生物材料性能的保存和儲(chǔ)存方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及儲(chǔ)存真核細(xì)胞生物材料（例如與材料和組織相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞）的方法， 同時(shí)降低或防止儲(chǔ)存相關(guān)的生物材料性能的損失。本發(fā)明還涉及在儲(chǔ)存期間維持生物材料 的（i)胞外基質(zhì)完整性（包括胞外基質(zhì)滲透性、水含量和糖胺聚糖含量）以及（ii)細(xì)胞活 力。
【背景技術(shù)】
[0002] 在過(guò)去的幾十年間，已開(kāi)發(fā)了儲(chǔ)存方法和技術(shù)以保存真核組織和細(xì)胞。這些儲(chǔ)存 方法和技術(shù)涉及在工程改造的胞外基質(zhì)、工程改造的組織和天然組織中將各種真核細(xì)胞儲(chǔ) 存一段時(shí)間，儲(chǔ)存方式允許在之后使用這些儲(chǔ)存的組織，如用于植入或移植至患者或用于 藥物或化學(xué)篩選生物試驗(yàn)。
[0003] 雖然這些儲(chǔ)存方法和技術(shù)廣泛地適用于基礎(chǔ)研宄和轉(zhuǎn)化研宄環(huán)境，但在儲(chǔ)存期間 維持生物材料性能（例如胞外基質(zhì)完整性和細(xì)胞活力）仍是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。例如，使用現(xiàn)有技 術(shù)時(shí)觀察到了顯著降低的胞外基質(zhì)滲透性和組織細(xì)胞活力，且這些降低可導(dǎo)致從儲(chǔ)存中取 出后低效的生物材料功能。
[0004] 在一個(gè)示例中，使用多種儲(chǔ)存技術(shù)保存軟骨細(xì)胞和軟骨組織，隨后將其從儲(chǔ)存中 取出并用作骨軟骨同種異體移植物。該同種異體移植物可修復(fù)（1)外傷誘導(dǎo)的軟骨缺陷和 (2)由骨關(guān)節(jié)炎破壞的軟骨表面。使用軟骨細(xì)胞和軟骨作為骨軟骨同種異體移植物以治療 骨關(guān)節(jié)炎是重要的，因?yàn)轭A(yù)測(cè)骨關(guān)節(jié)炎目前在美國(guó)影響約2000萬(wàn)人。因此，結(jié)果是，已產(chǎn)生 了一個(gè)巨大的產(chǎn)業(yè)用于提供整形外科植入物來(lái)治療因內(nèi)源性軟骨缺失或內(nèi)源性軟骨損傷 而導(dǎo)致具有缺陷型關(guān)節(jié)、骨質(zhì)疏松性骨折或背部疾病的人。
[0005] 雖然骨軟骨同種異體移植物顯示出治療軟骨相關(guān)醫(yī)療病癥的希望，但移植的關(guān)節(jié) 軟骨的軟骨細(xì)胞活力和胞外基質(zhì)完整性很大程度上決定了骨軟骨同種異體移植物移植的 結(jié)果（即成功的手術(shù)效果對(duì)比失敗的手術(shù)效果等）。目前的保存技術(shù)無(wú)法可接受地維持軟 骨的胞外細(xì)胞基質(zhì)完整性并在某些方面提高軟骨細(xì)胞活力。例如，常規(guī)的軟骨細(xì)胞和軟骨 低溫保存包括在包含二甲亞砜（DMSO)的溶液中冷凍這些細(xì)胞和組織，但這些技術(shù)導(dǎo)致關(guān) 節(jié)軟骨中80 - 100%的軟骨細(xì)胞死亡且胞外基質(zhì)因?yàn)楸男纬啥軗p。
[0006] 上述較差的低溫保存結(jié)果最終導(dǎo)致移植所謂"新鮮"關(guān)節(jié)部分（即軟骨細(xì)胞和/或 軟骨同種異體移植物）的實(shí)踐。例如，通常在供體死亡的24小時(shí)內(nèi)收獲供體來(lái)源的骨軟骨 組織移植物并在4°C下儲(chǔ)存最多42天以用于修復(fù)臨床軟骨缺陷。此外，將市售可得的新鮮 骨關(guān)節(jié)同種異體移植物儲(chǔ)存至少17天以允許在移植前進(jìn)行血清學(xué)和微生物學(xué)測(cè)試以最小 化受體中的潛在感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 雖然骨軟骨同種異體移植物移植已經(jīng)是用于修復(fù)（1)外傷誘導(dǎo)的軟骨缺陷和（2) 由骨關(guān)節(jié)炎破壞的軟骨表面的有效治療方法，但對(duì)于在儲(chǔ)存期間維持軟骨的軟骨細(xì)胞活力 和胞外基質(zhì)完整性而言仍存在多項(xiàng)挑戰(zhàn)。最近的研宄表明，重要的是同時(shí)維持軟骨細(xì)胞活 力和胞外基質(zhì)完整性以促進(jìn)成功的同種異體移植物移植。例如，如果從儲(chǔ)存中取出期間或 之后細(xì)胞活力和/或基質(zhì)完整性降低，則成功移植的可能性也會(huì)降低。在工程改造或天然 的組織中的大多數(shù)真核細(xì)胞中都存在這些挑戰(zhàn)。因此，新的真核組織和細(xì)胞保存技術(shù)是有 用的。
