本發(fā)明屬于生物，尤其涉及一種植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、大豆以種子為主要生產(chǎn)應(yīng)用的對象，是不可替代的植物蛋白和油料來源。種子是農(nóng)業(yè)發(fā)展的核心。利用以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的生物育種通過遺傳改良和基因工程，能夠提高作物產(chǎn)量、降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的風(fēng)險。對不同大豆材料進行組織轉(zhuǎn)化、篩選鑒定出具有良好愈傷誘導(dǎo)能力、再生能力和轉(zhuǎn)化能力，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因和基因編輯工作的開展奠定基礎(chǔ)，其中大豆種子消毒是組織培養(yǎng)的第一步。

2、大豆種子消毒的主要方法包括氯氣消毒、次氯酸鈉消毒、升汞消毒法和二次消毒法。比較常用的方法是氯氣消毒法，但由于氯氣是劇毒氣體，對實驗裝置的氣密性要求很高，并且無法對氯氣濃度和消毒時間進行統(tǒng)一，可能會造成消毒力度過大引起種子活性損傷以及環(huán)境污染。汞的劇毒性以及對環(huán)境的污染大，升汞消毒法在國際上已經(jīng)被淘汰。二次消毒法過程太繁瑣，且時間很長。而次氯酸鈉消毒大豆的濃度目前還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此，一種合適的次氯酸鈉消毒種子法對于解決大豆組織培養(yǎng)問題是很重要的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為克服相關(guān)技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明公開實施例提供了一種植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法及應(yīng)用。

2、所述技術(shù)方案如下：一種植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，該方法通過梯度篩選適合消毒的次氯酸鈉濃度，并對次氯酸鈉消毒方法的步驟進行優(yōu)化，具體包括以下步驟：

3、s1，挑選大小一致、飽滿且表面光滑無斑漬的大豆種子多份，用乙醇浸泡，邊浸泡邊搖晃，倒掉乙醇；

4、s2，向步驟s1得到的大豆種子中分別加入不同百分比有效氯的次氯酸鈉溶液，將盛有大豆種子和次氯酸鈉溶液的容器振蕩處理；

5、s3，將步驟s2中的大豆種子用無菌水清洗，滅菌濾紙上吹干，得到消毒的大豆種子。

6、在步驟s1中，用75％乙醇浸泡3min。

7、在步驟s2中，次氯酸鈉的有效氯濃度為0.6％。

8、在步驟s2中，向得到的大豆種子分別加入0.6％、1.2％、1.8％、2.4％和3％有效氯的次氯酸鈉溶液。

9、在步驟s2中，將盛有大豆種子和次氯酸鈉溶液的容器置于25℃搖床中100-120rpm振蕩處理30min。

10、在步驟s3中，將大豆種子用無菌水清洗6次，每次搖晃清洗1min，滅菌濾紙上吹1-2min。

11、在步驟s3中，得到消毒的大豆種子后，在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

12、在步驟s3中，萌發(fā)培養(yǎng)基的組分包括：b5、b5維生素、1.67mg/l6-ba、2％蔗糖、0.25％植物膠，ph＝5.8。

13、本發(fā)明的另一目的在于提供一種如植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法在大豆發(fā)根轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，該應(yīng)用中，向所述得到的大豆種子加入0.6％有效氯的次氯酸鈉溶液以及將盛有大豆種子和次氯酸鈉溶液的容器振蕩處理30min。

14、結(jié)合上述的所有技術(shù)方案，本發(fā)明所具備的有益效果為：本發(fā)明提供的一種植物組織培養(yǎng)用的大豆種子的消毒方法，先用75％乙醇消毒3min，然后1.2％的次氯酸鈉溶液25℃，100rpm搖床處理30min后，用無菌水清洗6次，每次搖晃清洗1min，滅菌濾紙上吹1-2min，最后在萌發(fā)培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)。本發(fā)明僅利用較低濃度的次氯酸鈉溶液處理種子，可以減少消毒時間以及對環(huán)境的污染，同時該處理方式的種子能夠保留種皮，便于12-16h種子萌發(fā)后進行劃傷處理，另外該處理萌發(fā)率較高，污染率低。

15、本發(fā)明利用低濃度次氯酸鈉溶液消毒法替代氯氣消毒法，可減少鹽酸的使用，降低成本的同時減少環(huán)境污染，本發(fā)明利用有效氯濃度來篩選標(biāo)定次氯酸鈉的最適消毒濃度。本發(fā)明利用有效氯濃度指標(biāo)篩選確定最適消毒濃度，解決了消毒大豆沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的問題。

技術(shù)特征：

1.一種植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，其特征在于，該方法通過梯度篩選適合消毒的次氯酸鈉濃度，并對次氯酸鈉消毒方法的步驟進行優(yōu)化，具體包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，其特征在于，在步驟s1中，用75％乙醇浸泡3min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，其特征在于，在步驟s2中，次氯酸鈉的有效氯濃度為0.6％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，其特征在于，在步驟s2中，向得到的大豆種子分別加入0.6％、1.2％、1.8％、2.4％和3％有效氯的次氯酸鈉溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，其特征在于，在步驟s2中，將盛有大豆種子和次氯酸鈉溶液的容器置于25℃搖床中100-120rpm振蕩處理30min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，其特征在于，在步驟s3中，將大豆種子用無菌水清洗6次，每次搖晃清洗1min，滅菌濾紙上吹1-2min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，其特征在于，在步驟s3中，得到消毒的大豆種子后，在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法，其特征在于，在步驟s3中，萌發(fā)培養(yǎng)基的組分包括：b5、b5維生素、1.67mg/l?6-ba、2％蔗糖、0.25％植物膠，ph＝5.8。

9.一種如權(quán)利要求1-8任意一項所述植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法在大豆發(fā)根轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用中，向所述得到的大豆種子加入0.6％有效氯的次氯酸鈉溶液以及將盛有大豆種子和次氯酸鈉溶液的容器振蕩處理30min。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種植物組織培養(yǎng)用大豆種子的消毒方法及應(yīng)用。該方法挑選大小一致、飽滿且表面光滑無斑漬的種子各多份，用乙醇浸泡；邊浸泡邊搖晃后倒掉乙醇；向得到的大豆種子分別加入不同百分比有效氯的次氯酸鈉溶液，將盛有大豆種子和次氯酸鈉溶液的容器振蕩處理；將大豆種子用無菌水清洗，滅菌濾紙上吹干，得到消毒的大豆種子。本發(fā)明僅利用較低濃度的次氯酸鈉溶液處理種子，可以減少消毒時間以及對環(huán)境的污染，同時該處理方式的種子能夠保留種皮，便于12?16h種子萌發(fā)后進行劃傷處理，另外該處理萌發(fā)率較高，污染率低。

技術(shù)研發(fā)人員：邱姍姍,閆柏松,胡樂佳
受保護的技術(shù)使用者：浙江省種業(yè)集團芯創(chuàng)生物育種有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9