專利名稱：分子標(biāo)記技術(shù)在快速鑒定雜交稻種真?zhèn)魏图兌确矫娴膽?yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)在產(chǎn)業(yè)方面的應(yīng)用，確切地說是分子標(biāo)記(SCAR-Sequence Characterized Amplified Region標(biāo)記)技術(shù)在快速準(zhǔn)確鑒定水稻雜交組合/品種真實性和純度方面的應(yīng)用。
水稻是我國的主要糧食作物之一。我國自1976年率先推廣雜交水稻以來，種植面積不斷擴(kuò)大，目前已占全國水稻種植面積的50％，其產(chǎn)量卻占水稻總產(chǎn)量的60％以上。隨著雜交水稻種植面積的不斷擴(kuò)大和雜交組合的日益增多，假種坑農(nóng)事件亦不斷出現(xiàn)。假種一方面是制種過程中生物學(xué)混雜(如串粉等)以及收獲、脫粒、加工、貯運過程中的機(jī)械性混雜引起的，另一方面是不法商人為牟取暴利人為造假引起的。這就迫切需要尋找一種快速有效地鑒定雜交水稻組合真實性和純度的方法。否則不僅會擾亂種子市場給農(nóng)民和國家造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，同時也將制約雜交水稻的推廣應(yīng)用。
過去傳統(tǒng)的鑒定方法是依據(jù)植株的形態(tài)特征和田間表現(xiàn)，需要在適宜播種季節(jié)前借助溫室或異地溫暖地區(qū)(如海南)進(jìn)行種植后方能判斷。雖然該方法的結(jié)論較為可靠，但卻耗時費力，不能有效地起到“打假”的作用。
八十年代，我國學(xué)者曾利同功酶作標(biāo)記進(jìn)行雜交種子的快速鑒定。由于同功酶檢測的多態(tài)性較少，且易受環(huán)境條件的影響，加之雜交稻組合種類增多，該方法已無能為力。
進(jìn)入九十年代，在分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)各種各樣的分子標(biāo)記技術(shù)相繼問世，尤其是威廉姆斯(Williams)等建立的RAPD(Random amplified poly-morphic DNA)分子標(biāo)記技術(shù)，為實驗室快速鑒定雜交稻種子的真實性和純度提供了一條新的途徑。我國學(xué)者陳洪等曾利用RAPD技術(shù)在300個隨機(jī)引物中篩選出引物P18能將汕優(yōu)63及其不育系珍汕97A加以區(qū)別。由于汕優(yōu)63與其不育系珍汕97A在種子外形上完全一致，容易混淆，雖然汕優(yōu)63與其恢復(fù)系明恢63帶型一致，但兩者在種子外形上差異十分明顯，能夠肉眼分辨，故該引物在一定范圍內(nèi)可以用來鑒別汕優(yōu)63(《科學(xué)通報》,1996,41(9),833～836)。本院亦曾利用RAPD技術(shù)對汕優(yōu)63及其三系(《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》,1996,24(3),193～195)，協(xié)優(yōu)63及其三系(《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》,1996,24(4),297～298)，汕優(yōu)63、汕優(yōu)64、汕優(yōu)皖3及其相應(yīng)的三系(《作物學(xué)報》，待發(fā)表)，以及協(xié)優(yōu)系列雜交水稻組合及其親本(《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》1999,27(2)，待印刷)的鑒別工作作了大量的研究，也找到了若干個引物可以用來鑒別上述雜交水稻不同組合及其親本。但由于RAPD技術(shù)穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，再者，目前我國推廣種植的雜交水稻組合很多，不同的組合其適應(yīng)種植的季節(jié)和區(qū)域又各有不同，一旦鑒定有誤，將直接危害水稻生產(chǎn)。
本發(fā)明綜合而又有序地使用了分子生物學(xué)的相關(guān)技術(shù)，其目的在于為雜交水稻種子的鑒定提供一種快速、準(zhǔn)確且可實際應(yīng)用的方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，對選定的水稻雜交組合及其親本利用10個堿基的寡核苷酸隨機(jī)引物進(jìn)行一系列分子生物學(xué)技術(shù)處理和實驗，依次篩選到RAPD標(biāo)記，對RAPD標(biāo)記進(jìn)行克隆和測序，依此設(shè)計并合成特異性PCR(Polymerase Chain Reaction)引物，進(jìn)而利用SCAR標(biāo)記對雜交水稻不同組合及其親本進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定。
本方法的具體過程如下首先用DNA提取液自雜交水稻各種組合及其親本的種?；蛐迈r葉片中提取基因組DNA。
