專利名稱：角膜活性保存液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥配制品，特別是一種角膜活性保存液。
在角膜的活性保存方法中，有傳統(tǒng)的濕房保存法，該法簡單易行，缺點是角膜保存時間太短(僅2天)；還有一種超低溫角膜保存法，雖可使角膜內(nèi)皮的有效活性保存數(shù)年，但設(shè)備昂貴，操作繁雜，且不能向外輸送供體。因此，全球眼庫均沒有用此法作為常規(guī)用于臨床。我國現(xiàn)在各地仍以濕房保存法為主。美國CHIRON公司生產(chǎn)的Optisol是目前保存角膜內(nèi)皮細胞活性最好的保存液，但價格昂貴，國內(nèi)尚無進口渠道。我國迫切需要一種既具有較好的保存效果，又在經(jīng)濟上適合國情的角膜活性保存液。
本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題而提供一種既經(jīng)濟、保存效果又好的角膜活性保存液的技術(shù)方案。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)措施實現(xiàn)的用MEM細胞培養(yǎng)基4.5～4.9g、硫酸軟骨素12～13g、低分子右旋糖酐4.8～5.2g、地塞米松12～14mg、抗生素48～52mg和HEPES 4.5～5.0g，固體分別用去離子水溶解，依次混合，加去離子水至500ml，混合均勻，調(diào)PH值達7.2～7.4，分裝、封口，配制出成品，4℃保存。使用時，可添加少量的氨基酸衍生物。
為提高配制過程的安全性，保持成份的性質(zhì)穩(wěn)定，能隨時配制出成品，還采取如下措施(1)將MEM細胞培養(yǎng)基用去離子水溶解、過濾，分裝、封口，即為半成品，高壓滅菌后，-10℃以下冷凍保存。
(2)將硫酸軟骨素用去離子水溶解、過濾，分裝、熔封封口，即為半成品，經(jīng)高壓滅菌后，冰箱4℃保存。
(3)將低分子右旋糖酐用去離子水溶解、過濾，分裝、熔封封口，即為半成品，經(jīng)高壓滅菌后，4℃保存。
(4)將HEPES用去離子水溶解、過濾、除菌后，分裝在安瓶中，熔封封口，即為半成品，做細菌培養(yǎng)合格后，室溫或4℃保存。
(5)所用的抗生素可以是妥布霉素和慶大霉素中的一種。
由于主要成份相對簡單，加入硫酸軟骨素和低分子右旋糖酐可明顯提高角膜內(nèi)皮細胞活性的保存效果，在保存期間和手術(shù)中可維持近乎生理的角膜厚度。更突出的是，加入地塞米松可以穩(wěn)定細胞的溶酶體膜及其他生物膜，增強細胞對毒素和損害的抵御能力，更好地保持內(nèi)皮細胞的形態(tài)和功能。配制過程科學(xué)，根據(jù)各成份的特點，高壓滅菌或微孔濾膜除菌制成無菌高濃度的半成品，均應(yīng)用制藥方式封裝，以保持成份的性質(zhì)穩(wěn)定，可隨時配制出成品，配制簡單且安全。本發(fā)明可使角膜活性的保存時間達2周以上，存放期間內(nèi)皮細胞活性穩(wěn)定、變化小，可與Optisol相匹配。酶組織化學(xué)檢查顯示隨保存時間的延長，本發(fā)明可比Optisol維持更高的內(nèi)皮細胞代謝功能。經(jīng)臨床應(yīng)用，角膜保存7天以上后再使用，術(shù)后1～4周植片內(nèi)皮細胞數(shù)均超過1500個/mm2。本發(fā)明所需原料易得，價格低廉，經(jīng)濟性好，適合國內(nèi)中期保存法，可成為當前我國眼庫中一種理想的中期保存液，填補國內(nèi)空白。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步，其實施效果也是顯而易見的。
