專利名稱：一種哺乳類動(dòng)物生雌性控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于哺乳類動(dòng)物性別比例控制技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及在雌性哺乳類動(dòng)物體內(nèi)殺死雄性胚胎的方法。
在公知技術(shù)中，與本發(fā)明較為相關(guān)的技術(shù)是利用含有H-Y抗體的抗血清在動(dòng)物體外鑒別胚胎的性別。在這方面，南朝鮮的Im等人(Anim.Biotech.Bull.34-37，1991)，國內(nèi)許曉霽等人(東北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2∶186-191，1990)近年來都曾用含有H-Y抗體的抗血清鑒定過小鼠和兔子胚胎的性別，其準(zhǔn)確率達(dá)80%左右。但由于這種方法需要先將胚胚移到動(dòng)物體外，經(jīng)鑒定性別后，再移回動(dòng)物體內(nèi)，所以不僅技術(shù)復(fù)雜，操作麻煩，同時(shí)還降低了胚胎的活力，使其成活率下降，致使這種方法難以在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于提供一種在哺乳類動(dòng)物體內(nèi)能有效地殺死雄性胚胎并使之多生雌性后代的方法。
本發(fā)明所依據(jù)的理論是免疫學(xué)原理，即在雄性胚胎中存在有H-Y抗原，可與H-Y抗體發(fā)生反應(yīng)，如有補(bǔ)體存在，則可介導(dǎo)補(bǔ)體參與反應(yīng)，從而導(dǎo)致雄性胚胎溶解死亡。本發(fā)明的技術(shù)解決方案可以包括下述兩個(gè)方面1、在雌性動(dòng)物受精后3-5天，胚胎發(fā)育至8細(xì)胞期至早期囊胚階段時(shí)，把H-Y單克隆抗體與補(bǔ)體同時(shí)輸入懷孕動(dòng)物的子宮角，在懷孕動(dòng)物體內(nèi)殺死雄性胚胎。
2、一種用于在懷孕動(dòng)物體內(nèi)殺死雄性胚胎的H-Y單克隆抗體的制備方法，包括(1)用G57BL/6純系小鼠制取脾細(xì)胞;
(2)篩選并準(zhǔn)備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞;
(3)飼養(yǎng)細(xì)胞;
(4)將脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合;
(5)篩選含有雜交瘤的陽性孔及克隆;
(6)收集H-Y單克隆抗體;
(6.1)血清DMEM培養(yǎng)上清液;
(6.2)無血清DMEM培養(yǎng)上清液;
(6.3)給C57BL/6雌性小鼠接種;
(7)對雜交瘤細(xì)胞及H-Y單克隆抗體進(jìn)行鑒定，其主要特點(diǎn)是
(1.1)將雄性小鼠脾細(xì)胞注射給雌性小鼠的時(shí)間為連續(xù)56-91天，每7天注射一次，于第42-77天時(shí)進(jìn)行眼眶采血，檢測血清抗體效價(jià);
(5.1)用生物素化第二抗體和酶標(biāo)記親合素代替常規(guī)ELISA的酶標(biāo)記第二抗體，用含有BSA(牛血清白蛋白)的PBS(磷酸鹽緩沖液)作為沖洗液沖洗ELISA反應(yīng)板;
(5.1.1)BSA的濃度為0.1%。
本發(fā)明具有以下積極效果1.本發(fā)明為哺乳類動(dòng)物特別是家畜生雌性控技術(shù)的應(yīng)用提供了一條新的途徑。通過對30只小鼠和10只家兔的試驗(yàn)，在獲得的100多只后代中，雌性后代的百分率平均為84%以上。