提取的基因組DNA同10個堿基寡核苷酸隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD多態(tài)性分析，從中篩選出擴(kuò)增條帶差異明顯、直觀感強(qiáng)的RAPD標(biāo)記。將此標(biāo)記自瓊脂糖凝膠中分離、提取后在相同的反應(yīng)條件下進(jìn)行RAPD重擴(kuò)增，從而得到增強(qiáng)的RAPD標(biāo)記。
將重擴(kuò)增后的RAPD標(biāo)記分離、純化后克隆到載體上，測定其多態(tài)性標(biāo)記的DNA堿基序列，確定其兩端的堿基組成。
根據(jù)克隆片段兩端的堿基序列設(shè)計出穩(wěn)定性較強(qiáng)的特異性雙引物(PCR引物)。雙引物的堿基序列同RAPD標(biāo)記兩端的堿基互補，其通常是20-30個堿基的寡核苷酸。
利用特異性雙引物同欲被鑒定的對象基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)得到SCAR標(biāo)記，分析SCAR標(biāo)記就可鑒定其真實性和純度。
非限定實施例敘述如下一、特異性雙引物設(shè)計1．選擇我國主栽的雜交水稻組合及其親本，其組合品種的親緣關(guān)系如表一。
表一實驗的品種、組合及親緣關(guān)系
2．基因組DNA的提取取單粒種子研磨至粉末狀，加600ul DNA抽提液，50℃條件下水浴一小時，在此期間不斷攪拌，4℃靜置12小時，10000rpm離心分離10min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5ml eppendorf離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置片刻，10000rpm離心分離10min，棄去上清液，沉淀用200ul的70％乙醇洗滌，10000rpm離心10min，重復(fù)洗滌兩次，沉淀室溫干燥后溶于20ul重蒸餾水中。
抽提液的組成為100mmol.L-1Tris-HCl,20mmol.L-1EDTA,500mmol.L-1NaCl,1.5％SDS。
3．RAPD多態(tài)性分析選取600個由10堿基組成的寡核苷酸隨機(jī)引物(美國Operon公司出品)，利用RAPD技術(shù)對表一所示的雜交組合和親本進(jìn)行多態(tài)性分析。
提取的基因組DNA進(jìn)行RAPD擴(kuò)增反應(yīng)，RAPD擴(kuò)增反應(yīng)條件是每35ul反應(yīng)體積中包括50ng左右的基因組DNA、0.2umol.L-1的引物、2UTag DNA聚合酶和0.1mmol.L-1dNTP，用9600型DNA擴(kuò)增儀(美國Perkin-Elmer公司出品)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)的程序為94℃ 5min變性后，按94℃ 1min、36℃ 1min，72℃ 2min的順序進(jìn)行30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃條件下延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，5v/cm 1.5h，以HaeⅢ酶切的φ×174DNA作為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，溴乙錠染色，紫外燈下觀察并拍照。
在600個引物中有28個引物能夠在不同的雜交組合及其親本之間擴(kuò)增出有明顯多態(tài)性的條帶，其中8個引物擴(kuò)增出的12條多態(tài)性條帶表現(xiàn)為較強(qiáng)的特異性差異，這種差異表現(xiàn)為條帶的有或沒有，能清晰又易于分辨，具有較好的直觀感。具體結(jié)果見表二。
表二RAPD多態(tài)性標(biāo)記及應(yīng)用<
<p>將上述8個RAPD標(biāo)記(OPK17/1400,OPP07/700(L),OPP07/700(H),OPC09/1200,OPW19/900,OPR15/1400,OPH03/1700,OPT04/700,OPG13/700)自瓊脂糖膠中分離提取后，以此為模板在相同的RAPD反應(yīng)條件下再擴(kuò)增一次，提取純化后得到增強(qiáng)的RAPD標(biāo)記。
4．克隆、測序?qū)⒃鰪?qiáng)的RAPD標(biāo)記克隆到載體pCRTM2.1(美國Invitrogen公司出品)上，用ABI310型DNA自動測序儀(美國Perkin-Elmer公司出品)測定其呈多態(tài)性標(biāo)記的DNA堿基序列，確定其兩端的堿基組成。