為能清楚地說明本方案的技術(shù)特點，現(xiàn)通過具體實施例，對其進行詳細闡述。
實施例配方1MEM細胞培養(yǎng)液的配制稱取4.5g MEM細胞培養(yǎng)基，放入燒杯中，用去離子水溶解，攪拌至全溶，過濾，自濾器上加去離子水至250ml，裝于玻璃瓶中，按靜脈輸液制備方法封口后，進行高壓滅菌，-10℃以下冷凍保存。
硫酸軟骨素的配制稱取溶質(zhì)12g，放入燒杯中，用去離子水溶解，攪拌至全溶，過濾，自濾器上加去離子水至100ml，裝于安瓶中，熔封封口后，高壓滅菌，冰箱4℃保存。
低分子右旋糖酐的配制稱取溶質(zhì)5.2g，放入燒杯中，用去離子水溶解，攪拌至全溶，過濾，自濾器上加去離子水至50ml，裝于安瓶中，熔封封口后，高壓滅菌，冰箱4℃保存。
HEPES的配制稱取溶質(zhì)4.5g，放入燒杯中加去離子水20ml溶解后，用1mol NaOH調(diào)PH至7.5～8.0后，用0.25μm微孔濾器(無菌，一次性用)除菌，裝于高壓滅菌的安瓶中，熔封封口后，做細菌培養(yǎng)，合格后，室溫或冰箱4℃保存。
在萬級凈化間、百級凈化臺內(nèi)，按無菌操作法將250ml MEM細胞培養(yǎng)液，100ml硫酸軟骨素、50ml低分子右旋糖酐、12mg地塞米松、48mg妥布霉素和20mlHEPES依次放入燒杯中，加去離子水至500ml，用玻璃棒攪勻，用1mol NaOH調(diào)PH值至7.2，分裝于玻璃安瓶中，熔封封口后，做細菌培養(yǎng)，合格后，冰箱4℃保存。
配方2MEM細胞培養(yǎng)液的配制稱取4.7g MEM細胞培養(yǎng)基，按配方1所述步驟配制。
硫酸軟骨素的配制稱取溶質(zhì)12.5g，按配方1所述步驟配制。
低分子右旋糖酐的配制稱取溶質(zhì)5.0g，按配方1所述步驟配制。
HEPES的配制稱取溶質(zhì)4.75g，按配方1所述步驟配制。
在萬級凈化間、百級凈化臺內(nèi)，按無菌操作法將250ml MEM細胞培養(yǎng)液、100ml硫酸軟骨素、50ml低分子右旋糖酐、13mg地塞米松、50mg妥布霉素和20mlHEPES依次放入燒杯中，加去離子水至500ml，用玻璃棒攪勻，用1mol NaOH調(diào)PH值至7.4，分裝于玻璃安瓶中，熔封封口后，做細菌培養(yǎng)，合格后，冰箱4℃保存。
配方3MEM細胞培養(yǎng)液的配制稱取4.9g MEM細胞培養(yǎng)基，按配方1所述步驟配制。
硫酸軟骨素的配制稱取溶質(zhì)13g，按配方1所述步驟配制。
低分子右旋糖酐的配制稱取溶質(zhì)4.8g，按配方1所述步驟配制。
HEPES的配制稱取溶質(zhì)5.0g，按配方1所述步驟配制。
在萬級凈化間、百級凈化臺內(nèi)，按無菌操作法將250ml MEM細胞培養(yǎng)液、100ml硫酸軟骨素、50ml低分子右旋糖酐、14mg地塞米松、52mg慶大霉素和20mlHEPES依次放入燒杯中，加去離子水至500ml，用玻璃棒攪勻，用1mol NaOH調(diào)PH值至7.3，分裝于玻璃安瓶中，熔封封口后，做細菌培養(yǎng)，合格后，冰箱4℃保存。
1.兔角膜內(nèi)皮活性試驗在100只兔角膜中各取25只，分別存于本發(fā)明三個配方和Optisol的各10ml保存液中，冰箱4℃保存，保存時間分別是5天、7天、10天、15天和20天。每次各取5只，行0.25％錐蘭加1％茜素紅聯(lián)合染色，用雙目顯微鏡觀察內(nèi)皮細胞活性密度和活性率，結(jié)果見表1。由表1看出，本發(fā)明三個配方均具有較好的角膜活性保存效果，與Optisol相接近。同時還看出本發(fā)明的活性率隨時間的變化較小，性質(zhì)穩(wěn)定，存放20天的活性率達90.5％以上。
