉米、稻、高粱、小麥、甜菜、糖楓這樣的比較多地產(chǎn)生溢泌物、 且糖、淀粉的產(chǎn)生能力高的植物作為對(duì)象。因?yàn)樵敿?xì)如后所述，可以使用從這些植物采集的 溢泌物作為生物燃料、生物塑料的原料。
[0213] 另外，如上所述，本發(fā)明中能夠使用的編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸可以從 各種植物分離而使用，可以根據(jù)對(duì)象植物的種類適宜選擇而使用。即，在對(duì)象植物細(xì)胞來自 單子葉植物的情況下，作為編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，可以導(dǎo)入從單子葉植物分 離的核酸。特別是在對(duì)象植物是稻科植物的情況下，優(yōu)選導(dǎo)入作為編碼來自稻的參與糖運(yùn) 輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的編碼0sSWEET13的核酸（0sl2g047620001)、編碼0sSWEET14的核酸 (0sllt050860001)和編碼0sSWEET15的核酸（0s02t051310001)。通過導(dǎo)入這些編碼 0sSWEET13 的核酸（0sl2g047620001)、編碼 0sSWEET14 的核酸（0sllt050860001)和編碼 0sSWEET15的核酸(0s02t051310001)，能夠顯著提高稻的溢泌物所含的糖量。
[0214] 另外，即使對(duì)象植物細(xì)胞來自單子葉植物，也可以導(dǎo)入編碼來自雙子葉植物的參 與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸。在對(duì)象植物細(xì)胞來自單子葉植物的情況下，優(yōu)選導(dǎo)入編碼來 自作為雙子葉植物的擬南芥的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸中編碼AtSWEETll的核酸 (At3g48740)和編碼AtSWEET12的核酸（At5g23660)。這些編碼AtSWEETll 的核酸 (At3g48740)和編碼AtSWEET12的核酸(At5g23660)，即使對(duì)象植物是稻等單子葉植物，也能 夠顯著提高溢泌物所含的糖量。
[0215] 其他工序、其他方法
[0216] 在上述的轉(zhuǎn)化處理后，通過現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行從植物體中篩選適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化體的 篩選工序。對(duì)篩選的方法不特別限定，例如，可以以潮霉素耐性等耐藥性為基準(zhǔn)進(jìn)行篩選， 也可以在育成轉(zhuǎn)化體后從植物體采集溢泌物，測(cè)定采集的溢泌物所含的糖分，篩選與野生 型相比糖濃度有意義地提高了的植株。另外，采集的溢泌物所含的糖分測(cè)定也可以采用不 是定量而是定性地測(cè)定的方法，例如可以通過使用與糖反應(yīng)而顯色的試紙的顯色法來測(cè) 定。
[0217] 另外，可以從轉(zhuǎn)化處理所得的轉(zhuǎn)化植物按照常規(guī)方法獲得后代植物。對(duì)于保持了 上述編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的表達(dá)量與野生型有意義地提高這樣的性狀的后 代植物，以其溢泌物所含的糖量作為基準(zhǔn)進(jìn)行篩選，從而能夠通過具有上述性狀而制作出 溢泌物所含的糖量增加了的穩(wěn)定的植物系統(tǒng)。此外，可以從轉(zhuǎn)化植物、其后代獲得植物細(xì) 胞、種子、果實(shí)、植株、愈傷組織、塊莖、扦插枝、塊等繁殖材料，基于這些通過具有上述性狀 而量產(chǎn)溢泌物所含的糖量增加了的穩(wěn)定的植物系統(tǒng)。
[0218] 如以上說明的那樣，根據(jù)本發(fā)明，通過將上述編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白 的核酸導(dǎo)入細(xì)胞，或者強(qiáng)化該核酸的表達(dá)，與野生型的植物體相比，能夠有意義地提高溢泌 物所含的糖濃度。其中，作為溢泌物所含的糖成分，是包含葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖這 樣的單糖類、蔗糖、乳糖和麥芽糖這樣的二糖類的含義。即，通過將上述編碼特定的參與糖 運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸導(dǎo)入細(xì)胞，或者強(qiáng)化內(nèi)源性的該基因的表達(dá)，能夠提高溢泌物所含 的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖等糖成分中的任意1種以上的濃度。特 別是根據(jù)本發(fā)明，能夠大幅提高溢泌物中的葡萄糖、果糖和蔗糖的濃度。
[0219] 特別是采集從排水組織產(chǎn)生的排水液作為溢泌物時(shí)，優(yōu)選將細(xì)胞中導(dǎo)入了上述編 碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸、或強(qiáng)化了該核酸的表達(dá)的植物在防止所產(chǎn)生的排 水液蒸騰這樣的條件下進(jìn)行栽培。進(jìn)而，更優(yōu)選將該植物在排水液的產(chǎn)生量這樣的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可以通過使栽培該植物時(shí)的栽培條件為濕度80 % RH以上、更優(yōu)選為90 % RH 以上的密閉空間，來防止排水液的蒸騰、并增大排水液的產(chǎn)生量。
[0220] 例如，野生型擬南芥的排水液所含的糖濃度為約2.0μΜ(平均值、單糖當(dāng)量），與此 相對(duì)，在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了上述特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)化擬南芥中，排水液中 的糖濃度增加到約98.5~6057.5μΜ。特別是，細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了編碼AtSWEET 12的核酸 (At5g23660)的轉(zhuǎn)化擬南芥，與其他轉(zhuǎn)化擬南芥相比，能夠產(chǎn)生包含更高濃度的糖成分的排 水液。
