一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]烏桕(Sapiumsebiferum)為大戟科烏桕屬多年生木本植物，廣泛分布于我國熱帶和亞熱帶地區(qū)，為我國特有經(jīng)濟(jì)樹種。烏桕樹冠整齊，葉形秀麗，秋葉鮮紅、紫色或鮮黃色，集觀形、葉、果于一體，具有非常高的觀賞價(jià)值，可作庭院綠化及行道樹。此外，烏桕適應(yīng)性較強(qiáng)，對(duì)土質(zhì)要求不高，耐旱、澇、貧瘠、適宜邊際土地種植，且種植模式多樣，易于實(shí)現(xiàn)大面積規(guī)?；a(chǎn)。因此，烏桕無論是作為觀賞樹種，還是荒山灘涂綠化樹種均已引起廣泛關(guān)注。但烏桕作為景觀或?yàn)┩烤G化樹種，普遍存在枝條稀疏，樹型中空的問題，在一定程度上限制了烏桕的應(yīng)用。
[0003]三倍體育種培育是植物種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑，在其遺傳學(xué)和育種學(xué)領(lǐng)域具有重要的意義。三倍體植物通常具有生長迅速、生長旺盛、抗逆性強(qiáng)、無籽等優(yōu)良性狀。相對(duì)于傳統(tǒng)的借助雜交技術(shù)創(chuàng)制三倍體而言，通過胚乳離體再生三倍體具有周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，由于胚乳細(xì)胞的染色體2/3來自母本，1/3來自父本，作為研究性狀遺傳規(guī)律的材料，也頗具價(jià)值;此外，胚乳細(xì)胞在形成三倍體植株的同時(shí)，可以產(chǎn)生大量不同倍性的混合體和非整倍體，可為育種提供豐富的不同倍性材料。因此，通過胚乳培養(yǎng)獲得營養(yǎng)生長旺盛的烏桕多倍體植株，可以克服烏桕在景觀和綠化應(yīng)用上的不足。
[0004]目前，關(guān)于利用烏桕胚乳為外植體，對(duì)烏桕進(jìn)行離體再生的研究也有報(bào)道，但主要集中在通過愈傷組織的誘導(dǎo)和分化來進(jìn)行植株再生研究，存在再生效率低，再生過程繁瑣等問題，很難滿足烏桕多倍體育種的需求。因此，針對(duì)當(dāng)前烏桕胚乳倍性育種所存在的問題，急需開發(fā)一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，以滿足烏桕倍性育種的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法。為實(shí)現(xiàn)烏桕的倍性育種和后期的遺傳改良研究奠定基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，包括如下步驟:
[0007](I)取烏桕成熟種子剪去種殼，經(jīng)表面消毒后接種于添加生長調(diào)節(jié)劑的啟培養(yǎng)基中，光照，進(jìn)行胚乳啟動(dòng)培養(yǎng)；
[0008](2)把胚乳從烏桕種子上剝離，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，獲得嫩綠不定芽叢；
[0009](3)將不定芽叢切塊，轉(zhuǎn)接于增殖和伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖和伸長；
[0010](4)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根，獲得健壯的烏桕試管苗，馴化后進(jìn)行移栽。
[0011]優(yōu)選地:所述步驟(I)的光照時(shí)間為6?9d;所述步驟(2)的光照時(shí)間為2?3周；所述步驟(4)中，培養(yǎng)3?4周后獲得烏桕試管苗。
[0012]優(yōu)選地:所述步驟(4)中，待芽長至2?3cm并伴有2?3個(gè)葉片時(shí)，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)彳丁生根。
[0013]優(yōu)選地:所述步驟(I)的表面消毒是指在無菌操作臺(tái)中，用75%的無水乙醇消毒30?45 s，之后用20%的次氯酸鈉溶液消毒8?12min，無菌水沖洗3?5遍，之后再經(jīng)600W超聲處理7?lOmin，種子表面消毒期間不停地?fù)u動(dòng)。
[0014]優(yōu)選地:所述步驟(I)的烏桕啟動(dòng)培養(yǎng)基為包括有2.0?8.0mg/L6_BA、0.2?1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。
[0015]優(yōu)選地:所述烏桕胚乳來源于經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)6?9d，處于萌動(dòng)狀態(tài)的烏桕種子。
[0016]優(yōu)選地:所述步驟(2)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括有3.0?6.0mg/L6_BA、0.05?0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。
[0017]優(yōu)選地:所述步驟(3)的切塊是指將胚乳叢生芽增殖前切成(0.2?0.4)X (0.3?0.5)cm2大小的切塊。
[0018]優(yōu)選地:所述步驟(3)的增殖和伸長培養(yǎng)基為包括有1.0?2.0mg/L 6_BA、0.05?
