一種控制殺滅火蟻的方法及驅(qū)蟲劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種以火蟻的HsTRPA-SiHsTRPA 為靶標(biāo)控制殺滅火蟻的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 火蟻(Solenopsis invicta)是一種入侵物種，原產(chǎn)于南美洲。它極具破壞性，并且 傳播廣泛?，F(xiàn)已在已在包括美國(guó)，澳大利亞，新西蘭，臺(tái)灣地區(qū)和中國(guó)大陸的許多國(guó)家和地 區(qū)中發(fā)現(xiàn)火蟻。由于世界貿(mào)易的發(fā)展，火蟻很可能進(jìn)一步傳播到其他國(guó)家?；鹣伒娜肭挚赡?帶來以下影響：（1)削減本區(qū)域種多樣化甚至本地物種滅絕，（2)造成農(nóng)作物減產(chǎn)，（3)火蟻 種群可在陸地和建筑物中大量繁殖并且叮咬人類，從而嚴(yán)重影響人類活動(dòng)。
[0003] 現(xiàn)有的火蟻控制方法包括使用殺蟲劑(例如:氯吡硫磷和氟苯脲)和一些生物控制 法(例如使用蚤蠅和病原霉菌）。然而，這些防治方法并不是特別的針對(duì)火蟻;而且殺蟲劑可 以廣泛的殺滅所有昆蟲，因而會(huì)破壞生態(tài)系統(tǒng)。
[0004]人們迫切的需要一種化合物既能特異有效的控制火蟻，又對(duì)環(huán)境和其他生物特別 是人類無害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的第一方面問題在于克服現(xiàn)有殺滅火蟻的方法對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的危 害性，提供一種特異性的殺滅火蟻、對(duì)其他物種無害的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種控制殺滅火蟻的方法，以火蟻的HsTRPA-SiHs TRPA為靶標(biāo)控制殺滅火蟻的方法。
[0007] 本發(fā)明的一優(yōu)選技術(shù)方案中，以癸酸作用于火蟻的HsTRPA-SiHsTRPA為靶標(biāo)控制 殺滅火蟻。
[0008] 本發(fā)明優(yōu)選技術(shù)方案中，所述癸酸濃度2 0.2mM，優(yōu)選為0.2mM <癸酸濃度< ImM， 更優(yōu)選為〇. 2mM <癸酸濃度< 0.5mM。
[0009] 本發(fā)明優(yōu)選技術(shù)方案中，所述火蟻指火蟻屬，包括五個(gè)種:紅火蟻、熱帶火蟻、木火 蟻、黑火蟻、巴西火蟻。
[0010] 本發(fā)明的第二方面，提供控制殺滅蟻類的驅(qū)蟲劑，其特征在于，其包含以火蟻的 Hs TRPA-SiHs TRPA為靶標(biāo)進(jìn)行作用的癸酸。
[0011 ] 本發(fā)明優(yōu)選技術(shù)方案中，所述癸酸濃度20.2mM，優(yōu)選為0.2mM ^癸酸濃度， 更優(yōu)選為〇. 2mM <癸酸濃度< 0.5mM。
[0012] 本發(fā)明優(yōu)選技術(shù)方案中，所述火蟻指火蟻屬，包括五個(gè)種:紅火蟻、熱帶火蟻、木火 蟻、黑火蟻、巴西火蟻。
[0013] 本發(fā)明的第三方面提供上述的驅(qū)蟲劑用于以HsTRPA-SiHsTRPA靶標(biāo)控制殺滅火 蟻。其中，所述癸酸濃度2 〇. 2mM，優(yōu)選為0.2mM <癸酸濃度< ImM，更優(yōu)選為0.2mM <癸酸濃 度仝0.5mM。
[0014]火蟻，是指膜翅目，蟻科，火蟻?zhàn)?，火蟻?Solenopsis Westwood)?；鹣仯瑒t指被其 蜇傷后會(huì)出現(xiàn)火灼感的螞蟻。火蟻在中國(guó)主要包括五個(gè)種:紅火蟻、熱帶火蟻、木火蟻、黑火 蟻、巴西火蟻。紅火蟻分布廣泛，為極具破壞力入侵生物之一。在中國(guó)紅火蟻是入侵生物。
[0015] 本發(fā)明中的"控制"是指對(duì)火蟻具有驅(qū)逐效果，導(dǎo)致其對(duì)傷害性刺激產(chǎn)生回避行 為。
[0016] 為了尋找合適的殺蟲劑，發(fā)明人對(duì)瞬時(shí)受體電位(TRP)A通道進(jìn)行研究，這個(gè)離子 通道還從未做為一個(gè)靶標(biāo)用來研發(fā)針對(duì)蟻類的驅(qū)蟲劑。一些TRPA通道（陽離子交換）功能 nocisensors昆蟲導(dǎo)致回避行為對(duì)傷害性刺激。目前的驅(qū)蟲劑作為激活味覺或嗅覺受體配 體誘導(dǎo)的避稅行為。這些受體是G蛋白偶聯(lián)受體激活細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，因而他們的功能是 不同的TRP通道。我們篩選植物天然化合物能夠激活火螞蟻hstrpa信道識(shí)別潛在的螞蟻驅(qū) 蟲劑。這些化合物可以用來控制的螞蟻，其他昆蟲和環(huán)境的影響最小。
【附圖說明】
[0017] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：
[0018] 圖1為將10個(gè)火蟻防置在培養(yǎng)皿的中線處。中線左右兩邊濾紙被分別被20%DMS0 和ImM癸酸浸濕。測(cè)試時(shí)間為20分鐘，每2分鐘統(tǒng)計(jì)分布在中線兩邊濾紙上的火蟻數(shù)量。在對(duì) 照組中，線左右兩邊濾紙被都被20%DMS0浸濕。我們通過(DMS0浸濕濾紙上的火蟻數(shù)量-癸 酸浸濕濾紙上的火蟻數(shù)量)/總火蟻數(shù)量。