2、使用本發(fā)明無論多胎動(dòng)物還是單胎動(dòng)物均可多生雌性。在多胎動(dòng)物中，如綿羊、山羊，用PMSG(孕馬血清促性腺激素)和HCG(人絨毛膜促進(jìn)腺激素)使動(dòng)物多排卵，然后再應(yīng)用H-Y單克隆抗體。這樣在殺死雄性胚胎之后，所剩雌性胚胎的數(shù)目比自然排卵的總數(shù)還多，因此，在使動(dòng)物多生雌性后代的同時(shí)，后代總數(shù)也有所增加。在單胎動(dòng)物中，如奶牛，如果懷孕雌性胚胎，則在應(yīng)用H-Y單克隆抗體之后，對其無任何不良影響;若懷孕雌性胚胎，則將其殺死。待過一個(gè)發(fā)情周期后，再行配種，其結(jié)果使奶牛多生雌性后代。
3、成本低。據(jù)計(jì)算，利用本發(fā)明使家兔、綿羊、奶牛每生一只(頭)雌性后代的花費(fèi)僅分別為0.5元、5元和10元人民幣，而產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益則比自然生產(chǎn)提高一倍至幾十倍。
4、方法簡便，容易操作，便于推廣。應(yīng)用本發(fā)明時(shí)，只需把H-Y單克隆抗體輸入子宮，故一般同行技術(shù)人員都可以熟練掌握操作。對H-Y單克隆抗體，只要具備所需的實(shí)驗(yàn)室條件，按本發(fā)明的方法，步驟便可制取。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述實(shí)施例1應(yīng)用H-Y單克隆抗體可使小鼠多生雌性后代。具體做法是分別挑選30只2月齡雌性和20只3月齡體大，健康的雄性普通昆明小鼠(北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供)，雌鼠分10個(gè)籠子飼養(yǎng)，公鼠則一個(gè)籠子飼養(yǎng)一只，自由采食顆粒飼料和飲水。試驗(yàn)期間白天開日光燈增強(qiáng)光照，晚間關(guān)燈。試驗(yàn)開始時(shí)，先對雌性小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵處理。超排處理的第一天，每只小鼠腹腔注射PMSG(衛(wèi)生部長春生物制品廠生產(chǎn))3單位，第三天同法注入HCG(上海生物制品廠生產(chǎn))3單位。第三天傍晚把按上述方法處理過的小鼠與公鼠合籠。次日檢查陰道栓，并作記錄。見栓后的第3天和第4天腹腔注入0.05毫升戊巴比妥鈉(33mg/ml)，隨后將一外徑為0.1-0.2毫米的塑料軟管通過陰道插入子宮，并通過該導(dǎo)管輸入單克隆抗體及補(bǔ)體各0.5毫升，提起后腿約1分鐘，放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。21天后生產(chǎn)。在小鼠生長至半月齡后可檢查雌雄比例。結(jié)果表明，后代中雌性占85%。
實(shí)施例2應(yīng)用H-Y單克隆抗體可使家兔多生雌性后代。具體做法是挑選10只4月齡健康母兔和5只6月齡公兔，單兔單籠飼養(yǎng)，自由采食配合飼料和飲水。試驗(yàn)開始時(shí)，先對母兔給予超排處理。超排處理的第一天背部皮下注射PMSG 100單位，第3天同法射HCG80單位后，放入公兔交配。于交配后第3天和第4天，由一人固定母兔，一人將一外徑為0.5毫米的橡膠導(dǎo)管通過陰道，插入子宮約3厘米，并通過該管將2毫升單克隆抗體和2毫升1∶20倍稀釋的補(bǔ)體輸入子宮。然后提起后腿約1分鐘。試驗(yàn)結(jié)果表明，后代中雌性占83.3%。
實(shí)施例3應(yīng)用H-Y單克隆抗體可使奶牛多生雌性。奶牛是單胎動(dòng)物，因此不必作超排處理。于人工授精或交配后第3天和第5天，先直腸檢查診斷黃體在那一側(cè)卵巢，然后通過一市售的沖取胚胎所用的橡膠管，將H-Y單克隆抗體和1∶20倍稀釋的補(bǔ)體各10毫升，輸入黃體所在一側(cè)的子宮角，隨后用手通過直腸由后向前按摩子宮角1分鐘。如懷雌性，則在282天前后出生，若懷有雄性，則被殺死，一個(gè)發(fā)情周期后又發(fā)情，這時(shí)可再配種或授精，并需再次輸入H-Y單克隆抗體和補(bǔ)體。