[0008] 本文描述了用于儲(chǔ)存生物材料的組合物和方法。在某些方面中，這些生物材料包 括真核細(xì)胞和真核組織，如軟骨細(xì)胞和軟骨。本文所述方法包括以降低或防止儲(chǔ)存期間或 從儲(chǔ)存中取出生物材料后生物材料性能（如胞外基質(zhì)滲透性和軟骨細(xì)胞活力）損失的方式 儲(chǔ)存這些生物材料。在某些方面中，將這些生物材料置于溶液中并隨后儲(chǔ)存以用于下次使 用，所述溶液包含動(dòng)物來(lái)源的產(chǎn)物。在某些方面中，本文所述溶液含有防止或降低生物材料 性能損失的試劑，且在某些方面中，該試劑可包括至少一種酶的抑制劑。例如，該試劑可包 括天然或合成的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP)抑制劑，其包括但不限于內(nèi)源性金屬蛋白酶組織抑 制劑（TIMP)、調(diào)節(jié)TIMP合成的化合物或多西環(huán)素等。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)部分列于后文說(shuō)明書(shū)中或可通過(guò)下文所述方面的實(shí)踐進(jìn)行了解。通 過(guò)所附權(quán)利要求中特別指出的要素和組合將會(huì)認(rèn)識(shí)和獲得下述優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)當(dāng)理解，上述一般 描述和以下詳細(xì)描述僅僅是示例性和說(shuō)明性的，而非限制性的。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1比較軟骨細(xì)胞在四種不同溶液中儲(chǔ)存28天后的軟骨細(xì)胞活力和增殖。通過(guò) 測(cè)量各樣品的相對(duì)熒光單位（RFU)來(lái)定量活力和增殖。
[0011] 圖2顯示4種不同溶液中冷儲(chǔ)存期間高細(xì)胞活力與軟骨基質(zhì)滲透性和電導(dǎo)率損失 之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)（R 2)。如圖2所示，在4天的儲(chǔ)存后恢復(fù)組織培養(yǎng)期間，關(guān)聯(lián)系數(shù)從0. 78 升尚至〇. 90。
[0012] 圖3顯示低溫儲(chǔ)存對(duì)于軟骨滲透性的影響，其基于低滲鹽水中軟骨樣品的電導(dǎo) 率。
[0013] 圖4是用于定量軟骨機(jī)械性能（如蠕變壓縮）的壓縮室的示意圖。
[0014] 圖5顯示多種儲(chǔ)存間隔后多西環(huán)素濃度對(duì)于軟骨細(xì)胞活力的影響。
[0015] 圖6顯示在多種多西環(huán)素濃度中冷凍儲(chǔ)存一個(gè)月后對(duì)豬軟骨塞電導(dǎo)率的影響。
[0016] 實(shí)施方式詳沐
[0017] 通過(guò)參考以下特定實(shí)施方式的詳述、本文包含的實(shí)施例以及附圖及其描述，可以 容易地理解公開(kāi)的方法和組合物。下文所述各方面不限于所述特定組合物和/或方法，其 當(dāng)然可以變化。
[0018] 本申請(qǐng)引用了多份出版物。這些出版物全文以及下文參考文獻(xiàn)列表中包含的出版 物的公開(kāi)內(nèi)容在此通過(guò)引用全文納入本申請(qǐng)中以更完整地描述本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。所 公開(kāi)的參考文獻(xiàn)還根據(jù)參考的特定部分單獨(dú)和特定地通過(guò)引用納入本文。
[0019] 可以以范圍的形式表示或給出濃度、數(shù)量和其它數(shù)值數(shù)據(jù)。應(yīng)該理解，使用這種范 圍形式只是為了方便和簡(jiǎn)潔，因此，應(yīng)該靈活地將其解釋成不僅包括作為范圍界限明確列 舉的數(shù)值，而且包括所有包含在該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值或子范圍，就如同各數(shù)值和子范圍都 已明確列舉。例如，"約1至5"的數(shù)值范圍應(yīng)理解為不僅包括明確表示的約1至約5的數(shù) 值，還單獨(dú)地包括單個(gè)值（如2、3和4)和子范圍（如1-3、2-4和3-5等）以及1、2、3、4和 5。相同的原理適用于僅僅陳述了一個(gè)作為最小值或最大值的數(shù)值的范圍。此外，無(wú)論所描 述的范圍或特征的寬度如何，這種解釋都適用。