2.兔角膜內(nèi)皮細胞酶組織化學(xué)染色在行錐蘭染色前，取保存于各液7天、15天的兔角膜各4只，切片，另取正常兔角膜4只切片作對照組，行酶組織化學(xué)染色，即測琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶三種酶，測每種酶時，從每只角膜各取切片4張，同一種孵育液孵育。三種酶染色均呈現(xiàn)反應(yīng)，分析結(jié)果見表2和表3。每種酶的透光密度值(OPTDM值)與酶的活性呈反比。由表2和表3可看出，隨保存時間的延長，本發(fā)明可較Optisol維持更高的內(nèi)皮細胞代謝功能。
3.用本發(fā)明對人角膜進行保存，并應(yīng)用于臨床。
先后對67位角膜病患者(均為單眼發(fā)病)進行角膜移植術(shù)，使用67只人角膜，保存于本發(fā)明和Optisol中的角膜分別為37只和30只，其中有2只因全角膜移植，沒有剩余邊緣角膜進行內(nèi)皮染色觀察。
臨床觀察結(jié)果見表4和表5。由表4和表5可看出，對保存于本發(fā)明保存液中的37只角膜平均保存6.5天，均獲透明愈合效果，其植片內(nèi)皮細胞活性率均在90％以上，對術(shù)后1～4周內(nèi)皮細胞進行了檢查，植片內(nèi)皮細胞數(shù)平均達2204.56個/mm2。
權(quán)利要求
1.一種角膜活性保存液，其特征是在保存液中(以500ml計)含有MEM細胞培養(yǎng)基4.5～4.9g、硫酸軟骨素12～13g、低分子右旋糖酐4.8～5.2g、地塞米松12～14mg、抗生素48～52mg和HEPES 4.5～5.0g，余者為去離子水，將它們依次混合均勻，調(diào)PH值達7.2～7.4，經(jīng)分裝、封口成成品，4℃保存。
2.按權(quán)利要求1所述的角膜活性保存液，其特征是將所述的MEM細胞培養(yǎng)基經(jīng)溶解、過濾、分裝、封口、高壓滅菌后，-10℃以下冷凍保存。
3.按權(quán)利要求1所述的角膜活性保存液，其特征是將所述的硫酸軟骨素經(jīng)溶解、過濾、分裝、封口、高壓滅菌后，4℃保存。
4.按權(quán)利要求1所述的角膜活性保存液，其特征是將所述的低分子右旋糖酐經(jīng)溶解、過濾、分裝、封口、高壓滅菌后，4℃保存。
5.按權(quán)利要求1所述的角膜活性保存液，其特征是將所述的HEPES經(jīng)溶解、過濾除菌、分裝、封口、做細菌培養(yǎng)合格后，室溫或4℃保存。
6.按權(quán)利要求1所述的角膜活性保存液，其特征是所述的抗生素是妥布霉素或慶大霉素。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種角膜活性保存液的技術(shù)方案,該方案的特點是在保存液中(以500ml計)含有MEM細胞培養(yǎng)基4.5～4.9g、硫酸軟骨素12～13g、低分子右旋糖酐4.8～5.2g、地塞米松12～14mg、抗生素48～52mg和HEPES4.5～5.0g,余者為去離子水,將它們依次混合,調(diào)pH值達7.2～7.4,分裝,封口,4℃保存。本發(fā)明配制方便,角膜保存效果好,是當前我國眼庫中一種理想的中期角膜保存液。
文檔編號A01N1/02GK1262866SQ99112089
公開日2000年8月16日 申請日期1999年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月12日
發(fā)明者董曉光, 謝立信, 張新晨, 史偉云, 袁鳳波, 李偉, 邵青 申請人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院眼科研究所