0.lmg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。
[0019]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下有益效果:
[0020](I)再生過程簡單，不經(jīng)過愈傷組織的誘導(dǎo)階段，可以在胚乳周邊表皮直接誘導(dǎo)出不定芽叢；
[0021](2)進(jìn)一步，本發(fā)明中采用次氯酸鈉與超聲結(jié)合的方法對(duì)烏桕種子進(jìn)行消毒，具有消毒時(shí)間短，消毒效果好，污染率為0%;同時(shí)，可以促進(jìn)種子的萌動(dòng)和后期胚乳的再生等優(yōu)勢；
[0022](3)進(jìn)一步，不定芽再生速度快，胚乳經(jīng)過6?9d的啟動(dòng)培養(yǎng)和2?3周的誘導(dǎo)培養(yǎng)，即可再生出大量的不定芽(每個(gè)胚乳20?40個(gè))；
[0023](4)再生頻率高，胚乳不定芽的誘導(dǎo)率高達(dá)100%。
[0024]因此，本發(fā)明所提供的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，不僅為烏桕倍性育種和遺傳改良提供了技術(shù)支撐，而且對(duì)于開展烏桕性狀遺傳規(guī)律等基礎(chǔ)研究具有重要意義。
【附圖說明】
[0025]圖1啟動(dòng)培養(yǎng)后剝離的烏桕成熟胚乳
[0026]圖2胚乳叢生芽誘導(dǎo)
[0027]圖3接種于增殖培養(yǎng)基上的胚乳叢生芽切塊
[0028]圖4叢生芽的增殖和伸長
[0029]圖5叢生芽的生根
[0030]圖6烏桕無菌苗的移栽
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0032]實(shí)施例1
[0033]—種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，具體如下:
[0034](I)取烏桕成熟種子剪去種殼，于無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒；表面消毒是指用75%的無水乙醇消毒30s，之后用20%的次氯酸鈉溶液消毒8min，無菌水沖洗3遍，之后再經(jīng)600W超聲處理7min，種子表面消毒期間不停地?fù)u動(dòng)。
[0035](2)將步驟(I)中消毒后的種子接種于添加有2.0mg/L 6_BA、0.2mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行胚乳啟動(dòng)培養(yǎng)。
[0036](3)光照培養(yǎng)6?9d后，把胚乳從處于萌動(dòng)狀態(tài)烏桕種子上剝離，接種于添加有3.0mg/L 6-BA、0.05mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基種進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。
[0037](4)光照培養(yǎng)2?3周后，獲得嫩綠不定芽叢;將不定芽叢切成0.2 X0.3cm2大小的切塊，接種于添加有1.0mg/L 6-BA、0.05mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖和伸長。
[0038](5)待芽長至2?3cm并伴有2?3個(gè)葉片時(shí)，轉(zhuǎn)入添加有0.3mg/L IBA的1/4MS固體生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根，3?4周后獲得根系健壯的烏桕試管苗，馴化后進(jìn)行移栽。
[0039]實(shí)施例2
[0040]—種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，具體如下:
[0041](I)取烏桕成熟種子剪去種殼，于無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒；表面消毒是指用75%的無水乙醇消毒40s，之后用20%的次氯酸鈉溶液消毒lOmin，無菌水沖洗4遍，之后再經(jīng)600W超聲處理I Omin，種子表面消毒期間不停地?fù)u動(dòng)。
[0042](2)將步驟(I)中消毒后的種子接種于添加有5.0mg/L 6_BA、0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行胚乳啟動(dòng)培養(yǎng)。
[0043](3)光照培養(yǎng)6?9d后，把胚乳從處于萌動(dòng)狀態(tài)烏桕種子上剝離(圖1)，接種于添加有4.5mg/L 6-BA、0.2mg/L 102、3(^/1蔗糖和7.(^/1瓊脂的13培養(yǎng)基種進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。
[0044](4)光照培養(yǎng)2?3周后，獲得嫩綠不定芽叢(圖2);將不定芽叢切成0.3X0.4cm2大小的切塊(圖3)，接種于添加有1.5mg/L 6-BA、0.07mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖和伸長(圖4)。
[0045](5)待芽長至2?3cm并伴有2?3個(gè)葉片時(shí)，轉(zhuǎn)入添加有0.3mg/L IBA的1/4MS固體生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根(圖5)，3?4周后獲得根系健壯的烏桕試管苗，馴化后進(jìn)行移栽(圖6)。
[0046]實(shí)施例3
[0047]—種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，具體如下:
[0048](I)取烏桕成熟種子剪去種殼，于無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面消毒;表面消毒是指于無菌操作臺(tái)中用75%的無水乙醇消毒45s，之后用20%的次氯酸鈉溶液消毒12min，無菌水沖洗5遍，之后再經(jīng)600W超聲處理Smin，種子表面消毒期間不停地?fù)u動(dòng)。
