植體均能產(chǎn)生愈傷，接種后第5天，未成熟子葉胚中部膨脹，子葉胚中部膨脹，表面開(kāi)始變得模糊，有少量淺綠色的愈傷組織出現(xiàn)，接種8天后，外植體長(zhǎng)滿淺綠色愈傷組織，整體變大[圖1]。培養(yǎng)15 d后各組合培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率均較高，其中在2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 1.0mg/L, 6-芐基腺嘌呤(6-BA) 0.lmg/L培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)率最高達(dá)到90% ;在只含6-芐基腺嘌呤(6-BA) (0-2.0mg/L)的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最低，接近于0，在只含有2，4-二氯苯氧乙酸(0-2.0mg/L)的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率也偏低，最高只達(dá)到78%，表明在楸樹(shù)的愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)和6-芐基腺嘌呤(6-BA)是必須的，只有在2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)和6-芐基腺嘌呤(6-BA)達(dá)到一定的比例時(shí)能提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。因此將愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基定為:在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 6-芐基腺嘌呤(6-BA) 0-2.0mg/L和2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)
0-2.0mg/Lο
[0035]3)愈傷組織的增殖及含有不同濃度的6-芐基腺嘌呤(6-BA)和α -萘乙酸(ΝΑΑ)，6-芐基腺嘌呤出-BA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)組合的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織增殖的效果比較。
[0036]將在不同濃度的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)和6_芐基腺嘌呤(6-BA)的組合培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的部分愈傷組織轉(zhuǎn)置添加6-芐基腺嘌呤(6-BA) (0-1.0mg/L)和α-萘乙酸(NAA) (0-0.lmg/L)的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖。部分愈傷組織會(huì)大量增殖，形態(tài)沒(méi)有發(fā)生明顯變化，但顏色會(huì)逐漸加深呈棕色，另外部分的愈傷組織生長(zhǎng)較慢，顏色逐漸褐化。45天之后，只有在6-芐基腺嘌呤出-BA)和α -萘乙酸(NAA)的組合培養(yǎng)基上有黑色顆粒狀的愈傷出現(xiàn)(圖2)，在6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1.0mg/L和α -萘乙酸(NAA)0.0 lmg/L的培養(yǎng)基中黑色顆粒狀愈傷(褐化愈傷組織生成黑色顆粒狀愈傷)最多，在6-芐基腺嘌呤出-BA) 0.9mg/L和α-萘乙酸(NAA)0.07mg/L的培養(yǎng)基中黑色顆粒狀愈傷(褐化愈傷組織生成黑色顆粒狀愈傷)次之，在只有2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的培養(yǎng)基無(wú)黑色顆粒狀愈傷產(chǎn)生。
[0037]4)體細(xì)胞胚的分化及含有不同濃度6-芐基腺嘌呤(6-BA)和α -萘乙酸(NAA)組合的分化培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化效果比較
分化培養(yǎng)基:在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 6-芐基腺嘌呤出-BA) 0-1.0mg/L和 α -萘乙酸(NAA) 0-0.lmg/L ο
[0038]將步驟3)獲得的愈傷組織轉(zhuǎn)置不同濃度6-芐基腺嘌呤出-BA)和α -萘乙酸(NAA)組合的培養(yǎng)基，在溫度25±2°C，光照時(shí)間12-16h /天，光照強(qiáng)度2000_25001ux下誘導(dǎo)分化，并對(duì)含有不同濃度6-芐基腺嘌呤出-BA)和α -萘乙酸(NAA)組合的分化培養(yǎng)基的誘導(dǎo)分化效果進(jìn)行比較。
[0039]結(jié)果45天之后只有黑色的顆粒狀愈傷組織在上述含有不同濃度6-芐基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)組合的培養(yǎng)基上有淺黃色的胚性愈傷組織的產(chǎn)生(圖3)，說(shuō)明在愈傷組織的增殖階段合適的培養(yǎng)基為6-芐基腺嘌呤(6-BA) 1.0mg/L, α -萘乙酸(NAA)
0.0 lmg/L,愈傷長(zhǎng)期在含有2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)有阻礙作用。其中，顆粒狀的黑色愈傷組織在含6-芐基腺嘌呤(6-BA) 0.2mg/L和α -萘乙酸(NAA) 0.05mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)率最高，在含6-芐基腺嘌呤(6-BA)
0.23mg/L和α -萘乙酸(NAA) 0.06mg/L的1/2MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)率次之，繼代30天后，淺黃色胚性愈傷組織的體積是轉(zhuǎn)接時(shí)的100倍以上，隨后，進(jìn)一步發(fā)育成球形胚(圖4)、心形胚(圖5)、魚(yú)雷胚(圖6)和子葉胚(圖7)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每0.5g的胚性愈傷組織中含有1000個(gè)以上的胚狀體(圖8)，繼續(xù)培養(yǎng)，產(chǎn)生大量體細(xì)胞胚。
[0040]5)植株再生
再生培養(yǎng)基:1/2 MS培養(yǎng)基(大量元素為MS基本培養(yǎng)基全量的1/2)
將步驟3)獲得的已經(jīng)長(zhǎng)出兩片子葉的子葉期胚轉(zhuǎn)接到1/2 MS培養(yǎng)基上在溫度25±2°C，光照時(shí)間12-16h /天，光照強(qiáng)度2000-25001UX下誘導(dǎo)萌發(fā)，莖端和根端同時(shí)發(fā)育，最后發(fā)育成完整植株(圖9)。
[0041]6)煉苗和移栽
先將步驟5)中經(jīng)生根培養(yǎng)后得到的再生植株進(jìn)行煉苗，移植。煉苗方法為:待再生苗長(zhǎng)出3-5片真葉時(shí)，將再生苗從培養(yǎng)瓶中移至緩沖間培養(yǎng)，逐步打開(kāi)組培瓶蓋，使再生植苗與空氣接觸，在20-25°C下煉苗7天；再將再生苗從緩沖間中移至培養(yǎng)室外常溫下煉苗培養(yǎng)7天左右。