實(shí)施例4H-Y單克隆抗體的制備1、脾細(xì)胞的準(zhǔn)備選取10只10周齡純系C57BL/6雌性小鼠，用同系雄性小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)腹腔進(jìn)行免疫，每7天一次，每次劑量為2.8×10^P6細(xì)胞，連續(xù)注射56-91天，于第42-77天時(shí)進(jìn)行眼眶采血，用精子細(xì)胞毒試驗(yàn)檢測血清抗體效價(jià)(其方法由Goldbery)描述，見Nature雜志232∶478，1971)。挑選4只血清抗體效價(jià)好的小鼠于最后一次免疫注射的第3天，眼眶放血致死小鼠無菌取出脾臟，用無血清DMEM培養(yǎng)液沖洗后置培養(yǎng)皿中，用6號針頭在脾臟上扎數(shù)個(gè)小孔，用注射器通過4號針頭向脾臟內(nèi)注射DMEM，以便沖出脾細(xì)胞，細(xì)胞懸液經(jīng)100目不銹鋼篩過濾除去小組織塊，取細(xì)胞樣品計(jì)數(shù)。
2、sp2/o骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，經(jīng)快速解凍后，用無血清DMEM洗兩遍以除去其中的冷凍保護(hù)劑，換上血清DMEM，并移入培養(yǎng)瓶中，置5%CO^Q2，37℃條件下培養(yǎng)，待其生長良好時(shí)，換以8-氮雜鳥嘌呤-DMEM繼續(xù)培養(yǎng)3代，取部分細(xì)胞用HAT-DMEM選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，證明細(xì)胞不能在其中生長時(shí)，恢復(fù)血清DMEM培養(yǎng)，待其達(dá)到對數(shù)生長期，取樣計(jì)數(shù)，準(zhǔn)備融合。
3、飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備于融合前和每次克隆前準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞。選擇體格較大的C57BL/6雌性小鼠，斷頸法處死后，消毒皮膚，無菌條件下向腹腔注射無血清DMEM10-15毫升，輕按腹部1-2分鐘后，抽取腹水，離心棄上清液，換以含血清DMEM，分加在96孔培養(yǎng)板上，每孔0.1毫升，培養(yǎng)過夜。
4、細(xì)胞融合及培養(yǎng)把脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按7.5∶1的比例混合于50毫升離心管中，100rpm(約200g)離心8分鐘，盡量棄去上清液，用手指輕彈管底，使細(xì)胞混勻，置離心管于37℃水浴中，0.5毫升預(yù)溫的PEG(聚乙二醇)，緩慢滴入細(xì)胞懸液中邊加邊彈動(dòng)管底，PEG于1分鐘內(nèi)加完，37℃水浴中靜止90分鐘后，緩慢滴入預(yù)溫的無血清DMEM，前5分鐘加5毫升，輕輕混勻，防止沖散雜交瘤細(xì)胞，再于5分鐘內(nèi)加入10毫升，最后5分鐘加入20毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管后，700rpm離心5分鐘，棄去上清液，緩慢加入HAT-DMEM，用吸管輕輕混勻，移入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。每4天換一次培養(yǎng)液，第12天換以HT-DMEM，第16天換以含血清DMEM。
