通過組織培養(yǎng)使刺果甘草染色體加倍的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物領域，具體涉及通過組織培養(yǎng)使刺果甘草染色體加倍的方法。
【背景技術】
[0002] 刺果甘草（Max.)，別名野甘草、胡蒼耳等，為豆科蝶 形花亞科甘草屬多年生半灌木植物。刺果甘草以根及種子入藥，具有催乳、殺蟲、止瀉、抗癌 等功效，長期被作為替代甘草藥材的重要植物資源之一。多年來人們對甘草進行了廣泛而 深入的研宄，但多集中在栽培、有效成分和藥理藥效研宄等方面。
[0003] 近年來，由于甘草在制藥業(yè)、食品業(yè)和化妝品業(yè)等的用量急劇增加，而多年來甘草 藥材主要依靠野生資源，由于對甘草的無節(jié)制采挖，使我國甘草資源遭到了嚴重破壞。雖然 人工栽培甘草在國內已得到廣泛推廣，但有效成分較低，用藥效果較差。因此，為了保護野 生甘草資源，探尋和發(fā)現甘草的優(yōu)質種源和甘草的替代資源變得迫在眉睫。
[0004] 對于刺果甘草染色體加倍的研宄鮮有報道，吳玉香等人雖然采用改良瓊脂涂抹法 和直接滴滲法處理刺果甘草幼苗頂芽進行多倍體的誘變，但方法較麻煩，花時間較長。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種通過組織培養(yǎng)使刺果甘草染色體加倍的方法。
[0006] 一種通過組織培養(yǎng)使刺果甘草染色體加倍的方法，包括如下步驟： A、 種子前處理：選取成熟飽滿、健康無病蟲害的甘草種子，用98%濃硫酸浸泡39-41min 后消毒； B、 取得無菌苗：取升汞處理過的刺果甘草種子用無菌水沖洗3-4次，接種到以MS培養(yǎng) 基為基質的瓶中，于25°C溫度下暗培養(yǎng)3d，之后每天以20001UX強度光照10h的光暗交替 處理4天，后移至26°C溫度下光培養(yǎng)，待植株生長到6-lOcm時備用； C、 培養(yǎng)的健壯愈傷組織：將步驟B中的無菌苗，接種到玉米素混合培養(yǎng)基上，于23°C條 件下暗培養(yǎng)5d，之后每天以20001UX強度光照16h的光暗交替處理； D、 處理刺果甘草愈傷組織：取步驟C培養(yǎng)的健壯愈傷組織，用0. 05 - 0. 2%濃度的秋水 仙素處理16 -24h ； E、 繼代培養(yǎng)：將處理過的愈傷組織接到玉米素混合培養(yǎng)基上進行第一次繼代培養(yǎng)，20d 后進行第二次繼代培養(yǎng)。
[0007] 優(yōu)選的，所述玉米素混合培養(yǎng)基的組成包括MS培養(yǎng)基、濃度為0.5mg/L的生長素 萘乙酸和濃度為0. 8mg/L6-反式-4-羥基-3-甲基-丁 -2-烯基氨基嘌呤，在此基礎上加 入蔗糖30g/L、瓊脂7g/L、活性炭3g/L、聚乙烯吡咯酮0. 5g/L，保持pH值為5. 8。
[0008] 優(yōu)選的，上述步驟A種子前處理中，甘草種子浸泡后，用1%氯化汞消毒lOmin。 [0009]優(yōu)選的，步驟D中對刺果甘草愈傷組織用0. 2%濃度的秋水仙素處理24h。用0. 2% 秋水仙素處理24h的誘變率甚至高達100%。
[0010] 優(yōu)選的，對步驟E繼代培養(yǎng)的刺果甘草組織進行染色體倍性檢測，具體步驟如下： 取新生的愈傷組織于0. 02%秋水仙素和0. 002mol/L 8-羥基喹啉混合液中預處理2. 5 h，沖 洗干凈，后用比例為3 : 1的乙醇-冰醋酸固定液固定2 h;再用混合酶液在25°C恒溫箱內 處理3 h ;用蒸餾水浸泡30min，去除蒸餾水后，再加入固定液固定半小時后制備細胞懸液， 制片檢測。
