本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

葫蘆茶(tadehagitriquetrum(l.)ohashi)，又名牛蟲草、金劍草、迫頸草、咸魚草、百勞舌等，為豆科葫蘆茶屬半灌木植物。葫蘆茶屬約有6種，主要分布于亞洲熱帶地區(qū)、太平洋群島和澳大利亞，其中我國分布有葫蘆茶(tadehagitriquetrum(l.)ohashi)和蔓莖葫蘆茶(tadehagipseudatriquetrum(dc.)yangethuang),主要分布于廣西、廣東、海南等華南地區(qū),常見于低山、平壩路邊灌叢中，其喜氣候溫暖條件。

葫蘆茶是一種民間常用中草藥，具有清熱解毒、消積利濕、殺蟲防腐等功效，常用于咽喉腫痛、急性腎炎、感冒發(fā)熱、前列腺增生、細菌性痢疾、黃疸性肝炎等疾病的治療。目前，葫蘆茶基本上處于野生狀態(tài)，但由于藥農(nóng)對葫蘆茶過度采摘，導致其野生資源銳減，為了防止葫蘆茶資源的匱乏和滿足未來對其開發(fā)利用的需要，人工大面積栽培勢在必行。葫蘆茶主要采用種子和扦插繁殖，但由于野生葫蘆茶的種子較小，難以收集，而扦插繁殖存在周期長、繁殖系數(shù)低等缺點，因此建立葫蘆茶的組培快繁方法顯得尤其迫切。

本發(fā)明選擇野生葫蘆茶新生莖段為外植體，通過篩選和優(yōu)化不定芽誘導、不定芽增殖、生根培養(yǎng)等過程的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，經(jīng)誘導、繼代、生根以及移栽等步驟，實現(xiàn)了葫蘆茶的快速繁殖。本發(fā)明具有誘導率高、繁殖系數(shù)高、種苗品質(zhì)好、成本低等特點，可直接用于葫蘆茶的繁育和保護，對于葫蘆茶的遺傳改良、種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用具有重要意義。

目前，國內(nèi)外尚未有葫蘆茶組織培養(yǎng)技術(shù)的報道，也未有葫蘆茶組培快繁專利的申請。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法，本發(fā)明通過篩選和優(yōu)化不定芽誘導、不定芽增殖、生根培養(yǎng)等過程的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，經(jīng)誘導、繼代、生根以及移栽等步驟，達到了非常高的誘導率，其誘導率達到了89％以上，實現(xiàn)了葫蘆茶的快速繁殖，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法，包括依次進行的如下步驟：獲取葫蘆茶的外植體、不定芽誘導、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽；

所述的不定芽誘導的不定芽誘導培養(yǎng)基包括：ms、1.0～3.0mg/l6-ba、0.5～1.0mg/lnaa、25～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l瓊脂，不定芽誘導培養(yǎng)基ph為5.4～5.8。

在上述的民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法中，所述的不定芽誘導操作的方法為：將采集得到的作為外植體的葫蘆茶的新生莖段為消毒后剪切成1.0～1.5cm的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中在25～28℃進行全暗培養(yǎng)30～45天即可誘導形成不定芽。

在上述的民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法中，所述的繼代培養(yǎng)操作所用到的不定芽增殖培養(yǎng)基包括：ms、0.5～1.5mg/l6-ba、0.1～0.3mg/lnaa、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l瓊脂、0.2～0.5g/l活性炭，不定芽增殖培養(yǎng)基ph為5.4～5.8。

在上述的民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法中，所述的繼代培養(yǎng)操作為將：將經(jīng)過不定芽誘導操作得到的不定芽切成長1～2cm的莖段并接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即可實現(xiàn)不定芽的大量增殖。

在上述的民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法中，所述的生根培養(yǎng)操作所用到的生根培養(yǎng)基包括：1/2ms、1.0～2.0mg/lnaa、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l瓊脂、0.2～0.5g/l活性炭，生根培養(yǎng)基ph為5.4～5.8。

在上述的民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法中，所述的生根培養(yǎng)操作的方法為：將繼代培養(yǎng)操作增殖得到的長2～3cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即能實現(xiàn)試管苗的生根。

在上述的民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法中，所述的移栽操作的具體方法為：將經(jīng)過生根培養(yǎng)操作得到的健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗3～5天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的大田土壤、細沙的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗。

在上述的民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖方法中，繼代培養(yǎng)操作、生根培養(yǎng)操中培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強度為2500～3000lx，光照時間為12～14小時/天。

