建立可應(yīng)用于人類疾病研究的雪貂模型的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種雪貂促排卵技術(shù)和一種雪貂體外受精技 術(shù)，W及基于上述方面的利用CRISPR/tas9的技術(shù)建立雪貂模型的方法，所述方法可應(yīng)用 于系統(tǒng)研究人類疾病。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腦是人類控制認(rèn)知、記憶、情感和活動(dòng)的功能器官，某些與大腦發(fā)育相關(guān)基因的 缺失或突變直接導(dǎo)致神經(jīng)疾病的發(fā)生。高等哺乳動(dòng)物的大腦皮層具有溝和回的結(jié)構(gòu)，運(yùn)一 結(jié)構(gòu)大大的增加了大腦皮層的表面積，研究表明運(yùn)與高級認(rèn)知等大腦功能密切相關(guān)。
[0003] 雪貂作為新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于呼吸道疾病等的研究，但是并沒有 在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中普遍應(yīng)用。雖然雪貂不屬于靈長類動(dòng)物，但是它與平滑腦的小鼠相比，雪 貂的大腦具有溝和回的結(jié)構(gòu)，并且是有社會(huì)性的動(dòng)物，因此，應(yīng)用雪貂作為模式動(dòng)物，研究 直接大腦發(fā)育型疾病W及精神類疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床治療等，具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。此 夕F，雪貂還具有體形小、易飼養(yǎng)、繁殖周期短、一胎多盧的優(yōu)點(diǎn)，是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī) 理的首選模式動(dòng)物。
[0004] 雪貂之所W沒有被神經(jīng)科學(xué)研究廣泛應(yīng)用，其中主要原因是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物無法實(shí) 現(xiàn)。隨著CRISPR/tas9技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備變得相對簡便[1，2]。
[0005] CRISPR/tas9運(yùn)一編輯基因的技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種物種，包括小鼠、大鼠、 猴等。W小鼠為例，主要實(shí)驗(yàn)過程如圖1所示，將一個(gè)或者多個(gè)sgRNA(單向?qū)NA)和 化s9mRNA注射到受精卵里，sgRNA介導(dǎo)化s9核酸酶在小鼠受精卵的特定基因組位點(diǎn)上進(jìn)行 切割、修復(fù)，導(dǎo)致基因被改變。
[0006] 由于雪貂作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并沒有被廣泛應(yīng)用，鮮有關(guān)于轉(zhuǎn)基因雪貂的報(bào)道。雪貂作 為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的馴化和飼養(yǎng)條件要求比較嚴(yán)苛，而且生殖周期等生理習(xí)性并沒有非常詳盡 的研究資料，目前已經(jīng)報(bào)道的唯一一例轉(zhuǎn)基因雪貂，是通過病毒結(jié)合核移植的方法獲得的 巧，4]，主要方法過程如圖2所示。正常的雪貂體細(xì)胞經(jīng)過定向基因修飾變?yōu)楦淖冞z傳學(xué)特 性的修飾后體細(xì)胞，然后在成熟的雪貂卵母細(xì)胞中通過顯微操作的方法用修飾后的體細(xì)胞 的細(xì)胞核替換卵母細(xì)胞的細(xì)胞核。核移植后的卵母細(xì)胞經(jīng)過發(fā)育，胚胎的基因就可W得到 相應(yīng)的改變。
[0007] 然而，一方面，CRISPR/tas9作為新興的技術(shù)，從未應(yīng)用于雪貂運(yùn)種模式動(dòng)物；另 一方面，病毒結(jié)合體細(xì)胞核移植的方法比較復(fù)雜，操作性不高，效率低下，只有1-3%，而 且使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物有可能帶上病毒的風(fēng)險(xiǎn)，此外，目前已經(jīng)報(bào)道的雪貂的超排方案是針對 Marshall化rret的，用于Angora化rret超排效率非常低，卵子不成熟，且無法做到雪貂的 體外受精，無法滿足高效制備轉(zhuǎn)基因雪貂的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中建立可應(yīng)用于人類疾病研究的雪貂模型的方法的不足，一 方面提供一種雪貂促排卵技術(shù)和一種雪貂體外受精技術(shù)，另一方面，在上述基礎(chǔ)上，利用CRISPR/tas9的技術(shù)，W3種基因（運(yùn)S個(gè)基因都與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)，一個(gè)是平滑腦癥、一 個(gè)是頭小崎形癥、一個(gè)是精神分裂癥）為例，建立可應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的雪貂模型 的方法，并將其用于相關(guān)疾病的致病機(jī)理研究，相關(guān)藥物的篩選和安全性評價(jià)，W及臨床手 術(shù)治療研究的模式動(dòng)物。