[0221 ]另外，野生型稻的排水液所含的糖濃度為約1.3μΜ(平均值、單糖當(dāng)量），在細(xì)胞內(nèi) 導(dǎo)入了上述編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的轉(zhuǎn)化稻中，排水液中的糖濃度增加 到約1074.3~185641.2μM。特別是細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了編碼AtSWEETll的核酸(At3g48740)、編碼 0sSWEET13的核酸(0sl2g0476200)或編碼SWo5的核酸的轉(zhuǎn)化稻，與其他轉(zhuǎn)化稻相比，能夠產(chǎn) 生包含更高濃度的糖成分的排水液。進(jìn)一步地，細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了編碼OsSWEETl 5的核酸 (0s02g051310001)的轉(zhuǎn)化稻，與細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了其他編碼特定的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核 酸的轉(zhuǎn)化稻的排水液中的最大糖濃度相比，能夠產(chǎn)生包含更高濃度的糖成分的排水液，排 水液中的糖濃度增加到最大450340.4μΜ。
[0222]如上，根據(jù)本發(fā)明，能夠采集高糖濃度的溢泌物。采集的溢泌物能夠在醇和/或有 機(jī)酸的發(fā)酵生產(chǎn)中使用。進(jìn)一步地，采集的溢泌物還可以作為生物煉制的原料使用。此時(shí)， 例如在作為溢泌物利用排水液的情況下，可以將從細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了上述編碼特定的參與糖運(yùn) 輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸、或者強(qiáng)化了該核酸的表達(dá)的植物采集的排水液直接在醇發(fā)酵、有機(jī) 酸發(fā)酵的反應(yīng)體系中利用，從而可以作為生物煉制的原料利用?；蛘撸部梢詫脑撝参锊?集的排水液進(jìn)行濃縮處理、添加其他碳源、氮源等的處理之后，在醇發(fā)酵、有機(jī)酸發(fā)酵的反 應(yīng)體系中利用。
[0223] 實(shí)施例
[0224] 以下，使用實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)的范圍不限于這些實(shí)施 例。
[0225] 1.擬南芥轉(zhuǎn)化用DNA構(gòu)建體的制作
[0226] 1.1通過PCR獲得編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA
[0227] 1.1.1編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA的擴(kuò)增
[0228] 以從擬南芥制備的c DNA作為模板，通過PCR進(jìn)行評(píng)價(jià)用的編碼A t SWEE T1、 AtSWEET2、AtSWEET3、AtSWEET4、AtSWEET5、AtSWEET6、AtSWEET7、AtSWEET9、AtSWEETll、 AtSWEET12、AtSWEET13、AtSWEET15 和 AtSWEET17 蛋白質(zhì)的 DNA 的擴(kuò)增。為了將評(píng)價(jià)用 DNA 插入 PRI201AN載體（夕力y，<才社制、#3264)中，設(shè)計(jì)在5 '末端添加了Sal I限制性酶識(shí)別序 列的正向引物，以及在3'末端添加了Sac I或Pst I限制性酶識(shí)別序列的反向引物(表6)。
[0231] 然后，使用這些引物和PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(TaKaRa、#R050A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 反應(yīng)液組成示于表7，反應(yīng)條件示于表8。
[0232] 表 7

[0236] 接著，為了將上述PCR擴(kuò)增所得的DNA片段插入pCR2 . l-ΤΟΡΟ載體DNA (Invitrogen、#K4500_01)中，進(jìn)行以下的處理，在5'末端和3'末端添加腺噪呤(Adenine)。 反應(yīng)液組成示于表9。使表9所示的反應(yīng)液在70 °C反應(yīng)15分鐘。
[0237] 表 9
[0239] 1.1.2擴(kuò)增DNA片段的切下和純化
[0240] 將PCR擴(kuò)增而得的各DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，使用MagExtractor-PCR&Gel Clean up試劑盒(T0Y0B0、#NPK-601)進(jìn)行切下純化。此外，切下純化按照試劑盒附帶的操作 說明書進(jìn)行。
[0241] 1.1.3擴(kuò)增DNA片段的轉(zhuǎn)化
[0242] 將純化而得的擴(kuò)增DNA片段使用Τ0Ρ0 TA Cloning(Invitrogen、#K4500-01)導(dǎo)入 pCR2.1-T0P0載體中。反應(yīng)液組成示于表10。使表10所示的反應(yīng)液在室溫反應(yīng)5分鐘。
[0243] 表1〇
[0245] 接著，將該反應(yīng)液2μ1添加到大腸桿菌（Escherichia coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞 (Τ0Υ0Β0、#DNA-903)中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在冰浴上放置30分鐘后，在42°C進(jìn)行30秒熱處理。然后， 在冰浴上驟冷，添加500μ1的S0C培養(yǎng)基（11^丨廿〇8611、#15544-034)，以37°(：、180印111振蕩培 養(yǎng)1小時(shí)。在添加了終濃度50μg/ml的卡那霉素的LB瓊脂平板上涂布溶解在DMF(N，N-二甲基 甲酰胺）中的40mg/ml X-gal 40yl、100mM IPTG 40μ1 后，再涂布培養(yǎng)液 100-200μ1，在37°C 培養(yǎng)一晚，第二天早晨獲得菌落。