[0020] 在本說(shuō)明書(shū)和后面的權(quán)利要求書(shū)中將提到許多術(shù)語(yǔ)，這些術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有以下定義：
[0021] "不含動(dòng)物產(chǎn)品"的溶液包括除下文所述生物材料外不包含動(dòng)物產(chǎn)品或來(lái)源于動(dòng) 物的任何產(chǎn)品的溶液。"動(dòng)物產(chǎn)品"可包括胎牛血清（FBS)，其是包括生長(zhǎng)因子的動(dòng)物來(lái)源 的產(chǎn)品并通常用于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。因此，在一個(gè)示例中，"不含動(dòng)物產(chǎn)品"的溶液可包括缺少 FBS的溶液。
[0022] 術(shù)語(yǔ)"生物材料"包括非植物、哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞和組織。
[0023] 本文描述了活生物材料和用于儲(chǔ)存這類生物材料的方法。在某些方面中，這些生 物材料包括工程改造和天然的組織中的真核細(xì)胞，且本文所述方法包括以降低或防止儲(chǔ)存 期間或從儲(chǔ)存中取出生物材料后生物材料性能損失（例如，降低或防止胞外基質(zhì)滲透性、 組織細(xì)胞活力或其組合的損失）的方式儲(chǔ)存這些生物材料。在某些方面中，將這些生物材 料置于溶液中，其可包括不含動(dòng)物產(chǎn)品的溶液，含有至少一種降低或防止生物材料性能損 失的試劑。隨后，將置于含有至少一種試劑的溶液中的生物材料在特定溫度范圍下儲(chǔ)存直 至進(jìn)一步需要這些生物材料時(shí)。對(duì)至少一種試劑的濃度進(jìn)行優(yōu)化從而最大化生物材料性能 (如胞外基質(zhì)完整性和細(xì)胞活力）。
[0024] 在某些方面中，該生物材料可包括任何非植物、哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞和/或組織，包 括原代細(xì)胞（如非永生細(xì)胞和/或組織）和永生細(xì)胞。在某些方面中，該生物材料可包括 天然和工程改造的組織和細(xì)胞。天然和工程改造的生物材料的示例可包括但不限于：軟骨 細(xì)胞、軟骨、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨、組織塞（tissue plug)、同種異體移植物組織塞、軟骨 組織塞、角膜、心臟瓣膜、血管、輸尿管、腸、皮膚、牙齒、腫瘤活檢、椎間盤(pán)或椎間體、韌帶、肌 腱等。在至少一個(gè)方面中，該生物材料包括至少軟骨細(xì)胞、軟骨或其組合。在其他方面中， 該生物材料僅包括軟骨細(xì)胞、軟骨或其組合。在某些方面中，該生物材料包括自體移植物組 織、同種異體移植物組織和異種移植物組織。例如，對(duì)于合適的人移植物組織，同種異體組 織和/或組織塞可來(lái)源于人供體。異種移植物組織可來(lái)源于豬供體、牛供體、綿羊供體、馬 供體或任何其他物種以用于醫(yī)療目的。本文所述組織還可來(lái)源于相同物種中獸醫(yī)應(yīng)用的動(dòng) 物物種；示例包括狗、貓、綿羊、奶牛和馬。
[0025] 在由本文所述組合物和方法使用本文所述組織和細(xì)胞時(shí)，一個(gè)目的是防止胞外基 質(zhì)完整性的損失和/或降低或防止細(xì)胞活力的損失。例如，可基于胞外膜滲透性、胞外膜水 含量、胞外膜糖胺聚糖含量或其組合來(lái)測(cè)定胞外基質(zhì)完整性。在某些方面中，在儲(chǔ)存生物材 料以防止或降低胞外基質(zhì)完整性損失時(shí)，一個(gè)目的是維持胞外膜滲透性、胞外膜水含量、胞 外膜糖胺聚糖含量或其組合中的至少一種。在測(cè)定生物材料的基質(zhì)完整性時(shí)，可使用本領(lǐng) 域已知的多種技術(shù)。這些技術(shù)包括測(cè)量滲透性、水含量和糖胺聚糖含量的基質(zhì)電導(dǎo)率試驗(yàn)、 凹痕測(cè)試、壓力/應(yīng)變測(cè)試、彈性、拉曼光譜、各種顯微鏡方法（如具有二次諧波發(fā)生的激光 掃描顯微鏡）等。如上文進(jìn)一步說(shuō)明的那樣，另一個(gè)目的是降低或防止生物材料細(xì)胞活力 的損失。在某些方面中，可使用本文所述組合物和方法來(lái)降低或防止多種類型的細(xì)胞死亡， 包括但不限于，壞死性細(xì)胞死亡、凋亡性細(xì)胞死亡、自噬性（II型）細(xì)胞死亡、失巢凋亡和壞 死性凋亡，并且在某些方面中，可通過(guò)使用下文進(jìn)一步描述的試劑來(lái)限制這些類型的細(xì)胞 死亡。此外，還可以使用代謝活性試驗(yàn)（如刃天青試驗(yàn)）、各種細(xì)胞染色技術(shù)（如過(guò)