[0011] 本發(fā)明采用秋水仙素處理誘導甘草屬植物種子產生愈傷組織和四倍體的刺果甘 草植株，得到了甘草的優(yōu)質種源，緩解了甘草市場供不應求的局面。
【附圖說明】
[0012] 圖1是秋水仙素處理對刺果甘草染色體數的鑒定圖。
【具體實施方式】
[0013] 下面的實施例可以進一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0014] 實施例中玉米素混合培養(yǎng)基的組成包括MS培養(yǎng)基、濃度為0. 5mg/L的生長素萘乙 酸（NAA)和濃度為0. 8mg/L6-反式-4-羥基-3-甲基-丁 -2-烯基氨基嘌呤，在此基礎上 加入蔗糖30g/L、瓊脂7g/L、活性炭3g/L、聚乙烯吡咯酮（PVP) 0. 5g/L，保持pH值為5. 8。
[0015] 實施例1 1、種子前處理：選取成熟飽滿、健康無病蟲害的甘草種子經沙磨處理后用98%濃硫酸 浸泡40min，用1%升采消毒lOmin。
[0016] 2、取得無菌苗：取升汞處理過的刺果甘草種子用無菌水沖洗4次，接種到以MS培 養(yǎng)基為基質的錐形瓶中，于25°C溫度下暗培養(yǎng)3d，之后每天以20001UX強度光照10h的光 暗交替處理4天，后移至26°C溫度下光培養(yǎng)，待植株生長到8cm時備用。
[0017] 3、將步驟2中的無菌苗，接種到玉米素混合培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱內，于23°C 條件下暗培養(yǎng)5d，之后每天以20001ux強度光照16h的光暗交替處理。其出愈率最高可達 90. 45%，且質地疏松，生長狀況良好。
[0018] 4、取上步驟培養(yǎng)的健壯愈傷組織，用0. 2%濃度的秋水仙素分別處理24h。
[0019] 5、將處理過的愈傷組織接到玉米素混合培養(yǎng)基上進行第一次繼代培養(yǎng)，20d后進 行第二次繼代培養(yǎng)，待生長出新的愈傷組織進行染色體倍性研宄。
[0020] 6、對繼代培養(yǎng)的刺果甘草組織進行染色體倍性檢測：取新生的愈傷組織于0. 02% 秋水仙素和〇. 〇〇2mol/L 8-羥基喹啉混合液中預處理2. 5 h，用蒸餾水沖洗干凈，后用乙 醇-冰醋酸（3 : 1)固定液固定2h;再用混合酶液在25°C恒溫箱內處理3 h;用蒸餾水浸 泡30min，去除蒸餾水后，再加入固定液固定半小時，后制備細胞懸液。用懸滴法制片，干燥 后用改良苯酚品紅染色3min，常規(guī)壓片，冰凍后揭去蓋玻片，自然干燥，中性樹膠封片，用 Olympum Bx61觀察并采集圖像，實施例1處理下的誘變率高達100%。
[0021] 實施例2 1、種子前處理：選取成熟飽滿、健康無病蟲害的甘草種子經沙磨處理后用98%濃硫酸 浸泡41min，用1%升采消毒lOmin。
[0022] 2、取得無菌苗：取升汞處理過的刺果甘草種子用無菌水沖洗3次，接種到以MS培 養(yǎng)基為基質的錐形瓶中，于25°C溫度下暗培養(yǎng)3d，之后每天以20001UX強度光照10h的光 暗交替處理4天，后移至26°C溫度下光培養(yǎng)，待植株生長到10cm時備用。
[0023] 3、將步驟2中的無菌苗，接種到玉米素混合培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱內，于23°C 條件下暗培養(yǎng)5d，之后每天以20001ux強度光照16h的光暗交替處理。其出愈