[0246] 1.1.4通過菌落PCR來進(jìn)行轉(zhuǎn)化的檢查和陽性克隆的篩選
[0247] 轉(zhuǎn)化的結(jié)果得到多個(gè)菌落。為了對(duì)于各菌落確認(rèn)有無插入DNA，使用Ml 3-F: 5 ' -GTA AAA CGA CCA GTC TTA AG-3'（序列號(hào) 164)和M13-R:5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3'（序列 號(hào)165)進(jìn)行菌落PCR。菌落PCR的反應(yīng)液組成示于表11，PCR條件示于表12。
[0248] 表11
[0252] 1.1.5來自陽性克隆的質(zhì)粒DNA純化
[0253] 從能夠確認(rèn)插入DNA的克隆純化質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA的純化使用QIAprep Spin Minipr印Kit(QIAGEN、#27106)，按照附帶的方案進(jìn)行。
[0254] 1.1.6陽性克隆的堿基序列確定
[0255] 以1.1.5中得到的質(zhì)粒DNA作為模板，使用M13-F和M13-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過雙 脫氧法(桑格爾法)來確定DNA片段的堿基序列。
[0256] 1.2通過化學(xué)合成來獲得編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA
[0257] 對(duì)于編碼AtSWEET8、AtSWEET10、AtSWEET14、AtSWEET16蛋白質(zhì)的DNA，以在5，末端 添加 Pst I限制性酶識(shí)別序列、在3,末端添加 Sail限制性酶識(shí)別序列的方式設(shè)計(jì)堿基序列， 進(jìn)行化學(xué)全合成。其結(jié)果能夠獲得插入了pEX-A載體(才X口 ^，<才于夕y 口 V'-）中的編 碼AtSWEET8和AtSWEET14蛋白質(zhì)的DNA、插入了 pCR2.1-T0P0載體中的編碼AtSWEETIO和 AtSWEET16蛋白質(zhì)的DNA。
[0258] 1.3通過限制性酶反應(yīng)來進(jìn)行編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA的切下和純化
[0259] 為了從1.1.5和1.2中得到的質(zhì)粒DNA取出編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA片段，進(jìn)行兩 次的限制性酶處理。針對(duì)各DNA的限制性酶的組合記于表13。
[0260] 表13
[0262] 1.3.1擴(kuò)增DNA片段的Sac I、Nde I或Sail限制性酶反應(yīng)(第一次）
[0263] 使用Sac I(TaKaRa、#1078A)、Nde I(TaKaRa、#1161A)或Sal I(TaKaRa、#1080A)制 作以下的反應(yīng)液，在37°C反應(yīng)一晚，切斷1.1.5或1.2中得到的質(zhì)粒。Sac I的反應(yīng)液組成示 于表14，Nde I的反應(yīng)液組成示于表15,Sail的反應(yīng)液組成示于表16。

[0270] 1.3.2通過限制性酶反應(yīng)切斷的DNA片段的純化
[0271]接著，為了純化DNA，進(jìn)行PCI (苯酚:氯仿：異戊醇=24: 24:1)提取和乙醇沉淀。在 反應(yīng)液中加入等量的PCI進(jìn)行攪拌，在以5分鐘、15000rpm離心回收的上層中加入等量的氯 仿，同樣離心而回收上層。在回收的上層中加入二倍量的乙醇，使用？6116七？3；[1^即（：0-Prec ip i tant ( 夕，^才^^ 卜、#70748)進(jìn)行乙醇沉淀。干燥后，將所得的DNA溶解在滅 菌水44μ1中。
[0272] 1.3.3擴(kuò)增DNA片段的Sail、Xba I和Sac I限制性酶反應(yīng)(第二次）
[0273] 接著，使用Sal I(TaKaRa、#1080A)、Xba I(TaKaRa、#1093A)或SacI(TaKaRa、# 1078A)制作以下的反應(yīng)液，在37°C反應(yīng)一晚，切斷1.3.2中得到的質(zhì)粒。Sal I的反應(yīng)液組成 示于表17，Xba I的反應(yīng)液組成示于表18，Sac I的反應(yīng)液組成示于表19。

[0280] 1.3.4通過限制性酶反應(yīng)切斷的DNA片段的純化
[0281] 將1.3.3中得到的反應(yīng)液與1.1.2的步驟同樣地進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，使用 MagExtractor-PCR&Gel Clean up試劑盒進(jìn)行切下純化。
[0282] 1.4通過限制性酶反應(yīng)來進(jìn)行pRI201AN載體的切下和純化
[0283] 為了與1.3中得到的編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA片段進(jìn)行連接，將pRI 201AN載體用 與1.3同樣的步驟進(jìn)行限制性酶處理。
[0284] 1.5連接
[0285] 1.5.1連接反應(yīng)
[0286] 為了將1.3中得到的編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA片段插入1.4中得到的pRI201AN載 體中，進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(夕力歹才、#6022)，在16°C 反應(yīng)一晚。
[0287] 1.5.2連接反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0288] 上述連接反應(yīng)結(jié)束后，使用反應(yīng)液2μ1通過與1.1.3同樣的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
