一種大麗花脫毒種苗的高效擴(kuò)繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種大麗花脫毒種苗的高效擴(kuò)繁方法，具體涉及一種能夠在短時(shí)間擴(kuò) 繁大量?jī)?yōu)良大麗花脫毒種苗的擴(kuò)繁方法，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大剛花（ZfeAJiajOi/Ma(aCav)為菊科大剛花屬多年生球根花丼，全屬約27種，又 名大理菊、天竺牡丹、西番蓮、洋芍藥、大麗菊、地瓜花、紅苕花等，原產(chǎn)墨西哥、哥倫比亞及 危地馬拉等國(guó)，后傳到歐洲、日本和我國(guó)。大麗花莖桿粗壯，葉片肥大，花形與牡丹相似，花 大而色彩艷麗，具有花姿優(yōu)美、花型多樣、花期長(zhǎng)、品種繁多等特點(diǎn)，被譽(yù)為花卉中的寵兒。 大麗花系天然種間雜交，人工選育的歷史不長(zhǎng)，世界各國(guó)普遍栽培，目前在東北、西北、華北 等地栽培較廣泛，其中在廣東秋、冬兩季栽培比較多。經(jīng)過(guò)人工雜交選擇，成為異源八倍體， 新品種層出不窮，花色嬌艷，花期長(zhǎng)，適應(yīng)性強(qiáng)，易于栽培，故一躍成為世界名花。目前大麗 花是墨西哥的國(guó)花，西雅圖的市花，我國(guó)吉林省的省花，張家口、赤峰、包頭(小麗花）等城市 的市花，大麗花象征大方、富麗，大吉大利，是世界著名的觀(guān)賞花卉。
[0003] 大麗花通常采用分根和扦插繁殖，但分根和扦插繁殖繁殖系數(shù)低，但每株每年僅 可分出5-6個(gè)新株，無(wú)法滿(mǎn)足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求，并且一直用分株繁殖，容易使病毒逐代積 累，從而造成大麗花品種退化嚴(yán)重。
[0004] 利用組織培養(yǎng)、離體快繁等技術(shù)可以解決大麗花病毒病積累和快速推廣的問(wèn)題。 國(guó)內(nèi)一些研究者采用大麗花外植體，進(jìn)行了一些組織培養(yǎng)研究，獲得了 一些研究進(jìn)展，但是 大麗花的組織培養(yǎng)技術(shù)國(guó)內(nèi)研究起步較晚，研究積累少，大麗花脫毒之后的快繁方法存在 誘導(dǎo)率較低、誘導(dǎo)苗質(zhì)量差且多弱苗、幼苗增殖效率低、苗移栽成活率低等問(wèn)題，嚴(yán)重制約 了大麗花種苗工廠(chǎng)化、規(guī)?；a(chǎn)。因此，建立健全簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的大麗花脫毒種苗擴(kuò)繁技術(shù)， 對(duì)促進(jìn)大麗花脫毒種苗工廠(chǎng)化、規(guī)?；a(chǎn)，對(duì)大麗花優(yōu)良品種的推廣具有廣闊的市場(chǎng)前 景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決目前大麗花脫毒苗擴(kuò)繁方法存在的誘導(dǎo)率較低、誘導(dǎo)苗質(zhì)量差且多弱苗、 幼苗增殖效率低、苗移栽成活率低等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種大麗花脫毒種苗的高效擴(kuò)繁 方法，通過(guò)建立健全了培養(yǎng)程序、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)組分的配比，提高了誘導(dǎo)苗的質(zhì)量和增殖 效率、移栽成活率，從而建立了高品質(zhì)和高數(shù)量快繁體系。