5、篩選含有雜交瘤的陽性孔及克隆以ELISA篩選陽性孔，其操作如下割下普通昆明小鼠尾巴，剝下皮膚，用壬氏液沖洗干凈，放入1%胰酶溶液中，10-30分鐘后，取出皮膚，用壬氏液洗3遍，將皮膚平貼于培養(yǎng)皿底上，加入1毫升0.1%胰酶溶液，用一玻璃棒輕輕從皮膚上刮下表皮細(xì)胞，用吸管反復(fù)吹打，直到細(xì)胞團(tuán)散開。將細(xì)胞按每孔0.05毫升分加到96孔ELISA反應(yīng)板上，每孔約10^P5細(xì)胞，放入4℃冰箱過夜。然后按下述步驟操作0.1%BSA--PH7.4,0.01MPBS洗3遍↓加0.05毫升H-Y單克隆抗體1小時(shí)↓振動(dòng)BSA-PBS洗3遍加0.05毫升生物素化第二抗體(11000)1小時(shí)↓振動(dòng)BSA-PBS洗3遍↓加0.05毫升酶標(biāo)親合素(11000)0.5小時(shí)↓振動(dòng)BSA-PBS洗5遍↓加0.05毫升底物溶液(聯(lián)苯二胺)10－20分鐘↓振動(dòng)加入0.05毫升 2M硫酸終止反應(yīng)↓酶聯(lián)儀上測定OD值那些OD值顯著高于陰性對照的孔為陽性孔。陰性對照孔只是不加入H-Y單克隆抗體，而加入雌性小鼠血清，其余操作同上述步驟。
6、收集H-Y單克隆抗體(1)血清DMEM培養(yǎng)上清液將經(jīng)過第三次克隆的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，每隔2-3天收集一次上清液，上清液經(jīng)2500rpm離心10分鐘，-30℃保存。
(2)無血清DMEM培養(yǎng)上清液收集對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，800rpm離心10分鐘，將細(xì)胞重新懸浮在無血清DMEM中，調(diào)節(jié)至106細(xì)胞/毫升，繼續(xù)培養(yǎng)4-5天，2500rpm離心10分鐘，收集上清液，-30℃保存。
(3)動(dòng)物接種選擇2月齡C57BL/6雌性小鼠10只，每只腹腔注射0.5毫升降植烷(英文名稱pristine)，約3周后，挑選腹部膨大的小鼠，每只再注射生長期雜交瘤細(xì)胞1毫升(10^P6細(xì)胞)，10-15天后，小鼠腹部進(jìn)一步增大，抽取腹水，18，000rpm離心15分鐘，取上清液經(jīng)ELISA檢測效價(jià)后，-30℃保存。
7、雜交瘤細(xì)胞及H-Y單克隆抗體的鑒定(1)對雜交瘤細(xì)胞采用染色體計(jì)數(shù)來鑒定，方法如下取一瓶雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)至生長旺盛期，在收獲前2.5小時(shí)加入秋水仙素，，使最終濃度為0.1微克/毫升。收獲細(xì)胞800rpm離心7分鐘，棄上清液，向管底的細(xì)胞加入5毫升0.75M的氯化鉀溶液，并在37℃水浴中放置15分鐘，再離心，棄去上清液，向管底細(xì)胞緩慢加入5毫升固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)，搖動(dòng)5分鐘，棄去上清液，加入固定液。按上述方法再固定一次后，取少量細(xì)胞滴在載玻片上，吹干，用姬姆薩染色溶液染色15-20分鐘。把載玻片放在顯微鏡下計(jì)算雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目。
通過對200個(gè)雜交瘤細(xì)胞的染色體分析，證明其染色體目為86-114條。在融合前，SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目為72條，而融合后加入了一些脾細(xì)胞的染色體。因此，雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目為86-114條，說明融合成功。
(2)H-Y單克隆抗體的鑒定H-Y單克隆抗體的鑒定包括確定其所屬類別，其對胚胎表面H-抗原的結(jié)合能力兩方面。
