本發(fā)明屬于外植體誘導再生領域，具體涉及一種櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法。

背景技術：

1、“喜馬拉雅”櫻花是上海市農(nóng)業(yè)科學院培育的一種適合上海地區(qū)種植的常綠早櫻品種，2023年11月獲得上海市林業(yè)局林木良種證。上海地區(qū)花期11—12月，耐熱性較強，–8℃以上的偶發(fā)性低溫能正常越冬，低于–9℃且持續(xù)1周以上的低溫寒潮，會造成凍害?？共⌒暂^強，同一地區(qū)栽培的日本“染井吉野”櫻花樹上發(fā)現(xiàn)有縮葉病、穿孔性褐斑病、櫻花根癌病的發(fā)生，但在喜馬拉雅櫻花上沒有發(fā)現(xiàn)。

2、“喜馬拉雅”櫻花作為一種珍貴的觀賞植物，在上海地區(qū)冬季盛開粉紅色花朵而受到園林愛好者的青睞，然而，由于其自然繁殖過程緩慢，且受環(huán)境因素影響較大，限制了其在園林綠化中的應用。現(xiàn)有技術中，喜馬拉雅櫻花的繁殖主要依賴于種子繁殖和傳統(tǒng)的扦插方法，這些方法存在繁殖效率低、遺傳變異大、難以規(guī)?；a(chǎn)等問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種利用“喜馬拉雅”櫻花葉片進行離體再生的方法，建立“喜馬拉雅”櫻花直接器官發(fā)生的技術，有效提高增殖效率，縮短種苗繁殖周期，此再生方式可用于遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，有助于今后的基因改良。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

3、一種櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法，包括以下步驟：

4、1)外植體預處理

5、選取櫻花“喜馬拉雅”組培苗葉片作為外植體，用解剖剪將葉片剪成小方塊；

6、2)誘導不定芽再生

7、將剪切好的葉片小方塊接種于誘導培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50～60天，誘導出不定芽再生；

8、其中，所述的誘導培養(yǎng)基以改良ms為基本培養(yǎng)基，并添加了6-芐基腺嘌呤2.0～3.0mg/l、萘乙酸0.01～0.05mg/l、水解酪蛋白0.4～0.5g/l；其中，所述改良ms為nh4no3、kno3、cacl2·2h2o、

9、mgso4·7h2o和kh2po4含量減半的ms培養(yǎng)基；

10、3)增殖培養(yǎng)

11、將不定芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)30～45天，形成叢生芽；

12、

13、光照培養(yǎng)條件為：溫度25～28℃，光照時間14～16小時，光

14、照強度為2000～3000勒克斯；

15、其中，所述的增殖培養(yǎng)基以wpm為基本培養(yǎng)基，并添加6-芐基腺嘌呤0.2～0.5mg/l、吲哚丁酸0.05～0.1mg/l、赤霉素0.4～0.6

16、mg/l、活性炭0.2～0.5g/l；

17、4)生根培養(yǎng)

18、將叢生芽切分成單株，接入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25～30天后

19、生根，得到生根苗；

20、培養(yǎng)條件為：溫度25～28℃，光照時間15～16小時，光照強

21、度為2800～3000勒克斯；

22、其中，所述的生根培養(yǎng)基以ms為基本培養(yǎng)基，并添加了吲哚丁酸0.8～1mg/l、萘乙酸0.2～0.5mg/l、活性炭0.2～0.5g/l；5)煉苗及馴化

23、將櫻花生根苗的組培瓶蓋打開，室溫條件下煉苗4～7天，移栽至基質(zhì)中，保持溫度25～30℃，每天噴霧2次，保持空氣濕度85％以上，覆蓋遮陽網(wǎng)，遮光率50％，馴化培養(yǎng)25～30天，得到幼苗。

24、優(yōu)選地，步驟2)所述的培養(yǎng)條件為黑暗、22～25℃。

25、進一步，步驟2)～4)中所述的誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中分別添加蔗糖25～30g/l和瓊脂粉6.5～7g/l，培養(yǎng)基ph值為5.75～5.85。

26、優(yōu)選地，步驟3)和4)所述的培養(yǎng)條件為溫度23～26℃，光照時間15～16小時，光照強度為2500～3000勒克斯。

27、又，步驟5)中所述基質(zhì)為：草炭土：珍珠巖＝1：1(體積比)。

28、進一步，所述改良ms培養(yǎng)基中，nh4no3含量為800～850mg/l，kno3含量為900～1000mg/l，cacl2·2h2o含量為200～240mg/l，mgso4·7h2o含量為170～200mg/l，kh2po4含量為80～90mg/l。

