快速生長人參細胞株及其大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥人參組織培養(yǎng)領(lǐng)域，涉及一種快速生長人參細胞株及其大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人參(Panax ginseng C.A.Mey)，屬五加科人參屬植物，是著名的藥用植物，主要分布在中國東北、韓國和日本。人參的次級代謝產(chǎn)物人參皂苷，具有廣泛的生理和藥理活性，包括免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗應(yīng)激、降血糖、抗炎、抗氧化及抗癌等作用。人參的藥用價值被世界廣泛關(guān)注，近年來隨著人參等中藥產(chǎn)業(yè)化的推進，人參單體皂苷生物活性和藥理作用研究的逐步深入，對人參皂苷的需求量顯著增加，據(jù)估計，世界每年僅銷售各種人參未成品就達10億多美元。人工栽培的人參，生長周期長(約6年左右)，繁殖系數(shù)低，不能連作(種植過人參的土壤20-30年內(nèi)難以再利用)，且對土壤環(huán)境要求嚴(yán)格。由于這些問題，使人參藥用產(chǎn)業(yè)陷入兩難境地。人參組織培養(yǎng)技術(shù)具有不受自然環(huán)境影響、無重金屬和農(nóng)藥殘留、培養(yǎng)周期短等特點，且重復(fù)性好，誘導(dǎo)率高，操作簡單，更易于進行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，具有很好的發(fā)展前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種快速生長人參細胞株及其大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，該方法操作簡單快速，可重復(fù)性好，可以提供安全、質(zhì)量均一的培養(yǎng)物。
[0004]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0005]—種快速生長人參細胞株及其大規(guī)模繼代培養(yǎng)的方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一、人參愈傷組織誘導(dǎo):
[0007]在超凈工作臺中用70-95%的酒精清洗整株人參40-60秒，再用無菌水沖洗人參2-4次，用2-5 %的次氯酸鈉溶液將沖洗過的人參完全浸泡12-20分鐘，再用無菌水沖洗3_6次，將人參放在無菌濾紙上吸干其表面水分；用滅過菌的接種刀將人參切成約0.2-0.5cm厚0.7-1.5cm2的小塊接種到準(zhǔn)備好的上，在22-28°C的條件下避光培養(yǎng)4_5周，可見愈傷組織的形成。
[0008]本步驟中，所述固體培養(yǎng)基為含有0.5-2mg/L 2，4_D、0.5-1.5mg/L6_BA和30-40g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基，pH = 5.5-6.5，在121°C、0.IMPa的壓力下滅菌15-30分鐘備用。
[0009]步驟二、人參愈傷組織的擴增及繼代培養(yǎng):
[0010]將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種在準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基上，在溫度22-28°C的條件下避光培養(yǎng)4-5周。
[0011]本步驟中，所述固體培養(yǎng)基為含有0.5-2mg/L 2，4_D、0.5-1.5mg/L6_BA和30-40g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基，pH = 5.5-6.5，在121°C、0.IMPa的壓力下滅菌15-30分鐘備用。
[0012]步驟三、人參不定根的誘導(dǎo):
[0013]將繼代培養(yǎng)后的愈傷組織接種在準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基上，在溫度為22-28°C的條件下避光培養(yǎng)2個4-5周，第I個4-5周后經(jīng)過一次轉(zhuǎn)板，誘導(dǎo)得到人參不定根，并觀察記錄誘導(dǎo)出的人參不定根日期。
[0014]本步驟中，所述固體培養(yǎng)基為含有2.0-7.0mg/L IBA和30_40g/L蔗糖的B5固體培養(yǎng)基，pH = 5.5-6.5，在121 °C、0.1MPa的壓力下滅菌15-30分鐘備用。
[0015]步驟四、快速生長人參細胞株的初篩:
[0016]根據(jù)人參不定根生根日期，選擇粗細均勻的先誘導(dǎo)出的不定根切成長度相等的片段，接種在準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基上，在溫度為22-28°C的條件下避光培養(yǎng)4-5周，每天觀察記錄其生長情況，初篩生長速度快的細胞株。
[0017]本步驟中，所述固體培養(yǎng)基為含有2.0-7.0mg/L IBA和30_40g/L蔗糖的B5固體培養(yǎng)基，pH = 5.5-6.5，在121 °C、0.1MPa的壓力下滅菌15-30分鐘備用。
[0018]步驟五、一株快速生長人參細胞株的篩選:
[0019]將初篩的細胞株選擇粗細均勻的不定根切成長度相等的片段，接種在準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基上，在溫度為22_28°C的條件下避光培養(yǎng)4-5周，篩選出一株生長速度最快的細胞株。
[0020]本步驟中，所述固體培養(yǎng)基為含有2.0-7.0mg/L IBA和30_40g/L蔗糖的B5固體培養(yǎng)基，pH = 5.5-6.5，在121 °C、0.1MPa的壓力下滅菌15-30分鐘備用。
[0021]步驟六、一株快速生長人參細胞株的大規(guī)模繼代培養(yǎng):