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案解決的： 一種大麗花脫毒種苗的高效擴(kuò)繁方法，其特征在于：該方法步驟如下： 1) 大麗花脫毒苗前處理：將大麗花脫毒苗清洗干凈并表面消毒，在無(wú)菌條件下切取葉 柄和花托，移入裝有配制好的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基廣口瓶中； 2) 不定芽的誘導(dǎo)：將接種有脫毒苗外植體的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基廣口瓶置于消毒處理過(guò) 的培養(yǎng)室中光培養(yǎng)，誘導(dǎo)出不定芽； 3) 切割不定芽繼代增殖：在無(wú)菌條件下將不定芽切下，移入裝有增殖培養(yǎng)基的廣口瓶 中培養(yǎng)，得到大量大麗花幼苗； 4) 煉苗：逐步采用增強(qiáng)培養(yǎng)光照、降低培養(yǎng)溫度的方法進(jìn)行煉苗； 5) 水培生根處理：將煉苗后的脫毒試管苗從廣口瓶中取出，保留原有根系，再將組培苗 栽于水培盤(pán)中的栽培板上，水培盤(pán)中加入生根營(yíng)養(yǎng)液； 6) 水培壯苗：生根培養(yǎng)7天后，倒掉生根營(yíng)養(yǎng)液，加入壯苗營(yíng)養(yǎng)液； 7) 移栽：將脫毒苗移栽到消過(guò)毒的基質(zhì)上，置于室外自然光下生長(zhǎng)。
[0007] 該方法的詳細(xì)步驟如下： 1) 大麗花脫毒苗前處理： 將大麗花脫毒苗先用自來(lái)水反復(fù)沖洗，用毛刷蘸取洗潔精洗一遍后接著用超純水沖 洗干凈，用70%酒精浸泡15s，再用無(wú)菌水沖洗兩次，0. 1%升汞內(nèi)加數(shù)滴吐溫20溶液浸泡 5min，用無(wú)菌水沖洗4-5次，濾紙吸干，將大麗花脫毒苗的葉柄和花托移入裝有不定芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)基的廣口瓶中； 2) 不定芽的誘導(dǎo)： 為防大麗花脫毒苗在生產(chǎn)過(guò)程中被病毒再浸染，培養(yǎng)室先經(jīng)過(guò)消毒，消毒劑選用40% 甲醛10ml/m3、高錳酸鉀5g/m3,對(duì)整個(gè)培養(yǎng)室進(jìn)行熏蒸2小時(shí)，熏蒸后，再采用75%乙醇擦拭 培養(yǎng)架進(jìn)行表面消毒，然后將接種有大麗花脫毒苗外植體的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基廣口瓶置于 消毒處理過(guò)的培養(yǎng)室中光培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度控制為26土rc，以熒光燈為光源，光照強(qiáng)度控 制為1500-2000LX，光周期控制為光14h/暗10h，25-30天誘導(dǎo)出不定芽； 3) 切割不定芽繼代增殖： 在無(wú)菌條件下將誘導(dǎo)2-3cm的不定芽從外植體上完整的切下，轉(zhuǎn)接到裝有增殖培養(yǎng)基 的廣口瓶中，培養(yǎng)室溫度控制為24± 1°C、光照強(qiáng)度控制為1500-2000LX、光周期控制為光 12h/暗12h下培養(yǎng)，培養(yǎng)15-25天后可得到大量大麗花幼苗； 4) 煉苗： 篩選5-8cm的大麗花脫毒試管苗，轉(zhuǎn)移到光照強(qiáng)度為2500-35001X的條件下，3-5天后， 將培養(yǎng)溫度降低為20-22 °C，再過(guò)3-5天，打開(kāi)廣口瓶封口，繼續(xù)煉苗3-5天； 5) 水培生根處理： 為減少轉(zhuǎn)接對(duì)脫毒試管苗根系帶來(lái)的傷害，轉(zhuǎn)接前向廣口瓶?jī)?nèi)加入少量水，并用鑷子 輕輕攪動(dòng)培養(yǎng)基，以免把苗子倒出時(shí)損傷根，試管苗倒出后洗凈根上的培養(yǎng)基，移栽到裝有 生根培養(yǎng)液的水培盤(pán)中的栽培板上，栽培密度1000-1200苗/m2,株距2-3cm，行距2-3cm， 水培器皿用盆底長(zhǎng)X寬=44X32cm，盆高=15cm的塑料盆作為栽培盆，每盆放2L營(yíng)養(yǎng)液， 并有定植孔間距為2cm-3cm的栽培板漂浮在營(yíng)養(yǎng)液上，將脫毒苗上方搭上一層透明的塑料 