29、本發(fā)明中，ms培養(yǎng)基的配方，由murashige?t和skoog?f于1962年發(fā)表公布(murashige?t?and?skoog?f，1962，a?revised?medium?for?rapid?growth?and?bioassayswith?tobacco?tissue?cultures.physiol?plant?15：473–479)。

30、本發(fā)明所述wpm(woody?plant?medium)培養(yǎng)基配方，由lloyd和mccown于1980發(fā)表公布(commercially?feasible?micropropagation?of?mountain?laurel,kalmialatifolia，by?use?of?shoot-tip?culture.proc?int?plant?prop?soc?30：420–427)。

31、本發(fā)明中，采用櫻花的葉片進行組織培養(yǎng)，葉片數(shù)量多，外植體取材容易，在誘導培養(yǎng)過程中，添加了6-ba和naa，使葉片誘導少量愈傷組織，從而直接誘導不定芽發(fā)生。本發(fā)明控制6-ba含量在2.0～3.0mg/l，naa含量為0.01～0.05mg/l，同時，添加水解酪蛋白，采用ms大量元素減少的方案，可防止外植體受到毒害，提高不定芽的誘導率。

32、本發(fā)明在增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中添加活性炭可提高增殖系數(shù)，防止愈傷組織生成并促進生根和莖伸長生長。

33、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有的有益效果如下：

34、本發(fā)明利用櫻花的葉片直接誘導不定芽發(fā)生，進行植株的再生，有效提高增殖效率，縮短種苗的繁殖周期至四個月，并且，此再生方式可用于遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，有助于進行基因改良。

35、本發(fā)明利用葉片直接誘導不定芽發(fā)生，誘導率達到75％，增殖系數(shù)得到了很大的提高，增殖系數(shù)在5.5左右，可顯著降低櫻花的種苗生產(chǎn)成本。

技術特征：

1.一種櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法，包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法，其特征在于，步驟2)所述的培養(yǎng)條件為黑暗、22～25℃。

3.根據(jù)權利要求1所述櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法，其特征在于，步驟3)和4)所述的培養(yǎng)條件為溫度23～26℃，光照時間15～16小時，光照強度為2500～3000勒克斯。

4.根據(jù)權利要求1所述櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法，其特征在于，步驟2)～4)中所述的誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中分別添加蔗糖25～30g/l和瓊脂粉6.5～7g/l，培養(yǎng)基ph值為5.75～5.85。

5.根據(jù)權利要求1所述櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法，其特征在于，步驟5)中所述基質(zhì)為：草炭土：珍珠巖＝1：1(體積比)。

6.根據(jù)權利要求1～4任一項所述櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法，其特征在于，所述改良ms培養(yǎng)基中，nh4no3含量為800～850mg/l，kno3含量為900～1000mg/l，cacl2·2h2o含量為200～240mg/l，mgso4·7h2o含量為170～200mg/l，kh2po4含量為80～90mg/l。

技術總結
一種櫻花新品種“喜馬拉雅”的高效不定芽再生方法，以一種常綠新品種“喜馬拉雅”櫻花的葉片為外植體，通過誘導不定芽再生、叢生芽增殖、生根培養(yǎng)后，得到生根組培苗，再煉苗、馴化得到櫻花種苗。本發(fā)明在誘導培養(yǎng)基中添加了一定濃度的6?BA和NAA，通過直接器官再生途徑從葉片外植體誘導不定芽，在增殖培養(yǎng)基中添加6?BA、IBA和GA<subgt;3</subgt;可以實現(xiàn)不定芽形成叢生芽，實現(xiàn)增殖的目的，增殖系數(shù)達到5.5左右，在生根培養(yǎng)基中添加了IBA和NAA，使莖基部形成不定根。利用本發(fā)明的方法進行新品種櫻花的組培快繁，縮短苗木繁殖時間，提高種苗生產(chǎn)效率，建立了櫻花直接器官再生的技術，可作為櫻花遺傳轉(zhuǎn)化的受體。

技術研發(fā)人員：高照亮,李水根,柴華,雋加香
受保護的技術使用者：上海市農(nóng)業(yè)科學院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/9