[0019] 圖2為計(jì)算試驗(yàn)在不同癸酸濃度時(shí)的回避系數(shù)。誤差線（土SEM)的計(jì)算是通過試驗(yàn) 在不同癸酸濃度時(shí)的回避系數(shù)。癸酸的濃度在〇. 03，0.2，0.5，and lmM(**)時(shí)P值(AN0VA)分 別為〈0 · 000004，〈0 · 002，〈0 · 00001，and〈0 · 000002。癸酸的濃度在0 · 03 時(shí)會(huì)吸引火蟻。
[0020] 圖3顯示了6種化合物的鈣離子成像法圖譜;其中，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞內(nèi) 鈣離子熒光指示劑fura-2的熒光強(qiáng)度在化合物流入腔膛期間與未流入時(shí)的比值?；衔锩?稱下面的橫線表示化合物流入腔膛所跨越的時(shí)間。其中測(cè)試的化合物，圖3A為1-辛醛，3B 為壬醛，3C為辛酸，3D為癸酸，3E為月桂酸，3F為3，7-二甲基-6-辛烯醛。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指 出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論 述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。
[0022] 本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)火蟻采集于廣州華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校區(qū)內(nèi)及野外。
[0023] 結(jié)合附圖，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步具體描述：
[0024] 實(shí)施例1趨向性試驗(yàn)
[0025] 將10只火蟻防置在培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿劃了一中線將其面積分為均等兩份。在該中 線左右兩邊放置濾紙，實(shí)驗(yàn)組中，濾紙分別被20%DMS0和ImM癸酸浸濕;對(duì)照組中，中線左右 兩邊濾紙都被20 % DMSO浸濕。將10只火蟻防置在培養(yǎng)皿的中線處。
[0026]測(cè)試時(shí)間為20分鐘，每2分鐘統(tǒng)計(jì)分布在中線兩邊濾紙上的火蟻數(shù)量。通過(DMS0 浸濕濾紙上的火蟻數(shù)量-癸酸浸濕濾紙上的火蟻數(shù)量)/總火蟻數(shù)量進(jìn)行計(jì)算。
[0027]圖2為計(jì)算試驗(yàn)在不同癸酸濃度時(shí)的回避系數(shù)。誤差線（土SEM)的計(jì)算是通過試驗(yàn) 在不同癸酸濃度時(shí)的回避系數(shù)。癸酸的濃度在0.03，0.2，0.5，and lmM(**)時(shí)P值(ANOVA)分 別為〈0 · 000004，〈0 · 002，〈0 · 00001，and〈0 · 000002。癸酸的濃度在0 · 03 時(shí)會(huì)吸引火蟻。
[0028]實(shí)施例2鈣離子成像試驗(yàn)
[0029] 2.1提取火蟻總RNA
[0030] 根據(jù)廠家說明用試劑盒TriZOI (Invitrogen公司）提取火蟻總RNA:將火蟻在 Trizol中裂解，反復(fù)震蕩，然后加入氯仿，上層水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加 0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15~30°C)放置10分鐘后，12000g(2~8°C)離心10 分鐘。去上清液后，讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥。
[0031] 2.2火蟻全長(zhǎng)SiHs TRPA的制備
[0032] 從NCBIs數(shù)據(jù)庫中獲得部分火蟻SiHsTRPA序列，然后由5'RACE(5'-FulI RACE試劑 盒，日本TAKARA公司）和3 ' RACE(SMARTer RACE試劑盒，Clontech公司）獲得全長(zhǎng)SiHsTRPA序 列。
[0033] 5RACE引物：
[0034] 5'-1外部引物（第一次PCR) :5，-GCGGATAATCCTTCGCTGCATAAGTGC-3,，（Seq ID No. I)
[0035] No. 2)
[0036] 3RACE引物：
[0037] 3'-1外部引物（第一次PCR) :5，-CCCTCGTCTGCGAATGACGACATCAAT-3,，（Seq ID No. 3)
[0038] 3'-2內(nèi)部引物（第二次卩〇0:5，-6〇6八1^八〇6〇：61'1766(^6八八八〇八1'(：-3，，（56110 No. 4)
[0039] 經(jīng)過兩輪PCT后，最后得到火蟻的SiHsTRPA全長(zhǎng)序列，如Seq ID No.5所示。
[0040] 2.3質(zhì)粒構(gòu)建
[0041 ] 根據(jù)已獲得全長(zhǎng)序列可以在NCBI ORF Finder網(wǎng)（http:// www.ncbi .111111.11；[11.80￥/^0奸/)進(jìn)行0(18區(qū)域判斷。然后在所判斷起始子的上游和終子的下 游處設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行PCR。由于PCR引物帶有Not I和Xba I的酶切點(diǎn)。SiHsTRPA被內(nèi)切酶 Not I和RcoRI (Themal)酶切后克隆到Ac5 · l/V5_His B載體（Invitrogen公司）中。這里， Ac5.1/V5-His B載體的果蠅肌蛋白5C啟動(dòng)子已經(jīng)被換為CMV啟動(dòng)子。