[0042]再取出再生苗，在流水下徹底清洗根部的培養(yǎng)基，最后將幼苗移至裝有已滅菌培養(yǎng)基質(zhì)(腐殖土:珍珠巖=1:1)的花盆中，澆透水置于溫棚中培養(yǎng)(圖10)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟: 1)愈傷組織的誘導(dǎo):以經(jīng)滅菌的楸樹(shù)為外植體，將其置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了 6-芐基腺嘌呤(6-BA)和 2，4- 二氣苯氧乙酸(2，4-D)； 2)愈傷組織的增殖:將愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基上增殖；所述增殖培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了濃度為0-2.0 mg/L的6-芐基腺嘌呤出-BA)和濃度為0-0.lmg/L 的 α -萘乙酸(NAA)； 3)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚的分化:將增殖后的愈傷組織置于分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了濃度為0-1.0 mg/L的6-芐基嘌呤出-BA)和濃度為0-0.1 mg/L 的 α -萘乙酸(NAA)； 4)植株再生:將分化出的體細(xì)胞胚胎置于再生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚萌發(fā)，得到楸樹(shù)再生苗；所述植株再生培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟I)中的外植體為未成熟的子葉胚。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述方法步驟I)中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤(6-ΒΑ)的濃度為0-2.0mg/L, 2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)的濃度為 0-2.0 mg/L ο4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟I)中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤出-BA)的濃度為0.lmg/L，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的濃度為1.0 mg/L ο5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述方法步驟2)增殖培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤(6-BA)的濃度為1.0mg/L, α -萘乙酸(NAA)的濃度為0.0lmg/L ； 所述方法步驟3)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中6-芐基嘌呤出-BA)的濃度為0.2mg/L，α -萘乙酸(NAA)的濃度為 0.05mg/L。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:子葉胚進(jìn)行滅菌的方法為:取楸樹(shù)未成熟細(xì)長(zhǎng)蒴果，用75%酒精棉球擦拭消毒，套剝?nèi)ス?，然后?%的NaClO對(duì)種子進(jìn)行表面消毒4min，無(wú)菌水清洗，4°C環(huán)境下保存10小時(shí)以上；再用2%的NaClO浸泡3min，無(wú)菌水清洗，剝?nèi)シN皮，取出子葉胚作為外植體。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述步驟I)的培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間12-16h /天，光照強(qiáng)度2000-25001ux ； 步驟2)的培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間12-16h /天，光照強(qiáng)度2000_25001ux ； 步驟3)的培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間12-16h /天，光照強(qiáng)度2000_25001ux。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于: 所述步驟I)中愈傷組織的誘導(dǎo)時(shí)間為10-17天，外植體成為長(zhǎng)滿淺綠色的愈傷組織； 步驟2)中的增殖時(shí)間為30-60天，淺綠色愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏w粒狀愈傷組織； 步驟3)中的誘導(dǎo)分化時(shí)間為60-90天，黑色顆粒狀愈傷組織分化產(chǎn)生淺黃色的胚性愈傷組織； 步驟4)中的植株再生培養(yǎng)時(shí)間為30天，體細(xì)胞胚萌發(fā)生成再生苗。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:對(duì)步驟4)中經(jīng)再生培養(yǎng)后得到的完整植株進(jìn)行煉苗，方法為:待再生苗長(zhǎng)出3-5片真葉時(shí)，打開(kāi)組培瓶蓋，使再生植苗與空氣接觸，在20-25 °C下煉苗7-10天。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法，其特征在于:所述楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法還包括移植，待再生苗生長(zhǎng)至5cm左右時(shí)，將再生苗從培養(yǎng)瓶中移至緩沖間培養(yǎng)，再將再生苗移至培養(yǎng)室外常溫培養(yǎng)，再取出再生苗，在流水下徹底清洗根部的培養(yǎng)基，最后將再生苗移至已滅菌培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)。
【專利摘要】一種楸樹(shù)的體外培養(yǎng)方法包括1）愈傷組織的誘導(dǎo)：將其置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤(6-BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；2）愈傷組織的增殖：將愈傷組織置于增殖培養(yǎng)基上增殖；增殖培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)；3）胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚胎的分化：將增殖后的愈傷組織置于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基是在1/2MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加了6-芐基腺嘌呤(6-BA)和α-萘乙酸(NAA)；4）植株再生：將分化出的體細(xì)胞胚胎置于再生培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體胚萌發(fā)，得到楸樹(shù)再生植株。本發(fā)明是為了擴(kuò)大楸樹(shù)的繁殖系數(shù)，為種質(zhì)保存、遺傳轉(zhuǎn)化提供條件。
【IPC分類】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105010143
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510443187
【發(fā)明人】陳發(fā)菊, 王玉宇, 梁宏偉, 王玉兵, 王長(zhǎng)蘭, 張德春, 姚偉
【申請(qǐng)人】三峽大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月27日