薄膜，使其處于溫度22-25°C、濕度多90%、光照強(qiáng)度為2000-30001x的清潔的溫室內(nèi)環(huán)境生 長(zhǎng)； 6) 水培壯苗： 生根培養(yǎng)7天后，脫毒苗根系基本發(fā)育完全，此時(shí)，撤掉塑料薄膜，倒掉生根營(yíng)養(yǎng)液，給 幼苗澆施壯苗營(yíng)養(yǎng)液； 7) 移栽： 當(dāng)大麗花脫毒苗長(zhǎng)到12-15cm時(shí)，移栽到消過(guò)毒的基質(zhì)上，移栽密度為行距15cm、株距 10cm，塑料薄膜覆蓋保濕，10-15天后逐步除去薄膜，置于室外自然光下生長(zhǎng)。
[0008] 步驟1)和2)中的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：MS+2. 5mg/L6-BA+0. 08NAA+3%蔗糖 +6. 5g/L植物凝膠，pH為5. 8。
[0009] 步驟 3)中的增殖培養(yǎng)基配方為：MS+3. 0mg/L6-BA+0. 5mg/LNAA+0. 5mg/ LGA+2. 5mg/L氯化膽堿 +4% 鹿糖 +6.Og/L瓊脂，pH為 5. 8。
[0010] 步驟 5)和 6)中的生根培養(yǎng)液配方為：500mg/LKN03, 500mg/LNH4NO3,92. 5mg/L MgSO4 ? 7H20,173mg/LCa(NO3)2 ? 4H20,150mg/LKH2PO4, 32mg/LKCl，17mg/LMnSO4 ? 7H20， 19mg/LNa2-EDTA, 14mg/LFeSO4 ? 7H20, 2. 2mg/LMnSO4 ? 4H20,0. 8mg/LZnSO4 ? 7H20,0. 8mg/ LH3B03,0? 4mg/LKI，50mg/L肌醇，lmg/L甘氨酸，0?OSmg/LVBi，0? 05mg/LVB6,混合制成生根 營(yíng)養(yǎng)液。
[0011] 步驟5)和6)中的生根培養(yǎng)液的另一種可選配方為：950mg/LKN03,825mg/L NH4N03,85mg/LKH2P04,2 20mg/LCaCl2 ? 2H20,185mg/LMgSO4 ? 7H20,19mg/LNa2-EDTA, 14mg/ LFeSO4 ? 7H20,llmg/LMnSO4 ? 4H20, 0. 4mg/LKI,3.lmg/LH3BO3,4. 3mg/LZnSO4 ? 7H20, 0.125mg/LNa2MoO4,0.0125mg/LCuS04,0 . 0 1 25mg/LCoCl2 .6H20,50mg/L肌醇，lmg/L甘氨 酸，0?OSmg/LVBi，0? 05mg/LVB6，混合制成生根營(yíng)養(yǎng)液。
[0012] 步驟 6)中的壯苗營(yíng)養(yǎng)液配方為：850mg/LKN03, 750mg/LNH4NO3,165mg/L MgSO4 ? 7H20,75mg/LKH2PO4, 200mg/LCaCl2 ? 2H20,20mg/LNa2-EDTA, 15mg/LFeSO4 ? 7H20， 10. 5mg/LMnSO4 ? 4H20,4. 25mg/LZnSO4 ? 7H20,3.Omg/LH3B03,0. 4mg/LKI，0. 12mg/L Na2M0O4 ? 2H20,0. 012mg/LCoCl2 ? 6H20,0. 012mg/LCuSO4 ? 5H20,0. 4mg/LKI，30mg/L肌醇， 0. 5mg/L甘氨酸，0.OSmg/LVBpO. 05mg/LVB6，混合制成壯苗營(yíng)養(yǎng)液。
[0013] 步驟7)中的消過(guò)毒的基質(zhì)成分為等體積比例的草炭、珍珠巖、蛭石。