[0009] 本發(fā)明首次應(yīng)用PMSG，F(xiàn)甜和HCG聯(lián)合超排卵方法結(jié)合體外受精技術(shù)，使得轉(zhuǎn)基 因雪貂的制備工作可W在盡量少的耗損實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的基礎(chǔ)上順利開展。在取得的雪貂受精卵 中，本發(fā)明首次應(yīng)用CRISPR/tas9技術(shù)，對受精卵的特定的與神經(jīng)系統(tǒng)疾病直接相關(guān)的基 因，包括化X，Aspm，Disci進(jìn)行編輯，從而最終導(dǎo)致運(yùn)S個(gè)基因突變，無法正常行使該基因 的生物學(xué)功能，獲得類似于人類由于運(yùn)=個(gè)基因突變而導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
[0010] 具體而言，本發(fā)明包括W下方面：
[00川 1. 一種促進(jìn)雪貂排卵的方法，所述方法使用PMSG(Pre即antMareSerum Gonadotropin)、FSH(FoilitropinAlfa)和HCG化umanChorionicGonadotropin)耳關(guān)合進(jìn) 行。
[001引 2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的方法，所述方法包括W下步驟：
[0013] 1)給母貂腹腔注射PMSG，優(yōu)選注射200-300單位，更優(yōu)選300單位；
[0014] 2) 24-48小時(shí)后，肌肉注射第一針FSH，此后連續(xù)注射8-10天FSH，每次的F甜注射 量優(yōu)選為5-10單位，更優(yōu)選為10單位；
[0015] 3)如果外陰腫脹，顏色由紅變白則腹腔注射HCG，HCG的注射量優(yōu)選為200-300單 位，更優(yōu)選為300單位；
[0016] 4)取卵，取卵時(shí)間優(yōu)選在HCG注射后40-48小時(shí)，更優(yōu)選為HCG注射后48小時(shí)。
[0017] 3.根據(jù)第2項(xiàng)所述的方法，第1)步和第2)步之間間隔48小時(shí)。
[001引 4.根據(jù)第2項(xiàng)所述的方法，F(xiàn)甜的注射為每天兩次，間隔12小時(shí)。
[0019] 5. -種雪貂體外授精方法，所述方法包括：
[0020] 1)取卵：手術(shù)取得雪貂的輸卵管，用預(yù)熱的肥ZB培養(yǎng)液經(jīng)輸卵管傘口沖出卵丘卵 母細(xì)胞復(fù)合體，用透明質(zhì)酸酶消化成無卵丘細(xì)胞的單個(gè)卵母細(xì)胞，放入38. 5°C，5%C〇2預(yù)平 衡3小時(shí)的IVF培養(yǎng)滴中備用；
[0021] 2)體外受精：將公貂經(jīng)附睪尾取出精液馬上放入步驟1)中獲得的含有卵母細(xì)胞 的IVF培養(yǎng)滴中，共解育，完成體外受精。
[002引 6.根據(jù)第5項(xiàng)所述的方法，所述共解育時(shí)間為3-4小時(shí)。
[0023] 7.根據(jù)第5項(xiàng)所述的方法，所述肥ZB培養(yǎng)液的組成為：81. 62mM氯化鋼，4. 83mM 氯化鐘，1. 18mM憐酸二氨鐘，1. 18mM硫酸儀，5mM碳酸氨鋼，1. 7mM二水合氯化巧，31. 3mM 乳酸鋼，0. 27mM丙酬酸鋼，20mMH巧es,ImM谷氨酷胺，0.ImM邸TA2化，5. 5mM葡萄 糖，0. 007%PVA，1N鹽酸。
[0024] 8. -種建立雪貂模型的方法，所述方法包括W下步驟：
[0025] 1)針對目的基因設(shè)計(jì)sgRNA單向?qū)NA序列，并體外轉(zhuǎn)錄CAS9mRNA和sgRNA序 列；
[0026] 2)根據(jù)1-4任一項(xiàng)所述的方法促雪貂排卵；
[0027] 3)根據(jù)5-7任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)行雪貂體外受精；
[0028] 4)將步驟1)獲得的化s9mRNA和目的基因的sgRNA顯微注射入受精卵；
[0029] 5)將步驟4)獲得的受精卵移植入受體進(jìn)行妊娠；
[0030] 6)鑒定子代轉(zhuǎn)基因雪貂。
[003。 9.根據(jù)第8項(xiàng)所述的方法，所述目的基因選自Aspm,Dcx,Disci。