A、所屬類別以下述瓊脂雙擴(kuò)散法來分析將用無血清DMEM培養(yǎng)液制備的H-Y單克隆抗體冷凍干燥濃縮約20倍后，加入瓊脂板中間孔中，在周圍孔中分別加入IgG1，IgG2，IgG，(H+L)，IgM等免疫球蛋白。把瓊脂板在培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)，然后觀察到在IgM孔與中間孔中間有反應(yīng)線出現(xiàn)，從而說明H-Y單克隆抗體屬IgM亞類。
B、與胚胎H-Y抗原結(jié)合的能力用胚胎免疫熒光試驗(yàn)證明，方法如下挑選8細(xì)胞期至早期囊胚期胚胎↓用PH7.4,0.01MPBS洗3遍加入124稀釋的單克隆抗體5％CO2,37℃↓45分鐘PBS洗3遍↓11000熒光標(biāo)記第二抗體5％CO2 45分鐘37℃↓PBS洗兩遍↓置熒光顯微鏡下觀察對468枚胚胎分析表明，各有約50%的胚胎表現(xiàn)特異熒光和不表現(xiàn)特異熒光，分別代表雄胚胎和雌胚胎，符合自然性別比例，說明H-Y單克隆抗體能與胚胎H-Y抗原結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種哺乳類動(dòng)物生雌性控方法，其特征在于把H-Y單克隆抗體和補(bǔ)體輸入懷孕動(dòng)物的子宮角，在懷孕動(dòng)物體內(nèi)殺死雄性胚胎。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在向懷孕動(dòng)物體內(nèi)輸入H-Y單克隆抗體的同時(shí)輸入補(bǔ)體。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于可以在雌性動(dòng)物受精后3-5天，胚胎發(fā)育至8細(xì)胞期至早期囊胚階段時(shí)輸入單克隆抗體和補(bǔ)體。
4.一種用于在懷孕動(dòng)物體內(nèi)殺死雄性胚胎的H-Y單克隆抗體的制備方法，包括(1)用C57BL/6純系小鼠制取脾細(xì)胞;(2)篩選并準(zhǔn)備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞;(3)飼養(yǎng)細(xì)胞;(4)將脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合;(5)篩選含有雜交瘤的陽性孔及克隆;(6)收集H-Y單克隆抗體;(6.1)血清DMEM培養(yǎng)上清液;(6.2)無血清DMEM培養(yǎng)上清液;(6.3)給C57BL/6雌性小鼠接種;(7)對雜交瘤細(xì)胞及H-Y單克隆抗體進(jìn)行鑒定;其特征在于(1.1)將雄性小鼠脾細(xì)胞注射給雌性小鼠的時(shí)間為連續(xù)56-91天，每7天注射一次，于第42-77天時(shí)進(jìn)行眼眶采血，檢測血清抗體效價(jià);(5.1)用生物素化第二抗體和酶標(biāo)記親合素代替常規(guī)ELISA的酶標(biāo)記第二抗體，用加有BSA(牛血清白蛋白)的PBS(磷酸鹽緩沖液)作為沖洗液沖洗ELISA反應(yīng)板;(5.1.1)BSA的濃度為0.1%。
全文摘要
本發(fā)明屬于哺乳類動(dòng)物性別比例控制技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及在雌性哺乳類動(dòng)物體內(nèi)殺死雄性胚胎的方法。其特點(diǎn)是把H-Y單克隆抗體和補(bǔ)體輸入懷孕動(dòng)物的子宮角，在懷孕動(dòng)物體內(nèi)殺死雄性胚胎。試驗(yàn)表明，用該方法可以使后代雌性的百分率達(dá)84％以上。本方法操作簡便、安全可靠，適用于各種哺乳類動(dòng)物特別是家畜的雌性擴(kuò)繁生產(chǎn)。
文檔編號A61D19/00GK1062460SQ9210034
公開日1992年7月8日 申請日期1992年1月20日 優(yōu)先權(quán)日1992年1月20日
發(fā)明者曹文廣, 董偉 申請人:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)