[0049](2)將步驟(I)中消毒后的種子接種于添加有8.0mg/L 6_BA、1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行胚乳啟動(dòng)培養(yǎng)。
[0050](3)光照培養(yǎng)6?9d后，把胚乳從處于萌動(dòng)狀態(tài)烏桕種子上剝離，接種于添加有
6.0mg/L 6-BA、0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基種進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。
[0051 ] (4)光照培養(yǎng)2?3周后，獲得嫩綠不定芽叢;將不定芽叢切成0.4X0.5cm2大小的切塊，接種于添加有2.0mg/L 6-BA、0.lmg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖和伸長。
[0052](5)待芽長至2?3cm并伴有2?3個(gè)葉片時(shí)，轉(zhuǎn)入添加有0.3mg/L IBA的1/4MS固體生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根，3?4周后獲得根系健壯的烏桕試管苗，馴化后進(jìn)行移栽。
[0053]上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本
【發(fā)明內(nèi)容】
并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取烏桕成熟種子剪去種殼，經(jīng)表面消毒后接種于添加生長調(diào)節(jié)劑的啟培養(yǎng)基中，光照，進(jìn)行胚乳啟動(dòng)培養(yǎng)； (2)把胚乳從烏桕種子上剝離，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，獲得嫩綠不定芽叢； (3)將不定芽叢切塊，轉(zhuǎn)接于增殖和伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖和伸長； (4)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根，獲得健壯的烏桕試管苗，馴化后進(jìn)行移栽。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(I)的光照時(shí)間為6?9d;所述步驟(2)的光照時(shí)間為2?3周;所述步驟(4)中，培養(yǎng)3?4周后獲得烏桕試管苗。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(4)中，待芽長至2?3cm并伴有2?3個(gè)葉片時(shí)，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(I)的表面消毒是指在無菌操作臺(tái)中，用75%的無水乙醇消毒30?45s，之后用20%的次氯酸鈉溶液消毒8?12min，無菌水沖洗3?5遍，之后再經(jīng)600W超聲處理7?1min，種子表面消毒期間不停地?fù)u動(dòng)。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(I)的烏桕啟動(dòng)培養(yǎng)基為包括有2.0?8.0mg/L 6_BA、0.2?1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:所述烏桕胚乳來源于經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)6?9d，處于萌動(dòng)狀態(tài)的烏桕種子。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(2)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為包括有3.0?6.0mg/L 6_BA、0.05?0.5mg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(3)的切塊是指將胚乳叢生芽增殖前切成(0.2?0.4) X (0.3?0.5)cm2大小的切塊。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，其特征在于:所述步驟(3)的增殖和伸長培養(yǎng)基為包括有1.0?2.0mg/L 6_BA、0.05?0.lmg/L TDZ、30g/L蔗糖和7.0g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種烏桕成熟胚乳離體直接再生植株的方法，包括如下步驟：(1)取烏桕成熟種子剪去種殼，經(jīng)表面消毒后接種于添加生長調(diào)節(jié)劑的啟培養(yǎng)基中，光照，進(jìn)行胚乳啟動(dòng)培養(yǎng)；(2)把胚乳從烏桕種子上剝離，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，光照，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，獲得嫩綠不定芽叢；(3)將不定芽叢切塊，轉(zhuǎn)接于增殖和伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖和伸長；(4)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根，獲得健壯的烏桕再生植株。本發(fā)明具有再生過程簡單，不經(jīng)過愈傷組織的誘導(dǎo)階段，可以在胚乳周邊表皮直接誘導(dǎo)出不定芽叢的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105706931
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610115535
【發(fā)明人】侯金艷, 吳麗芳, 趙華
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院