利用礦物成核劑進(jìn)行冷凍的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及利用礦物成核劑來冷凍容器中的生物實(shí)體或制劑的含水質(zhì) (water-containingquantity)的方法、該礦物作為成核劑的用途W(wǎng)及在其整個(gè)或部分表 面上或表面中具有該礦物的容器。
【背景技術(shù)】
[0002] 存在兩種相關(guān)的方法用于生物學(xué)材料的保藏。在低溫保存中，W冷凍狀態(tài)冷凍并 儲(chǔ)存生物學(xué)材料。在冷凍干燥（凍干）中，從冷凍的生物學(xué)樣品中除去水，然后將其W干燥 狀態(tài)儲(chǔ)存。冷凍干燥也被用于（例如）藥物的儲(chǔ)存或溶質(zhì)的樣品化中（patterning)。
[0003] 低溫保存被廣泛應(yīng)用于保持生物學(xué)樣品的長期活力W用于醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)和獸醫(yī) 學(xué)。為了在解凍后獲得高活力，必需加入保護(hù)性化合物（已知為低溫保存添加劑或低溫保 存劑）并且W受控速率冷卻樣品。對(duì)于許多細(xì)胞類型，在冷卻過程中通過受控成核來誘發(fā) 冰形成而不是使冰自發(fā)成核是合乎需要的。
[0004] 用于低溫保存的樣品通常被置于例如W下的專用低溫容器中：
[000引?吸管（Straws)，其是直徑為2mm至4mm，長度達(dá)140mm，且容量為0. 2ml至0. 5ml 的薄壁管.
[0006]?冷凍管（化yovials)，其是直徑為約12. 5mm且容量為0. 5ml至5. 0ml的短粗 (wide short)管；
[0007] ?用于較大體積的低溫保存的容量為5ml至1000ml的柔性袋；W及
[000引 ?在機(jī)器人技術(shù)和高通量篩選中使用的微孔板、介質(zhì)管（matrixtube)和其他SBS 形式。
[0009] 一系列設(shè)備可被用于W受控速率來冷凍吸管和冷凍管。該些設(shè)備可使用液氮作為 制冷劑或通過機(jī)械制冷來冷卻。另外存在一些被動(dòng)冷卻裝置。該些裝置中的某些使樣品中 的冰受控成核，該可W手動(dòng)或自動(dòng)進(jìn)行。
[0010] 在W受控速率冷凍之后，將樣品在低溫（通常為液氮的溫度（-196°C))下保持冷 凍。在此溫度下，如果細(xì)胞能夠在低溫下存活，則其生存力與儲(chǔ)存時(shí)間無關(guān)。當(dāng)需要使用時(shí)， 將樣品快速解凍（通常處于保持在37°C的水浴中）并除去低溫保存劑。
[0011] 冷凍干燥（凍干）被廣泛用于生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域W長期穩(wěn)定細(xì)胞、疫 苗、蛋白和其他生物活性化合物。冷凍干燥也被用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)材料，例如應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)中 (MassieI等（2011),TissueE；ngPartCMethods. 17:765-774)和新型陶瓷制造中的支架 和基質(zhì)。在冷凍干燥過程中，將含水樣品置于專用容器（通常為玻璃瓶）中并在冷凍干燥 機(jī)中的冷卻架上冷凍。冷凍之后，降低局部氣壓并且冷凍樣品中的冰升華。在從樣品除去 水之后，在真空下使瓶升溫冰將其密封?？稍诃h(huán)境溫度下分裝該樣品并通過加入水進(jìn)行恢 復(fù)。
[0012] 在冷凍干燥中，樣品往往會(huì)普遍過度冷卻，該會(huì)導(dǎo)致樣品之間具有不同的冰晶 結(jié)構(gòu)。冰在接近烙點(diǎn)的溫度下成核會(huì)導(dǎo)致樣品具有快速升華的大冰晶。相對(duì)而言，其中 冰在遠(yuǎn)離烙點(diǎn)的溫度下成核的樣品會(huì)具有小的冰晶并且W慢速升華（SearlesJA等 (2001),Journalof化armaceuticalSciences90:860-871)。當(dāng)處理大量的樣品時(shí)， 通常選擇處理?xiàng)l件W適應(yīng)具有最小冰晶的群（population)的緩慢干燥，導(dǎo)致處理時(shí)間 延長并且設(shè)備和設(shè)施低效使用。冰成核溫度被認(rèn)為確定處理時(shí)間和生物學(xué)活性恢復(fù)的 關(guān)鍵因素(KasperJC,FriessW(2011),EuropeanJournalofPharmaceuticsand Bio地armaceutics78:248-263)。
[0013] 按照常規(guī)低溫保存的哺乳動(dòng)物胚胎的成功復(fù)原依賴于在高的零下溫度（通常 為-7°C)下的受控冰成核。由于大量的過度冷卻而形成細(xì)胞內(nèi)冰，其中使冰自發(fā)成核的樣 品具有差的復(fù)原（Whittin曲amDG(1977),CibaFoundation52.ElsevierAmsterdamEds KElliotandJWhelanpp97-127)。通過控制冰成核也提高了許多細(xì)胞類型（包括哺乳 動(dòng)物精子和干細(xì)胞）的生存力。該通常是通過冷卻低溫容器W使內(nèi)容物低于其烙點(diǎn)并且然 后手動(dòng)使該低溫容器的外部與制冷工具接觸或機(jī)械攬拌該低溫容器來進(jìn)行的。該一過程通 常被稱作"接種（seeding)"。接種的缺點(diǎn)在于其是一種手動(dòng)步驟，該意味著能夠被處理的 樣品較少并且需要物理介入（physicalaccess)該樣品。