[0032] 10.根據(jù)第8或9項(xiàng)所述的方法用于相關(guān)人類疾病研究及針對人類疾病的藥物篩 選和/或安全性評價(jià)方面的用途。
[0033] 本發(fā)明首次使用PMSG，F(xiàn)甜和HCG聯(lián)合促排卵，排卵穩(wěn)定高效，達(dá)到25-35枚/ 只。而現(xiàn)有技術(shù)中僅有的可參考的超排方案是使用PMSG和HCG聯(lián)合超排方案，效率低，卵 不成熟。此外，本發(fā)明首次使用雪貂的體外受精而不需要體外獲能。另外本發(fā)明首次應(yīng)用 CRISPR/tas9技術(shù)制備的轉(zhuǎn)基因雪貂，相比之前唯一一例應(yīng)用病毒結(jié)合體細(xì)胞核移植的方 法，效率提高很多，可W達(dá)到80%左右，并且沒有病毒危害性。本發(fā)明的模型可W例如模擬 人由于Dcx基因突變或者Aspm基因突變引起的神經(jīng)疾病，成為最為合適的疾病模式動(dòng)物。 而之前已有的化X突變小鼠模型，因小鼠的大腦沒有溝回，故不能復(fù)制人的疾病表型。
【附圖說明】
[0034] 圖1.應(yīng)用CRISPR/tas9技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因小鼠示意圖。
[0035] 圖2.通過基因編輯體細(xì)胞核結(jié)合核移植的方法改變胚胎基因組的示意圖。圖 3.sgRNA的設(shè)計(jì)，其中對于每個(gè)基因設(shè)計(jì)了 2個(gè)sgRNA,其中灰色帶下劃線的GGT/GGA/GGG/ GGC序列為Protospacer-adjacentmotif(PAM)，其余灰色不帶下劃線的為基因干擾革己序 列。
[0036] 圖4.S個(gè)不同品系的轉(zhuǎn)基因雪貂經(jīng)過T7EN1酶切鑒定，可W被酶切的是基因突變 雪貂，被星號標(biāo)出。
[0037] 圖5.S個(gè)不同品系的轉(zhuǎn)基因雪貂經(jīng)過測序分析具體的基因突變位點(diǎn)。與野生型 比較，刪除的堿基用點(diǎn)表示，增加的堿基用小寫字母標(biāo)注。同時(shí)，括號內(nèi)表示缺失了或者增 加了幾個(gè)堿基，W及運(yùn)種類型的結(jié)果在20個(gè)檢測中所占數(shù)量。
[0038] 圖6.Dcx轉(zhuǎn)基因雪貂的大腦結(jié)構(gòu)改變。轉(zhuǎn)基因雪貂大腦皮層變薄、溝回變少、腦室 變大。
[0039] 圖7.Aspm轉(zhuǎn)基因雪貂的大腦結(jié)構(gòu)改變。轉(zhuǎn)基因雪貂大腦變小、溝回變淺。
【具體實(shí)施方式】
[0040] 實(shí)施例1.CRISPR/化s9祀向修飾基因載體構(gòu)建和體外轉(zhuǎn)錄
[0041] 1)SgRNA轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建：針對雪貂Aspm(GenBankAccession No:XM_004756200) ,Dcx(GenBankAccessionNo:XM_004769082),Disci(GenBank AccessionN〇:XM_013047589)S個(gè)基因，設(shè)計(jì)了特異的SgRNA序列（圖3)，具體序列參見 表1。
[0042] 表 1
[0043]
[0044] 每2條單鏈核酸序列（表2)退火形成雙鏈DNA，雙鏈DNA連接到 px330(Addgene，42230)載體中。
[0045] 表2.sgRNA克隆引物序列
[0046]
[0047] 2)化s9和SgRNA體外轉(zhuǎn)錄：利用表3中的引物將T7轉(zhuǎn)錄子通過PCR方法加入到 化s9和SgRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，化s9序列和參考文獻(xiàn)凹中一致，PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收凈化， 用mMESSAGEmMACHI肥T7ULTRA試劑盒化ifeTechnologies)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 Cas9mRNA和SgRNA用MEGAclear試劑盒化ifeTechnologies)純化并測量濃度。
[004引表3.連接T7轉(zhuǎn)錄子引物 [0049]
[0050] 實(shí)施例2.雪貂促排卵
[0051] 選擇2-3歲，體重1. 5-2KG，3周左右未發(fā)情經(jīng)產(chǎn)母貂，腹腔注射300單位 PMSG(Pre即antMareSerumGonadotropin)(寧波S生藥業(yè)），48小時(shí)后肌肉注射第一針 FSHO^ollitropinAlfa)(MerckSerono) 10單位，此后連續(xù)注射10天，每天兩次，間隔12小 時(shí)，每次10單位，在注射FSH后持續(xù)觀察雪貂發(fā)情情況，如果發(fā)情，則腹腔注射300單位 HCG(HumanQiorionicGonadotropin