本發(fā)明涉及種苗繁育技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微型種子消毒轉(zhuǎn)接方法。

背景技術(shù)：

目前，實(shí)生苗組培技術(shù)在新品種選育領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，尤其應(yīng)用于發(fā)育不完全的種子。常用的種子無(wú)菌播種有點(diǎn)播、撒播，而相對(duì)較小的微型種子（直徑小于1mm）通常采用果莢消毒法，即在果莢開(kāi)裂之前采收，對(duì)其進(jìn)行消毒，消毒后剝?nèi)スv進(jìn)行無(wú)菌播種，該方法無(wú)法保證果莢內(nèi)微型種子的成熟度及品質(zhì),這主要是由于微型種子如蝴蝶蘭、白芨等充分成熟時(shí)果夾會(huì)開(kāi)裂，在開(kāi)裂前不能保證其成熟度和品質(zhì)。因此，研究一種微型種子直接消毒轉(zhuǎn)接的方法顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于研究一種微型種子消毒轉(zhuǎn)接的方法，采用本發(fā)明可有效解決微型種子播種不均勻，密度較大，勤于分瓶的難題。

一種微型種子消毒轉(zhuǎn)接方法，它包括以下幾個(gè)步驟：

1）種子的收集：

將進(jìn)行無(wú)菌轉(zhuǎn)接的微型種子，在果莢略微發(fā)黃、扭曲還未開(kāi)裂時(shí)進(jìn)行套袋，收集成熟飽滿的種子，置于4℃冰箱備用；

2）無(wú)菌材料的準(zhǔn)備：

將1.5ml離心管，無(wú)菌水，0.1%-0.2%瓊脂，1000μL移液槍頭，121℃，20min進(jìn)行高溫滅菌，冷卻備用;

3）種子的消毒處理：

將步驟1）獲得的種子取適量（不要多于離心管1/10的體積）裝于1.5mL離心管，加入1mL無(wú)菌水，震蕩10-30s，4000-6000r/s離心30s,將上清及漂浮的未成熟種子棄掉；向離心管中加入1mL70-75%酒精，震蕩10s,4000-6000r/s離心15s（為保證種子活性，酒精接觸時(shí)間不超30s），用移液槍小心去除上清；加入1mL無(wú)菌水，震蕩10-30s，4000-6000r/s離心30s，去上清，重復(fù)2-3次洗去酒精；向離心管中加入1mL0.1% HgCl₂，強(qiáng)力震蕩滅菌3-5min， 4000-6000r/s離心30s，去上清；加入1mL無(wú)菌水，強(qiáng)力震蕩1min，4000-6000r/s離心30s，去上清，重復(fù)3-5次，去除HgCl₂后備用；

本步驟中采用的轉(zhuǎn)速為4000-6000r/s ，轉(zhuǎn)速過(guò)低成熟種子不能離心沉積，轉(zhuǎn)速過(guò)高干癟種子不能漂??；

本步驟中采用的滅菌時(shí)間為3-5min，若滅菌時(shí)間過(guò)短消毒不徹底，滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)種子受HgCl₂毒害，活性降低。

）無(wú)菌種子的轉(zhuǎn)接：

向步驟3）獲得的盛無(wú)菌種子的離心管中加入1mL-1.5mL的0.1%-0.2%瓊脂，用移液槍吸打至種子均勻懸浮后吸取懸浮液，依據(jù)播種密度，將懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)基，直至懸浮液均勻分布于固體培養(yǎng)基表面。在超凈工作臺(tái)中晾至懸浮液凝固即可封口、標(biāo)記。

本步驟中使用的0.1%-0.2%瓊脂能夠保證微型種子充分懸浮，濃度過(guò)低不能使種子懸浮，濃度過(guò)高易造成懸浮液凝固，不利于播種。

）無(wú)菌種子的培養(yǎng)：

將步驟4）獲得的無(wú)菌種子培養(yǎng)至長(zhǎng)出兩片真葉后即可分瓶進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)，此為通過(guò)組培技術(shù)獲得的實(shí)生苗。

本發(fā)明所述的壯苗、生根培養(yǎng)均為現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明在果莢開(kāi)裂后，進(jìn)行微型種子的收集、消毒、轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)獲得一種微型種子(直徑小于1mm)在實(shí)生苗組培過(guò)程中消毒播種方法。本發(fā)明的具體優(yōu)點(diǎn)如下：第一，微型種子直接消毒法解決了果莢開(kāi)裂后，微型種子消毒難的問(wèn)題；第二，解決了微型種子播種不均勻，密度較大，勤于分瓶的難題。該方法能夠保證微型種子完全成熟后播種，提高萌發(fā)率；播種時(shí)保證微型種子均勻平鋪，疏密可控，受光均勻，在雜交選育及實(shí)生苗生產(chǎn)中具有很好的技術(shù)效果和推廣前景。

具體實(shí)施方式

一種微型種子消毒轉(zhuǎn)接方法，其中本實(shí)施例中的微型種子為蝴蝶蘭種子，它包括以下幾個(gè)步驟：

（1）選取蝴蝶蘭雜交140天的果莢，進(jìn)行套袋處理，10天后收集到成熟飽滿、自然開(kāi)裂的蝴蝶蘭種子，置于4℃冰箱備用；

（2）將1.5ml離心管，無(wú)菌水，0.1%瓊脂，1000μL移液槍頭裝袋封口后，進(jìn)行高溫滅菌，冷卻備用。

（3）將步驟1）獲得的種子取適量（不多于1/10體積）裝于1.5mL離心管，加入1mL無(wú)菌水，震蕩10s，4000r/s，離心30s，去掉廢液及漂浮的種子；向離心管中加入1mL70%酒精，上下震蕩10s, 4000r/s，離心15s，用移液槍小心去除廢液；加入1mL無(wú)菌水，震蕩10s，4000r/s，離心30s，去廢液，重復(fù)2次；向離心管中加入1mL0.1% HgCl₂，強(qiáng)力震蕩3min,4000r/s離心30s，去廢液；加入1mL無(wú)菌水，強(qiáng)力震蕩1min，4000r/s離心30s，去廢液，重復(fù)3次后備用；