[0014] 已經(jīng)提出了其他的物理方法來誘導(dǎo)成核。例如在冷凍干燥機(jī)中，之后落入樣品中 的水蒸汽的結(jié)晶（雪）誘導(dǎo)成核。最近，普萊克斯公司（PraxairCo巧oration)已經(jīng)引進(jìn) 了 '壓致移動(dòng)（pressureshift)'工藝，其中用氣氣將冷凍干燥機(jī)中的樣品加壓至28psig， 然后冷卻至期望的成核溫度。然后將該壓力降低至IpsigW誘導(dǎo)成核化onstantinidisA K等（2011),Journalof化armaceuticalSciences100:；3453-3470)。然而，該種方法仍 然是試驗(yàn)性的，成本高昂，難W更新改造并且不適用于小型冷凍干燥機(jī)。
[0015] 針對(duì)低溫保存樣品的冰成核，已經(jīng)考察了大量的化學(xué)成核劑（有時(shí)被稱為成 核催化劑）。該些成核劑促使被稱作異相成核化eterogeneousnucleation)或促進(jìn)成 核（facilitatednucleation)的現(xiàn)象發(fā)生。實(shí)例包括艦化銀的晶體、細(xì)菌了香假單胞 桿菌（Pseudomonassyringeae)和膽固醇的晶體。將該成核劑加入到樣品中，然后將樣 品冷卻。當(dāng)在樣品內(nèi)部達(dá)到充分水平的過度冷卻時(shí)，就會(huì)發(fā)生冰成核。該種過程使得大 量的樣品經(jīng)過處理，但也存在有關(guān)其毒性或潛在毒性或其細(xì)菌源性化acterialorigin) 或動(dòng)物源性的缺點(diǎn)。已知的成核劑不太可能與細(xì)胞一起使用于臨床應(yīng)用。當(dāng)大量的該 些成核劑在較高的零下溫度下誘導(dǎo)冰形成時(shí)，它們在藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP)的 標(biāo)準(zhǔn)下被制造是不太可能的并且它們會(huì)具有毒性（SaridakisE等（2008),Trendsin Biotechnology. 27:99-106) 〇
[0016] 一些細(xì)菌菌株能夠在高達(dá)-2°C的溫度下使冰成核（ValiG. (1995).Principles oficenucleation.BiologicalicenucleationandItsApplication.R.E.Lee,G. Warren和L.Gusta.St.Paul,Minnesota,APS出版社）。然而，細(xì)菌的冰成核活性對(duì)于環(huán) 境生長條件高度敏感并且所得的蛋白是熱敏感的。該種對(duì)于環(huán)境條件的敏感性使得其 不適于該一應(yīng)用。存在其他（非細(xì)菌）生物學(xué)材料在高的零下溫度下使冰成核的報(bào)道 化enderson-BeggSK.等（2009).AtmosphericScienceLetters10:215-219)。然而，在 加熱下冰核往往不穩(wěn)定并且仍具有非常差的特性。艦化銀已經(jīng)顯示出在非常高的溫度下對(duì) 冰形成的催化作用（VonnegutB等（1984),J.Appl.Meteor. 23(3) :486-490)，但不能與樣 品一起用于臨床應(yīng)用。
[0017] 礦物粉塵被認(rèn)為是相對(duì)低效的冰核?？偨Y(jié)了浸于水滴中的固體顆粒的冰成核 數(shù)據(jù)的綜述性文章引述了礦物粉塵的最高冷凍溫度（約-15°C)0tooseC和0M加ler口012),AtmosphericChemistiTand曲ysics. 12:9817 - 9854;和MurrayB.J等 (2012),QiemicalSocietyReviews. 41:6519-6554)。
[001引刮板式換熱器（scrapedsurfaceheatexchanger)被用于冷凍較大體積的水、 糖、乳制品、色素、風(fēng)味劑和其他添加劑的混合物W形成冰洪淋或冰沙飲料。該刮板式換熱 器在高壓和恒定攬拌下冷卻混合物。成核通常在較少數(shù)量的位置中自發(fā)地發(fā)生。冰晶持續(xù) 生長并且被機(jī)械打碎W使最終產(chǎn)品中存在的冰晶的尺寸最小。小的冰晶被認(rèn)為是合乎需求 的，因?yàn)橄啾扔诤休^大冰晶的冰洪淋，其賦予冰洪淋更加順滑的質(zhì)感。然而由于冰洪淋的 高糖含量，當(dāng)在-l0°C至-2(TC之間的溫度下儲(chǔ)存時(shí)，其往往會(huì)部分融化和再結(jié)冰，該導(dǎo)致 較大的冰晶生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明設(shè)及通過采用冰的控制成核用的礦物來改善含水產(chǎn)品的冷凍處理。
[0020] 因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了用于冷凍生物實(shí)體或制劑的含水質(zhì)的方法，包 括：
[0021] (A)使所述含水質(zhì)與礦物成核劑在容器中接觸；W及
[0022] 做冷卻所述含水質(zhì)，W使所述礦物成核劑起到促進(jìn)冰的非自發(fā)形成的作用。
[0023] 通過促進(jìn)冰的非自發(fā)形成，所述礦物成核劑有利地提供了在冰成核過程中的控制 元素，所述冰成核有助于保持所述生物實(shí)體或