[0289] 1.5.3通過菌落PCR檢查連接反應(yīng)
[0290] 通過將在菌落PCR中擴(kuò)增的DNA片段的長(zhǎng)度用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化，來確認(rèn) 編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA是否插入載體。
[0291 ] 1.5.4通過連接反應(yīng)獲得的DNA構(gòu)建體的制備
[0292] 從能夠確認(rèn)插入DNA的菌落進(jìn)行質(zhì)粒DNA的純化，得到插入了目的DNA片段的克隆。 質(zhì)粒DNA的純化使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN、#27106)按照附帶的方案進(jìn)行。 所得的DNA構(gòu)建體(AtSWEET/pRI201AN)的物理圖譜示于圖6。在圖6中，LB表示左邊框（left border )，RB表不右邊框（right border )，TN0S表不來自根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)的Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因 N0S的轉(zhuǎn)錄終止子，NPTII表示來自大腸桿菌 (Escherichia coli)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(neomycin phosphotransferasell)基因， Pnos表示來自根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因 N0S的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，THSP表示來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的熱休克蛋白（heat shock protein)基因 HSP的轉(zhuǎn)錄終止子，AtSTCET表示編碼來自擬南芥（Arabidopsis thaliana)的SWEET蛋白質(zhì)的DNA，P35S表示花椰菜花葉病毒35S轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，AtADH 5'-UTR 表不來自擬南芥（Arabidopsis thaliana)的醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase)基因 ADH 的翻譯增強(qiáng)子，ColElori表示大腸桿菌(Escherichia coli)的復(fù)制起點(diǎn)，Ri ori表示發(fā)根 農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogene)S的復(fù)制起點(diǎn)。
[0293] 1.6.1通過化學(xué)合成獲得編碼OsSWEET蛋白質(zhì)的DNA以及構(gòu)建體的制作
[0294] 如下進(jìn)行設(shè)計(jì):在參考擬南芥的密碼子頻率而以氨基酸序列不改變的方式重新進(jìn) 行了序列設(shè)計(jì)的編碼 0sSWEET5、0sSWEETll、0sSWEET12、0sSWEET13、0sSWEETl^P0sSWEET15 蛋白質(zhì)的DNA的起始密碼子側(cè)添加 Nde I限制性酶識(shí)別序列，在終止密碼子側(cè)添加 Sac I限 制性酶識(shí)別序列。然后，將設(shè)計(jì)的DNA進(jìn)行化學(xué)全合成，通過插入pRI201AN載體而獲得各DNA 構(gòu)建體。此外，使添加在5'末端的Nde I限制性酶識(shí)別序列（5'CATATG3'）所含的ATG與編碼 SWEET蛋白質(zhì)的DNA的起始密碼子一致。
[0295] 1.6.2通過化學(xué)合成獲得編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人工基因以及構(gòu)建體的制 作
[0296] 如下制作作為編碼具有共有序列1的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的具有天然不 存在的堿基序列的DNA、即具有共有序列1的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人工基因6種。首先， 對(duì)于序列號(hào)132~137的氨基酸序列所示的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白51〇1、51〇2、51〇3、51〇4、51〇5和51〇6，作 為編碼各轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸分別設(shè)計(jì)序列號(hào)168、169、170、171、172和173。然后，在這些序列 號(hào)168、169、170、171、172和173中的起始密碼子側(cè)添加陽61限制性酶識(shí)別序列，終止密碼子 側(cè)添加 Sac I限制性酶識(shí)別序列。然后，將設(shè)計(jì)的DNA進(jìn)行化學(xué)全合成，通過插入pRI201AN載 體而獲得6種DNA構(gòu)建體。此外，使添加在5'末端的Nde I限制性酶識(shí)別序列（5'CATATG3'）所 含的ATG與序列號(hào)168、169、170、171、172和173的起始密碼子一致。
[0297] 1.7向擬南芥的轉(zhuǎn)化