（4）向步驟3）獲得的盛無(wú)菌種子的離心管中加入1.5mL的0.1%瓊脂，用移液槍吸打至種子均勻懸浮后吸取懸浮液，均勻分布于培養(yǎng)基表面，15min后，晾干、封口、標(biāo)記。

（5）將步驟4）獲得的無(wú)菌種子培養(yǎng)2個(gè)月后，長(zhǎng)出兩片真葉進(jìn)行分瓶轉(zhuǎn)接，2個(gè)月后進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)，3個(gè)月后得蝴蝶蘭雜交的實(shí)生苗。

本實(shí)施例中，種子的萌發(fā)率高達(dá)84.38%，中間只進(jìn)行一次分瓶。而同期用傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)接的種子，萌發(fā)率為78.31%左右，中間因?yàn)椴シN不均勻，進(jìn)行了3次分瓶。

實(shí)施例2

一種微型種子消毒轉(zhuǎn)接方法，其中本實(shí)施例中的微型種子為霍山石斛種子，它包括以下幾個(gè)步驟：

（1）選取霍山石斛自交170天的果莢，進(jìn)行套袋處理，10天后收集到成熟飽滿、自然開(kāi)裂的石斛種子，置于4℃冰箱備用；

（2）將1.5ml離心管，無(wú)菌水，0.15%瓊脂，1000μL移液槍頭裝袋封口后，進(jìn)行高溫滅菌，冷卻備用。

（3）將步驟1）獲得的種子取適量（不多于1/10體積）裝于1.5mL離心管，加入1mL無(wú)菌水，震蕩20s，5000r/s，離心30s，去掉廢液及漂浮的種子；向離心管中加入1mL0.1% HgCl₂，強(qiáng)力震蕩4min,5000r/s離心30s，去廢液；加入1mL無(wú)菌水，強(qiáng)力震蕩1min，5000r/s離心30s，去廢液，重復(fù)4次后備用；

（4）向步驟3）獲得的盛石斛種子的離心管中加入1.5mL的0.15%瓊脂，用移液槍吸打至種子均勻懸浮后吸取懸浮液，均勻分布于培養(yǎng)基表面，晾干、封口、標(biāo)記。

（5）將步驟4）獲得的無(wú)菌種子培養(yǎng)50天后，長(zhǎng)出兩片真葉進(jìn)行分瓶轉(zhuǎn)接，2個(gè)月后進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)，3個(gè)月后得霍山石斛實(shí)生苗。

本實(shí)施例中，石斛種子消毒轉(zhuǎn)接40天后，萌發(fā)率為86.21%，中間進(jìn)行一次分瓶。而同期用傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)接的種子，萌發(fā)率不高于85%，中間因?yàn)椴シN不均勻，造成光照不足，進(jìn)行了2次分瓶轉(zhuǎn)接。

實(shí)施例3

一種微型種子消毒轉(zhuǎn)接方法，其中本實(shí)施例中的微型種子為白芨種子，它包括以下幾個(gè)步驟：

（1）選取白芨自交160天的果莢，進(jìn)行套袋處理，5天后收集到成熟飽滿、自然開(kāi)裂的白芨種子，置于4℃冰箱備用；

（2）將1.5ml離心管，無(wú)菌水，0.2%瓊脂，1000μL移液槍頭裝袋封口后，進(jìn)行高溫滅菌，冷卻備用。

（3）將步驟1）獲得的種子取適量（不多于1/10體積）裝于1.5mL離心管，加入1mL無(wú)菌水，震蕩30s，6000r/s，離心30s，去掉廢液及漂浮的種子；向離心管中加入1mL75%酒精，上下震蕩10s, 6000r/s，離心15s，用移液槍小心去除廢液；向離心管中加入1mL0.1% HgCl₂，強(qiáng)力震蕩5min,6000r/s離心30s，去廢液；加入1mL無(wú)菌水，強(qiáng)力震蕩1min，6000r/s離心30s，去廢液，重復(fù)5次后備用；

（4）向步驟3）獲得的盛無(wú)菌種子的離心管中加入1.5mL的0.2%瓊脂，用移液槍吸打至種子均勻懸浮后吸取懸浮液，均勻分布于培養(yǎng)基表面，晾干、封口、標(biāo)記。

（5）將步驟4）獲得的白芨種子培養(yǎng)45天后，長(zhǎng)出兩片真葉進(jìn)行分瓶轉(zhuǎn)接一次，40天后進(jìn)行壯苗、生根培養(yǎng)，3個(gè)月后得白芨實(shí)生苗。

本實(shí)施例中，白芨種子消毒轉(zhuǎn)接40天后，萌發(fā)率高于90%，中間進(jìn)行1次分瓶，而同期用傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)接的種子，萌發(fā)率不高于80%，中間因?yàn)椴シN較密不均勻，造成受光不勻，部分徒長(zhǎng)，進(jìn)行了3次分瓶。