有益效果：

本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)了民間中草藥葫蘆茶的快速繁殖，具有簡單、易行、經(jīng)濟的特點。通過本發(fā)明育成的葫蘆茶試管苗移栽成活率達到95％以上，可解決葫蘆茶的人工大面積栽培中存在種苗缺乏的問題。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實施例一

(1)外植體采集：2014年春季，于廣西環(huán)江縣野外選取生長健壯的葫蘆茶的新生莖段為外植體。

(2)不定芽誘導：將采取回實驗室的外植體先在自來水沖洗過夜后于超凈工作臺中于0.1％的升汞溶液中消毒30分鐘，無菌水沖洗2次后用無菌濾紙吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分鐘。無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分，再置于0.1％的升汞溶液中消毒3分鐘，無菌水沖洗5次后經(jīng)無菌濾紙吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中在25℃進行全暗培養(yǎng)32天即可誘導形成不定芽，誘導率達到90.7％，污染率低至6.8％。所述的不定芽誘導培養(yǎng)基為：ms+3.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+25g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂，ph為5.4。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)所得的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)26天即可實現(xiàn)不定芽的大量增殖，增殖系數(shù)達到7.9倍。所述的不定芽增殖培養(yǎng)基為：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+15g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.2g/l活性炭，ph為5.4。

(4)生根培養(yǎng)：切取步驟(3)增殖得到的長約2～3cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即能實現(xiàn)試管苗的生根，生根率為95.3％。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms+2.0mg/lnaa+15g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.2g/l活性炭，ph為5.4。

(5)移栽：將步驟(4)得到的健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的大田土壤、細沙的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗,移栽30天后成活率達到98％以上。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為2500lx，光照時間為12小時/天。

實施例二

(1)外植體采集：2015年春季，在廣西羅城仫佬族自治縣野外選取生長健壯的葫蘆茶的新生莖段為外植體。

(2)不定芽誘導：將采取回實驗室的外植體先在自來水沖洗過夜后于超凈工作臺中于0.1％的升汞溶液中消毒45分鐘，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘。無菌水沖洗4次后用無菌濾紙吸干水分，再置于0.1％的升汞溶液中消毒4分鐘，無菌水沖洗6次后經(jīng)無菌濾紙吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中在26℃進行全暗培養(yǎng)39天即可誘導形成不定芽，誘導率為92.5％，污染率低于7％。所述的不定芽誘導培養(yǎng)基為：ms+2.0mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+27g/l蔗糖+5.0g/l瓊脂，ph為5.6。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)所得的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天即可實現(xiàn)不定芽的大量增殖，增殖系數(shù)達到6.9倍。所述的不定芽增殖培養(yǎng)基為：ms+1.1mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+23g/l蔗糖+5.5g/l瓊脂+0.35g/l活性炭，ph為5.6。

(4)生根培養(yǎng)：切取步驟(3)增殖得到的長約2～3cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)27天即能實現(xiàn)試管苗的生根，生根達到97.6％。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms+1.6mg/lnaa+23g/l蔗糖+4.8g/l瓊脂+0.4g/l活性炭，ph為5.6。

(5)移栽：將步驟(4)得到的健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗4天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的大田土壤、細沙的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為98.2％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為26℃，光照強度為2700lx，光照時間為13小時/天。

實施例三

(1)外植體采集：2016年春季，在云南麗江野外選取生長健壯的葫蘆茶的新生莖段為外植體。

(2)不定芽誘導：將采取回實驗室的外植體先在自來水沖洗過夜后于超凈工作臺中于0.1％的升汞溶液中消毒60分鐘，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒20分鐘。無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5分鐘，無菌水沖洗7次后經(jīng)無菌濾紙吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中在28℃進行全暗培養(yǎng)45天即可誘導形成不定芽，誘導率為89.6％，污染率低于2％。所述的不定芽誘導培養(yǎng)基為：ms+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l瓊脂，ph為5.8。

(3)繼代培養(yǎng)：將步驟(2)所得的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即可實現(xiàn)不定芽的大量增殖，增殖系數(shù)達到6.3倍。所述的不定芽增殖培養(yǎng)基為：ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l瓊脂+0.5g/l活性炭，ph為5.8。

(4)生根培養(yǎng)：切取步驟(3)增殖得到的長約2～3cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即能實現(xiàn)試管苗的生根，生根為92.5％。所述的生根培養(yǎng)基為：1/2ms+1.0mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l瓊脂+0.5g/l活性炭，ph為5.8。

(5)移栽：將步驟(4)得到的健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗3～5天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1的大田土壤、細沙的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率為98.4％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，光照強度為3000lx，光照時間為14小時/天。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。