[0298] 將1 .5和1 .6. 1以及1 .6.2中制作的植物表達(dá)用載體通過電穿孔法（Plant Molecular Biology Mannal,Second Edition，B.G.Stanton and A.S.Robbert,Kluwer Acdemic Publishers 1994)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58Cl株。接下 來將導(dǎo)入了植物表達(dá)用載體的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)通過Clough等所 記載的浸潤(rùn)法（Steven J.Clough and Andrew F.Bent, 1998,The Plant Journal 16,735-743)導(dǎo)入野生型擬南芥生態(tài)型Col-0中，回收T1(轉(zhuǎn)化(transformant)第一代)種子。將回收 的T1種子在包含卡那霉素（50mg/L)、羧芐青霉素（100mg/L)和苯菌靈（Benlate)水合劑 (10mg/L:住友化學(xué)社制）的MS瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂濃度為0.8% ))中進(jìn)行無菌播種，培養(yǎng)約2 周，篩選轉(zhuǎn)化體。將篩選的轉(zhuǎn)化體移植在新的上述MS瓊脂培養(yǎng)基中，再栽培約1周后，移植在 加入了蛭石與土壤混合物（So i 1 MiX)(f力夕(7)夕氺）以體積比1:1混合而得的土的盆中， 獲得T2(轉(zhuǎn)化第二代)種子。
[0299] 1.8擬南芥排水液的獲得
[0300] 將通過編碼△七5^^1'、085'?^1'、5￥〇1、5￥〇2、5￥〇3、5￥〇4、5￥〇5和5￥〇6蛋白質(zhì)的0嫩轉(zhuǎn) 化而得的擬南芥的Τ1或Τ2植物體在18L/6D(18小時(shí)光條件之后6小時(shí)暗條件的24小時(shí)光循 環(huán)條件）、22°C下進(jìn)行栽培。對(duì)馴化后經(jīng)過1~2周的植物體給予1/1000花寶(HYPONeX)，用纏 繞膜(旭化成制、f" 7 ^ 7 包裹植物使?jié)穸葹?0 %以上優(yōu)選為90 %以上，使排水液排出 (圖7)。主要回收附著于葉里的排水液，分析排水液中的糖濃度。此外，將使野生型擬南芥感 染農(nóng)桿菌栽培而收獲的種子定義為T1種子，將T1種子通過藥劑篩選或PCR等方法確認(rèn)細(xì)胞 中導(dǎo)入了DNA的植物體定義為T1植物，將栽培T1植物而收獲的種子定義為T2種子。
[0301] 2.稻轉(zhuǎn)化用DNA構(gòu)建體的制作
[0302] 2.1編碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA的擴(kuò)增
[0303] 以上述1.5.4中制備的擬南芥轉(zhuǎn)化用DNA構(gòu)建體(編碼AtSWEET8蛋白質(zhì)的DNA、編碼 AtSWEETll蛋白質(zhì)的DNA和編碼AtSWEET12蛋白質(zhì)的DNA)作為模板，通過PCR分別擴(kuò)增編碼 AtSWEET8蛋白質(zhì)的DNA、編碼AtSWEETll蛋白質(zhì)的DNA和編碼AtSWEET12蛋白質(zhì)的DNA。此外， 為了將擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入pENTR/D-TOPO載體，在5 '端添加了 CACC序列。
[0304] 2.2使用擴(kuò)增DNA片段的轉(zhuǎn)化
[0305]將所得的反應(yīng)液的一部分進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)了存在預(yù)定大小的擴(kuò)增產(chǎn) 物，然后使用pENTER Directional Τ0Ρ0 Cloning試劑盒（彳 ^匕、卜口'2工^)導(dǎo)入pENTR/D-Τ0Ρ0載體中。
[0306] 接著，將反應(yīng)液總量添加到大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞（夕力 yパY才）中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在冰浴上放置30分鐘后，在42°C進(jìn)行45秒的熱處理。然后，在冰浴 中驟冷，添加300μ1的S0C培養(yǎng)基（夕力y，彳才），以37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將該培養(yǎng) 液涂布在添加了終濃度50μg/ml的卡那霉素的LB瓊脂平板上，在37 °C過夜培養(yǎng)，第二天早晨 獲得菌落。
[0307] 2.3通過菌落PCR來進(jìn)行轉(zhuǎn)化的檢查和陽性克隆的篩選
[0308]通過將菌落PCR中擴(kuò)增的DNA片段的長(zhǎng)度用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化，確認(rèn)編碼 AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA插入了載體中。
[0309] 2.4從陽性克隆純化質(zhì)粒DNA
[0310]從能夠確認(rèn)插入DNA的克隆進(jìn)行質(zhì)粒DNA的純化。質(zhì)粒DNA的純化使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN、#27106)按照附帶的方案進(jìn)行。
[0311] 2.5陽性克隆的堿基序列確定
[0312 ] 以2.4中純化的質(zhì)粒DNA作為模板，使用Ml 3-F和Ml 3-R引物，通過DNA測(cè)序儀(<;/夕 7 ^ 3 -少夕一 CEQ8000)進(jìn)行DNA片段的堿基序列的確定。
[0313] 2.6LR反應(yīng)和轉(zhuǎn)化
[0314] 使用插入了2.4中得到的編碼AtSWEET8蛋白質(zhì)的DNA、編碼AtSWEETll蛋白質(zhì)的 DNA、編碼At SWEET 12蛋白質(zhì)的DNA的pENTR/D-TOPO質(zhì)粒DNA和稻轉(zhuǎn)化用載體(pZH2B_GW0x)進(jìn) 行Gateway LR反應(yīng)，如圖8所示，構(gòu)建了用于在稻植物體內(nèi)過表達(dá)的構(gòu)建體。
[0315] 接著，將反應(yīng)液總量添加到大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞（夕力 彳才)中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在冰浴上放置30分鐘后，以42°C進(jìn)行45秒的熱處理。然后，在冰浴中 驟冷，添加300μ1的S0C培養(yǎng)基（夕力y，彳才），以37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將該培養(yǎng)液 涂布在添加了終濃度50μg/ml的奇霉素（spectinomycin)的LB瓊脂平板上，在37°C過夜培 養(yǎng)，第二天早晨獲得菌落。