[0014] 本發(fā)明的有益效果： (1) 本發(fā)明消毒方法簡(jiǎn)單、有效，外植體消毒效果好，外植體的污染率降低為5%以下； (2) 本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)誘導(dǎo)率較低、增殖效率低的缺點(diǎn)，不定芽誘導(dǎo)率比平均水平 提高30%左右；不定芽增殖效率比平均水平提高30%左右；最終擴(kuò)繁效率提高了 70%左右； (3) 本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)種苗質(zhì)量差、弱苗多的缺點(diǎn)，獲得的種苗質(zhì)量高，弱苗或死 苗率降低到僅有1%左右； (4) 本發(fā)明苗移栽成活率比現(xiàn)有技術(shù)大大提高，移栽成活率達(dá)到99%左右。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 附圖1為大麗花不定芽誘導(dǎo)的結(jié)果圖； 附圖2為大麗花不定芽增殖的結(jié)果圖； 附圖3為本技術(shù)路線(xiàn)下獲得優(yōu)質(zhì)大麗花種苗的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。
[0017] 實(shí)施例 本實(shí)施例的大麗花脫毒種苗的高效擴(kuò)繁方法，實(shí)施時(shí)間為2012年-2013年，大麗花脫 毒苗前處理、植株再生及煉苗在連云港市振興花卉園進(jìn)行，組培苗移栽在連云港市東辛農(nóng) 場(chǎng)花卉試驗(yàn)基地內(nèi)進(jìn)行，詳細(xì)步驟如下： 1) 大麗花脫毒苗前處理： 將大麗花脫毒苗先用自來(lái)水反復(fù)沖洗，用毛刷蘸取洗潔精洗一遍后接著用超純水沖 洗干凈，用70%酒精浸泡15s，再用無(wú)菌水沖洗兩次，0. 1%升汞內(nèi)加數(shù)滴吐溫20溶液浸泡 5min，用無(wú)菌水沖洗5次，濾紙吸干，將大麗花脫毒苗的葉柄和花托移入裝有不定芽誘導(dǎo)培 養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方為：MS+2. 5mg/L6-BA+0. 08NAA+3%蔗糖+6. 5g/L植物凝膠，pH為5. 8)的 廣口瓶中，為對(duì)比本發(fā)明不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的效果，同時(shí)選擇了另2種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基配方分別為：MS+BA1. 0mg/L+NAA0. 8mg/L+3%蔗糖+5g/L瓊脂，pH為5. 8 (對(duì)比文件 來(lái)自于田慕貞等《大麗花的組織培養(yǎng)》）、MS+6-BA0. 5mg/L+NAA0.lmg/L+3%蔗糖+6g/L瓊脂， pH為5. 8 (對(duì)比文件來(lái)自于邱靖等《大麗花的組織培養(yǎng)初步研究》）； 2) 不定芽的誘導(dǎo)： 為防大麗花脫毒苗在生產(chǎn)過(guò)程中被病毒再浸染，培養(yǎng)室先經(jīng)過(guò)消毒，消毒劑選用40% 甲醛10ml/m3、高錳酸鉀5g/m3,對(duì)整個(gè)培養(yǎng)室進(jìn)行熏蒸2小時(shí)，熏蒸后，再采用75%乙醇擦拭 培養(yǎng)架進(jìn)行表面消毒，然后將接種有大麗花脫毒苗外植體的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基廣口瓶置于 消毒處理過(guò)的培養(yǎng)室中光培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度控制為26°C，以熒光燈為光源，光照強(qiáng)度控制為 1800Lx，光周期控制為光14h/暗10h，25天后誘導(dǎo)出不定芽，結(jié)果如圖1，統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo) 率，本發(fā)明不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到69. 8%，顯著高于其他3個(gè)平均46%左右的不定芽誘導(dǎo)率，不定 芽誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1 ;
3) 切割不定芽繼代增殖：