[0022]將篩選出的一株快速生長人參細胞株不定根接種在液體培養(yǎng)基中，在溫度為22-28°C的條件下避光培養(yǎng)4-5周，從250ml小搖瓶經(jīng)過IL大搖瓶、20L氣升式反應(yīng)器逐級擴大繼代培養(yǎng)。
[0023]本步驟中，所述液體培養(yǎng)基為含有1.0-5.0mg/L IBA和30_40g/L蔗糖的SH液體培養(yǎng)基，pH = 5.5-6.5，在121 °C、0.1MPa的壓力下滅菌15-40分鐘備用。
[0024]本發(fā)明利用組織培養(yǎng)方法篩選快速生長人參不定根細胞株，并對此細胞株不定根進行逐級放大的大規(guī)模繼代培養(yǎng)，比人參細胞培養(yǎng)更具有實際意義，不但其生長速率快，而且其活性次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)率高且比較穩(wěn)定，同時不受自然環(huán)境環(huán)境影響，具有操作工藝簡單、重復(fù)性好、誘導(dǎo)率高、增殖速度快等特點。
【附圖說明】
[0025]圖1為人參愈傷組織誘導(dǎo)；
[0026]圖2為人參愈傷組織誘導(dǎo)不定根；
[0027]圖3為快速生長人參細胞株篩選；
[0028]圖4為250ml搖瓶人參不定根擴繁培養(yǎng)；
[0029]圖5為IL搖瓶人參不定根擴繁培養(yǎng)；
[0030]圖6為20L氣升式反應(yīng)器人參不定根擴繁培養(yǎng)。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍中。
[0032]實施例1:
[0033]步驟一、人參愈傷組織誘導(dǎo):
[0034]用2mol/L 的 HCl 和 NaOH 溶液將 IL 含有 1.5mg/L 2，4-D、1.0mg/L 6-BA 和 30g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌20分鐘備用；在超凈工作臺內(nèi)將國家參茸產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心鑒定的二等野山參的新鮮根用95%的酒精清洗整個人參60秒，再用無菌水沖洗人參2次，用2%的次氯酸鈉溶液將沖洗過的人參完全浸泡13分鐘，再用無菌水沖洗4次，將人參放在無菌濾紙上吸干其表面的水分；用滅過菌的接種刀將人參切成約0.3cm厚Icm2的小塊接種到準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基上，在23°C的條件下避光培養(yǎng)5周，可見愈傷組織的形成(圖1)。
[0035]步驟二、人參愈傷組織的擴增及繼代培養(yǎng):
[0036]用2mol/L 的 HCl 和 NaOH 溶液將 IL 含有 1.5mg/L2，4-D、1.0mg/L6_BA 和 30g/L 蔗糖的MS固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌20分鐘備用；選擇生長狀態(tài)良好的愈傷組織，用滅過菌的手術(shù)刀和鑷子接種到準(zhǔn)備好的MS固體培養(yǎng)基上，在23°C的條件下避光培養(yǎng)5周，進行愈傷組織擴增和繼代培養(yǎng)。
[0037]步驟三、人參不定根的誘導(dǎo):
[0038]用2mol/L的HCl和NaOH溶液將IL含有3.0mg/L IBA和30g/L蔗糖的B5固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌20分鐘備用；選擇生長狀態(tài)良好的愈傷組織，用滅過菌的手術(shù)刀和鑷子接種到準(zhǔn)備好的B5固體培養(yǎng)基上，在23°C的條件下避光培養(yǎng)2個5周，第I個5周后經(jīng)過一次轉(zhuǎn)板，誘導(dǎo)得到人參不定根(圖2)，并觀察記錄誘導(dǎo)出的人參不定根日期。
[0039]步驟四、快速生長人參細胞株的初篩:
[0040]用2mol/L的HCl和NaOH溶液將IL含有3.0mg/L IBA和30g/L蔗糖的B5固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌20分鐘備用；選擇粗細均勻的不定根，用滅過菌的手術(shù)刀和鑷子切成長度0.5cm的片段，接種在準(zhǔn)備好的B5固體培養(yǎng)基上，在溫度23°C的條件下避光培養(yǎng)4周，初步篩選出生長速度較快的細胞株ABCDE。
[0041]步驟五、一株快速生長人參細胞株的篩選:
[0042]用2mol/L的HCl和NaOH溶液將IL含有3.0mg/L IBA和30g/L蔗糖的B5固體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌20分鐘備用；將初篩出的細胞株AB⑶E選擇粗細均勻的不定根，用滅過菌的手術(shù)刀和鑷子切成長度0.5cm的片段，接種在準(zhǔn)備好的B5培養(yǎng)基上，在溫度為23°C的條件下避光培養(yǎng)4周，篩選出一株生長速度最快的細胞株C (圖 3)。
[0043]步驟六、一株快速生長人參細胞株的大規(guī)模繼代培養(yǎng):
[0044]250ml搖瓶人參不定根擴繁培養(yǎng)(圖4):用2mol/L的HCl和NaOH溶液將裝在250ml三角瓶中的10ml含有3.0mg/L IBA和30g/L蔗糖的SH液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌20分鐘備用；將篩選出的人參細胞株C不定根用滅過菌的手術(shù)刀和鑷子切成0.5cm左右的片段接種在準(zhǔn)備好的SH液體培養(yǎng)基中，在溫度為23°C的條件下避光SOrpm振蕩培養(yǎng)4周，進行人參不定根的擴繁和繼代培養(yǎng)。
[0045]IL搖瓶人參不定根擴繁培養(yǎng)(圖5):用2mol/L的HCl和NaOH溶液將裝在IL三角瓶中的500ml含有3.0mg/L IBA和30g/L蔗糖的SH液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌20分鐘備用；將通過250ml搖瓶擴繁的不定根用滅過菌的手術(shù)刀和鑷子切成0.5cm左右的片段接種在準(zhǔn)備好的