[0316] 2.7通過菌落PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)化的檢查和陽性克隆的篩選
[0317]通過將在菌落PCR中擴(kuò)增的DNA片段的長(zhǎng)度用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行可視化，確認(rèn)編 碼AtSWEET蛋白質(zhì)的DNA插入了載體。
[0318] 2.8從陽性克隆純化質(zhì)粒0嫩
[0319]從能夠確認(rèn)插入DNA的克隆進(jìn)行質(zhì)粒DNA的純化。質(zhì)粒DNA的純化使用QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN、#27106)按照附帶的方案進(jìn)行。
[0320] 2.9陽性克隆的堿基序列確定
[0321] 以2.8中純化的質(zhì)粒DNA作為模板，使用以下的引物通過DNA測(cè)序儀(^%/夕7 ^ 3 一少夕一 CEQ8000)進(jìn)行DNA片段的堿基序列的確定。
[0322] Ubi3'F:5'-TGC TGT ACT TGC TTG GTA TTG-3'（序列號(hào) 166)
[0323] UbiTseq3:5'_GGA CCA GAC CAG ACA ACC-3'（序列號(hào) 167)
[0324] 2.10.1通過化學(xué)合成來獲得編碼OsSWEET蛋白質(zhì)的DNA
[0325] 對(duì)編碼 0sSWEET13、0sSWEET14 或者 0sSWEET15蛋白質(zhì)的DNA，為了導(dǎo)入 pENTR/D-Τ0Ρ0載體中而設(shè)計(jì)成在5 '端添加了 CACC序列。將設(shè)計(jì)的DNA進(jìn)行化學(xué)全合成，插入pENTR/D-Τ0Ρ0載體中。
[0326] 2.10.2通過化學(xué)合成獲得編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人工基因
[0327] 如下制作作為編碼具有共有序列1的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸的具有天然不 存在的堿基序列的DNA、即具有共有序列1的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人工基因2種。首先， 對(duì)于序列號(hào)132和136的氨基酸序列所示的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SWol和SW 〇5,作為編碼各轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核 酸分別設(shè)計(jì)序列號(hào)174和175。然后，對(duì)這些序列號(hào)174和175,為了導(dǎo)入pENTR/D-TOPO載體中 而設(shè)計(jì)成在5 '端添加了 CACC序列。將設(shè)計(jì)的DNA進(jìn)行化學(xué)全合成，插入pENTR/D-TOPO載體 中。
[0328] 2.11編碼OsSWEET蛋白質(zhì)的DNA或人工基因的構(gòu)建體的制作
[0329] 使用2.10.1和2.10.2中合成的DNA，與上述2.6~2.9同樣地構(gòu)建稻轉(zhuǎn)化用載體。
[0330] 2.12向稻中的轉(zhuǎn)化
[0331] 使用上述2.9和2.11中制作的植物表達(dá)用載體，按照11^?1&1^1〇11?1 &1(2006) 47,969-976所記載的方法，將編碼AtSWEET、0sSWEET、SWol和SWo5蛋白質(zhì)的DNA導(dǎo)入稻（日本 晴）中。
[0332] 2.13稻排水液的獲得
[0333] 將導(dǎo)入了編碼AtSWEET、0sSWEET、SWol和SWo5蛋白質(zhì)的DNA的稻的轉(zhuǎn)化第一代，移 植到加入了 8分左右的蛭石的直徑6cm壺中進(jìn)行馴化。此外稻的栽培在18L(30°C)/6D(25°C) (18小時(shí)30 °C明條件之后6小時(shí)25 °C暗條件的24小時(shí)光循環(huán)條件）下進(jìn)行。對(duì)馴化后經(jīng)過1~ 2周的植物體充分給予1/1000花寶(HYPONeX)，用纏繞膜(旭化成社制、fy 包裹植 物使?jié)穸葹?0%以上優(yōu)選為90%以上，使排水液從稻的排水組織中排出（圖9)?；厥崭街?葉的排水液，分析糖濃度。
[0334] 3.排水液中的糖濃度分析
[0335] 3.1排水液樣品的稀釋
[0336] 使用移液器測(cè)定1.8中得到的擬南芥的排水液、2.13中得到的稻的排水液的體積， 加入純水定容至0.35ml。接著，進(jìn)行10000 XG、10分鐘的離心分離，然后將上清0.3mL移至自 動(dòng)取樣器瓶中用于HPLC分析。
[0337] 3.2通過HPLC進(jìn)行的糖濃度的分析
[0338] 糖濃度的分析在以下的條件下使用HPLC進(jìn)行。此時(shí)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用葡萄糖、果 糖、蔗糖各50μΜ混合而成的標(biāo)準(zhǔn)液。
[0339] 分析柱：CarboPac ΡΑ1 (夕、< 才專夕只）
[0340] 洗脫液：100mM NaOH
[0341] 流量：lml/min
[0342] 進(jìn)樣量：25μ1
[0343] 檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器（夕、V才氺夕'ED40)
[0344] 4.分析結(jié)果
[0345] 將對(duì)于1.8中得到的擬南芥的排水液、2.13中得到稻的排水液測(cè)定糖濃度而得的 結(jié)果示于表20和21。