[0042] PCR引物，正向：
[0043] 5'-TGAATTCACCATGTGTGAGAATGATAAAGATTCGTTAGG-3',(Seq ID No.6)
[0044] PCR引物，逆向：
[0045] 5/-AATTTGCGGCCGCCCTATAATGAGGTATTTTCTTCTTTCGCCAA-3 / .(Seq ID No.7)
[0046] 2.4鈣離子成像
[0047]撫育在蓋薄片上的HEK293(InVitr〇gen公司）細(xì)胞被所構(gòu)建的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后加 入Dsred作為轉(zhuǎn)染指示劑。Dsred可以指示被TRPAl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以便在鈣項(xiàng)試驗(yàn)，只測(cè)試被 TRPAl轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
[0048]在鈣離子成像試驗(yàn)前的1-2小時(shí)添加細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光指示劑fura-2 (Invitrogen)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將覆蓋有細(xì)胞的蓋薄片置于連接到重力流動(dòng)系統(tǒng)（RC-26G，Warner Instruments Inc. ,Hamden,CT)的腔膛內(nèi)。用CCD照相機(jī)（CoolSNAP ES,Roper scientific photometries , Tucson ,AZ)在340和380nm下檢測(cè)螢光。最后用IPlab軟件（Scanalytics Inc .Rockvi I Ie ,MD)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0049]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)例的限制，上述實(shí)例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明 的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和 改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同 物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種控制殺滅火蟻的方法，其特征在于，以火蟻的HsTRPA-SiHsTRPA為靶標(biāo)控制殺滅 火蟻。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以癸酸作用于火蟻的HsTRPA(SiHsTRPA)靶 標(biāo)控制殺滅火蟻。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述癸酸濃度為20.2mM。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述癸酸濃度為:0.2mM<癸酸濃度<ImM。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述火蟻指火蟻屬，包括五個(gè)種:紅火蟻、 熱帶火蟻、木火蟻、黑火蟻、巴西火蟻。6. -種控制殺滅蟻類的驅(qū)蟲劑，其特征在于，其包含以火蟻的HsTRPA-SiHsTRPA為靶標(biāo) 進(jìn)行作用的癸酸。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的驅(qū)蟲劑，其特征在于，所述癸酸濃度為20.2mM。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的驅(qū)蟲劑，其特征在于，所述癸酸濃度為：0.2mM《癸酸濃度< lmM〇9. 如權(quán)利要求6所述的驅(qū)蟲劑用于以HsTRPA-SiHsTRPA靶標(biāo)控制殺滅火蟻。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，癸酸濃度為20.2mM。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種以火蟻的HsTRPA-SiHsTRPA為靶標(biāo)控制殺滅火蟻的方法，具體而言，以癸酸作用于火蟻的HsTRPA(SiHsTRPA)靶標(biāo)控制殺滅火蟻，且所述癸酸濃度為≥0.2mM。本發(fā)明還公開了一種控制殺滅蟻類的驅(qū)蟲劑，其包含癸酸，所述癸酸濃度為≥0.2mM，優(yōu)選為0.2mM≤癸酸濃度為≤1mM。本發(fā)明選用植物天然化合物能夠激活火螞蟻hstrpa信道識(shí)別潛在的螞蟻驅(qū)蟲劑。這些化合物可以用來控制的螞蟻，其他昆蟲和環(huán)境的影響最小。
【IPC分類】A01P7/04, A01P17/00, A01N37/02
【公開號(hào)】CN105432613
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510760506
【發(fā)明人】門脅辰彥, 董曉峰, 彭廣大, 許益鐫, 加塩麻紀(jì)子, 富永真琴
【申請(qǐng)人】西交利物浦大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2015年11月10日