5．設(shè)計PCR引物與SCAR標(biāo)記根據(jù)RAPD標(biāo)記中兩端的堿基序列和PCR引物特殊要求設(shè)計出穩(wěn)定性較強(qiáng)的特異性雙引物(PCR引物)，用PCR引物同水稻雜交組合及其親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為每35ul反應(yīng)體積中包括0.1mmol.L-1的dNTP混合物，正向和反向引物各0.2umol.L-1(根據(jù)鑒別水稻雜交組合/品種的不同而選擇適宜的引物，具體情況見表三)，2U Tag DNA聚合酶和50ng左右的水稻基因組DNA，用美國Perkin-Elmer公司的9600型DNA擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序為94℃ 5min℃變性后，按94℃1min、55℃ 1min、72℃ 2min的設(shè)置進(jìn)行35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后在72℃下延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4％瓊脂糖凝膠上電泳1.5h(5v/cm)，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，Polaroid一次成像拍照，根據(jù)標(biāo)記條帶的有無即SCAR標(biāo)記對雜交水稻組合和親本進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定。
表三雙引物與SCAR標(biāo)記
二、鑒定應(yīng)用實施例例1利用分子標(biāo)記(SCAR標(biāo)記)對汕優(yōu)63自然群體和人工群體種子進(jìn)行真實性和純度的鑒定。
自然群體指雜交種直接取自制種基地，其純度以海南種植鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。人工群體指人為設(shè)計的，選用高純度(100％)的汕優(yōu)63，人為摻入與其種子外形相同的不育系A(chǔ)、保持系B以及其他外形相似的種子，其純度是事先設(shè)定的。
首先從被檢種子群體中隨機(jī)取300粒種子，逐個提取其基因組DNA。選用4#正、反向PCR引物(見表3)對被檢測的300粒種子和標(biāo)準(zhǔn)的汕優(yōu)63基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)產(chǎn)物在1.4％的瓊脂糖凝膠上電泳1.5h(5v/cm)，紫外燈下和標(biāo)準(zhǔn)的汕優(yōu)63電泳結(jié)果對照，觀察是否有大小為800堿基的條帶即SCAR標(biāo)記。若有即為真的汕優(yōu)63種子，若無此帶即不是汕優(yōu)63種子，鑒定結(jié)果見表四和圖一。
表四SCAR標(biāo)記鑒定和海南種植鑒定的比較
圖一為用SCAR標(biāo)記對汕優(yōu)63種子真實性和純度進(jìn)行鑒定的電泳結(jié)果(顯示部分樣品電泳)。圖一a為自然群體1是標(biāo)準(zhǔn)汕優(yōu)63,2-49是被檢測的種子，其中27無SCAR標(biāo)記帶即不是汕優(yōu)63種子。圖一b為人工群體1是標(biāo)準(zhǔn)汕優(yōu)63,2-19是被檢測的種子，其中4、5、8、9、12、13無SCAR標(biāo)記帶即不是汕優(yōu)63種子。
例2安徽省巢湖農(nóng)技部門在協(xié)青早不育系(協(xié)青早A)的繁殖中混雜了保持系協(xié)青早B，這將極大影響協(xié)優(yōu)雜交稻的制種工作，為確定混雜程度，我們使用7#正、反向PCR引物(見表3)對其樣品進(jìn)行SCAR標(biāo)記的鑒定，結(jié)果顯示混雜率為3％，確定為不合格不育系，不能在制種中使用，后經(jīng)當(dāng)季田間檢驗，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，從而避免了在生產(chǎn)上的損失。
權(quán)利要求
1.一種分子標(biāo)記技術(shù)在快速準(zhǔn)確鑒定水稻雜交組合/品種真實性和純度方面的應(yīng)用，用隨機(jī)引物對水稻雜交組合及其親本進(jìn)行一系列相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)處理和實驗，其特征在于(1)雜交組合及其親本基因組DNA的提??；(2)利用10個堿基的寡核苷酸隨機(jī)引物同提取的基因組DNA進(jìn)行RAPD多態(tài)性分析，得到RAPD標(biāo)記，并對其重擴(kuò)增、提取和純化；(3)將純化后的RAPD標(biāo)記克隆到載體上，測定其DNA堿基序列；(4)根據(jù)克隆片段兩端的堿基序列設(shè)計出特異的PCR引物，利用該引物進(jìn)行SCAR標(biāo)記。
全文摘要
一種分子標(biāo)記技術(shù)在快速準(zhǔn)確鑒定水稻雜交組合/品種真實性和純度方面的應(yīng)用，就是將PAPD標(biāo)記經(jīng)克隆、測序后設(shè)計出穩(wěn)定的PCR引物，進(jìn)而利用SCAR標(biāo)記可在1～2天內(nèi)對水稻雜交組合/品種的種子進(jìn)行真實性和純度鑒定，其準(zhǔn)確度與種植鑒定的準(zhǔn)確度一樣可靠。本發(fā)明可直接應(yīng)用于雜交水稻不同組合及其親本的真實性和純度的鑒定。
文檔編號A01H1/02GK1237328SQ9910376
公開日1999年12月8日 申請日期1999年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月10日
發(fā)明者楊劍波, 汪秀峰, 李莉, 向太和, 倪大虎, 王永杰, 皮桃花, 張毅, 吳家道 申請人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院