[0350]從表20和21可判定，用編碼SWEET蛋白質(zhì)的核酸中被分類為進(jìn)化枝III的編碼 At SWEET9~15的DNA、編碼Os SWEET 13~15的DNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的擬南芥和稻，排水液中的糖濃 度全部大幅提高。特別是用編碼At SWEET 11的DNA、編碼At SWEET 12的DNA、編碼At SWEET 15的 DNA、編碼OsSWEET13的DNA和編碼0sSWEET14的DNA的任一DNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的情況下，能夠更 大幅地提高排水液中的糖濃度。另外，判明與用被分類為進(jìn)化枝III的編碼SWEET蛋白質(zhì)的 DNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的擬南芥相比，用被分類為進(jìn)化枝III的編碼SWEET蛋白質(zhì)的DNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)化 的稻，排水液中的糖濃度提高。特別是判明了對(duì)稻轉(zhuǎn)化了編碼Os SWEET 13的DNA、編碼 0sSWEET14的DNA和編碼0sSWEET15的DNA的任一 DNA的情況下，與對(duì)擬南芥轉(zhuǎn)化了相同DNA的 情況下相比，排水液中的糖濃度顯著提高。
[0351] 另外，判明了在導(dǎo)入了具有共有序列1的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的人工基因的植 物體中，也同樣地能夠提高排水液中的糖濃度。由結(jié)果可知，通過導(dǎo)入編碼具有共有序列1 的參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白的核酸，和/或強(qiáng)化該蛋白質(zhì)的表達(dá)，能夠不限定宿主植物地，在 任何植物中提高排水液中的糖濃度。
[0352] 在野生型植物中，也有時(shí)根據(jù)個(gè)體不同而稀少地在排出液中檢測(cè)到50μΜ左右的 糖。但是如本實(shí)施例所示，導(dǎo)入編碼被分類為進(jìn)化枝III的SWEET蛋白質(zhì)的DNA的效果，明顯 遠(yuǎn)高于在野生型植物中檢測(cè)到的最大濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中，導(dǎo)入了編碼參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)的核酸， 和/或強(qiáng)化了該蛋白質(zhì)的表達(dá)，所述參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì)具有共有序列，所述共有 序列包含以下的氨基酸序列： (L/I/V/M/F)x(G/A)xx(I/L/V/M/F)xxxx(L/I/V/F)(A/S)(P/S)(l-3aa)(P/S/T/A)T(F/ L)xx(I/V)xxxKxxxxxxxxPYxxx(L/I)xxxx(L/I)x(I/L/M/V/F)xY(A/S/G)(7-13aa)(I/L/V/ Μ)(l-2aa)(I/V)Nxxxxxx(E/Q)xxYxxx(Y/F)xx(Y/F)(A/G/S)(35-36aa)(R/Q/H)xxxxGx(V/ I/L)xxxxx(V/M/L/I/F)xxxx(A/S/T)P(L/M)x(I/V)(I/M/V/L)(2-7aa)(V/I)(V/I/M)x(T/S) x(S/N)xx(F/Y)(M/L)(P/S)(F/I/V/L)xLSxx(L/I)(T/V)xx(A/G)xxff(F/L)xYGxxxxDxx(V/I) xxPNxxGxx(F/L)(G/S)xxQ(Μ/I)x(L/M/I/V/F)(Y/H/F)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是屬于作為基于SWEET蛋白質(zhì)的氨基酸序列的分類組的進(jìn)化枝I~V中的進(jìn)化枝III的蛋白 質(zhì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)， (a) 包含序列號(hào)15~137的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)， (b) 包含與序列號(hào)15~137的任一氨基酸序列有90%以上的同一性的氨基酸序列、且具 有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述共有序列包含以 下的氨基酸序列： G(L/I/V/F/M)xGx(I/V/L)(I/V/L)(S/T)xxxxL(A/S)P(L/V/I/M)(P/S/T/A)TFxx(I/V)x (K/R)xK(S/T)xxx(F/Y)x(S/A)xPYxx(A/S/T)LxSxxLx(L/I/M/V)(Y/F)Y(A/G)(7-9aa)(L/I) (I/V/L)(T/S)INxx(G/A)xx(I/V/M)(E/Q)xxYxxx(F/Y)(L/I/V/F)x(Y/F)Ax(K/R/N)xxxxx (T/A)(7-8aa)(V/F/L/I/M)(18-19aa)(R/Q/H)xxxxGx(I/V)xxxxx(V/I/L/M)x(V/M)F(A/V) (A/S/T)PLx(I/V)(I/M/V/L)xxV(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)x(F/Y)MP(F/I/L)xLS(L/ F/V)xL(T/V)(L/I)xAxxff(F/L)xYG(L/F)xxxDxx(V/1)xxPNxxGxx(L/F)(G/S)xxQMx(L/V/I) (Y/F)xx(Y/F)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)， (a) 包含序列號(hào)15~35的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)， (b) 包含與序列號(hào)15~35的任一氨基酸序列有90%以上的同一性的氨基酸序列、且具 有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述共有序列包含以 下的氨基酸序列： (A/V)xxxG(I/L/V)xGN(I/L/V)(I/L/V)S(F/L)x(V/T)xL(A/S)P(V/L/I)(P/A)TFxx(I/ V)x(K/R)xK(S/T)xx(G/S)(F/Y)(Q/S/E)SxPYxx(A/S/T)LxS(A/C/S)xLx(L/I/M)(Y/F)Y(A/ G)xx(K/T)(3-5aa)(L/M/P)(L/I)(I/L/V)(T/S)INxx(G/A)xx(I/V)(E/Q)xxY(I/L)x(L/M/V/ I)(F/Y)(L/I/V/F)x(Y/F)Ax(K/R)xxxxx(T/A)xx(L/M/F/V/I)(L/F/V/I)xxx(N/D)(F/V/I/ L)xx(F/L)xx(I/L/V)xxxxxx(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)xxxxGx(I/V)xxxx(S/A)(V/L/M)(C/S/A) VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(I/M/V)xxV(I/V)(K/R/Q)(T/S)(K/R)S(V/A)E(F/Y)MP(F/I)xLS(L/ F/V)xL(T/V)(L/I)(S/N)A(V/I)xff(F/L)xYGLxx(K/N)Dxx(V/I)xxPN(V/I)xGxx(F/L)(G/S) xxQMxL(Y/F)xx(Y/F)〇7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)， (a) 包含序列號(hào)15~26的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)， (b) 包含與序列號(hào)15~26的任一氨基酸序列有90%以上的同一性的氨基酸序列、且具 有參與糖運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的蛋白質(zhì)。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述共有序列包含以 下的氨基酸序列： (M/L/V)xx(T/K/N/S)xxxxAxxFG(L/I/V)LGN(I/L/V)(I/V)SFxVxL(S/A)P(V/I) PTFxxIxK(K/R)K(S/T)x(E/K)(G/S)(F/Y)(Q/E)S(I/L)PYxx(A/S)LxS(A/C)xLx(L/I/M)YY (A/G)xxK(4-5aa)(L/M)(L/I)(I/V)(T/S)IN(A/S/T)(F/V)(G/A)x(F/V)(I/V)(E/Q)xxY(I/ L)x(L/M/I)(F/Y)(F/V/I/L)x(Y/F)Ax(K/R)xx(R/K)xx(T/A)(L/V/M)K(V/L/M/F)(L/I/V/F) xxx(N/D)(F/V/I)xx(F/L)xx(I/L)(L/I/V/F)(L/M/V)(L/V)xx(F/L)(L/I/V)(5-6aa)(R/Q)x (K/S/Q)x(L/I/V)Gx(I/V)Cxxx(S/A)(V/L)(S/C/A)VF(A/V)(A/S)PLx(I/V)(M/I/V)xxV(I/ V)(K/R)T(K/R)S(V/A)E(Y/F)MPFxLS(L/F)xLT(I/L)(S/N)A(V/I)xff(L/F)xYGLx(L/I)(K/N) Dxx(V/I)A(L/F/I/M)PN(V/I)(L/I/V)Gxx(L/F)GxxQM(I/V)L(Y/F)(V/L/I/M)(V/L/I/M)(Y/ F)(K/R/Q)〇9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白質(zhì) 是以下的(a)或(b)的蛋白質(zhì)， (a) 包含序列號(hào)15~21的任一氨基酸序列的蛋白質(zhì)， (b) 包含與序列號(hào)15~21的任一氨基酸序列有90%以上的同一性的氨基酸序列的蛋白 質(zhì)。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，是顯花植物。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述顯花植物是被 子植物。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述被子植物是單 子葉植物。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述單子葉植物是 禾本科植物。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述禾本科植物是 稻屬(Oryza)植物。15. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述被子植物是雙 子葉植物。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述雙子葉植物是 十字花科植物。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其特征在于，所述十字花科植物 是擬南芥屬(Arabidopsis)植物。18. 溢泌物的制造方法，包括栽培權(quán)利要求1~17的任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化植物，從該轉(zhuǎn)化 植物采集溢泌物的工序。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的溢泌物的制造方法，其特征在于，將栽培所述轉(zhuǎn)化植物的栽 培條件設(shè)置為相對(duì)濕度80 % RH以上。20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的溢泌物的制造方法，其特征在于，所述溢泌物是排水液。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK105848471SQ201480070912
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2014年12月25日
【發(fā)明人】大音德, 米倉(cāng)円佳, 青木直大, 大杉立, 廣瀨龍郎
【申請(qǐng)人】豐田自動(dòng)車株式會(huì)社, 國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué), 國(guó)立研究開發(fā)法人農(nóng)業(yè)·食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究機(jī)構(gòu)